Γενετικά Τροποποιημένα Φυτά

Transcript

1 Γενετικά Τροποποιημένα Φυτά I. Γενετική τροποποίηση, Γενικές Αρχές Αγροβακτηρίδιο Βαλλιστική Παροδική Έκφραση Άλλες μέθοδοι Αναγέννηση σε ιστοκαλλιέργεια II. Eφαρμογές ΓΤ, III. Έλεγχος-Ανίχνευση ΓΤ, Εκτίμηση Επικινδυνότητας

2 Τα επόμενα ~50-70 χρόνια το Χερσαίο/θαλάσιο παραγωγικό σύστημα θα πρέπει να παράξει για την ανθρώπινη διατροφή περίπου όσα τρόφιμα χρειάστηκαν από τότε που το ανθρώπινο γένος υπάρχει στη Γη!

3

4

5

6 Green Revolution iles/lamb_wi06/plant_biotech_breeding(8m ar06).ppt#259,4,slide 4 GR varieties - dwarfed & survive storms, some disease resistance, year round planting Dwarfism due to defects in gibberellic acid (GA)

7 Green Revolution - undertaken in the 1960s Extensive effort to increase yield of wheat and other grains Included improvements in breeding, fertilization, and irrigation Breeding improvement example: hybrid corn (uniform, therefore easier to harvest and much higher yields) HOWEVER, FARMERS MUST BUY THE HYBRID SEED EVERY YEAR, CAN T PROPAGATE THEMSELVES Norman Borlaug won Nobel Peace Prize in 1970 for his part in the Green Revolution

8

9

10

11

12 Cauliflower and broccoli are derived from the same genetic ancestor, Brassica oleracea, but were developed over many years into individual and very different vegetables through selection and breeding. Biotechnology can make this process more precise and less time-consuming. (California Agriculture June 2004, EDITORIAL OVERVIEW Challenges and opportunities for horticultural biotechnology )

13 PLANT BIOTECHNOLOGY IN WAVES Martina Newell=McGloughlin, Director, UC SystemwideBiotech Research and Education Program

14 ύο Στρατηγικές εκτοπικής έκφρασης: Α. Παροδική έκφραση (transient expression) Αγροεμποτισμός (Agroinfiltration) Ιικοί φορείς Β. Σταθερή έκφραση Γενετική τροποποίηση

15 ύο Στρατηγικές εκτοπικής έκφρασης: Α. Παροδική έκφραση (transient expression) Αγροεμποτισμός (Agroinfiltration) Ιικοί φορείς Β. Σταθερή έκφραση Γενετική τροποποίηση

16 Παρατήρηση: Kορονωτός κάλλος προκαλείται από το A.tumefaciens

17 Agrobacterium tumefaciens

18 To Aγροβακτηρίδιο έχει γενωμικό DNA αποτελούμενο από 4 μόρια και ένα μεγάλο πλασμίδιο

19 Γονιδιακή μεταφορά με Agrobacterium tumefaciens H συχνότερη μέθοδος μεταφοράς Χρησιμοποιεί το Agrobacterium tumefaciens, φυσική γενετική μηχανική Agrobacteria Βακτήρια εδάφους, gram-negative, συγγενικό του Rhizobium 4 είδη : tumefaciens- προκαλεί κορωνοτό κάλλο rubi- προκαλεί μικρούς κάλλους σε κάποια δικότυλα rhizogenes- η ασθένεια των μαλλιαρών ριζών radiobacter- μη τοξικό

20 Γονιδιακή μεταφορά με Agrobacterium tumefaciens είναι η μέθοδος που επιλέγεται για την τροποποίηση δικότυλων εν είναι το ίδιο αποτελεσματική σε όλα τα δικότυλα (υπάρχει γενετική προδιάθεση γι αυτό) Περίπλοκο βακτηρίδιο το γονιδίωμα είναι γνωστό; Αποτ. Από 4 χρωμοσώματα; ~ 5500 γονίδια

21 Επιμόλυνση και δημιουργία όγκου Η μόλυνση συμβαίνει μόνο σε τραυματισμένους ιστούς Περιλαμβάνει αναγνώριση και χημειοταξία προς το τραύμα Οι κάλλοι είναι πραγματικοί όγκοι Ο φαινότυπος είναι αποτέλεσμα μεταφοράς DNA στο φυτό

22 Συγκρότηση Ti πλασμιδίου Γονίδια τοξικότητας (vir) operons Α-H (24 genes) Γονίδια σύζευξης (con) ori V Γονίδια καταβολισμού οπινών Γονίδια φυτο-ορμονών Γονίδια σύνθεσης οπινών Αλληλουχίες ορίων

23

24 Ti Plasmid Μεγάλο (>200-kb) Συζευκτικό ~10% του πλασμιδίου μεταφέρεται στο φυτό μετά τη σύζευξη Το DNA που μεταφέρεται (ονομ. T-DNA) ενσωματώνεται σχεδόν τυχαία στο χρωμοσωμικό DNA Το πλασμίδιο Ti επίσης κωδικοποιεί: 1. Ένζυμα που σχετίζονται με το μεταβολισμό των οπινών 2. Πρωτεΐνες που σχετίζονται με την τοξικότητα (Vir genes)

25 Τα γονίδια του T-DNA και η ογκογέννεση Το T-DNA των Αγροβακτηριδίων αγρίου τύπου κωδικοποιούν δύο τύπων λειτουργίες παραγωγή φυτοορμονών και σύνθεση οπινών Τα γονίδια του T-DNA έχουν κατάλληλους υποκινητές (φυτικούς) και τέτοια χρήση κωδικονίων που τους επιτρέπουν να εκφράζονται στα φυτικά κύτταρα αλλά όχι στα βακτηριδιακά. Για την παραγωγή φυτο-ορμονών υπεύθυνα είναι τα γονίδια Tms1 και Tms2 που μετατρέπουν την τρυπτοφάνη σε Ινδολ-3-οξικό οξύ (IAA), και το γονίδιο Tmr/Ipt που μετατρέπει την αδενίνη σε ισοπεντυλ-αδενίνη.

26 Το Αγροβακτήριο κωδικοποιεί και ένζυμα που καταλύουν τη βιοσύνθεση ορμονών και οδηγούν στη δημιουργία όγκου L-tryptophan O 2 Tms1 indole-2-acetamide CO 2 Tms2 NH 3 2-isopentenyl-PP indole-3-acetic acid (αuxin) adenosine - 5 -PO 4 Tmr1 isopentenyladenine-5-po 4 (a cytokinin) PPi

27 εν έχουν χαρακτηριστεί όλα τα γονίδια του T-DNA Το ORF 6b, μόλις πρόσφατα βρέθηκε ότι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που έχει χαρακτηριστικά ευκαρυοτικού παράγοντα μεταγραφής (DNA-binding domain). Το A. rhizogenes περιέχει διαφορετικό μεγαπλασμίδιο (Ri) αλλά φέρει κατά το μεγαλύτερο μέρος τις ίδιες λειτουργίες Το πλασμίδιο Ri T-DNA φαίνεται ότι δεν κωδικοποιεί για σύνθεση κυτοκινίνης και άρα παράγει υπερβολικά μεγάλο αριθμό ριζών αλλά όχι κάλλο.

28 Εύρος Ξενιστή Το A. tumefaciens έχει εντυπωσιακά μεγάλο εύρος ξενιστών που περιλαμβάνει σχεδόν όλες τις οικογένειες δικότυλων. εν είναι καλοί ξενιστές τα μονοκότυλα και τα γυμνόσπερμα. Σε κάποιες περιπτώσεις αυτό μοιάζει να είναι αποτέλεσμα της έλλειψης συγκεκριμένου φαινολικού επαγωγέα Σε άλλες περιπτώσεις φαίνεται ότι δεν υπάρχουν συγκεκριμένα γονίδια «συνεργασίας» από τον ξενιστή

29 Τα πρώτα στάδια της «επίθεσης»: Επαγωγή: Ακετοσυριγκόνη, σιναπικό οξύ κ.α. φαινολικές ουσίες + σάκχαρα (VirA ενεργοποιεί την VirG-μ.π. για άλλα Vir)+ χαμηλό ph (5-6) Πρόσδεση: Βιτρονεκτίνη + άλλες επιφανειακές πρωτεΐνες + υδατάνθρακες

30

31

32 Απλουστευμένη τοπολογία της ογκογόνου περιοχής (T-DNA) και συνοριακές αλληλουχίες ενός πλασμιδίου Ti (ptic58) LB (left border): TGgCAGGATATATATTGtgGtGTAAAC RB (right border): TGaCAGGATATATATTGgcGgGTAAAC

33 Αλληλουχίες Συνοριακών άκρων διαφόρων πλασμιδίων Τι και consensus sequence. ptic58 (nopaline Ti) * LB:TGgCAGGATATATATTGtgGtGTAAAC RB:TGaCAGGATATATATTGgcGgGTAAAC nopaline Ti LB:ggTGGCAGGATATATtgtggTGTAAAC RB:ttTGGCAGGATATATtggcggGTAAAC ptiach5(octopine Ti)TL-LB:ggcGGCAGGATATATtcaatTGTAAAc TL-RB:acTGGCAGGATATATaccgtTGTAATt TR-LB:ggtGGCAGGATATATcgaggTGTAAAa TR-RB:gaTGGCAGGATATATcgaggTGTAATa Ri plasmid CONSENSUS TL-LB:ggTGGCAGGATATATtgtgaTGTAAAa TL-RB:acTGaCAGGATATATgttccTGTcAtg xxtggcaggatatatxxxxxtgtaaa/t

34 Η γονιδιακή περιοχή Vir του πλασμιδίου Τι εν δράσει: Τα οπερόνια VirA,B,C,D,E,F,G επάγονται από φαινολυκά συστατικά του φυτού, μονόκλωνες αλυσίδες του Τ-DNA παράγονται με συνεργασία των πρωτενών πρωτεϊνη virc, VirD1 & 2, και «συσκευάζονται για μετακόμιση» από τη πρωτεϊνη VirE2 και μεταφέρονται στο φυτικό κύτταρο μέσω της συζευκτικής γέφυρας που δομούν οι πρωτεϊνες VirB1-11

35 Χαρακτηριστικά ενσωμάτωσης T-DNA Αντίθετα με τα μεταθετά στοιχεία το T-DNA δεν κωδικοποιεί για ενζυμικές δραστικότητες ικανές για εισαγωγή και ένθεση Hενσωμάτωση πρέπει να γίνετε από ένζυμα του ξενιστή (επιδιορθωτικοί μηχανισμοί DNA?) Στη ζύμη η ενσωμάτωση γίνεται με ομόλογο ανασυνδυασμό Η ενσωμάτωση γίνεται πριν την σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας?

36 H ενσωμάτωση του T-DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή γίνετε σε σχετικά- τυχαίες θέσεις με βάση αναλύσεις σε χιλιάδες φυτά. Η ενσωμάτωση πιστεύετε ότι συμβαίνει με μη κανονικό ανασυνδυασμό (illegitimate recombination). Φαίνεται να υπάρχει συσχέτιση μεταξύ συχνότητας ενσωμάτωσης και κυτταρική διαίρεση Τα γενετικά τροποποιημένα από Αγροβακτηρίδιο κύτταρα φέρουν συνήθως ένα αντίγραφο του T-DNA στο γονιδίωμα τους αν και έχουν παρατηρηθεί και πολλαπλά αντίγραφα διάσπαρτα στο γονιδίωμα.

37 Distribution of T-DNA insertions across the Arabidopsis genome. Analysis of 225,000 independent events Alonso et al Science 301:653 (2003)

38 Φυτικά γονίδια που εμπλέκονται στην ενσωμάτωση του T-DNA Υπάρχουν αρκετά φυτικά γονίδια που φαίνεται ότι είναι απαραίτητα για την μόλυνση από το Αγροβακτηρίδιο. Προφανώς ο ρόλος τους σο κύτταρο είναι άλλος και απλώς χρησιμοποιούνται από τον εισβολέα Έχουν βρεθεί μεταλλάγματα στο Arabidopsis σε διάφορους γενετικούς τόπους που επηρεάζουν, περισσότερο ή λιγότερο την μόλυνση από το Αγροβακτήριο (Reduced efficiency Agrobacterium transformation mutants (rat mutants) (Gelvin 2001)

39 From Covey & Grierson

40 Τα γονίδια τοξικότητας (vir) 8 οπερόνια Α-Η: Vir A αισθητήρας σινιάλου ενεργοποιεί την πρωτεΐνη G VirG επάγει την τοξικότητα (ενεργ. Vir γονιδίων) Vir D 1,2, C 1 αποκοπή μονόκλωνου T-DNA Vir D 2, Σύνδεση με το 5 άκρο (RB) του T-DNA VirE2, Συνδέεται με το ssdna (προστασία) Άλλες VirD προωθούν το DNA στο φυτό

41 Τα γονίδια τοξικότητας (vir), συνέχεια VirB- 11 πρωτεΐνες σχετιζόμενες με τον συζευκτικό πόρο VirD2 VirE2 Σχετίζονται και με την μεταφορά στον πυρήνα

42

43 Hypothetical model for virb membrane channel From P. Zambryski

44 Άλλοι καθοριστικοί ως προς την ικανότητα μόλυνσης παράγοντες μπορεί να είναι: i) Η ευαισθησία ή εξειδίκευση των VirA πρωτεϊνών ii) Άλλα vir γονίδια iii) Τα ογκογονίδια μπορεί να μην είναι συμβατά με το ξενιστή

45 Γενετική Μηχανική Φυτών και Αγροβακτήριο Το T-DNA ενσωματώνεται μέσα στο γονιδίωμα Κανένα από τα γονίδια που βρίσκονται μέσα στο T-DNA δεν είναι απαραίτητο για την μεταφορά και ενσωμάτωση Μόνο τα όρια του T-DNA και οι λειτουργίες vir είναι απαραίτητες

46 Τa Τεχνικά Προβλήματα Πώς μπορούν να διατηρηθούν οι λειτουργίες vir χωρίς να είναι το πλασμίδιο τεράστιο; Εάν απαλειφθούν τα γονίδια του όγκου πως θα ξέρουμε ποια κύτταρα τροποποιήθηκαν;

47 Σύστημα δυαδικών φορέων Στρατηγική 1. Μεταφορά του T-DNA σε ένα ξεχωριστό μικρό πλασμίδιο 2. Αφαιρούνται τα γονίδια aux (Τms) και cyt(tmr) 3. Εισάγεται κατάλληλο γονίδιο επιλογής 4. Τα γονίδια Vir διατηρούνται αλλά σε διαφορετικό πλασμίδιο μόνιμα μέσα στο στέλεχος

48 Σύστημα δυαδικών φορέων (συν.) 5. Εισάγεται το ΕΓ ανάμεσα στα δεξιά και αριστερά όρια 6. Και τα δύο πλασμίδια πρέπει να είναι ταυτόχρονα παρόντα στο Aγροβακτηρίδιο 7. Ο φυτικός ιστός συν-καλλιεργείται με τα Αγροβακτήρια

49 Πώς μπορούν να διατηρηθούν οι λειτουργίες vir χωρίς να είναι το πλασμίδιο τεράστιο; Οι λειτουργίες vir δε είναι ανάγκη να βρίσκονται in cis το Τ-DNA MCS disarmed Ti plasmid vir region + LB ori YFG RB kan R cloning vector plasmid

50 υαδικοί φορείς: τα γονίδια τοξικότητας μεταφέρονται σε δεύτερο πλασμίδιο που βρίσκεται στο ίδιο κύτταρο και δρουν in trans Separate vir and binary plasmids Cointegrating vector Binary vector Vir plasmid Agrobacterium Cointegrating vector T-DNA T-DNA Plant Cell

51 Transfering the binary vector to agrobacterium via triparental mating. One E. coli strain carries a self-transmissible plasmid ( helper ) which is transferred (by a process known as conjugation ) to the other E. coli strain carrying the vector plasmid on which the transgene cassette is already assembled. The helper plasmid provides the conjugation mechanism for the vector plasmid, promoting its mobilization into agrobacterium.

52 Εάν απαλειφθούν τα γονίδια του όγκου πως θα ξέρουμε ποια κύτταρα τροποποιήθηκαν; Γονίδια επιλογής Μόνο ένα μικρό μέρος από τα κύτταρα μετασχηματίζεται MCS Πρέπει να χρησιμοποιηθούν γονίδια τα οποία θα εξασφαλίζουν ότι τα μετασχηματισμένα ζουν τα άλλα πεθαίνουν. = επιλογή LB orι YFG RB kan R cloning vector plasmid

53 Τα πρώτα γονίδια επιλογής ήταν γονίδια ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά Ορισμένα αντιβιοτικά που δρουν στα βακτηρίδια νεκρώνουν και φυτικά κύτταρα (οργανίδια) kanamycin hygromycin Υπάρχουν όμως και βακτηριδιακά γονίδια που μεταβολίζουν το αντιβιοτικό Π.χ. neomycin phosphotransferase II (nptii; kan R ) Η έκφραση ενός τέτοιου γονιδίου στα φυτικά κύτταρα τα καθιστά ανθεκτικά στο αντιβιοτικό και συνεπώς το nptii μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως παράγοντας επιλογής

54 Νεώτερα γονίδια επιλογής: Γονίδια ανθεκτικότητας σε ζιζανιοκτόνα - glyphosate tolerance (mod. EPSP synthase) - phosphinothricin tolerance (converted) Γονίδια μετατροπής του μεταβολισμού - phosphomannose isomerase - D-amino acid oxidase

55 LB MCS YFG + kan R RB kan R ori cloning vector plasmid Τα γονίδια που θα εισαχθούν στον πυρήνα πρέπει να εκφραστούν επαρκώς στον πυρήνα Οι συχνότεροι υποκινητές που χρησιμοποιούνται σήμερα είναι ο nos (γονίδιο της nopaline synthase) και ο CaMV35S (από τον ιό CaMV)

56 Εισαγωγή επιθυμητού γονιδίου (ΕΓ) Κάθε γονίδιο που εισάγεται για έκφραση πρέπει να έχει: κατάλληλο εκκινητή και καταληκτική αλληλουχία κατάλληλη αλληλουχία έναρξης μετάφρασης Χρήση κωδικονίων φυτικού τύπου. Μπορούν να εισαχθούν ταυτόχρονα πολλά γονίδια σε έναν μετασχηματισμό αλλά: Όσο πιο μεγάλο το T-DNA τόσοπιοδύσκολοηενσωμάτωση Όσο πιο μεγάλος ο φορέας τόσο πιο δύσκολος ο χειρισμός

57 Άμεση μεταφορά DNA Εισαγωγή γυμνού DNA στα κύτταρα και μετά επιλογή μετασχηματισμένων Εισαγωγή DNA : 1. Ηλεκτροπόρωση 2. Βομβαρδισμός σωματιδίων (Βιο-βαλιστική) 3. Χημική εισαγωγή (PEG)

58 Ηλεκτροπόρωση Χρησιμοποιούνται κύτταρα χωρίς τοιχώματα (πρωτοπλάστες) Εφαρμόζεται ηλεκτ. Πεδίο υψηλού voltage, το οποίο προκαλεί πρόσκαιρους πόρους στη μεμβράνη επιτρέποντας στο DNA να εισέλθει στο κύτταρο Χρησιμοποιείται στα μονοκότυλα (καλαμπόκι, ρύζι) Μειονέκτημα: πολύ δύσκολη η αναγέννηση από πρωτοπλάστες

59 Electroporation Overview of method Many variables need optimizing Protoplast density 2 x 10 6 ml -1 Plasmid concentration 200μg/mL Removal of cell walls not always necessary 1.5 kv Plasmid size 3-6 Kb Ion concentration KCl 125 mm Examine cells for activity of transgene (e.g. GUS expression)

60 Isolated protoplasts on a hemocytometer

61

62

63 Χημικά επαγόμενος μετασχηματισμός Συνήθως εφαρμόζεται σε πρωτόπλαστες ιάφορα πρωτόκολλα: 1. Εισαγωγή του DNA σε τεχνητές μεμβράνες (λιποσώματα), που θα συντηχθούν με την κυτ. μεμβράνη 2. Πρόσδεση του DNA με πολύ-κατιόντα (PEG) για την εξουδετέρωση φορτίων, ορισμένα κύτταρα θα εισάγουν με ενδοκυτ. το σύμπλοκο 3. Συνδυασμός των 1 και 2

64 Βομβαρδισμός σωματιδίων Λιγότερα εμπόδια από την ηλεκτροπόρωση Μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε οποιοδήποτε ιστό Μπορεί να τροποποιήσει οργανίδια Αρχές Μεθόδου: 1. Κατακρήμνιση DNA σε μικρά ( μm) σφαιρίδια βολφραμίου ή χρυσού (ειδικό βάρος+ανενεργότητα) 2. Επιτάχυνση σωματιδίων σε ιστούς 3. Επιλεκτική αναγέννηση όπως και για το Αγροβακτηρίδιο

65 Original biolistic gun. DNA is bound to the microprojectiles, which impact the tissue or immobilized cells at high speeds. From J. Sanford et al.

66

67 Particle bombarment using helium powered gene gun Helium gas Overview of method Rupture disk Macroprojectile Target cell Stops macroprojectile DNA-coated micocarrers 1. Bombard cells with DNA-coated microbeads 2. Detect activity of GUS-fusion proteins by adding X-Glc - Dos not require cell culture or pre-treatment of recipient tissue - Technique currently favored for transformation of monocots

68 Particle bombardment Biolistic Gun

69

70 Σύγκριση Αγροβακτηριδίου/Βαλλιστικής Ι. Αγροβακτήριο Λίγες ενθέσεις ανά μετασχηματισμό Σχετικά εύκολη διαδικασία (σε κάποια φυτά) Σχεδόν τυχαία ένθεση Μίμηση «φυσικού» τρόπου ένθεσης Μειονεκτήματα: εν τροποποιεί όλα τα φυτικά είδη

71 Σύγκριση Αγροβακτηριδίου/Βαλλιστικής ΙΙ. Βαλλιστική Εφαρμόσιμη σε κάθε είδος ιστού Μετασχηματίζει και οργανίδια Εύκολη Μειονεκτήματα: Πολλαπλές ενθέσεις, συχνά πολύπλοκες Σχετικά ακριβή

72 ύο Στρατηγικές εκτοπικής έκφρασης: Α. Παροδική έκφραση (transient expression) Αγροεμποτισμός (Agroinfiltration) Ιικοί φορείς Β. Σταθερή έκφραση Γενετική τροποποίηση

73

74 Overexpression of GFP on a GFP expressing plant by Agroinfiltration

75 Agroinfiltration of GFP-Virp1 fusion I. Whole leaf

76 Agroinfiltration of GFP-Virp1 fusion II. protoplasts

77 Αναγέννηση μετασχηματισμένων φυτών Αρχές: Τα φυτικά κύτταρα είναι πολυδύναμικά (polypotent) H ανάπτυξή τους δεν είναι προκαθορισμένη και μπορεί να τροποποιηθεί ορμονικά Υπάρχει η δυνατότητα να οδηγηθούν προς αναγέννηση μόνο εκείνα τα κύτταρα που είναι μετασχηματισμένα

78 Eξαίρεση: η γενετική τροποποίηση του Arabidopsis που γίνεται με εμβάπτιση των άνθεων. Ακολουθεί επιλογή των σπόρων που περιέχουν τουλάχιστον ένα διαγονίδιο

79 ύο γενικές κατευθύνσεις: Α. Αναγέννηση μέσω de novo οργανογένεσης Β. Αναγέννηση μέσω εμβρυογένεσης

80 orange cells are transformable blue cells can be regenerated black cells can regenerate transformants

81 GERMINATION The surface-sterilized tomato seeds are placed in a petri dish with nutrient medium for germination

82 CUT EXPLANTS After 7 days, the tomato seedings are at the stage where the cotyledons (explants) can be cut for use in transformation.

83 CUT EXPLANTS The cotyledon explants are cut from the seedlings in liquid MS. The wounded cells made by cutting will be the site of DNA transfer from the Agrobacterium. EXPOSE TO AGROBACTERIUM After overnight preconditioning on the feeder plates, the explants are competent for transformation and are exposed to the agrobacterium.

84 BLOT EXCESS AGROBACTERIUM Excess agrobacterium is blotted from the explants on filter paper to avoid excess growth of the bacteria during cocultivation. DNA TRANSFER The explants are co-cultivated with the agrobacterium for 48 hours to allow time for the agrobacterium to transfer the engineered DNA to the wounded plant cells.

85 TOMATO PLANT REGENERATION The explants are placed on a medium containing antibiotics for selection and control of the Agrobacterium. The medium also contains the growth regulator, zeatin riboside. Here the formation of an initial callus can be seen on the explant. The callus occurs at the site of wounding and is a result of stimulated plant cell growth caused by the growth regulator, zeatin riboside. Time point: 3 weeks

86 SHOOTS BEGIN After 6 weeks the cotyledon explants are cut from the calli and discarded. Shoots are beginning to form and are transferred to fresh MSZ media. ROOTING MEDIA The tomato shoots have regenerated from the calli and are ready to be transferred to rooting media. This media lacks zeatin, but contains kanamycin for selection of transformants. Time point: 9 weeks

87 TRANSGENIC PLANTS These are fully differentiated transgenic tomato plants rooting in MS media with kanamycin. Time point: 11 weeks

88 TRANSFER TO SOIL Rooted plantlets are then transferred to boxes containing soil. The plants must be acclimated to the air, or "hardened off". The process takes 4-5 days. Time point: 13 weeks

89 TO THE GREENHOUSE These transgenic plants are ready for transfer to the greenhouse. Shown are two cultivars of tomato; Moneymaker (left), and Motelle (right). Both contain engineered genes. Time point: 15 weeks

90 A GREENHOUSE OF TRANSGENIC PLANTS. Plants and growth conditions are carefully monitored and controlled. The plants are used for analysis, seed production, or are transplanted to the field.

91 Particle bombardment Biolistic Gun Ubiquitin promoter which is monocot specific controlling a bacterial reporter gene, gusa, in transgenic rice.

92

93 Reporter gene under tissue specific promoter a-amylase promoter which is endosperm specific controlling a bacterial reporter gene, gusa, in transgenic rice. The blue stain, is expressed to peak levels at day 6 in the germinating transgenic seed.

94 Expected and unexpected effects of plant transformation Insertion locus effects

95 Expected and unexpected effects in plant transformationsomaclonal variation

96 r/pgrppage.html

97 Expected and unexpected effects of plant transformation Insertion locus effects