ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ "ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ"

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ "ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ" Reymera A. et al Μοριακές Αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης RAD51 με τις πρωτεΐνες BRCA2 και p53 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της ΣΤΕΛΛΑΣ Α. ΑΤΖΑΜΟΓΛΟΥ (Μαθηματικός Ε.Κ.Π.Α.) ΑΘΗΝΑ 2012 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

2 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ "ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ" Μοριακές Αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης RAD51 με τις πρωτεΐνες BRCA2 και p53 ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ της ΣΤΕΛΛΑΣ Α. ΑΤΖΑΜΟΓΛΟΥ (Μαθηματικός Ε.Κ.Π.Α.) Επιβλέποντες: Καθ. Δρ. Κωνσταντίνος Βοργιάς & Καθ. Δρ. Σταύρος Χαμόδρακας Τριμελής Επιτροπή: Δρ. Κ. ΒΟΡΓΙΑΣ Δρ. Σ. ΧΑΜΟΔΡΑΚΑΣ Δρ. Β. ΟΙΚΟΝΟΜΙΔΟΥ Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α. Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α. Λέκτορας Ε.Κ.Π.Α. ΑΘΗΝΑ Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

3 Αφιερώνεται Στη πολυαγαπημένη μου κόρη Μαντώ και στην οικογένειά μου. Καθώς και στους Βοργιά Κωνσταντίνο Μεγαλοφώνου Περσεφόνη Μπούτου Ευφροσύνη Παπανδρέου Νικόλαο Παπατριανταφύλλου Μαρία Χαμόδρακα Σταύρο που με ενεθάρρυναν, με τον τρόπου τους ο καθένας, στην προσπάθεια αυτή. Ευχαριστώ! Στέλλα Ατζαμόγλου Οπαδός της "Διά βίου παιδείας", και όχι της στείρας "Διά βίου μάθησης". Δηλαδή της αδιάκοπης προσπάθειας του ανθρώπου για την εφαρμογή του οράματος, της ολοκλήρωσης του ως ατομική ύπαρξη, ως πολιτικό-κοινωνικό και διαλεκτικό όν, ως μονάδα, στην εξελικτική πορεία του συνόλου των όντων, τη δεδομένη χρονική στιγμή (συνθήκες), με άσβεστη έμπνευση που συνεπάγεται αυξημένη διάκριση και επομένως δημιουργική ευτυχία και όχι με τυφλό πάθος που συνεπάγεται στιγμιαία ευχαρίστηση κ.π.α.!! 3 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η επιβίωση και η αναπαραγωγή των οργανισμών εξαρτάται από τη γενετική τους σταθερότητα. Η σταθερότητα επιτυγχάνεται: (α) μέσω της εξαιρετικά ακριβούς αντιγραφής του DΝΑ, (β) μέσω της επιδιόρθωσης των λαθών που γίνονται κατά την αντιγραφή και των τυχαίων βλαβών που συμβαίνουν συνεχώς στο DΝΑ. Η RAD51 είναι η πρωταγωνίστρια πρωτεΐνη της επιδιόρθωσης του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό (Homologous Recombination-HR), του αλάνθαστου μηχανισμού επιδιόρθωσης της πιο επικίνδυνης βλάβης του DNA, της θραύσης και των δύο αλυσίδων του (Double Stranded Breaks). Η αδυναμία επιδιόρθωσης των DSBs οδηγεί σε χρωμοσωμικές αλλοιώσεις και μπορεί να οδηγήσει σε αστάθεια του γονιδιώματος που συνδέεται με καρκινογένεση, γήρανση και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Η RAD51 είναι μια υψηλά συντηρημένη πρωτεΐνη, απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων για την οποία δεν έχουν ανιχνευθεί μεταλλάξεις σε καρκίνους του ανθρώπου. Λόγω της εξελικτικής σύγκλισης της λειτουργίας των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA με HR, αντικείμενο της συγκεκριμένης εργασίας αποτέλεσε: (α) η αναλυτικότερη μελέτη της σχέσης δομήςλειτουργίας πρωτεϊνών - κλειδιών που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA με HR (RAD51, BRCA2 και p53), (β) η μελέτη των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης RAD51 με τις πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη λειτουργίας της, κατά τον HR (BRCA2 και p53), (γ) ο εντοπισμός των σημαντικών καταλοίπων της πρωτεΐνης RAD51 καθοριστικών για τη παραπάνω αλληλεπίδραση και (δ) η διαπίστωση ύπαρξης, στη πρωτεΐνη RAD51, ετερόκλητης, πολλαπλού σκοπού, περιοχής αλληλεπίδρασης. Η πολυδυναμική αναγνώριση μοριακών στόχων, συμπεριλαμβανομένων άλλων πρωτεϊνών, πεπτιδίων και DNA είναι απαραίτητη για τη σωστή λειτουργία της πρωτεΐνης ως ρεκομπινάση που αποτελεί ακόμη τη "δικλείδα ασφαλείας" της ρύθμισης του HR του DNA. SUMMARY Molecular Interaction of RAD51 protein with BRCA2 and p53 proteins. Survival and reproduction of organisms depends on their genetic stability. The stability is achieved a) by means of highly accurate DNA replication, and b) through the repair of rare errors made during replication and spontaneous accidental damages occurring continuously in DNA. RAD51 is the Leading Protein in DNA repair via Homologous Recombination (HR) - the Error Free DNA Repair Mechanism of the most dangerous DNA damages - Double Strand Breaks (DSB). The inability to repair DSBs leads in chromosomal lesions that can lead to genome instability associated with carcinogenesis or aging, or programmed cell death. The RAD51 is a highly conserved protein essential for the survival of cells for which no mutations have been detected in human cancers. Because of the evolutionary convergence of function of proteins involved in DNA repair by HR, object of this work was: (a) the detailed study of structure-function relationship of key proteins involved in DNA repair by HR (RAD51, BRCA2 and p53), (b) studying the interaction of RAD51 protein with proteins that regulate her operation during HR (BRCA2 and p53), (c) the identification of important residues of the protein RAD51, the key for the above interaction and (d) the detection of existence of a multipurpose promiscuous binding site in RAD51 protein, necessary for the proper function of the protein as recombinase and as "safety valve" of regulation of HR of DNA. 4 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η αέναη προσπάθεια του ανθρώπου για αποκατάσταση της υγείας του σώματος ξεκινά στο πολύ μακρινό παρελθόν του ανθρώπου και φτάνει μέχρι και σήμερα. Η προσπάθεια αυτή κινείται με ιλιγγιώδεις ρυθμούς κάνοντας χρήση της τεχνολογίας της οποίας η εξέλιξη είναι και αυτή ιλιγγιώδης. Επειδή όμως "ουδέν καλό αμιγές κακού", οι παραπάνω θετικές προοπτικές έδωσαν και το έναυσμα να ξεπηδήσουν τα τελευταία χρόνια στο Δυτικό κόσμο νέα φουτουριστικά ρεύματα, που υποστηρίζουν τη χρήση των νέων τεχνολογιών για τη δημιουργία ενός "Trans human", στον οποίο η αλληλεπίδραση εγκεφάλου-υπολογιστών και η νευροφαρμακολογία θα ενισχύσουν τη νοημοσύνη του, ενώ ο στενός έλεγχος των βιοχημικών διαδικασιών θα βελτιώσει τις επιδόσεις του σώματος, προσφέροντας ισχυρότερους μύες, πιο ευέλικτες αρθρώσεις και πιο οξυμένες αισθήσεις. Το σενάριο αυτό μπορεί ωστόσο να αποκτήσει τρομακτικές διαστάσεις στην περίπτωση που η χρήση της τεχνολογίας δε γίνει για αποκατάσταση και θεραπεία, αλλά για την ανεξέλεγκτη και αμετροεπή επέκταση των ανθρώπινων δυνατοτήτων. Και ιδιαίτερα όταν η επέκταση αυτή γίνεται αυτοσκοπός, καθώς σύμφωνα με τους υποστηρικτές της "προκειμένου να επιβιώσουμε θα πρέπει να νευρομεταμοσχευθούμε, να βιο-συγκολληθούμε και να υπερμοφοποιηθούμε στην πιο στενή συμβίωση με τον βιο-μηχανικό και ηλεκτρονικό κόσμο.". Η κουλτούρα αυτή αντανακλά, ωστόσο, ένα βαθύτερο φόβο ότι για να επιζήσουμε θα πρέπει να γίνουμε ισχυρότεροι και από τις μηχανές, όπως οι πρωτόγονοι άνθρωποι έπρεπε να γίνουν ισχυρότεροι από τα θηρία και δυστυχώς προϋποθέτει και τη "μετάλλαξη" του ίδιου του ανθρώπινου ψυχισμού, με την υιοθέτηση ενός άκαρδου πνεύματος επιβίωσης που ακυρώνει κάθε ίχνος ανθρωπιάς. Όμως ας αφήσουμε το "κακό" του γνωμικού και ας εστιάσουμε στο "καλό". Οι ιλιγγιώδεις ρυθμοί ανάπτυξης των επιστημών και η μεταξύ τους συνεργασία, είναι αρωγοί στην προσπάθεια του ανθρώπου να αντιμετωπίσει την ασθένεια του σημερινού τρόπου ζωής μας: τον "Καρκίνο". Η προέλευση της λέξης Καρκίνος, αποδίδεται στον Έλληνα ιατρό Ιπποκράτη, που έμεινε στην ιστορία ως "ο πατέρας της ιατρικής". Ο Ιπποκράτης χρησιμοποίησε τους όρους "καρκίνος" και "καρκίνωμα" για να περιγράψει διάφορους όγκους που εμφάνιζαν εσωτερικά ή εξωτερικά έλκη και διογκώσεις. Στην Ελληνική γλώσσα οι λέξεις αυτές αναφέρονται στα καβούρια, τα οποία θυμίζουν τον καρκίνο, αφού οι ακτινωτές μεταστάσεις των καρκινικών κυττάρων, φέρνουν αμυδρά στο μυαλό τη μορφή που έχουν τα πόδια και οι δαγκάνες του καβουριού. Ο καρκίνος (όγκος) είναι η ανώμαλη ανάπτυξη κύτταρων με αποτέλεσμα τη δημιουργία όγκων σε διάφορα σημεία του σώματος. Η ανώμαλη αυτή λειτουργία δεν πρέπει να συγχέεται με δυο φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού: Την αναγέννηση των ιστών που συμβαίνει όταν αφαιρείται ιστός και ο οργανισμός ξανά φτιάχνει τον ίδιο ιστό (π.χ. στην καταστροφή των ηπατικών κύτταρων, το ήπαρ αναγεννάτε σε 6 μήνες όπως ήταν αρχικά). Την υπερπλασία που συμβαίνει σε ανάγκη του οργανισμού να αναπτύσσει φυσιολογικούς ιστούς (π.χ. υπερπλασία του ενός νεφρού όταν υπάρχει έλλειψη του άλλου). Με τον όρο "καρκίνος" περιγράφεται μία ομάδα νοσημάτων, που η αιτία τους 5 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

6 βρίσκεται σε κυτταρικό επίπεδο (Πηγή: /whatiscancer). Ο όρος αναφέρεται στην υπερβολική, χωρίς προγραμματισμό, ανάπτυξη κυττάρων του οργανισμού, που ήταν φυσιολογικά, μέχρι τη στιγμή της έναρξης της διαδικασίας καρκινογένεσης. Οργανικά, ο καρκίνος είναι μία ασθένεια των κυττάρων. Συνεπώς, η κατανόηση του καρκίνου προϋποθέτει μία μικρή αναφορά σχετικά με το τι συμβαίνει όταν φυσιολογικά κύτταρα μετατρέπονται σε καρκινικά. Πως φυσιολογικά κύτταρα μετατρέπονται σε καρκινικά. Ο ανθρώπινος οργανισμός αποτελείται από κύτταρα. Όλα τα κύτταρα προέρχονται από άλλα κύτταρα. Ο μοναδικός τρόπος για να παραχθεί ένα νέο κύτταρο είναι με διαίρεση ενός προϋπάρχοντος κυττάρου. Φυσιολογικά, τα κύτταρα αναπτύσσονται και διαιρούνται, ώστε να προκύψουν νέα, θυγατρικά, κύτταρα και να διατηρηθεί η υγεία του οργανισμού. Μερικές φορές, η διαδικασία αυτή εκτρέπεται από το φυσιολογικό, οπότε προκύπτουν νέα κύτταρα, όχι όμως θυγατρικά των γονικών κυττάρων, χωρίς να τα χρειάζεται ο οργανισμός. Παράλληλα, τα γονικά κύτταρα παραμένουν. Τα πλεονάζοντα κύτταρα σχηματίζουν μάζες, που καλούνται όγκοι. Σε μερικές περιπτώσεις αυτά τα παθολογικά κύτταρα κάνουν μετάσταση, δηλαδή εξαπλώνονται και σε άλλα μέρη του σώματος δημιουργώντας δευτερεύοντες όγκους (μεταστατικούς όγκους) παρόμοιους με αυτούς του αρχικού καρκίνου. Ο καρκίνος συνήθως δεν επηρεάζει μόνο ένα όργανο του σώματος και δεν έχει μία μορφή. Μπορεί να περιλαμβάνει οποιοδήποτε ιστό του σώματος και να έχει τελείως διαφορετική μορφή σε κάθε σημείο του σώματος. Υπάρχουν πάνω από 200 διαφορετικά είδη καρκίνου και δεν αντιμετωπίζονται όλοι με τον ίδιο τρόπο. Κάθε ένα είδος έχει τον δικό του τρόπο θεραπευτικής αντιμετώπισης. Οι περισσότερες μορφές καρκίνου είναι στην ουσία όγκοι. Εξαίρεση αποτελεί η λευχαιμία, τύπος καρκίνου όπου τα καρκινικά κύτταρα κυκλοφορούν μέσα στο αίμα και στα όργανα και τελικά αναπτύσσονται σε συγκεκριμένους ιστούς. Οι όγκοι μπορεί να είναι καλοήθεις ή κακοήθεις. Δεν είναι όμως όλοι οι όγκοι επικίνδυνοι. Οι καλοήθεις όγκοι δεν ονομάζονται καρκινικοί, δεν κάνουν μετάσταση και δεν είναι επικίνδυνοι για τη ζωή του ατόμου. Άλλοι ιατρικοί όροι που χρησιμοποιούνται για να υποδείξουν την ύπαρξη καρκινικής νόσου είναι οι όροι κακοήθης όγκος, καρκίνωμα και νεόπλασμα. Εάν δεν θεραπευθούν, οι καρκίνοι μπορούν τελικά να προκαλέσουν το θάνατο. Η επιβίωση των ασθενών με καρκίνο έχει βελτιωθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια. Ο καρκίνος αποτελεί την δεύτερη αιτία θανάτου στις ανεπτυγμένες χώρες μετά τα καρδιαγγειακά νοσήματα. Οι περισσότεροι καρκίνοι μπορούν να θεραπευθούν. Πολλοί θεραπεύονται, ειδικά εάν η θεραπεία αρχίσει νωρίς! Ο καρκίνος του μαστού. Ο καρκίνος του μαστού συγκαταλέγεται ανάμεσα στις συχνότερες μορφές καρκίνου που εμφανίζονται στο γυναικείο πληθυσμό. Αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες της μέσης ηλικίας, ενώ στις Ην. Πολιτείες, τη δυτική Ευρώπη και την Ελλάδα 1 στις 9 γυναίκες προσβάλλεται από την ασθένεια. Ο τρόπος ζωής, οι περιβαλλοντικές συνθήκες αλλά και η οικογενειακή προδιάθεση αποτελούν μερικούς από τους παράγοντες κινδύνου εμφάνισης της νόσου. Μόνο ένα μικρό ποσοστό που αφορά το 5-10% των περιπτώσεων, αναφέρεται στον οικογενή καρκίνο και οφείλεται σε μεταλλαγές γονιδίων που σχετίζονται 6 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

7 με την ασθένεια. Κάθε χρόνο, διαγιγνώσκονται στην Ευρώπη 3,2 εκατομμύρια καρκίνοι ( κυρίως του μαστού, του παχέος εντέρου και του ορθού ή του πνεύμονα. Παρά την πρόοδο που σημειώνεται στην έρευνα και τη θεραπεία της ασθένειας αυτής, ο καρκίνος παραμένει σοβαρή μάστιγα για την υγεία. Η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει αναλάβει πρωτοβουλίες σε διάφορα επίπεδα για να σώσει ζωές αλλά και για να βελτιώσει την ποιότητα ζωής των καρκινοπαθών. Η γενική υγεία μπορεί να βελτιωθεί, και ως εκ τούτου να αποφευχθούν ορισμένα είδη καρκίνου, με την υιοθέτηση υγιεινότερου τρόπου ζωής. Σημαντικό ρόλο στην έγκαιρη διάγνωση και τη θεραπεία της ασθένειας παίζει επίσης η εφαρμογή προγραμμάτων προσυμπτωματικού ελέγχου. Θέμα της διπλωματικής εργασίας και Ευχαριστίες. Η παρούσα διπλωματική εργασία ασχολείται με τρεις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στους μηχανισμό ελέγχου της κυτταρικής διαίρεσης και σχετίζονται με καρκίνο. Τα γονίδια αυτών των πρωτεϊνών ονομάζονται ογκοκατασταλτικά. Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος "Βιοπληροφορική" που οργανώνει το τμήμα της Βιολογίας του Εθνικού & Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών (Ε.Κ.Π.Α.). Η εκπόνηση της διπλωματικής εργασίας έγινε υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Δρ. Κωνσταντίνου Βοργιά, του τομέα Βιοχημείας-Μοριακής Βιολογίας του τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α. και της Δρ. Ευφροσύνης Μπούτου, τους οποίους ευχαριστώ θερμά για την καθοδήγηση, την συμπαράσταση και τις συμβουλές τους. Ακόμη θα ήθελα να ευχαριστήσω όλο το διδακτικό προσωπικό του Μεταπτυχιακού Προγράμματος για τις γνώσεις που μου πρόσφεραν και για την βοήθεια τους (άμεση ή έμμεση), την Επίκ. Καθηγήτρια Περσεφόνη Μεγαλοφώνου του τομέα Ζωολογίας Θαλάσσιας Βιολογίας, του τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α. που ήταν αυτή που με ενθουσιασμό, με πληροφόρησε για το συγκεκριμένο μεταπτυχιακό, την Καθηγήτρια Μαρία Παπατριανταφύλλου, του τομέα Άλγεβρας και Γεωμετρίας του τμήματος των Μαθηματικών του Ε.Κ.Π.Α. που με ενεθάρρυνε, τον Δρ. Νικόλαο Παπανδρέου για την βοήθεια και τις υποδείξεις του. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Δρ. Σταύρο Χαμόδρακα, καθηγητή Βιοφυσικής - Μοριακής Βιοφυσικής και Υπολογιστικής Βιολογίας/Βιοπληροφορικής και διευθυντή του τομέα Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής του Τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α., για την έμπνευση και τις γνώσεις που μου μετέδωσε. Ευχαριστώ τον κο Παναγιώτη Καστρίτη, ερευνητή στο Εργαστήριο Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού, στο Τμήμα Χημείας, στο Πανεπιστήμιο της Ουτρέχτης, για τη βοήθειά του στο αρχικό "docking" των πρωτεϊνών p53 & RAD51. Και τέλος, ευχαριστήσω θερμά, τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, για χρόνο που διέθεσαν για την αξιολόγηση της εργασίας αυτής. 7 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

8 ΣΤΟΧΟΙ Οι στόχοι της παρούσης διπλωματικής εργασίας είναι: α) η αναλυτικότερη μελέτη της σχέσης δομής-λειτουργίας πρωτεϊνών- κλειδιών που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό (RAD51, BRCA2 και p53), β) η μελέτη των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης RAD51 με τις πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη λειτουργίας της, κατά τον ομόλογο ανασυνδυασμό (BRCA2 και p53) και γ) ο εντοπισμός των σημαντικών καταλοίπων της πρωτεΐνης RAD51, των καθοριστικών, για τη παραπάνω αλληλεπίδραση. Η εργασία είναι χωρισμένη στα κάτωθι μέρη: ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Περιγράφονται οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA και οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Περιγράφονται οι πρωτεΐνες που παίρνουν μέρος στην επιδιόρθωση του DNA μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Μετά γίνεται βασική περιγραφή των τριών πρωτεϊνών RAD51, BRCA-2 και p53 με τις αλληλεπιδράσεις των οποίων καταπιάνεται η εργασία αυτή. Στη συνέχεια παρουσιάζονται οι αλληλεπιδράσεις της RAD51 με την BRCA-2 και την p53 αντίστοιχα. ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Περιγράφονται τα προγράμματα και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν. Παρατίθενται τα συμπεράσματα της εργασίας. Ακολουθούν συνοπτική λίστα των Εικόνων και των Πινάκων της εργασίας και η Βιβλιογραφία. 8 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ... 5 Θέμα της διπλωματικής εργασίας και Ευχαριστίες ΣΤΟΧΟΙ... 8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 9 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ & ΔΙΕΥΚΡΙΝΙΣΕΙΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Α. Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο Α.1 Διαίρεση ή θάνατος κατά το "Νικάν ή θνήσκειν" Α.2 Φάσεις του Κυτταρικού Κύκλου Β. Κυκλίνες & Κινάσες ρύθμιζουν το κυτταρικό κύκλο Γ. Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) Γ.1 Το σημείο ελέγχου G Γ.2 Το σημείο ελέγχου S (intra-s checkpoint) Γ.3 Το σημείο ελέγχου G Γ.4 Ενεργοποίηση, Ρύθμιση και Τροποποίηση της δράσης της p ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Α. Γενικά Β. Απόπτωση-Νέκρωση Β.1 Βιοχημικά Μονοπάτια της Απόπτωσης Γ. Γήρανση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΒΛΑΒΕΣ και ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ του DNA Α. Γενικά Β. ΛΑΘΗ στο DNA Γ. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ - ΑΙΤΙΑ ΒΛΑΒΩΝ ΤΟΥ DNA Δ. ΕΙΔΗ ΒΛΑΒΩΝ ΣΤΟ DNA ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗΣ του DNA Α. Γενικά Β. Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί του DNA Β.1 Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair-RR) Β.2 Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER) Β.3 Επιδιόρθωση μη συμπληρωματικής βάσης (Mismatch Repair-MMR) Β.4 Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair- NER) Β.5 Επιδιόρθωση δίκλωνων σχάσεων του DNA (μετα-αντιγραφική επιδιόρθωση) ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - Επιδιόρθωση DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό Α. Γενικά για τον Αvασυvδυασμό του DNA Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

10 Β. Επιδιόρθωση του DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό (HRR) Β.1 Ανίχνευση βλάβης και ενεργοποίηση της επιδιόρθωσης Γ. Φάσεις της επιδιόρθωσης της διπλής σχάσης του DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Αλληλεπίδραση πρωτεϊνών Α. Γενικά Β. Ορισμοί Β.1 Συγγένεια ή Συνάφεια - Εξειδίκευση Γ. Τύποι αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών Γ.1 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ ομο-ολιγομερών πρωτεϊνών Γ.2 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ ετερόλογων πρωτεϊνών Γ.3 Αλλά Είδη Αλληλεπιδράσεων Γ.3.1 Μη υποχρεωτικές και υποχρεωτικές αλληλεπιδράσεις - σύμπλοκα Γ.3.2 Παροδικές και μόνιμες αλληλεπιδράσεις - σύμπλοκα Δ. Πολυδυναμική αναγνώριση ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Πρωτεϊνικές Αλληλεπιδράσεις κατά την HRR Α. Αλληλεπιδράσεις κατά την επιδιόρθωση της DSB του DNA με HR Β. Αλληλεπιδράσεις Ανταλλαγής Κλώνων B.1 Η λειτουργία της RAD51 κατά την ανταλλαγή των DNA κλώνων Β.2 Διαμεσολαβητικές πρωτεΐνες του ανασυνδυασμού (recombination mediators) Β.3 Ρύθμιση της RAD Γ. RAD51 και Καρκίνος ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Δομές των πρωτεϊνών RAD51 p53 BRCA Α. Γενικά για τη δομή της πρωτεΐνης RAD B. Γενικά για τη δομή της πρωτεΐνης p Γ. Γενικά για τη δομή της πρωτεΐνης BRCA ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Αλληλεπίδραση της RAD51 με την BRCA Α. Αρχιτεκτονική και διασύνδεση-διεπαφή του RAD51-BRC4 συμπλόκου Β. Η ρύθμιση της λειτουργίας της RAD51 από τη BRCA Β.1 Η ρύθμιση της αυτο-συγκρότησης (self association) της RAD51 από τη BRCA Γ. BRC4 μεταλλάξεις που σχετίζονται με καρκίνο Γ.1 Πειραματικές μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη λειτουργία της RAD Δ. Αναστολή λειτουργίας RAD51 από πεπτίδιο από BRC-μοτίβο της BRCA ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Αλληλεπίδραση της RAD51 με την p Α. Γενικά Β. Η διεπαφή πρόσδεσης DNA του p53cd Α.Δ.Σ. δεσμεύει τα RAD51 Πεπτίδια Τα ηλεκτροστατικά συστατικά της πρόσδεσης Γ. Μια πολλαπλού σκοπού, ετερόκλητη θέση δέσμευσης Γ.1 Θέσεις δέσμευσης p53 και RAD Γ.2 Σύνοψη Θέσεων δέσμευσης p53 και RAD Δ. Συμπεράσματα για την ετερόκλητη θέση δέσμευσης στην p Δ.1 Αποφυγή μεταλλάξεων της p53 και σχεδιασμός φαρμάκων Δ.2 Ποια περιοχή στο p53cd θα μπορούσε να είναι στόχος για χημική ακόλουθο; Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

11 ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ Α. Γενικά Α. 1 Δευτεροταγής δομή της RAD51 (αα ) PDB: 1N0W Α.2 Δευτεροταγής δομή του N-Terminal Domain της RAD51 (αα 1-114) - PDB: 1B Α.3 Δευτεροταγής δομή της BRCA2 BRC4 repeat (αα )- PDB: 1N0W-b Α.4 Δευτεροταγής δομή της p53 (αα )- PDB: 2OCJ Β. Χρήση Jpred3 για ενδεικτική πρόβλεψη δευτεροταγούς δομής Γ. Χρήση του ClustalW για στοίχιση της RAD Δ. Μοντελοποίηση της δομής της RAD51 με Homology Modelling Δ.1 Γενικά για τις μεθόδους Πρόγνωσης διπλώματος Πρωτεϊνών Δ.2 Μέθοδος πρόγνωσης διπλώματος Πρωτεϊνών με Ομολογία (Homology Modelling) Δ.3 WHATIF και MODELLER Ε.1 Γενικά για τις μεθόδους Μοντελοποίησης Αλληλεπίδρασης Πρωτεϊνών Ε.2 Το HADDOCK Software web portal Ε.3 Το GRAMM Software web portal Ε.4 Τα αποτελέσματα του docking ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το Αυτοτελές Δομικό Στοιχείο ATPase της HsRAD Σύνοψη Σημαντικών Θέσεων της RAD51, για την δέσμευση RAD51, DNA, BRC4, p Για την RAD51 (αυτό - συγκρότηση) Για το DNA Για την BRC4 επανάληψη της BRCA Για την p ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ & ΠΙΝΑΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

12 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ & ΔΙΕΥΚΡΙΝΙΣΕΙΣ Συντομογραφίες BER = Base Excision Repair = Επιδιόρθωση Αποκοπής Βάσεων BIR = Break - Induced Replication = Αντιγραφή από το σημείο της Σχάσης και μετά DSB = Double Strand Break = Δίκλωνη Σχάση - Σχάση και των δύο Αλυσίδων DSBR = Double - Strand Break Repair = Επιδιόρθωση Δίκλωνων Σχάσεων dsdna = Double-Stranded DNA = Δίκλωνο DNA Holliday Junction (Double) ή Cross - Strand Exchange = Σύνδεση του Holliday ή Δομή Ανταλλαγής των Διασταυρούμενων Κλώνων HR = Homologous Recombination = Ομόλογος Ανασυνδυασμός hsrad51 Ή RAD51 (στον Ενικό) = Homo Sapiens RAD51 = Ανθρώπινη RAD51 IR = Ionizing Radiation = Ιονίζουσα Ακτινοβολία NER = Nucleotide Excision Repair = Επιδιόρθωση Αποκοπής Νουκλεοτιδίων RAD51 (στο πληθυντικό) = Οι RAD51, οι Ευκαρυωτικές Ορθόλογες Πρωτεΐνες της Βακτηριακής Πρωτεΐνης RecA ROS = Reactive Oxygen Species = Οξυγονούχες Ενώσεις RPA = Replication Protein A = Αναπαραγωγή Πρωτεΐνη A scrad51 = Saccharomyces Cerevisiae RAD51 SDSA = Synthesis Dependent Strand Annealing = Αναδόμηση Κλώνου Εξαρτώμενη Από Τη Σύνθεση SSA = Single Strand Annealing = Μονόκλωνη Ανόπτηση / Αναδιάταξη SSB = Single Stranded DNA-Binding Protein = Πρωτεΐνη που δεσμεύεται σε Μονόκλωνο DNA ssdna = Single-Stranded DNA = Μονόκλωνο DNA DDR = DNA Damage Response = ανταπόκριση σε βλάβη DNA HRR = Homologous Recombinational Repair = Επιδιόρθωση με Ομόλογο Ανασυνδυασμό Διευκρινίσεις Η ονομασία των στοιχείων δευτεροταγούς δομής του ATPase Α.Δ.Σ. της Hs RAD51 προέρχεται από την εργασία των Pellegrini L., et al και την αντίστοιχη κατατεθειμένη κρυσταλλική δομή PDB:1N0W Homologous pairing = Ομόλογη αντιστοίχιση Interface = Διεπαφή = Περιοχή αλληλεπίδρασης Binding site = Περιοχή δέσμευσης ή πρόσδεσης Recombinase = Ρεκομπινάση = Κύρια Πρωτεΐνη του Ομόλογου Ανασυνδυασμού Self-association = Αυτό-συγκρότηση ή Ολιγομερισμός /Πολυμερισμός προέρχεται από την εργασία των Pellegrini L. and Venkitaraman Α Domain = Αυτοτελές Δομικό Στοιχείο Α.Δ.Σ. = Αυτοτελές Δομικό Στοιχείο ή Αυτοτελή Δομικά Στοιχεία 12 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

13 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Α. Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο Α.1 Διαίρεση ή θάνατος κατά το "Νικάν ή θνήσκειν" Όλα τα κύτταρα προέρχονται από άλλα κύτταρα. Ο μοναδικός τρόπος για να παραχθεί ένα νέο κύτταρο είναι με διαίρεση ενός προϋπάρχοντος κυττάρου. Για ν' αναπαραχθεί ένα κύτταρο πρέπει να διεκπεραιώσει μια ιεραρχική ακολουθία αντιδράσεων μέσω των οποίων πρώτα διπλασιάζει το περιεχόμενό του και μετά διαιρείται στα δύο. Η κρίσιμη διεργασία διπλασιασμού και διαίρεσης, γνωστή ως Κυτταρικός Κύκλος ή "Κύκλος Ζωής του Κυττάρου", είναι περίπλοκη και ελέγχεται προσεκτικά. Βλάβη σε οποιαδήποτε από τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον Κυτταρικό κύκλο μπορεί να προκαλέσει το θάνατο του κυττάρου. Μεταλλάξεις των παραγόντων του κυτταρικού κύκλου συχνά προκαλούν το θάνατο του κυττάρου. Αυτό δυσχεραίνει την ανάλυση των παραγόντων του μηχανισμού ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την κατανόηση του τρόπου λειτουργίας τους. Η επιστήμη αξιοποιεί τα μεταλλαγμένα στελέχη για ν' αναγνωρίσει γονίδια και πρωτεΐνες με βάση τη λειτουργία τους: αν ένα γονίδιο είναι απαραίτητο για μια ορισμένη διεργασία, μια βλάβη σε αυτό το γονίδιο θα εκδηλωθεί με διαταραχή της εν λόγω διεργασίας. Από την ανάλυση της ελαττωματικής συμπεριφοράς του μεταλλαγμένου οργανισμού συνάγονται ενδείξεις για τη λειτουργία στην οποία είναι απαραίτητο το γονίδιο και από την ανάλυση του DΝΑ, του μεταλλαγμένου οργανισμού μπορεί ν' αναγνωριστεί το ίδιο το γονίδιο. Α.2 Φάσεις του Κυτταρικού Κύκλου Η διαδικασία διπλασιασμού και διαίρεσης ενός κυττάρου αποτελείται από τρεις φάσεις: τη μεσόφαση (που διακρίνεται σε τρεις επιμέρους φάσεις G1, S, G2), την πυρηνοδιαίρεση Μ και την κυτταροδιαίρεση D. Αυτή η διαδικασία εναλλαγής των φάσεων G1-S- G2-M-D αποτελεί τον "κύκλος της ζωής του κυττάρου". Εικόνα 1. Φάσεις κυτταρικού κύκλου Το 1882, ο Fleming περιγράφοντας τον κύκλο της ζωής ενός κυττάρου, ονόμασε τη διαδικασία της πυρηνικής διαίρεσης "μίτωση" (από τον ελληνικό όρο μίτος που Πηγή: σημαίνει νήμα, κλωστή). Επειδή τα κύτταρα φαίνονταν να είναι ενεργά μόνο στη φάση της μίτωση, ο υπόλοιπος κυτταρικός κύκλος χαρακτηρίστηκε ως "μεσόφαση" ή "φάση ηρεμίας" (interphase). Στην πραγματικότητα όμως κατά τη διάρκεια της μεσόφασης συμβαίνει η μεγαλύτερη κυτταρική δραστηριότητα που προετοιμάζει το κύτταρο για την κυτταρική διαίρεση, με κυρίαρχη την αντιγραφή του 14 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

15 γενετικού υλικού (DNA) κατά τη φάση S (Pollard & Earnshaw 2002). Τα κύτταρα ακολουθούν επαναλαμβανόμενους κύκλους αντιγραφής του DNA, (φάση S), και πυρηνικής και κυτταρικής διαίρεσης, (φάση μίτωσης, Μ), με πολύ μεγάλη ταχύτητα. Η αντιγραφή του DNA, αρχίζει αμέσως μόλις σταματήσει η μίτωση και ένας κυτταρικός κύκλος κυτταρικής διαίρεσης ολοκληρώνεται μέσα σε μισή ώρα. Καθώς όμως η εμβρυογένεση εξελίσσεται, οι ανάγκες της κυτταρικής ζωής σε ένα περισσότερο πολύπλοκο περιβάλλον, μεγαλώνουν. Έτσι, εμφανίζονται και άλλες φάσεις στον κυτταρικό κύκλο, η φάση G1 (1st gap phase), η οποία παρεμβάλλεται ανάμεσα στην πυρηνική διαίρεση (Μ φάση) και στη σύνθεση του DNA (S φάση) και η φάση G2 (2nd gap phase), η οποία λαμβάνει χώρα μεταξύ S και Μ φάσης. Η δημιουργία των δυο επιπλέον φάσεων, προέκυψε από την ανάγκη ελέγχου της σωστής διαμόρφωσης του DNA και ενδεχόμενης επιδιόρθωσης αυτού (φάση G1), καθώς και ελέγχου και επιδιόρθωσης σφαλμάτων κατά την αντιγραφή του DNA (φάση G2), (Pollard & Earnshaw 2002). Οι επιπλέον φάσεις, έχουν ως συνέπεια την αύξηση κατά πολύ του χρόνου ολοκλήρωσης ενός κυτταρικού κύκλου. Πηγή: Pollard & Earnshaw 2002 Εικόνα 2. Φάσεις του κυτταρικού κύκλου και Σημεία Ελέγχου Απλουστευμένη διαγραμματική αναπαράσταση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Ο κύκλος αποτελείται από τέσσερα στάδια. Κατά τη διάρκεια της φάσης G1, το κύτταρο μεγαλώνει σε μέγεθος. Κατά τη διάρκεια της φάσης S, το κύτταρο διπλασιάζει το DNA των χρωμοσωμάτων του. Κατά τη διάρκεια της φάσης G2, το κύτταρο ελέγχει για την σωστή 15 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

16 ολοκλήρωση της αντιγραφής του DNA. Στη φάση M, τα χρωμοσώματα συμπυκνώνονται και επισυνάπτονται στη μιτωτική άτρακτο, η οποία χωρίζει η διπλή ζεύγη στο πλαίσιο της προετοιμασίας για τη διαίρεση του κυττάρου. Βρόγχοι, βιοχημικής ανατροφοδότησης που ονομάζονται σημεία ελέγχου (checkpoints) σταματούν τον κύκλο σε διάφορα σημεία με στόχο την επιτυχή ολοκλήρωση των προηγούμενων σταδίων. Η φάση G1 Η φάση αυτή διαφέρει σημαντικά μεταξύ διαφόρων κυτταρικών τύπων, καθώς και μέσα στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό. Επίσης είναι δυνατό να επηρεάζεται σε σημαντικό βαθμό από διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες. Έτσι, σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως όταν υπάρχει περιορισμός των θρεπτικών συστατικών ή όταν δίνεται στα κύτταρα το σήμα για τελική διαφοροποίηση, είναι δυνατό κύτταρα που βρίσκονται στη G1, αντί να προετοιμαστούν για τη σύνθεση του DNA, να εισέρχονται σ ένα στάδιο αναστολής, γνωστό ως στάδιο G0. Η διάρκεια αυτού του σταδίου, το οποίο θεωρείται ως μέρος της G1 μπορεί να κυμαίνεται από ημέρες έως μήνες ή και χρόνια. Τα κύτταρα σε αυτή τη φάση δεν είναι ανενεργά, αλλά αντίθετα βρίσκονται σε μία διαρκή διαδικασία πρωτεϊνοσύνθεσης, κίνησης ή έκκρισης ουσιών προς το περιβάλλον. Επιπλέον, μπορούν υπό την επίδραση κατάλληλων ερεθισμάτων του περιβάλλοντος να εισέλθουν και πάλι στον κυτταρικό κύκλο. Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου κατά μήκος της φάσης G1 ελέγχεται από δύο σημεία ελέγχου (checkpoints), το σημείο περιορισμού (restriction point) και το σημείο βλάβης του DNA (G1 DNA damage checkpoint). Αν υπερπηδηθούν τα σημεία αυτά, τότε το κύτταρο θα ολοκληρώσει τον κύκλο ανεξάρτητα από τις συνθήκες του περιβάλλοντος (Pollard & Earnshaw 2002, Alberts B. et al 2006, Ροδάκης, Λεκανίδου, Τσιτήλου 2007). Η φάση S H διάρκεια της φάσης S, καθώς και των λοιπών φάσεων G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου ποικίλλει στα διαφορετικά είδη κυττάρων, αλλά όχι σημαντικά σε κύτταρα του ίδιου είδους. Επιπλέον, σε αντίθεση με τη φάση G1, η διάρκεια των φάσεων αυτών ελάχιστα επηρεάζεται από τις συνθήκες του περιβάλλοντος και μπορεί να θεωρηθεί ως σταθερό χαρακτηριστικό κάθε κυτταρικού τύπου. Η φάση S του κυτταρικού κύκλου αποτελεί τη φάση αντιγραφής του γενετικού υλικού. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα χρωμοσώματα έχουν ιδιαίτερα μεγάλο μέγεθος, αποτελούμενα κατά μέσο όρο από 150 x 10 6 ζεύγη βάσεων. Η αντιγραφή συνεπώς σε τέτοιου μεγέθους χρωμοσώματα ξεκινά από πολλαπλά ανεξάρτητα σημεία, που για το ανθρώπινο γονιδίωμα είναι της τάξης των 2 x Αν υπήρχε, μόνο ένα σημείο έναρξης θα απαιτούνταν περίπου 800 ώρες για την πλήρη αντιγραφή ενός και μόνο χρωμοσώματος, γεγονός που θα είχε ιδιαίτερες επιπτώσεις για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Κάθε περιοχή του χρωμοσώματος που αντιγράφεται από ένα σημείο έναρξης, ονομάζεται ρεπλικόνιο (replicon). Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς κάθε αντιγραφική μονάδα αποτελείται από μια ομάδα ρεπλικονίων. Κάθε τέτοια ομάδα αντιγράφεται σε διαφορετικούς χρόνους κατά τη διάρκεια της S (ασύγχρονη διαδικασία). Γενικά, οι περιοχές ενεργού μεταγραφής του γονιδιώματος, καθώς και οι περιοχές που 16 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

17 εκφράζουν γονίδια που είναι ενεργά σε όλα τα κύτταρα του οργανισμού (γονίδια οικονομίας κυττάρου-housekeeping genes) αντιγράφονται πρώτες κατά τη φάση S, ενώ οι περιοχές ανενεργού ετεροχρωματίνης (πχ. η περιοχή του κεντρομεριδίου) αντιγράφονται αργότερα, προς το τέλος της S (Ροδάκης, Λεκανίδου, Τσιτήλου 2007, Pollard & Earnshaw 2002). Κατά τη διάρκεια της φάσης G1, τα χρωμοσώματα τροποποιούνται με την προσκόλληση διαφόρων πρωτεϊνών στα σημεία έναρξης της αντιγραφής με αποτέλεσμα το σχηματισμό των προ- αντιγραφικών συμπλόκων (prereplication complex). Καθώς προχωράει η αντιγραφή κατά τη φάση S τα συμπλέγματα απενεργοποιούνται με αποτέλεσμα να αποτρέπεται η διπλή αντιγραφή τμημάτων του DNA στον ίδιο κυτταρικό κύκλο. Οι παραπάνω διαδικασίες ρυθμίζονται από μεταβολές στις δραστηριότητες των κυκλινών (cyclins) και των αντίστοιχων κινασών (cyclin-dependent kinases). Η φάση G2 Κατά τη διάρκεια της φάσης G2 τα κύτταρα ελέγχουν την ακεραιότητα της δομής του DNA και προετοιμάζονται για τη μίτωση. Εφόσον, ανιχνευτεί κάποια βλάβη στο γενετικό υλικό, ενεργοποιείται ένας καταρράκτης πρωτεϊνικών κινασών, γνωστός ως το σημείο ελέγχου βλαβών του DΝA της G2 (G2 DNA damage checkpoint), με τελικό αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των κινασών που είναι υπεύθυνες για την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης. Ο κυτταρικός κύκλος καθυστερεί στη G2 (G2 arrest) μέχρις ότου επιδιορθωθεί η βλάβη ή επάγεται η απόπτωση, εφόσον η βλάβη δεν είναι δυνατό να επιδιορθωθεί. Η φάση της μίτωσης Μ Κατά τη διάρκεια της μίτωσης και της επακόλουθης κυτταροκίνησης, τα χρωμοσώματα και το κυτταρόπλασμα διαιρούνται σε δύο θυγατρικά κύτταρα. Ο διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων ελέγχεται από το σημείο ελέγχου της μετάφασης Μίτωση (Πηγή: Βικιπαίδεια) (metaphase checkpoint), που καθυστερεί το διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων, μέχρις ότου τα χρωμοσώματα έχουν ευθυγραμμιστεί πλήρως στη μιτωτική άτρακτο. Το σημείο αυτό ονομάζεται επίσης και σημείο ελέγχου της μιτωτικής ατράκτου (spindle checkpoint). Η μίτωση διακρίνεται σε 5 διακριτές φάσεις. Η πρόφαση χαρακτηρίζεται από την έναρξη της συμπύκνωσης των χρωμοσωμάτων. Στο κυτταρόπλασμα, λαμβάνουν χώρα δραματικές μεταβολές της κινητικής των μικροσωληνίσκων, των οποίων ο χρόνος ημι-ζωής μειώνεται από ~10 λεπτά σε 30 δευτερόλεπτα και συνοδεύεται από διαχωρισμό των διπλασιασμένων κεντροσωματίων, καθένα από τα οποία συμμετέχει στο σχηματισμό του ενός πόλου της μιτωτικής ατράκτου. Στον πυρήνα αρχίζει να καταστρέφεται η πυρηνική μεμβράνη και να εξαφανίζεται ο πυρηνίσκος, γεγονός που αντανακλά τη μείωση της μεταγραφικής δραστηριότητας του κυττάρου, η οποία σταματά τελείως στο τέλος της 17 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

18 πρόφασης. Κατά τη διάρκεια της προμετάφασης διασπάται πλήρως η πυρηνική μεμβράνη και τα χρωμοσώματα αρχίζουν να συνδέονται τυχαία σε διάφορα σημεία των μικροσωληνίσκων, που ξεκινούν από τους δύο πόλους της μιτωτικής ατράκτου. Καθώς οι κινητόχωροι σε κάθε χρωμόσωμα συνδέονται σε αντίθετους πόλους της μιτωτικής ατράκτου, το χρωμόσωμα μετακινείται αργά κάπου στο ενδιάμεσο μεταξύ των δύο πόλων, στον ισημερινό του κυττάρου. Όταν έχει ολοκληρωθεί η δέσμευση των χρωμοσωμάτων στα ινίδια της ατράκτου, τότε το κύτταρο θεωρείται ότι βρίσκεται στη μετάφαση. Ακολουθεί η ανάφαση, που είναι η μικρότερη χρονικά φάση της μιτωτικής διαίρεσης, καθώς διαρκεί μερικά μόνο λεπτά. Χαρακτηρίζεται από το διαχωρισμό και κίνηση των αδερφών χρωματίδων προς τους δύο αντίθετους πόλους του κυττάρου (ανάφαση Α), οι οποίοι στη συνέχεια απομακρύνονται μεταξύ τους (ανάφαση Β). Η μετάβαση στην ανάφαση από την προηγούμενη φάση (μετάφαση) απαιτεί την πρωτεολυτική αποδόμηση των μορίων που ρυθμίζουν το ζευγάρωμα των αδερφών χρωματίδων (όπως η πρωτεΐνη CLIP) και εξαρτάται από την τοποϊσομεράση ΙΙ και την ειδική πρωτεόλυση με ουμπικιτίνη. Η άφιξη των χρωμοσωμάτων στους πόλους σηματοδοτεί την τελόφαση. Στη φάση αυτή τα χρωμοσώματα αποσυσπειρώνονται, παίρνοντας τη χαρακτηριστική μορφή της χρωματίνης της μεσόφασης. Συγχρόνως επανεμφανίζεται ο πυρηνίσκος και δημιουργείται πάλι η πυρηνική μεμβράνη. Τέλος, ένας δακτύλιος ακτίνης και μυοσίνης, γνωστός και ως συσταλτός δακτύλιος (contractile ring) περιβάλλει τους δύο νέους πυρήνες και διαχωρίζει το κυτταρόπλασμα στα δύο επιμέρους κύτταρα. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται κυτταροκίνηση. Εικόνα 3. Συνολική παρουσίαση των φάσεων της μίτωσης Πηγή: 18 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

19 Πηγή: 19 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

20 Β. Κυκλίνες & Κινάσες ρύθμιζουν το κυτταρικό κύκλο Ένα από τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά του κυτταρικού κύκλου είναι η μεγάλη ακρίβεια εκτέλεσης του. Η αξιοθαύμαστη αυτή πιστότητα στην αναπαραγωγή, επιτυγχάνεται με έναν μεγάλο αριθμό μονοπατιών μεταγωγής σημάτων, που είναι γνωστά ως σημεία ελέγχου (checkpoints). Τα σημεία αυτά, ελέγχουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, εξασφαλίζοντας την αλληλεξάρτηση της S φάσης με τη μίτωση, την ακεραιότητα του γονιδιώματος και την πιστότητα του διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων. Η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, πρέπει να εξασφαλίζει την ολοκλήρωση των γεγονότων σε κάθε φάση, πριν πραγματοποιηθεί η είσοδος στην επόμενη. Σήμερα γνωρίζουμε πως το σύστημα ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, βασίζεται σε δυο οικογένειες πρωτεϊνών, τις κυκλίνες (cyclins) και τις εξαρτώμενες από αυτές πρωτεϊνικές κινάσες (Cyclin Dependent Kinases -CDKs). Ο πρώτος που έκανε λόγο για τις κυκλίνες και τη σύνδεσή τους με τον κυτταρικό κύκλο, ήταν ο Hunt, το Αυτός και οι συνεργάτες του, παρατηρώντας την αύξηση και την πτώση των επιπέδων μιας πρωτεΐνης, διατύπωσαν την άποψη, πως η σύνθεσή της οδηγεί τα κύτταρα στη μίτωση ενώ η αποικοδόμηση της τους επιτρέπει να ολοκληρώσουν ένα κυτταρικό κύκλο και να προχωρήσουν στον επόμενο. Αυτή η περιοδική αύξηση και καταστροφή των πρωτεϊνών αυτών έδωσε και το χαρακτηριστικό τους όνομα κυκλίνες. Οι κυκλίνες αποτελούν μια συνεχώς αυξανόμενη οικογένεια πρωτεϊνών, που παρουσιάζουν ομολογία σε μια περιοχή ~100 αμινοξέων, που ονομάζεται "κυτίο κυκλίνης" (cyclin box). Η περιοχή αυτή των κυκλινών, δεσμεύεται σε μέλη μιας οικογένειας πρωτεϊνικών κινασών, που παρουσιάζουν υψηλή συντήρηση και έχουν την ξεχωριστή ιδιότητα να χρειάζονται την αντίστοιχη κυκλίνη, προκειμένου να ενεργοποιηθούν. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι νεοσυντεθειμένες Cdks έχουν ολοκληρώσει μόνο μερικώς την διαμόρφωση της τριτοταγούς τους δομής, με αποτέλεσμα το ενεργό τους κέντρο να παρεμποδίζεται από ένα τμήμα τους που ονομάζεται Τ- βρόχος (T-loop). Επιπλέον, μια μικρή α-έλικα που περιέχει γλουταμικό οξύ και είναι απαραίτητη για τη σύνδεση με το ATP έχει επίσης λάθος προσανατολισμό, μακριά από την καταλυτική σχισμή (catalytic cleft) του ενζύμου, με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η φωσφορυλίωση των αντίστοιχων υποστρωμάτων. Η ενεργοποίηση πραγματοποιείται με τη σύνδεση της Cdk με την αντίστοιχη κυκλίνη, με αποτέλεσμα την ολοκλήρωση της στερεοδομής της και την ενεργοποίηση του καταλυτικού κέντρου. Παράλληλα, αλλάζει και η δευτεροταγής δομή του Ν-τελικού άκρου με αποτέλεσμα η α-έλικα που προαναφέρθηκε να προσανατολίζεται σωστά ώστε το κρίσιμο Γλουταμικό να στρέφεται προς το ενεργό κέντρο και να αλληλεπιδρά με το ATP, που με τη σειρά του παίρνει κατάλληλη μορφή για να αντιδράσει με τα υποστρώματα. Εικόνα 4. Ενεργοποίηση των Cdks Πηγή: Pollard & Earnshaw Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

21 Όμως, παρά τις παραπάνω αλλαγές, το σύμπλοκο κυκλίνης-cdk είναι μόνο μερικώς ενεργοποιημένο. Η πλήρης ενεργοποίηση πραγματοποιείται με τη φωσφορυλίωση μιας συντηρημένης Θρεονίνης, στη θέση 160 του Τ-βρόχου, από την CAK, (Cdk Activating Kinase). Η CAK είναι υπεύθυνη για τη φωσφορυλίωση των κινασών CDK1, CDK2, CDK4 και CDK6 και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Η φωσφορυλίωση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της καταλυτικής δραστηριότητας του συμπλέγματος Cdk-κυκλίνης, περίπου κατά 300 φορές (Pollard & Earnshaw 2002). Όπως φαίνεται από τα παραπάνω, η ενζυμική δράση των Cdks ρυθμίζεται σε διάφορα επίπεδα: με την αλληλεπίδραση της κυκλίνης, με την ενεργοποίηση από τη CAK, με φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση. Επιπλέον, υπάρχουν και τουλάχιστον δύο μηχανισμοί αρνητικής ρύθμισης των Cdks: Ο πρώτος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης των Cdks αφορά στη φάση G2, όπου η δραστηριότητα των Cdks ελέγχεται με τη φωσφορυλίωση δύο αμινοξικών καταλοίπων (Θρεονίνη - 14 και Τυρισίνη 15) από πρωτεϊνικές κινάσες. Η φωσφορυλίωση αυτή παρεμβάλλεται στο σημείο πρόσδεσης του ATP επηρεάζοντας τη φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων. Ο δεύτερος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης των Cdks είναι η αλληλεπίδραση τους με διάφορα μόρια-αναστολείς (CDKIs, CDK inhibitors), όπως φαίνεται στην εικόνα 3. Οι CDKIs που έχουν ταυτοποιηθεί μέχρι σήμερα, ανήκουν σε δυο οικογένειες: την INK4 και την KIP. Εικόνα 5. Η ρύθμιση της ενζυμικής δράσης των συμπλόκων Κυκλίνες/Κινάσες σε διάφορες φάσεις. Πηγή: Pollard & Earnshaw 2002 Στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, διαφορετικά συμπλέγματα Cdksκυκλινών, ελέγχουν διαφορετικά στάδια του κυτταρικού κύκλου. Στον άνθρωπο έχουν προσδιοριστεί τουλάχιστον 16 διαφορετικές κυκλίνες, ορισμένες από τις οποίες δρουν στη G1 φάση, άλλες στη G2, κάποιες ακόμα και στη Μ, ενώ υπάρχουν και κυκλίνες που δρουν ανεξάρτητα από τον κυτταρικό κύκλο. Οι Cdks έχουν την ιδιότητα να συντονίζουν τον κυτταρικό κύκλο, λειτουργώντας ως "μοριακοί διακόπτες". Όταν είναι ενεργές, ο κυτταρικός κύκλος προχωρά στο στάδιο που ελέγχει η συγκεκριμένη Cdk, ενώ το αντίθετο συμβαίνει όταν αυτές είναι ανενεργές. 21 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

22 Γ. Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints) Γ.1 Το σημείο ελέγχου G1 Κατά τη διάρκεια της φάσης G1, το κύτταρο καλείται ν αποφασίσει εάν θα συνεχίσει εκτελώντας έναν ακόμα κυτταρικό κύκλο ή αν θα παραμείνει σε μη διαιρούμενη κατάσταση μόνιμα ή προσωρινά. Το σημείο μεταξύ της αρχικής και της τελικής G1 φάσης, το οποίο αντιπροσωπεύει την αμετάκλητη δρομολόγηση του κυττάρου προκειμένου να διαιρεθεί, ονομάζεται σημείο περιορισμού (restriction point). Η μεταγωγή σημάτων από τους διάφορους αυξητικούς παράγοντες, οδηγεί τα κύτταρα που βρίσκονται στην αρχική φάση G1, είτε να περάσουν το σημείο περιορισμού και να διαιρεθούν, είτε, εξαιτίας ανεπαρκών σημάτων, να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και να οδηγηθούν στο σημείο G0. Τελικά, κατά τη διάρκεια της G1 φάσης, το κύτταρο παίρνει την απόφαση να διαιρεθεί, να διαφοροποιηθεί ή να πεθάνει. Όπως γίνεται κατανοητό, η διεκπεραίωση της σωστής απόφασης, περιλαμβάνει πολύπλοκα, αλληλοεξαρτώμενα μονοπάτια, στα οποία οποιοδήποτε λάθος μπορεί να οδηγήσει σε καρκινογένεση. Πολλά ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως και οι θεραπείες που στοχεύουν σε αυτά, μπορούν να συνδεθούν με λάθη στο σημείο αυτό (Nakanishi et al 2006). Οι Cdks της G1 φάσης, είναι αυτές που οδηγούν στην αντιγραφή του DNA. Η ενεργοποίηση της Cdk της φάσης G1, οδηγεί στη στρατολόγηση ελικασών, πριμασών και πολυμερασών στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο, προκαλώντας το ξεδίπλωμα της διπλής έλικας του DNA και τελικά, την αντιγραφή αυτού. Η παραπάνω διαδικασία μονοπάτι μεταγωγής σήματος για τη μετάβαση του κυττάρου από τη G1 στην S φάση δεν είναι μοναδικό. Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός μονοπατιών μεταγωγής σήματος που παίρνει μέρος στην απόφαση του κυττάρου να διαιρεθεί ή όχι. Ενδεικτικά αναφέρεται η εμπλοκή του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, το οποίο επηρεάζει άμεσα τις διαδικασίες στο σημείο αυτό. Η μεταγραφή της p53 ενεργοποιείται από τη στιγμή που θα προκύψει βλάβη στο DNA. (Βλέπε παρακάτω.) Εικόνα 6. Εμπλοκή περισσότερων μονοπατιών μεταγωγής σήματος, στο G1 σημείο ελέγχου. Πηγή: Pollard & Earnshaw Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

23 Γ.2 Το σημείο ελέγχου S (intra-s checkpoint) Όπως στη φάση G1, έτσι και στην S, υπάρχουν μηχανισμοί ελέγχου των βλαβών του DNA. Όπως και στο σημείο ελέγχου G1, η οποιαδήποτε βλάβη του DNA ανιχνεύεται από τις κινάσες ΑΤΜ/ΑΤR, που ενεργοποιούν τις εκτελεστικές κινάσες Chk1 και Chk2, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τη φωσφατάση Cdc25Α και την απενεργοποιούν. Με τον τρόπο αυτό αποτρέπεται η ενεργοποίηση της κυκλίνης CDK2 και καθυστερεί η αντιγραφή του γενετικού υλικού (αναστέλλοντας τη σύνδεση της Cdc45 στη χρωματίνη, η οποία με τη σειρά της επάγει τη σύνδεση της πολυμεράσης α στα προαντιγραφικά συμπλέγματα) και δίνοντας χρόνο για επιδιόρθωση του γενετικού υλικού. Γ.3 Το σημείο ελέγχου G2 Στη φάση G1 το κύτταρο αποφασίζει, όπως προαναφέρθηκε, αν θα προχωρήσει ή όχι σε έναν επόμενο κυτταρικό κύκλο. Κατά τη διάρκεια της φάσης G2 το κύτταρο καλείται να πάρει μια δεύτερη σημαντική απόφαση: αν είναι ασφαλές να προχωρήσει σε μίτωση και σε διαχωρισμό των αδερφών χρωματίδων. Εφόσον υπάρχει κάποια βλάβη του DNA προτού διαχωριστούν οι αδερφές χρωματίδες, οι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί μπορούν να χρησιμοποιήσουν τις γενετικές πληροφορίες από τη "σωστή" χρωματίδα προκειμένου να διορθώσουν εκείνη που έχει υποστεί βλάβη. Αντίθετα, μετά το διαχωρισμό τους, δεν είναι δυνατό να εκτελεστεί ένα τέτοιο επιδιορθωτικό πρόγραμμα, με αποτέλεσμα συνήθως να προκύπτουν σημαντικές χρωμοσωμικές βλάβες μετά το διαχωρισμό. Για το λόγο αυτό τα κύτταρα χρησιμοποιούντο σημείο ελέγχου G2, γνωστό και σαν G2-M, με το οποίο εμποδίζονται να αρχίσουν τη διαδικασία της μίτωσης, εάν έχουν υποστεί κάποια βλάβη κατά τη διάρκεια της G2 φάσης ή εάν έχουν εισέλθει στη φάση αυτή με κάποια βλάβη από τις προηγούμενες, S ή G1. Η συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2, μπορεί επίσης να αντανακλά το σημείο ελέγχου της αντιγραφής του DNA (intra S checkpoint), και κατά το οποίο, γίνονται αντιληπτά τμήματα DNA που στην προηγούμενη φάση S, δεν αντιγράφηκαν σωστά ή πλήρως. Η βλάβη του DNA στη G2 ανιχνεύεται όπως και στις προηγούμενες φάσεις από τις κινάσες ATM/ATR οι οποίες έχουν τουλάχιστον 2 σημαντικά υποστρώματα: το ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 και την κινάση Chk1. Η Chk1 στη συνέχεια φωσφορυλιώνει την φωσφατάση Cdc25C, που αποτελεί βασικό επαγωγέα της μίτωσης και την απενεργοποιεί. Παράλληλα, στην απενεργοποίηση της φωσφορυλιωμένης Cdc25C συμβάλλει και η σύνδεση μιας ομάδας πρωτεϊνών σ, οι οποίες έχουν την ικανότητα να προσδένονται σε διάφορα υποστρώματα, μόνον εφόσον περιέχουν σερίνη που έχει φωσφορυλιωθεί. Η σύνδεση της Cdc25C με τις παραπάνω πρωτεΐνες, έχει ως αποτέλεσμα τη διάσπαση της στο κυτταρόπλασμα και κατ επέκταση την αναστολή της μίτωσης (Pollard & Earnshaw 2002). Από την άλλη μεριά η φωσφορυλίωση του p53 από τις ATM/ATR οδηγεί, όπως και στη φάση G1, σε αύξηση του αναστολέα p21, ο οποίος αναστέλλει την έναρξη της πρόφασης, απενεργοποιώντας το σύμπλοκο Cdk1-κυκλίνης Α. Επιπλέον, ένας άλλος στόχος του p53 είναι και η πρωτεΐνη σ, η οποία συνδέεται με το σύμπλοκο Cdk1-κυκλίνης Β, με αποτέλεσμα την παραμονή του στο κυτταρόπλασμα, παρεμποδίζοντας τη μεταφορά του στον πυρήνα για την έναρξη της μίτωσης. 23 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

24 Εικόνα 7. Διαγραμματική αναπαράσταση του G2 σημείου ελέγχου Από όλα τα παραπάνω γίνεται κατανοητό, πως υπάρχουν πάρα πολλά κυτταρικά μονοπάτια που αλληλοσυνδέονται ελέγχοντας τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Επομένως, είναι αναγκαία η κατανόηση τους, προκείμενου να γίνει αντιληπτός ο μηχανισμός της καρκινογένεσης και της ανάπτυξης κατάλληλων θεραπευτικών αγωγών. Γ.4 Ενεργοποίηση, Ρύθμιση και Τροποποίηση της δράσης της p53 Ένα από τα πιο ισχυρά σήματα που προκαλεί αύξηση της συγκέντρωσης της p53 στο κύτταρο είναι η παρουσία μονόκλωνου DΝΑ (ssdna). Αν η γενετική βλάβη είναι περιορισμένη, η p53 σταματά τον κυτταρικό κύκλο είτε στο σημείο ελέγχου μετάβασης από τη φάση G1 στη φάση S, είτε στο σημείο ελέγχου G2/M είτε στο σημείο ελέγχου του σχηματισμού της μιτωτικής ατράκτου. Σύμφωνα με έρευνες το σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου είναι μόνιμο και το κύτταρο επιβιώνει για αρκετά σημαντικό χρονικό διάστημα όντας σε αυτή την κατάσταση. Αντίθετα, στην περίπτωση που η βλάβη του DNA είναι εκτενέστερη η p53 προκαλεί απόπτωση του κυττάρου. Παρόλη την μέχρι τώρα ερευνητική πορεία, σημαντικές λεπτομέρειες για τον ακριβή τρόπο ενεργοποίησης της p53 δεν έχουν γίνει γνωστές, έχουν προταθεί όμως κάποια μοντέλα. Το κεντρικό μοντέλο προβλέπει την ύπαρξη της p53 σε ανενεργή μορφή μέσα στο κύτταρο υπό φυσιολογικές συνθήκες. Όταν όμως το DNA υποστεί ζημιά, η p53 συνδέεται χωρίς εξειδίκευση σε μονόκλωνο τμήμα της αλυσίδας του DNA. Εκεί πρωτεϊνικές κινάσες φωσφορυλιώνουν την πρωτεϊνική κινάση ATM (Ataxia-Telangiectasia-Mutated), και την ενεργοποιούν. Η τελευταία ανήκει στην οικογένεια των κινασών PIK3 (phosphatidylinositol 3 kinase). Το όνομά της προήλθε από την ασθένεια ataxia telangiectasia mutated με την 24 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

25 οποία συνδέεται. Αυτή, φωσφορυλιώνει την p53 στη Σερίνη 15 απομακρύνοντας τη από την πρωτεΐνη Mdm 2 με την οποία είναι συνδεδεμένη σε ανενεργή κατάσταση και την ενεργοποιεί, αυξάνοντας ταυτόχρονα τη σταθερότητά της και τη συγκέντρωσή της στον πυρήνα του κυττάρου. ( Εικόνα 6.) Η p53 αποτελεί έναν μεταγραφικό παράγοντα, ο οποίος ενεργοποιεί μια σειρά γονιδίων, μεταξύ των οποίων και τον αναστολέα των CDKs, με τον οποίο επάγεται στάση του κυτταρικού κύκλου στη G1 (G1 arrest) προκειμένου να επιδιορθωθεί η βλάβη. Σε περίπτωση ανεπιτυχούς επιδιόρθωσης, η p53 συμμετέχει στην ενεργοποίηση άλλων μονοπατιών που οδηγούν το κύτταρο σε απόπτωση. 25 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 - ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Α. Γενικά Μέχρι πρόσφατα, o ρόλος ταυ κυτταρικού πολλαπλασιασμού εθεωρείτο πρωταρχικός στη ρύθμιση της ομοιόστασης των φυσιολογικών ιστών. Σύμφωνα με νεώτερα όμως δεδομένα, o κυτταρικός θάνατος αποτελεί ενεργητική διαδικασία, αντίστροφη λειτουργικά από τον πολλαπλασιασμό και ουσιώδη για τη διατήρηση της μoρφo-λειτουργικής ακεραιότητας των ιστών. O κυτταρικός θάνατος συνιστά τη μη αναστρέψιμη απώλεια των ζωτικών λειτουργιών του κυττάρου και αποτελεί μια φυσιολογική διαδικασία, που συντελείται τόσο στην μορφογένεση, όσο και στους ιστούς των ενηλίκων με συνεχή φθορά και ανάπλαση. O ορισμός αυτός, του κυτταρικού θανάτου, διαχωρίζεται από τη νέκρωση και τη γήρανση που οδηγεί σε νέκρωση που είναι το τελικό αποτέλεσμα ενός ανεπανόρθωτου κυτταρικού τραυματισμού που προκαλείται από ποικίλους παθολογικούς παράγοντες. O κυτταρικός θάνατος, σαν επακόλουθη φυσιολογικής εξελικτικής διαδικασίας, είναι γνωστός στη βιβλιογραφία με τον ελληνικό όρο "απόπτωσης" (apoptosis). Οι όροι "προγραμματισμένες κυτταρικός θάνατος" και "απόπτωση " μάλλον είναι συνώνυμες έννοιες και αναφέρονται στις κυτταρoπλασματικές και πυρηνικές εκείνες μεταβολές που οδηγούν στο θάνατο μεμονωμένα κύτταρα, χωρίς να θίγονται τα γειτονικά κύτταρα του ιστού. Οι μορφολογικές αλλοιώσεις συνίστανται σε πυρηνική και κυτταρoπλασματική συρρίκνωση του κυττάρου, ακολουθούμενη από λύση της πυρηνικής μεμβράνης, κατάτμηση της χρωματίνης και σχηματισμό πολλαπλών θραυσμάτων που αποτελούνται από συρρικνωμένη πυρηνικό και κυτταρoπλασματικό υλικό. Τα κυτταρικά αυτά υπολείμματα εξουδετερώνονται από γειτονικά κύτταρα των ιστών (μικροφάγα, αναρμόδια κύτταρα κ.ά.), απουσία φλεγμονώδους αντίδρασης με διήθηση λευκοκυττάρων. Οι μηχανισμοί ρύθμισης της απόπτωσης και οι παράγοντες που επάγουν ή καταστέλλουν τον κυτταρικό θάνατο, δεν είναι εντελώς γνωστοί. Η απόπτωση θεωρείται ότι μοιράζεται κάποιους κοινούς μοριακούς δρόμους με τον φυσιολογικό κυτταρικό κύκλο. Β. Απόπτωση-Νέκρωση Υπάρχουν τουλάχιστον δύο μορφές κυτταρικού θανάτου: η απόπτωση (apoptosis) και η νέκρωση (necrosis), όροι που προέρχονται από την ελληνική γλώσσα και χρησιμοποιούνται διεθνώς. Ο όρος απόπτωση προτάθηκε αρχικά από τον Kerr et al (1972), ο οποίος βασίστηκε στα υπερ-μικροσκοπικά χαρακτηριστικά συρρίκνωσης ηπατικών κυττάρων μετά από απολίνωση της πυλαίας φλέβας σε αρουραίους. Τέτοια χαρακτηριστικά περιλάμβαναν τη συμπύκνωση της χρωματίνης, τη συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος, τη φυσαλιδοποίηση της κυτταρικής μεμβράνης (blebbing) και τον τελικό σχηματισμό αποπτοσωματίων (apoptotic bodies). Αργότερα οι Nicotera et al (1997) διαπίστωσαν ότι η απόπτωση αποτελεί μια ενεργητική διαδικασία που απαιτεί την κατανάλωση σημαντικής ενέργειας με τη μορφή ATP. Παράλληλα, κυτταρικά οργανίδια, όπως τα μιτοχόνδρια διατηρούνται ανέπαφα κατά τη διάρκεια της απόπτωσης. Η απόπτωση αποτελεί μία φυσιολογική μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, 26 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

27 που αποσκοπεί στην εξάλειψη κυττάρων τα οποία έχουν ολοκληρώσει τον κύκλο ζωής τους ή φέρουν γενετικές βλάβες που τα καθιστούν ανώφελα ή και επιβλαβή για τον οργανισμό. Αποτελεί δηλαδή ένα γενετικά ελεγχόμενο σύστημα "αυτοκαταστροφής" του κυττάρου, που παίζει σημαντικότατο ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, στην ωρίμανση και στη λειτουργία των πληθυσμών του ανοσοποιητικού και αιμοποιητικού συστήματος και τη διατήρηση της ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Αντίθετα, η απορρύθμιση του σηματοδοτικού μηχανισμού της απόπτωσης σχετίζεται με πληθώρα παθολογικών καταστάσεων, που μπορεί να σχετίζονται είτε με αποπτωτική ανεπάρκεια, όπως τα διάφορα νεοπλάσματα, αυτοάνοσα νοσήματα ή ορισμένες ιογενείς λοιμώξεις, είτε με αποπτωτική περίσσεια, όπως διάφορες νευροεκφυλιστικές διαταραχές, εγκεφαλικά επεισόδια, νοσήματα αίματος, AIDS κα. (Gastman 2001, Kamer et al 2001). Σε αντίθεση με την απόπτωση, η νέκρωση αποτελεί μια ανεξέλεγκτη, μη ρυθμιζόμενη γενετικά διαδικασία, που αποτελεί συνήθως το αποτέλεσμα οξέος κυτταρικού τραυματισμού, προερχόμενου από ποικίλες καταστάσεις, όπως μόλυνση, φλεγμονή ή ισχαιμία. Το προκαλούμενο τραύμα έχει ως συνέπεια την αποτυχία των φυσιολογικών μηχανισμών που είναι απαραίτητοι για τη διατήρηση της ομοιοστασίας, όπως η μεταφορά ιόντων, η παραγωγή ενέργειας και η διατήρηση της οξεοβασικής ισορροπίας. Είναι μια παθητική διαδικασία, που δεν απαιτεί την κατανάλωση ενέργειας και μορφολογικά χαρακτηρίζεται από διόγκωση του κυτταροπλάσματος, λύση της κυτταρικής μεμβράνης και έξοδο του κυτταροπλασματικού περιεχομένου (Nicotera et al 2004). Παράλληλα επέρχεται και πλήρης αποδόμηση και καταστροφή των ενδοκυττάριων οργανιδίων. Η έξοδος του κυτταροπλασματικού περιεχομένου έχει ως αποτέλεσμα την κινητοποίηση φλεγμονώδους αντίδρασης από το ανοσοποιητικό σύστημα και την καταστροφή του ιστού που περιβάλλει τη νεκρωτική εστία. Εικόνα 8. Απόπτωση-Νέκρωση Πηγή: 27 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

28 ΠΙΝΑΚΑΣ 1. Βασικές διαφορές απόπτωσης και νέκρωσης συνοπτικά. Απόπτωση Ποικίλα εξωκυττάρια ή ενδοκυττάρια ερεθίσματα Νέκρωση Οξύς κυτταρικός τραυματισμός λόγω εξωκυττάριων ερεθισμάτων Ενεργητική διαδικασία που βασίζεται στην κατανάλωση ATP Παθητική διαδικασία, δεν απαιτείται η κατανάλωση ενέργειας Συρρίκνωση του κυτταροπλάσματος Διόγκωση του κυτταροπλάσματος, αυξημένη κενοτοπίωση, διόγκωση μιτοχονδρίων και λύση κυτταρικών οργανιδίων Φυσαλιδοποίηση (blebbing) της κυτταρικής μεμβράνης Τελικός σχηματισμός πολλαπλών κυστιδίων (αποπτωτικά σωμάτια) που περιβάλλονται από μεμβράνη και περικλείουν κυτταρόπλασμα και οργανίδια Συμπύκνωση της χρωματίνης σε μάζες ομοιογενούς πυκνότητας Διάσπαση του DNA στο επίπεδο των νουκλεοσωμάτων εξαρτώμενη από τις κασπάσες Λύση της κυτταρικής μεμβράνης και έξοδος του κυτταροπλασματικού περιεχομένου και των οργανιδίων. Τυχαία διάσπαση του DNA σε θραύσματα ποικίλων διαστάσεων Ανεξάρτητη από τις κασπάσες Φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών σωματίων χωρίς την πρόκληση φλεγμονώδους αντίδρασης Φλεγμονώδης αντίδραση Β.1 Βιοχημικά Μονοπάτια της Απόπτωσης Η γενετική και μοριακή βάση της απόπτωσης αποκρυπτογραφήθηκε αρχικά στον νηματοειδή σκώληκα C. Elegans, με την ανακάλυψη των γονιδίων που παίζουν καθοριστικό ρόλο στην προαγωγή, όπως τα ced-3 και ced-4 (cell death gene 3, 4) ή στην αναστολή της αποπτωτικής διαδικασίας (ced-9) (Ellis et al 1986, 1991). Μεταγενέστερες έρευνες έδειξαν ότι κατά την εξέλιξη των ειδών οι μοριακοί μηχανισμοί της απόπτωσης συντηρήθηκαν σε μεγάλο βαθμό, διατηρώντας πολλές ομοιότητες με αυτούς του C. Elegans (Green et al 2000). Κατά τη διάρκεια της απόπτωσης ενεργοποιείται μια σειρά πρωτεασών της κυστεϊνης 28 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

29 (cystein dependent-aspartate-specific proteases=caspases), που ονομάζονται κασπάσες και αποτελούν τα κύρια εκτελεστικά μόρια της απόπτωσης Εικόνα 9. Οικογένεια ανθρώπινων κασπασών. Ταξινομούνται ανάλογα με τη δράση τους σε: ενεργοποιητές και εκτελεστικές κασπάσες. Οι περιοχές τους CARD (=caspase recruitment domain), DED (=death effector domain) εμπλέκονται στη μετανάστευση και ενεργοποίηση των κασπασών. Το Ν-άκρο των εκτελεστικών κασπασών, διατηρεί τις κασπάσες αυτές ανενεργές και απομακρύνεται κατά την απόπτωση. Η μεγάλη υπομονάδα και η μικρή υπομονάδα αποτελούν τις καταλυτικές περιοχές των κασπασών και συνδέονται μέσω ενός μικρού συνδέτη (linker region) (~10 αμινοξέα). Γ. Γήρανση Πηγή: Γήρανση είναι το φαινόμενο που περιγράφει τη μη αναστρέψιμη παύση της διαίρεσης των κυττάρων. Η ενασχόληση της Ιατρικής με την αντι-γήρανση δεν είναι καινούριο φαινόμενο αλλά στις μέρες μας τα δεδομένα αλλάζουν ραγδαία με τις επιταχυνόμενες εξελίξεις. Ως σημείο εκκίνησης της σύγχρονης έρευνας για το φαινόμενο της "κυτταρικής γήρανσης" θεωρείται η μελέτη ενός από τους σημαντικότερους μηχανισμούς της γήρανσης από το βιολόγο Leonard Hayflick. Ο ερευνητής παρέλαβε κύτταρα εμβρύου και τα καλλιέργησε σε τρυβλίο Petri παρέχοντάς τους θρεπτικές ουσίες για να διαιρούνται. Μετά από 100 περίπου διαιρέσεις ο κύκλος διακόπηκε, ενώ ο μεταβολισμός των κυττάρων επιβραδύνθηκε και οι μεμβράνες υποβαθμίστηκαν ποιοτικά. Το όριο στον αριθμό διαιρέσεων των κυττάρων είναι και το "κλειδί" της γήρανσης του οργανισμού. Το φαινόμενο αποδόθηκε στις ελεύθερες ρίζες οι οποίες μπορούν να καταστρέψουν σημαντικά κυτταρικά στοιχεία, και να καταστρέψουν ακόμα και το DNA. Η προφανής λύση ήταν η χορήγηση αντιοξειδωτικών. Τα αντιοξειδωτικά όμως δεν αρκούσαν για την επιβράδυνση της γήρανσης. Στα μέσα της δεκαετίας του 90 οι έρευνες είχαν 29 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

30 προσανατολισθεί προς έναν άλλο μηχανισμός γήρανσης, τη γλυκοζυλίωση, τη σύνδεση δηλαδή των πρωτεϊνών με σάκχαρα, πράγμα που τις καθιστά μαλακές και κολλώδεις. Οι γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες σχηματίζουν ένα δύσκαμπτο πλέγμα που παρεμποδίζει τη λειτουργία των ιστών όπως οι αρθρώσεις, ο φακός του οφθαλμού, οι αρτηρίες κα. Παράλληλα προχωρούσε η έρευνα πάνω στους μηχανισμούς της κυτταρικής γήρανσης. Στην πορεία της διερεύνησης του ανθρώπινου γονιδιώματος οι ερευνητές ανακάλυψαν το συσχετισμό των τελομερών με τη διαδικασία γήρανσης. Τα τελομερή είναι βραχείες αλληλουχίες DNA στα άκρα κάθε χρωμοσώματος που δεν φέρουν γενετικές πληροφορίες αλλά φθείρονται (γίνονται βραχύτερα) σε κάθε αναδιπλασσιασμό του γενετικού υλικού. Τα μόνα κύτταρα που εξαιρούνται είναι τα αθάνατα κύτταρα του σπέρματος αλλά και τα καρκινικά που δεν γνωρίζουν περιορισμό στον αριθμό των διαιρέσεων. Η υπόθεση ήταν ότι η καταστροφή του τελομερούς άφηνε εκτεθειμένα τα ακραία γονίδια του χρωμοσώματος τα οποία και παρήγαγαν ανεξέλεγκτα πρωτεΐνες προκαλώντας γήρανση. Στόχος ήταν να μελετηθεί ο μηχανισμός που εξασφαλίζει την ακεραιότητα των τελομερών στα σπερματοζωάρια και στους μονοκύτταρους οργανισμούς. Το 1984 οι Carol Greider και Elizabeth Blackburn εντόπισαν ένα ένζυμο ικανό να αποκαθιστά τα τελομερή στο αρχικό τους μήκος, το οποίο ονόμασαν τελομεράση. Το 2010 οι Elizabeth H. Blackburn, Carol W. Greider και Jack W. Szostak πήραν το βραβείο Νόμπελ στην Ιατρική για την ανακάλυψη του τρόπου με τον οποίο τα χρωμοσώματα προστατεύονται από τα τελομερή και την τελομεράση. Όπως αναφέρει ο Ευάγγελος Μαγκίρης στο άρθρο του "Μακροβιοτική Ιατρική: Ένα φιλόδοξο όραμα" (Περισκόπιο, Η Ιατρική του 21ου αιώνα, τόμος 2, 2009 ) "οι συνεχιζόμενες έρευνες στρέφονται στον έλεγχο της ρύθμισης του γονιδίου της τελομεράσης με στόχο την ελεγχόμενη ενεργοποίηση και απενεργοποίησή του, ώστε να διατηρείται η ισορροπία του οργανισμού. Μπορεί η σύγχρονη γονιδιοτεχνολογία να εντοπίσει μια ικανοποιητική λύση για αυτό το πρόβλημα. Ήδη υποστηρίζεται ότι έχει αναπτυχτεί μέθοδος μεταφοράς του γονιδίου της τελομεράσης (από την εταιρεία Geron) με τη βοήθεια της οποίας επιτυγχάνεται η επούλωση τραυμάτων σε περιπτώσεις όπου υπάρχουν προβλήματα σχετιζόμενα με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό". Στο μέλλον όμως, ο μηχανισμός αυτός της "γήρανσης" ενδέχεται να χρησιμοποιηθεί και ως αντικαρκινική θεραπεία. Έτσι οι καρκινοπαθείς δεν θα χρειάζεται να λαμβάνουν τοξικά φάρμακα για να απαλλαγούν από τη νόσο, υποστηρίζουν επιστήμονες, που ανακάλυψαν μια νέα μοριακή οδό που εξαναγκάζει τα καρκινικά κύτταρα να... γεράσουν πρόωρα και να πεθάνουν. Σύμφωνα με τα ευρήματα μιας μελέτης σε ποντίκια που πραγματοποίησαν ο Pier Paolo Pandolfi από την Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ και οι συνάδελφοί του, ο αποκλεισμός του καρκινογόνου γονιδίου Skp2 πυροδότησε την έναρξη μιας διαδικασίας γήρανσης των καρκινικών κυττάρων -της ίδιας διαδικασίας που παρατηρείται στη φωτογήρανση. Όπως αναφέρουν οι ερευνητές στο περιοδικό Nature, το εύρημα αυτό ενδέχεται να οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας νέας στρατηγικής για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν στη μελέτη τους ποντίκια που είχαν τροποποιηθεί γενετικά ώστε να αναπτύξουν μια μορφή καρκίνου του προστάτη, απενεργοποιώντας σε ορισμένα εξ αυτών 30 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

31 το γονίδιο Skp2. Όταν τα ποντίκια έφθασαν στην ηλικία των έξι μηνών, οι επιστήμονες διαπίστωσαν ότι τα ζώα στα οποία το Skp2 είχε απενεργοποιηθεί δεν είχαν αναπτύξει όγκους, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα ποντίκια. Η ανάλυση ιστών που ελήφθησαν από τους λεμφαδένες και τον προστάτη των ποντικιών με ανενεργό Skp2 έδειξε ότι πολλά κύτταρα είχαν αρχίσει να γερνούν και ο ρυθμός κυτταρικής διαίρεσης ήταν αργός, κάτι που δεν συνέβαινε στα ποντίκια με φυσιολογική λειτουργία του Skp2. Οι ερευνητές επισημαίνουν εκ των προτέρων ότι η σχετιζόμενη με το Skp2 οδός γήρανσης φαίνεται να είναι ενεργή μόνο στα καρκινικά και όχι στα υγιή κύτταρα. "Δεν γερνά ο ασθενής, αλλά μόνο ο καρκίνος", δήλωσε ο Pandolfi, απαντώντας σε μια αναμενόμενη υποθετική ερώτηση. Πηγή: Reuters "Cancer cells made to grow old and die" Ο μηχανισμός αναπαραγωγικής γήρανσης σε κύτταρα ανθρώπου εξαρτάται από την πρωτεΐνη p53. Το γονίδιο της p53 είναι ογκο-κατασταλτικό γονίδιο. Απενεργοποίηση της πρωτεΐνης p53 λόγω μετάλλαξης συσχετίζεται με συσσώρευση βλαβών στο DNA του κυττάρου, επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και προδιάθεση σε καρκινογένεση. Μεταλλάξεις στο γονίδιο p53 παρατηρούνται σε περισσότερο από 50% των νεοπλασιών του ανθρώπου. H πρωτεΐνη p53 προσδένεται σε ρυθμιστικές αλληλουχίες γονιδίων- στόχων και επάγει τη μεταγραφή αυτών. Στόχοι της p53 περιλαμβάνουν γονίδια που κωδικοποιούν για αναστολείς CDK πρωτεϊνών και οδηγούν στο σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου. Η αναπαραγωγική γήρανση είναι ένα μόνιμο σταμάτημα του κυτταρικού κύκλου. Αντιγραφή των τελομερών του DNA Απαιτεί τη δράση της τελομεράσης, ενζύμου με ενεργότητα αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase) Η τελομεράση προσδένεται στα τελευταία νουκλεοτίδια του 3 άκρου του DNA και χρησιμοποιεί το συστατικό της RNA ως καλούπι για τη σύνθεση telomeric repeats στο 3 άκρο του DNA Ακολούθως, οι DNA pols α, δ συνθέτουν τα telomeric repeats στην 5 αλυσίδα του DNA έχοντας ως καλούπι τις αλληλουχίες του 3 άκρου Τέλος, τα άκρα του DNA τροποποιούνται από ενδονουκλεάσες και δημιουργείται το telomere cap στο άκρο του DNA με τη συμμετοχή πρωτεϊνών Telomere Repeat Factors (TRFs) Το μήκος των τελομερών καθορίζει την αναπαραγωγική ηλικία του κυττάρου Τα σωματικά κύτταρα του ανθρώπου δεν εκφράζουν telomerase Σε κάθε αντιγραφή του DNA τα τελομερή «χάνουν» ζεύγη νουκλεοτιδίων (base pairs, bp) Μετά από περιορισμένο αριθμό κύκλων αντιγραφής του DNA - κυτταρικών διαιρέσεων, τα τελομερή συρρικνώνονται σε ένα ελάχιστο μήκος και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός σταματά, δηλ. επέρχεται Αναπαραγωγική Γήρανση (Replicative Senescence) 31 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΒΛΑΒΕΣ και ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ του DNA Α. Γενικά Η ποικιλία των ζωντανών οργανισμών και η επιτυχία τους να εποικίσουν σχεδόν κάθε γωνιά της γης, στηρίζεται σε γενετικές αλλαγές που συσσωρεύτηκαν σταδιακά μέσα σ' εκατομμύρια χρόνια και επέτρεψαν στους οργανισμούς να προσαρμόζονται σε μεταβαλλόμενες συνθήκες και να εγκαθίστανται σε νέες περιοχές. Ωστόσο, βραχυπρόθεσμα και από τη σκοπιά ενός ξεχωριστού οργανισμού, οι γενετικές αλλαγές είναι επιζήμιες. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τους πολυκύτταρους οργανισμούς, όπου μια γενετική αλλαγή είναι πολύ πιθανό να διαταράξει την εξαιρετικά πολύπλοκη και συντονισμένη ανάπτυξη και φυσιολογία του οργανισμού. Η επιβίωση και η αναπαραγωγή των οργανισμών, δηλαδή η λεγόμενη "διαιώνιση των ειδών" εξαρτάται από τη γενετική τους σταθερότητα. Η σταθερότητα επιτυγχάνεται μέσω α) της λειτουργίας του εξαιρετικά ακριβούς μηχανισμού της αντιγραφής του DΝΑ ώστε να εξασφαλιστεί η πιστότητα κληρονόµησης των γενετικών πληροφοριών, οι οποίες είναι κωδικοποιημένες στο DNA. Ο ηµισυντηρητικός τρόπος αντιγραφής του DNA εξασφαλίζει την ακριβή αντιγραφή των δύο ελίκων, μεταγραφή της μίας έλικας του DNA και την ακριβή παραγωγή πρωτεϊνών, γεγονότα που εξασφαλίζουν τη σωστή λειτουργία του κυττάρου. Η σταθερότητα επιτυγχάνεται όμως και μέσω β) της λειτουργίας μηχανισμών για την επιδιόρθωση των σπάνιων λαθών που γίνονται κατά την αντιγραφή του DΝΑ και των τυχαίων βλαβών που συμβαίνουν συνεχώς στο DΝΑ. Οι περισσότερες από αυτές τις μεταβολές του DΝΑ είναι παροδικές, επειδή αποκαθίστανται αμέσως από διεργασίες οι οποίες συλλογικά περιγράφονται με τον όρο επιδιόρθωση του DΝΑ (βλέπε παρακάτω). Β. ΛΑΘΗ στο DNA Παρ όλη την πιστότητα αντιγραφής του DNA κατά το μηχανισµό αντιγραφής του και την κινητοποίηση επιδιορθωτικών μηχανισμών τελικά εμφανίζεται µη ακριβής τοποθέτηση αζωτούχων βάσεων σε αναλογία 1 λάθος κάθε 109 νουκλεοτίδια και επιπλέον επειδή το κύτταρο δεν είναι ένα κλειστό και απομονωμένο σύστημα αλλά το DNA του κυττάρου επηρεάζεται από το εσωτερικό και εξωτερικό του περιβάλλον, τελικά δημιουργούνται βλάβες καθ' όλη τη διάρκεια ζωής του κυττάρου. Ορισμένες από τις βλάβες στο DNA εάν δεν αντικατασταθούν, εγκαθίστανται και μπορεί να οδηγήσουν σε µία μετέπειτα αντιγραφή του DNA, σε μόνιμη μεταλλαγή στη συμπληρωματικότητα των βάσεων και σε σπάνιες περιπτώσεις κληρονόμησης των βλαβών (μεταλλάξεις), που αντανακλούν σε λάθη μεταγραφής του DNA και κατ επέκταση στην παραγωγή ελαττωματικών πρωτεϊνών, ενώ άλλες βλάβες είναι δυνατό να προκαλέσουν τον κυτταρικό θάνατο. Είναι πολύ σημαντικό να προστατεύονται από μεταλλάξεις τα αναπαραγωγικά κύτταρα (germ cells). Μία μετάλλαξη σ' ένα από αυτά τα κύτταρα θα μεταβιβαστεί σε όλα τα κύτταρα του πολυκύτταρου οργανισμού ο οποίος αναπτύσσεται από αυτό, συμπεριλαμβανομένων και των γαμετικών κυττάρων για την παραγωγή της επόμενης γενεάς. Ωστόσο, εξίσου απαραίτητο είναι να προστατεύονται από γενετικές αλλαγές και τα πολλά άλλα κύτταρα ενός πολυκύτταρου οργανισμού (τα σωματικά κύτταρα), ώστε να διασφαλιστεί η υγεία και η 32 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

33 ευημερία του. Οι αλλαγές νουκλεοτιδίων που συμβαίνουν σε σωματικά κύτταρα μπορεί να δημιουργήσουν παραλλαγμένα κύτταρα, ορισμένα από τα οποία αυξάνουν με ανεξέλεγκτο τρόπο εις βάρος των υπολοίπων κυττάρων του οργανισμού. Σε ακραία περίπτωση, προκύπτει ο ανεξέλεγκτος κυτταρικός πολλαπλασιασμός που εκδηλώνεται ως καρκίνος. Οι διάφορες μορφές του καρκίνου, οι οποίες ευθύνονται περίπου για το 30% των θανάτων που συμβαίνουν στην Ευρώπη και τη Βόρειο Αμερική, σε μεγάλο βαθμό οφείλονται στη σταδιακή συσσώρευση αλλαγών στις αλληλουχίες του DΝΑ των σωματικών κυττάρων λόγω τυχαίων μεταλλάξεων. Επομένως, μια δεκαπλάσια αύξηση στη συχνότητα των μεταλλάξεων θα οδηγούσε σε καταστροφική αύξηση της επίπτωσης του καρκίνου, με επιτάχυνση του ρυθμού της παραγωγής των παραλλαγμένων σωματικών κυττάρων. Γ. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ - ΑΙΤΙΑ ΒΛΑΒΩΝ ΤΟΥ DNA Το γονιδίωμα των ευκαρυωτικών κυττάρων βρίσκεται κάτω από συνεχείς "επιθέσεις". Τα λάθη στο DNA μπορεί να προέρχονται από ενδογενείς ή εξωγενείς παράγοντες. Λάθη στο DNA συμβαίνουν αυθόρμητα κατά τη διάρκεια της ζωής ενός κυττάρου. Ένας μεγάλος αριθμός λαθών -βλαβών, προέρχονται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, η ιονίζουσα ακτινοβολία και διάφοροι γενο-τοξικοί χημικοί παράγοντες. Παράλληλα, το γονιδίωμα μπορεί να υποστεί βλάβες και από παραπροϊόντα του ίδιου του φυσιολογικού μεταβολισμού του κυττάρου, όπως ενεργές ρίζες οξυγόνου (Reactive Oxygen Species-ROS) (π.χ. υπεροξειδικά ανιόντα, ρίζες υδροξυλίου κ.α.), που προέρχονται από την αναπνευστική μηχανή ή από μηχανισμούς υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Όμως όπως είναι γνωστό, παράγοντες που είναι σε θέση να επάγουν βλάβες στο γενετικό υλικό, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία, η υπεριώδης ακτινοβολία (φωτοδυναμική θεραπεία) και οι περισσότεροι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, χρησιμοποιούνται με ιδιαίτερη επιτυχία στη θεραπευτική αντιμετώπιση συνήθων ασθενειών, όπως ο καρκίνος, αρτηριακές στενώσεις κ.α. Ενώ η βλάβη του DNA στα τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα (πχ νευρικά, μυϊκά κα) κινητοποιεί τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης, προκειμένου να εξασφαλιστεί η ακεραιότητα του μεταγραφόμενου γονιδιώματος, αντίστοιχες βλάβες σε ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, ενεργοποιεί τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (checkpoints). Τα σημεία αυτά σταματούν τον κυτταρικό κύκλο προκειμένου να επιτρέψουν στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς να λειτουργήσουν, αποτρέποντας τη μεταφορά λανθασμένης γενετικής πληροφορίας στις επόμενες κυτταρικές γενεές. Οι Ενδογενείς Βλάβες προκαλούνται κατά τη διάρκεια ενδογενών κυτταρικών διαδικασιών (όπως αντιγραφή DNA, μεταβολισμός που κατά τη διάρκεια του παράγονται Δραστικές Οξυγονούχες Ενώσεις (Reactive Oxygen Species, ROS) ) Ενδογενής βλάβη, λόγω της εγγενούς αστάθειας των χημικών δεσμών στη δομή του DNA, εμφανίζεται αυθόρμητα υπό κανονικές φυσιολογικές συνθήκες και υπολογίζεται να είναι περίπου 10 4 συμβάντα ανά κύτταρο, ανά ημέρα (Lindahl, 1993). Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA μπορεί να προκληθεί κατάρρευση της πιρούνας αντιγραφής του DNA και δίκλωνες σχάσεις (DSBs) με σκοπό την επανέναρξη της διαδικασίας 33 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

34 της αντιγραφής των χρωμοσωμάτων. Οι Εξωγενείς Βλάβες προκαλούνται από εξωγενείς παράγοντες όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία (Ionizing Radiation - IR) ή γονοτοξικούς παράγοντες στα τρόφιμα / νερό και το περιβάλλον, στο οποίο ένας οργανισμός είναι εκτεθειμένος, θερμική διάσπαση, τοξίνες, κάπνισμα, χημικά μεταλλαξογόνα Μεταξύ των χημικών ουσιών που δρουν ως μεταλλαξιγόνοι παράγοντες έχουν γίνει αποδεκτά τα προϊόντα από τον καπνό των εργοστασίων ή τις εξατμίσεις των αυτοκινήτων (οξείδια του αζώτου). Αντιπροσωπευτικά αναφέρεται ότι από τις χημικές ουσίες κυριότερες μεταλλαξιγόνες είναι οι αζωτούχες ενώσεις (νιτρώδες οξύ Η-ΝΟ 2, νιτροζαμίνες, αλκυλιωτικές ουσίες, οι αρωματικοί υδρογονάνθρακες κ.α.). Ως βιολογικοί μεταλλαξιγόνοι παράγοντες θεωρούνται ορισμένοι ιοί, που προκαλούν βλάβες στο DNA και ιδιαίτερα οι ογκογόνοι ιοί. Δ. ΕΙΔΗ ΒΛΑΒΩΝ ΣΤΟ DNA Οι βλάβες του DNA εμφανίζονται σε διάφορες μορφές οι κυριότερες από τις οποίες είναι: (Pollard & Earnshaw 2002, Alberts B. et al 2006, Ροδάκης, Λεκανίδου, Τσιτήλου 2007): "Τυπογραφικά" λάθη της πολυμεράσης κατά την αντιγραφή του DNA όπως έλλειψη (deletion) βάσεως Αλλοίωση βάσεων με πρόκληση αλκυλίωσης, υδροξυλίωσης ή απαμίνωσης. Προσθήκη ογκωδών χημικών μορίων (adduct) στην έλικα του DNA, με την ενσωμάτωση ενός ογκώδους μορίου. Σχηματισμός διμερών μεταξύ δύο γειτονικών βάσεων πχ πυριμιδίνης. Σχηματισμός χιαστών δεσμών (cross link) στο DNA, είτε ως εσωτερικών (σύνδεση βάσεων από τη μία αλυσίδα στην άλλη), είτε ως σύνδεση μεταξύ DNA και πρωτεϊνών π.χ. με ιστόνες. Παρεμβολή βάσεων (intercalation) στην αλληλουχία του DNA, με αποτέλεσμα να αποδιοργανώνεται το ορθό ζευγάρωμα των βάσεων. Σχηματισμός σχάσεων είτε μονόκλωνες (single strand breaks), είτε δίκλωνες (double strand breaks). Από τη συστηματική μελέτη των βλαπτικών παραγόντων, είναι πλέον γνωστό ότι ο κάθε παράγοντας προκαλεί διαφορετικού τύπου βλάβες στο DNA, με κοινό αποτέλεσμα τη μεταβολή της λειτουργικότητας ή της δομικής του ακεραιότητας. Για αυτό το λόγο, έχουν εξελιχθεί στα ευκαρυωτικά κύτταρα διάφοροι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί, προκειμένου να είναι δυνατή η επιδιόρθωση των διαφορετικών τύπων βλαβών με τον πλέον ακριβή τρόπο. 34 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

35 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 - ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗΣ του DNA Α. Γενικά Όπως προαναφέρθηκε η ακριβής μεταφορά των γενετικών πληροφοριών είναι ζωτικής σημασίας για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, προκειμένου να εγγυηθεί την επιβίωση των ειδών. Η μεγάλη πιστότητα με την οποία αντιγράφονται και διατηρούνται οι αλληλουχίες του DΝΑ έχει σημασία τόσο για τ' αναπαραγωγικά κύτταρα, τα οποία μεταβιβάζουν τα γονίδια στην επόμενη γενεά, όσο και για τα σωματικά κύτταρα, τα οποία φυσιολογικά λειτουργούν ως προσεκτικά ελεγχόμενα μέλη της πολύπλοκης κοινότητας των κυττάρων ενός πολυκύτταρου οργανισμού. Συνεπώς, δεν πρέπει να μας ξενίζει το γεγονός ότι όλα τα κύτταρα έχουν αποκτήσει ένα περίτεχνο σύνολο μηχανισμών μέσω των οποίων ελαττώνουν τον αριθμό των αλλαγών που συμβαίνουν στο DΝΑ τους. ΠΙΝΑΚΑΣ 2: Σύνοψη παραγόντων, βλαβών και επιδιορθωτικών μηχανισμών του DNA Σύνοψη των κυριότερων βλαβών του DNA που μπορεί να προκληθούν από εξωγενείς ή ενδογενείς παράγοντες. Ενδεικτικά αναφέρεται ο πιθανός επιδιορθωτικός μηχανισμός που μπορεί να λειτουργήσει σε κάθε περίπτωση. ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΙΟΝΙΖΟΥΣΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΕΝΕΡΓΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΥΠΕΡΙΩΔΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΠΟΛΥΚΥΚΛΙΚΟΙ ΑΡΩΜ. ΥΔΡΟΓΟΝΑΝΘΡΑΚΕΣ CIS-PLATIN ΛΑΘΗ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗΣ ΕΝΕΡΓΕΣ ΡΙΖΕΣ ΟΞΥΓΟΝΟΥ ΙΟΝΙΖΟΥΣΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΑΛΚΥΛΙΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ CIS- PLATIN ΤΥΠΟΣ ΒΛΑΒΗΣ ΒΛΑΒΗ DNA ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗΣ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΗ ΒΑΣΗ ΕΛΛΕΙΨΗ ΜΟΝΟΚΛΩΝΗ ΣΧΑΣΗ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΕΚΤΟΜΗ ΒΑΣΗΣ (BASE EXCISION REPAIR) CROSS LINK ΧΗΜΙΚΗ ΠΡΟΣΘΗΚΗ (ADDUCT) ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΕΚΤΟΜΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΟΥ (NOUCLEOTIDE EXCISION REPAIR) ΕΛΛΕΙΨΗ ΠΑΡΕΜΒΟΛΗ ΜΙΚΡΕΣ ΠΡΟΣΘΗΚΕΣ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΛΑΘΟΣ ΒΑΣΗΣ (MISMATCH REPAIR) CROSS LINK ΔΙΚΛΩΝΗ ΣΧΑΣΗ ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟ (ΟΜΟΛΟΓΟ Ή ΜΗ) 35 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

36 Β. Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί του DNA Μέχρι το 2001 είχαν ανακαλυφθεί και χαρακτηριστεί ως προς την αλληλουχία τους περίπου 130 γονίδια που συμμετέχουν στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς του DNA. Μεταλλάξεις στα γονίδια αυτά έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη καρκίνου, καθώς και με ποικίλα κληρονομικά νοσήματα όπως η μελαγχρωματική ξηροδερμία, η αταξίατηλεαγγειαεκτασία, η αναιμία Fanconi, τα σύνδρομα Bloom, Cockayne, Werner, Rothmund- Thomson κα (Boutou et al 2011, Christmann et al 2003). Πέντε είναι οι κύριοι μηχανισμοί επιδιόρθωσης βλαβών του DNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα: Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair-RR) Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER) Επιδιόρθωση λάθος βάσης (μη συμπληρωματικής) (Mismatch Repair-MMR) Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair- NER) Επιδιόρθωση δίκλωνης σχάσης του DNA (DNA Double-Strand Break Repair) Από τους παραπάνω μηχανισμούς ο πρώτος αφορά τόσο τα προκαρυωτικά όσο και τα ευκαρυωτικά κύτταρα, ενώ οι υπόλοιποι κυρίως αναφέρονται σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Αναλυτικότερα: Β.1 Επιδιόρθωση με ανάταξη (Reversion Repair-RR) Στην κατηγορία αυτή περιλαμβάνονται 3 διαφορετικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης: Επιδιόρθωση ενός σταδίου από την Ο 6 μεθυλογουανίνη-dna μεθυλοτρανσφεράση (single step repair by MGMT): ο μηχανισμός αυτός χρησιμοποιείται για την επιδιόρθωση σημειακών βλαβών που επάγονται από αλκυλιωτικούς παράγοντες. Μια από τις πλέον συνήθεις τέτοιες βλάβες είναι η Ο 6 - αλκυλογουανίνη (πχ Ο 6 μέθυλο ή αίθυλογουανίνη), που αποτελεί την κυριότερη πηγή των GC σε AT μεταλλάξεων μετά από αλκυλίωση. Στα κύτταρα των θηλαστικών οι Ο 6 αλκυλιωτικές βλάβες επιδιορθώνονται με ένα στάδιο από τη Ο 6 μεθυλογουανίνη-dna μεθυλοτρανσφεράση (MGMT) (γνωστή και ως ATάση, AGT, AGAT, ομόλογη της Ada της E. coli). Η επιδιορθωτική αυτή πρωτεΐνη μεταφέρει μεθυλικές ή χλωροαιθυλικές ομάδες από την αλκυλιωμένη γουανοσίνη σε κατάλοιπο κυστεΐνης που βρίσκεται στο ενεργό της κέντρο. Η μεταφορά αυτή οδηγεί σε μη αντιστρεπτή αδρανοποίηση της πρωτεΐνης και την οδηγεί απευθείας σε αποδόμηση. Ανάταξη βλάβης του DNA από τα ομόλογα της AlkB: Πρόσφατα έχει περιγραφεί και ένας άλλος τρόπος ανάταξης των μεθυλιωτικών βλαβών του DNA τόσο στη μία (single stranded) όσο και στις δύο (double stranded) αλυσίδες του DNA από τις ομόλογες πρωτεΐνες της οικογένειας AlkB (AlkB1, AlkB2, AlkB3). Οι πρωτεΐνες αυτές δεν παρουσιάζουν δραστηριότητα ούτε νουκλεάσης, ούτε γλυκοζυλάσης, ούτε μέθυλοτρανσφεράσης. Αντί αυτών, παρουσιάζουν ομοιότητες με την υπεροικογένεια των 2- οξυγλουταρικών και των εξαρτώμενων από το σίδηρο διοξυγενασών. Έτσι, οι AlkB 36 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

37 επιδιορθώνουν βλάβες του DNA, όπως η 1-μέθυλο-αδενίνη και 3-μέθυλο-κυτοσίνη. Φωτοεπιδιόρθωση (photoreactivation): στο μηχανισμό αυτό πρωταγωνιστούν πρωτεΐνες της οικογένειας των φωτολυασών / κρυπτοχρωμάτων. Οι φωτολυάσες συνδέονται με μηχανισμούς ανεξαρτήτους από το φως σε σημείο που έχει επαχθεί βλάβη του DNA από υπεριώδη ακτινοβολία. Η αντίδραση επιδιόρθωσης, ωστόσο, γίνεται με τη χρήση της ενέργειας του φωτός μήκους κύματος nm. Με τον τρόπο αυτό αποκαθίστανται οι βλάβες που αφορούν στη δημιουργία διμερών πυριμιδίνης, τα οποία διασπώνται σε μονομερή. Φωτολυάσες ωστόσο, έχουν βρεθεί μόνο σε βακτήρια, κατώτερούς ευκαρυωτικούς οργανισμούς (πχ D. melanogaster) και ορισμένα φυτά αλλά όχι στον άνθρωπο. Β.2 Επιδιόρθωση με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER) Η επιδιόρθωση με εκτομή βάσης είναι ένας μηχανισμός υπεύθυνος για την απομάκρυνση κατεστραμμένων βάσεων του DNA, που αναγνωρίζονται από ειδικά ένζυμα, τις DNA γλυκοζυλάσες. Οι κυριότερες βλάβες που υπόκεινται σε αυτόν τον επιδιορθωτικό μηχανισμό είναι αυτές που προκύπτουν τυχαία από το ίδιο το κύτταρο, μέσω παραγωγής ελευθέρων ριζών προερχόμενων από τον κυτταρικό μεταβολισμό ή από φλεγμονώδεις αντιδράσεις. Επιπλέον, αφορούν βλάβες που προκύπτουν και από εξωγενείς παράγοντες, όπως η ιονίζουσα ακτινοβολία, η υπεριώδης ακτινοβολία μακρού κύματος, αλκυλιωτικούς παράγοντες (π.χ νιτροαζαμίνες) ή διάφορα χημειοθεραπευτικά φάρμακα, που επίσης επάγουν αλκυλιωτικές βλάβες (π.χ αδριαμυκίνη, μιτομυκίνη, DTIC, τεμοζολομίδη) (Christmann et al 2003). Η διαδικασία επιδιόρθωσης με εκτομή βάσης (Base Excision Repair-BER) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα: Αναγνώριση, απομάκρυνση της βάσης και διάνοιξη: το πρώτο βήμα πραγματοποιείται από τις DNA γλυκοζυλάσες, οι οποίες αναγνωρίζουν και απομακρύνουν τη λάθος βάση με υδρόλυση του Ν- γλυκοσιδικού δεσμού (Scharer et al 2001). Στα κύτταρα των θηλαστικών έχουν αναγνωριστεί 11 διαφορετικές γλυκοζυλάσες, με διαφορετική ειδικότητα υποστρωμάτων και διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης (MBD4, MPG, MYH, NEIL1, NEIL2, NEIL3, NTH1, OGG1, SMUG1, TDG, UNG) (Boutou et al 2011, Christmann et al 2003). Αυτές διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: στην κατηγορία Ι ανήκουν εκείνες που απομακρύνουν την κατεστραμμένη βάση αφήνοντας μια απουρινική/απυριμιδινική ΑP (apurinic/apyrimidinic) περιοχή στο DNA (π.χ MPG), ενώ στην κατηγορία ΙΙ ανήκουν εκείνες, οι οποίες μετά την απομάκρυνση της βάσης, διασπούν την περιοχή ΑΡ με μία ενδογενή 3 -ενδονουκλεάση, δημιουργώντας μονόκλωνη θραύση στην περιοχή (π.χ OGG1). Οι γλυκοζυλάσες τύπου Ι διασπούν το φωσφοδιεστερικό δεσμό της περιοχής ΑΡ με μία ΑΡενδονουκλεάση (ΑΡΕ1 alias APEX, ref-1, HAP-1), με αποτέλεσμα το σχηματισμό 5 δεσοξυριβοζυλ-5φωσφορικού (5 drp) και 3 -ΟΗ (Wilson et al 2001). Εισαγωγή νουκλεοτιδίου: η εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου δεν εξαρτάται από τη χημική δομή της ΑΡ περιοχής. Κατά τη διάρκεια της μικρής έκτασης BER (short patch BER), η 5 drp περιοχή αντικαθίσταται από την DNA πολυμεράση β (Polβ), η οποία εισάγει ένα μονήρες νουκλεοτίδιο. Η Polβ επίσης συμμετέχει και στην μεγάλης έκτασης 37 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

38 BER (long-patch BER), εισάγοντας το πρώτο νουκλεοτίδιο στις ανοιγμένες ΑΡ περιοχές (Christmann et al 2003) Απόφαση μεταξύ μικρής ή μεγάλης έκτασης BER: Το κρίσιμο σημείο για την εκτέλεση μικρής ή μεγάλης έκτασης BER είναι η απομάκρυνση του 5 drp μετά την εισαγωγή του πρώτου νουκλεοτιδίου. Εκτός, από την προσθήκη του αρχικού νουκλοετιδίου (πολυμερισμός), η Polβ διαθέτει και ιδιότητα λυάσης, καταλύοντας την απελευθέρωση υπολειμμάτων 5 drp από σχισμένες ΑΡ περιοχές (β- elimination) (Sobol et al 2000). Αντίθετα, σε οξειδωμένες ή ανηγμένες ΑΡ περιοχές, δε συμβαίνει η παραπάνω διαδικασία διάσπασης του 5 drp, αλλά μετά την απομάκρυνση της Polβ ακολουθεί μεγάλης έκτασης BER εξαρτώμενη από την PCNA (Nakamura et al 2000). Αποκατάσταση της μονόκλωνης σχάσης και επιδιορθωτική σύνθεση DNA με μεγάλης έκτασης BER: αυτό μπορεί να πραγματοποιηθεί με τις πολυμεράσες δ και ε (Polδ και Polε), μαζί με τις PCNA και RF-C, οδηγώντας σε μεγαλύτερα τμήματα επιδιόρθωσης που φτάνουν τα 10 νουκλεοτίδια. Πρόσδεση (ligation): η επιδιόρθωση με εκτομή βάσεως ολοκληρώνεται στο στάδιο αυτό, που επιτελείται με τις DNA λιγάσες Ι και ΙΙΙ. Η λιγάση Ι αλληλεπιδρά με τις PCNA και Polβ, συμμετέχοντας κυρίως στην μεγάλης έκτασης BER, ενώ η λιγάση ΙΙΙ αλληλεπιδρά κυρίως με τις Polβ και PARP-1 [poly (ADP-ribose) polymerase I], εμπλεκόμενη στη μικρής έκτασης BER. Εικόνα 10. Base Excision Repair-BER Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης με εκτομή βάσης Πηγή: Christmann et al Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

39 Β.3 Επιδιόρθωση μη συμπληρωματικής βάσης (Mismatch Repair-MMR) Αυτός ο μηχανισμός επιδιόρθωσης είναι υπεύθυνος για την απομάκρυνση μη συμπληρωματικών βάσεων, που προκύπτουν είτε τυχαία ή μη απαμίνωση, οξείδωση ή μεθυλίωση των βάσεων ή από λάθη της αντιγραφής. Οι κύριοι στόχοι της MMR είναι τα λανθασμένα ζεύξη βάσεων, όπως τα G/T (που προκύπτει από την απαμίνωση της 5- μεθυλ-κυτοσίνης), καθώς και τα G/G, A/C και C/C. Η διαδικασία επιδιόρθωσης μη συμπληρωματικής βάσης (Mismatch Repair-MMR) πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα: Αναγνώριση των βλαβών του DNA: η αναγνώριση των βλαβών χημικά τροποποιημένων βάσεων γίνεται από το λεγόμενο σύμπλοκο MutSα, που αποτελείται από τις ομόλογες πρωτεΐνες MSH2 και MSH6. Προκειμένου η σύνδεση τους στις λάθος περιοχές να είναι αποτελεσματική, απαιτείται φωσφορυλίωση του συμπλέγματος MutSα. Επίσης, η MSH2 μπορεί να συνδέεται και με την πρωτεΐνη επιδιόρθωσης MSH3, σχηματίζοντας το σύμπλοκο MutSβ. Το κάθε σύμπλοκο έχει διαφορετικά υποστρώματα και συνεπώς παίζει διαφορετικό ρόλο στην διαδικασία MMR (Christmann et al 2003). Διάκριση μεταξύ μητρικής και θυγατρικής αλυσίδας του DNA: δεν έχει επακριβώς ξεκαθαριστεί ο μηχανισμός με τον οποίο γίνεται η διάκριση των δύο αλυσίδων κατά την MMR. Για το σκοπό αυτό έχουν αναπτυχθεί τουλάχιστον δύο μοντέλα, στα οποία επισημαίνεται ο ρόλος του ATP στη διαδικασία αναγνώρισης. Εκτομή και επιδιορθωτική σύνθεση: από τη στιγμή που το σύμπλοκο MutSα συνδέεται στην περιοχή της λάνθασμένης βάσης, αλληλεπιδρά με ένα άλλο ετεροδιμερές σύμπλοκο, το MutL, που αποτελείται από τις ομόλογες επιδιορθωτικές πρωτεΐνες MLH1 και PMS2. Η εκτομή του τμήματος του DNA που φέρει τη λάθος βάση γίνεται από την εξωνουκλεάση Ι και η νέα σύνθεση από την πολυμεράση δ (polδ). Εικόνα 11. Mismatch Repair-MMR Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης μη συμπληρωματικής βάσης Πηγή: Christmann et al 2003 Β.4 Επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (Nucleotide Excision Repair- NER) Η επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου είναι ο σημαντικότερος μηχανισμός επισκευής 39 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

40 μεγάλων βλαβών του DNA, που προκαλούνται από την υπεριώδη ακτινοβολία, όπως διάφορα φωτοπροϊόντα (6-4 photoproducts) διμερή πυριμιδίνης, διασταυρώσεις μέσα στην ίδια αλυσίδα (cross links), καθώς και μεγάλες χημικές προσθήκες (adducts) που προκαλούνται από διάφορους γενοτοξικούς παράγοντες (πχ άλφα τοξίνη, βενζοπυρένιο κα). H NER πραγματοποιείται με δύο ξεχωριστά μονοπάτια, που ονομάζονται : γενική επιδιόρθωση του γονιδιώματος (global genomic repair-ggr) και επιδιόρθωση συνδεδεμένη με τη μεταγραφή (transcription coupled repair-tcr). Το μονοπάτι GGR θεωρείται ανεξάρτητο από τη μεταγραφή και απομακρύνει βλάβες από μη μεταγραφόμενες περιοχές του γονιδιώματος ή από το μη-μεταγραφόμενο τμήμα των μεταγραφόμενων περιοχών. Αντίθετα, η TCR απομακρύνει διάφορες περιοχές αναστολής της RNA- πολυμεράσης από τις μεταγραφόμενες περιοχές των ενεργών γονιδίων. Β.4.1 Ο μηχανισμός της γενικής επιδιόρθωσης του γονιδιώματος (GGR), περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια : Αναγνώριση της βλάβης του DNA: η βλάβη αρχικώς αναγνωρίζεται από τα συμπλέγματα XPC- HR23B και RPA-XPA (υπάρχουν 7 γονίδια που συμμετέχουν σε αυτό το μονοπάτι XPA-XPG, που παίρνουν την ονομασία τους από τη διαταραχή μελεγχρωματικό ξηρόδερμα xeroderma pigmentosum, στο οποίο παρατηρείται αυξημένη ευπάθεια στην υπεριώδη ακτινοβολία και συχνή ανάπτυξη καρκίνου του δέρματος, λόγω μετάλλαξης αυτών των γονιδίων). Επιπλέον, ένας άλλος σημαντικός παράγοντας που συμμετέχει στην αναγνώριση βλαβών από υπεριώδη ακτινοβολία είναι η πρωτεΐνη DDB (damaged DNA binding protein), ένα ετεροδιμερές αποτελούμενο από τις υπομονάδες DDB1 και DDB2 που ανήκει στην ομάδα XPE. Ξεδίπλωμα του DNA (DNA unwinding): μετά την αναγνώριση της βλάβης, ένας μεταγραφικός παράγοντας που αποτελείται από 7 διαφορετικές πρωτεΐνες (XPB, XPD, GTF2H1, GTF2H2, GTF2H3, GTF2H4, CDK7, CCNH και MNAT1) μεταναστεύει στο σημείο της βλάβης, επαγόμενος από την XPC- HR23B. Ο παράγων αυτός διαθέτει δραστηριότητα ελικάσης από τις υπομονάδες του XPB και XPD, με αποτέλεσμα το ξεδίπλωμα του DNA γύρω από την περιοχή της βλάβης (Yokoi et al 2000). Αποκοπή της βλάβης: πραγματοποιείται με διπλή τομή στα άκρα του "κρημνού". Η 3 εκτομή γίνεται με την XPG και η 5 εκτομή με την XPF-ERCC1. Επιδιορθωτική σύνθεση του DNA: το κενό που προκύπτει συμπληρώνεται από τις πολυμεράσες δ και ε και η τελική πρόσδεση γίνεται από τη λιγάση Ι και άλλους βοηθητικούς παράγοντες 40 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

41 Β.4.2 Ο μηχανισμός της συνδεδεμένης με τη μεταγραφή επιδιόρθωσης (transcription coupled repair- TCR) περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια : Αναστολή της RNA-πολυμεράσης ΙΙ (RNAPII): η απομάκρυνση γίνεται από τις πρωτεΐνες CSA και CSB (οι οποίες πήραν το όνομα τους από το σύνδρομο Cockayne s, στο οποίο η μετάλλαξη τους οδηγεί σε ανεπάρκεια του μηχανισμού TCR, με αποτέλεσμα σημαντική ανεπάρκεια του μεταγραφικού μηχανισμού των κυττάρων). Υπάρχει η άποψη ότι η CSB δρα ως αποσυζευκτικός παράγοντας, απομακρύνοντας το σύμπλοκο RNAPII, που έχει ακινητοποιηθεί στο σημείο της βλάβης. Στη διαδικασία αυτή μπορεί να συμβάλλει σε ορισμένες περιπτώσεις και ο παράγοντας TFIIS, ο οποίος δεν απομακρύνει, αλλά μετατοπίζει την RNAPII κατά 35 περίπου νουκλεοτίδια, καθιστώντας την περιοχή της βλάβης προσβάσιμη για επιδιόρθωση (Christmann et al 2003). Αποκοπή της βλάβης: πραγματοποιείται με τις εξωνουκλεάσες XPF-ERCC1 και XPG, όπως και στην GGR. Επιδιορθωτική σύνθεση του DNA: το κενό που προκύπτει συμπληρώνεται από τις πολυμεράσες δ και ε και η τελική πρόσδεση γίνεται από τη λιγάση Ι, όπως και στην GGR. Εικόνα 12. Nucleotide Excision Repair - NER Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης με εκτομή νουκλεοτιδίου Πηγή: Christmann et al Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

42 Β.5 Επιδιόρθωση δίκλωνων σχάσεων του DNA (μετα-αντιγραφική επιδιόρθωση) Η διπλή σχάση των αλυσίδων του DNA, αποτελεί την πλέον γενοτοξική βλάβη, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρού βαθμού χρωμοσωμικές ανωμαλίες (θραύσεις χρωμοσωμάτων, μετατοπίσεις, ανταλλαγές κ.α) ή σε κυτταρικό θάνατο. Για το λόγο αυτό η άμεση και αποτελεσματική επιδιόρθωση της βλάβης αποκτά ιδιαίτερη βιολογική σημασία. Έχουν περιγραφεί δύο μηχανισμοί για την επιδιόρθωση των δίκλωνων σχάσεων του DNA: ο ομόλογος ανασυνδυασμός (homologous recombination-hr) και η μη ομόλογη σύνδεση των άκρων (non homologous end-joining NHEJ) Από αυτούς, ο μεν πρώτος είναι χωρίς λάθη, ενώ αντίθετα ο δεύτερος επιρρεπής σε λάθη, με αποτέλεσμα απώλεια γενετικής πληροφορίας. Η χρήση του ενός ή του άλλου τύπου εξαρτάται μεταξύ των άλλων και από τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία επάγεται η βλάβη, όπου η NHEJ συμβαίνει κυρίως στη φάση G0/G1, ενώ ο HR προς το τέλος της S ή στη G2 φάση, αφού απαραίτητη προϋπόθεση για να γίνει ομόλογος ανασυνδυασμός είναι να έχει προηγηθεί ο διπλασιασμός του DNA και ο σχηματισμός των δύο αδερφών χρωματίδων. Β.5.1 Ο μηχανισμός μη ομόλογης σύνδεσης των άκρων non homologous end-joining NHEJ Κατά την μη ομόλογη σύνδεση των άκρων, συνδέονται τα άκρα των σπασμένων αλυσίδων του DNA, χωρίς να εξασφαλίζεται απαραίτητα η ομολογία των βάσεων στα σημεία της σύνδεσης. Το πρώτο βήμα κατά τη διαδικασία αυτή είναι η σύνδεση ενός ετεροδιμερούς συμπλέγματος, αποτελούμενου από τις πρωτεΐνες Ku78 και Ku80, που προστατεύει τη περιοχή της βλάβης από διάσπαση από εξωνουκλεάσες. Μετά τη σύνδεση του στο DNA το ετεροδιμερές αλληλεπιδρά με την καταλυτική υπομονάδα της DNA-PK (XRCC7, DNA-PKcs) σχηματίζοντας το αντίστοιχο ολοένζυμο. Το DNA-PKcs ενεργοποιεί το μόριο XRCC4, το οποίο βρίσκεται προσδεμένο στη λιγάση IV, η οποία συνδέει τα σπασμένα άκρα μεταξύ τους. Στην πλειοψηφία, όμως των περιπτώσεων, η απευθείας αυτή σύνδεση των σπασμένων άκρων που έχουν προκύψει από μεταλλαξιογόνους παράγοντες δεν είναι εφικτή, αλλά θα πρέπει να προηγηθεί επεξεργασία των σπασμένων άκρων. Αυτό γίνεται κυρίως με το σύμπλοκο MRE11-Rad50-NBS1, το οποίο διαθέτει δραστηριότητα εξωνουκλεάσης, ενδονουκλεάσης και ελικάσης και απομακρύνει περίσσειες DNA στο 3 άκρο. Αντίστοιχα, η επεξεργασία στο 5 άκρο γίνεται από την ενδονουκλεάση FEN 1 (Christmann et al 2003). 42 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

43 Εικόνα 13. Non Homologous End Joining - NHEJ Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης των δίκλωνων σχάσεων του DNA με μη ομόλογη σύνδεση των άκρων Πηγή: Christmann et al 2003 Β.5.2 Ο μηχανισμός του ομόλογου ανασυνδυασμού Κατά τον ομόλογο ανασυνδυασμό το κατεστραμμένο χρωμόσωμα έρχεται σε άμεση επαφή με ένα ομόλογο μη κατεστραμμένο τμήμα DNA συνήθως της αδερφής χρωματίδας, το οποίο χρησιμεύει ως μήτρα για την επιδιόρθωση. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός ξεκινά με τη νουκλεολυτική εκτομή των δύο σπασμένων αλυσίδων στην κατεύθυνση 5-3 από το σύμπλοκο MRE11-Rad50-NBS1. Στη συνέχεια, κάθε 3 σπασμένο τμήμα του DNA συνδέεται με ένα επταμερές δακτυλιοειδές σύμπλοκο που σχηματίζεται από τις πρωτεΐνες Rad52, που το προστατεύει από περαιτέρω διάσπαση από εξωνουκλεάσες. Κατόπιν, το σύμπλοκο Rad52 αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο RAD51 (RAD51B, RAD51C, RAD51D, XRCC2 και XRCC3), ενεργοποιώντας τη διαδικασία ανταλλαγής ομόλογων τμημάτων γενετικού υλικού μεταξύ της κατεστραμμένης και ακέραιης αδερφής χρωματίδας. Επίσης, μία άλλη σημαντική πρωτεΐνη, που αλληλεπιδρά με τη RAD51 είναι και η RPA, η οποία συνδέεται στη μετατοπισμένη αλυσίδα σταθεροποιώντας την επαγόμενη από το RAD51 ανταλλαγή ομόλογων τμημάτων. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας σύνθεσης του DNA ακολουθεί η τελική σύνδεση (ligation) και μετανάστευση (branch migration) των επιδιορθωμένων τμημάτων. Επειδή η επιδιόρθωση του DNA από τον υψηλής πιστότητας μηχανισμό του ομόλογου ανασυνδυασμού, γνωστή με τον όρο HRR- Homologous Recombinational Repair (Επιδιόρθωση με Ομόλογο Ανασυνδυασμό) είναι πρακτικά, ο μόνος "αλάνθαστος" μηχανισμός επιδιόρθωσης του κυττάρου θα αναλυθεί παρακάτω σε ξεχωριστό κεφάλαιο. 43 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

44 Εικόνα 14. Homologous Recombination Repair - HRR Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης δίκλωνων σχάσεων του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό. Πηγή: Christmann et al Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

45 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 - Επιδιόρθωση DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό Α. Γενικά για τον Αvασυvδυασμό του DNA Γνωρίζουμε ότι οι αλληλουχίες DΝΑ του κυττάρου μεταβιβάζονται από γενιά σε γενιά με πολύ λίγες αλλαγές. Ωστόσο, με το πέρασμα του χρόνου οι αλλαγές συσσωρεύονται και έτσι το DΝΑ των χρωμοσωμάτων μεταβάλλεται και επίσης μπορεί ν' ανασυνδυαστεί. Το ιδιαίτερο σύνολο γονιδίων που περιέχει το γονιδίωμα ενός οργανισμού συχνά τροποποιείται από τέτοιες αναδιατάξεις του DNA. Σ' έναν πληθυσμό, αυτό το είδος γενετικής ποικιλότητας επιτρέπει στους οργανισμούς να εξελίσσονται απαντώντας σε αλλαγές του περιβάλλοντος. Οι αναδιατάξεις του DNA προκαλούνται από ένα είδος μοριακών μηχανισμών που αποκαλούνται γενετικός ανασυνδυασμός. Υπάρχουν αρκετοί τύποι μηχανισμών ανασυνδυασμού που μπορεί να επιφέρουν αλλαγές στο γονιδίωμα ενός ξεχωριστού κυττάρου. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός προκαλεί ανταλλαγή γενετικών πληροφοριών με ακρίβεια. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός ίσως είναι ο πιο θεμελιώδης μηχανισμός ανασυνδυασμού. Τα βασικά χαρακτηριστικά του φαίνεται ότι είναι τα ίδια σε όλους τους οργανισμούς πάνω στη Γη. Παρόλο που ο μηχανισμός του ομόλογου ανασυνδυασμού δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, οι ακόλουθες ιδιότητες πιθανώς είναι κοινές σε όλα τα κύτταρα: 1. Δύο δίκλωνα μόρια DNA που έχουν περιοχές με πολύ παρόμοια (ομόλογη) αλληλουχία νουκλεοτιδίων παρατάσσονται έτσι ώστε οι ομόλογες αλληλουχίες τους να βρίσκονται αντικριστά. Στη συνέχεια, τα μόρια αυτά μπορεί να επιχιαστούν: συγκεκριμένα, σε μια πολύπλοκη αντίδραση, οι δυο κλώνοι κάθε διπλής έλικας σπάζουν και τα σπασμένα άκρα ενώνονται με τα άκρα του απέναντι μορίου του DNA και ξανασχηματίζουν δύο ακέραιες διπλές έλικες που αποτελούνται από τμήματα και των δύο, διαφορετικών, μορίων του DNA (Εικόνα δεξιά ). 2. Η θέση της ανταλλαγής (το σημείο όπου η κόκκινη διπλή έλικα ενώνεται με την πράσινη) μπορεί να βρίσκεται οπουδήποτε μέσα στις ομόλογες αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων των δύο ανασυνδυαζόμενων μορίων DNA. 3. Στη θέση της ανταλλαγής, οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων δεν μεταβάλλονται. Το σπάσιμο και η επανασύνδεση γίνονται με τέτοια ακρίβεια ώστε να μην χάνεται αλλά ούτε και να κερδίζεται έστω και ένα νουκλεοτίδιο. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός αρχίζει μ' ένα απότομο χτύπημα: ένα ειδικό ένζυμο κόβει ταυτόχρονα και τους δύο κλώνους της διπλής έλικας και δημιουργεί ένα πλήρες ρήγμα στο μόριο του DΝΑ. Στη συνέχεια τα 5' άκρα του ρήγματος υποδομούνται από ένα ένζυμο που πέπτει το DNA, αφήνοντας Εικόνα 15. Αvασυvδυασμόs DNA 45 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

46 προεξέχοντα μονόκλωνα 3' άκρα. Καθένα από αυτά τα μονόκλωνα τμήματα αναζητά μια ομόλογη συμπληρωματική έλικα DΝΑ για να ζευγαρώσει. Αν συμβεί αυτό, τότε μεταξύ των δύο χρωμοσωμάτων θα δημιουργηθεί ένα "κοινό μόριο". Οι εγκοπές στους κλώνους του DΝΑ "σφραγίζονται" ώστε τα δύο μόρια του DΝΑ να συγκρατούνται τώρα μέσω επιχιασμού μεταξύ των δύο κλώνων, έναν από κάθε μόριο. Αυτό το κρίσιμο ενδιάμεσο στον ομόλογο ανασυνδυασμό αναφέρεται ως δομή ανταλλαγής των διασταυρούμενων κλώνων (cross - strand exchange) ή σύνδεση του Holliday (Holliday junction) Τα κύτταρα χρησιμοποιούν εξειδικευμένες πρωτεΐνες για να διευκολύνουν τον ομόλογο ανασυνδυασμό. Οι πρωτεΐνες αυτές προκαλούν εγκοπές στο DNA, καταλύουν την ανταλλαγή των κλώνων και κόβουν τις δομές Holliday. Επιχιασμός είναι το φαινόμενο κατά το οποίο υπάρχει περιέλιξη των χρωματίδων των ομόλογων χρωματοσώματων και συμβαίνει συνήθως κατά την πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης. Είναι πολύ σημαντικά για την κληρονομικότητα διότι οδηγούν σε αναδιανομή του γενετικού υλικού. Επειδή Τα βασικά χαρακτηριστικά του ομόλογου ανασυνδυασμού είναι πολύ διατηρημένα, οι πρωτεΐνες που διεκπεραιώνουν αυτή τη διεργασία σε διαφορετικούς οργανισμούς συχνά έχουν μεγάλη ομολογία στην αμινοξική τους αλληλουχία. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα στα κύτταρα και στους οργανισμούς. Επιτρέπει στον οργανισμό να επιδιορθώσει DΝΑ που έχει υποστεί βλάβη και στους δύο κλώνους της διπλής έλικας και μπορεί ν' αποκαταστήσει άλλες γενετικές βλάβες που συμβαίνουν σχεδόν σε κάθε γύρο αναγραφής του DΝΑ. Επίσης είναι αναγκαίος για τον ακριβή διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων που συμβαίνει κατά τη μείωση στους μύκητες, στα φυτά και στα ζώα. Ο χρωμοσωμικός "επιχιασμός" προκαλεί ανταλλαγή γενετικών πληροφοριών μεταξύ ομόλογων χρωμοσωμάτων, δημιουργώντας έτσι νέους συνδυασμούς αλληλουχιών DNA σε κάθε χρωμόσωμα. Το όφελος της ανάμειξης γονιδίων φαίνεται ότι είναι τόσο μεγάλο για τους απογόνους ώστε η ανακατανομή των γονιδίων με ομόλογο ανασυνδυασμό δεν περιορίζεται μόνο σε οργανισμούς με φυλετική αναπαραγωγή, αλλά είναι επίσης διαδεδομένη και σε οργανισμούς που αναπαράγονται αφυλετικά, π.χ. τα βακτήρια. Όπως προαναφέρθηκε στο ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2, βραχυπρόθεσμα και από τη σκοπιά ενός ξεχωριστού οργανισμού, οι γενετικές αλλαγές είναι επιζήμιες. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για τους πολυκύτταρους οργανισμούς, όπου μια γενετική αλλαγή είναι πολύ πιθανό να διαταράξει την εξαιρετικά πολύπλοκη και συντονισμένη ανάπτυξη και φυσιολογία του οργανισμού. Η επιβίωση και η αναπαραγωγή των οργανισμών, δηλαδή η λεγόμενη "διαιώνιση των ειδών" εξαρτάται από τη γενετική τους σταθερότητα. Μια μετάλλαξη που επηρεάζει έστω και ένα ζεύγος νουκλεοτιδίων μπορεί να καταστρέψει έναν οργανισμό αν συμβεί σε μια ζωτική θέση στην αλληλουχία του DΝΑ. 46 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

47 Β. Επιδιόρθωση του DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό (HRR) Καθώς το γονιδιώμα μεταφέρει όλες τις απαραίτητες πληροφορίες για τη ζωή είναι προφανές ότι η διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος είναι κρίσιμη για την επιβίωση των κυττάρων, μια σειρά από μηχανισμούς που έχει εξελιχθεί με την πάροδο του χρόνου για να εξασφαλιστεί η πλέον αποτελεσματική εκτέλεση της διαδικασίας επιδιόρθωσης του γονιδιώματος. Όπως έχει αναφερθεί οι μηχανισμοί Επιδιόρθωσης του DNA είναι σε θέση να επισκευάσουν σχεδόν όλους τους διαφορετικούς τύπους των χρωμοσωμικών αλλοιώσεων ώστε να διασφαλιστεί ότι οι γενετικές πληροφορίες θα μεταφερθούν με ακρίβεια στην επόμενη γενιά. Η απάντηση του κυττάρου σε βλάβες του DNA (DNA Damage Response - DDR) περιλαμβάνει ένα σύνθετο δίκτυο πρωτεϊνών, που αποτελείται από: την αναγνώριση βλαβών στο DNA, μεταγωγή σήματος, μεταγραφική ρύθμιση, έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, επιδιόρθωση του DNA και την επαλήθευση της αποτελεσματικότητας της επισκευής, ανάλογα με τον τύπο της βλάβης, την κατάσταση αναπαραγωγής του γονιδιώματος, καθώς και το στάδιο του κυτταρικού κύκλου. H πιο επικίνδυνη μορφή βλαβών του DNA και κρίσιμη για την επιβίωση του κυττάρου είναι η θραύση και των δύο αλυσίδων του DNA (double strand breaks - DSBs) Η αδυναμία επιδιόρθωσης των DSBs οδηγεί σε χρωμοσωμικές αλλοιώσεις: ελλείψεις, διπλασιασμούς ή μετατοπίσεις χρωμοσωμικών τμημάτων, θρυμματισμό ή συγκόλληση χρωμοσωμάτων. Κατά συνέπεια, αδυναμία επιδιόρθωσης των DSBs οδηγεί σε αστάθεια του γονιδιώματος η οποία συνδέεται με την καρκινογένεση. Όταν υπάρχει έστω και ένα DSB, σταματά ο κυτταρικός κύκλος και ενεργοποιούνται μηχανισμοί επιδιόρθωσης της βλάβης ή επαγωγής προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Επομένως οι σχάσεις της διπλής έλικας του DNA είναι οι πιο σημαντικές βλάβες και αν δεν επιδιορθωθούν μπορεί να οδηγήσουν σε σημαντική χρωμοσωμική αστάθεια. Όπως είδαμε τα κύτταρα διαθέτουν σύνθετα μονοπάτια εντοπισμού και επιδιόρθωσης των γενετικών βλαβών. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός και η σύνδεση μη ομόλογων άκρων είναι οι κυριότεροι μηχανισμοί επιδιόρθωσης των σχάσεων της διπλής έλικας και δρουν σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Ενώ η σύνδεση μη ομόλογων άκρων συνεισφέρει στην επιδιόρθωση των βλαβών σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, ο ομόλογος ανασυνδυασμός συνεισφέρει ελάχιστα στην G1 και προοδευτικά όλο και περισσότερο καθώς το κύτταρο κινείται προς την G2. Τα BRCA1 και BRCA2 είναι ογκοκατασταλτικά γονίδια και εμπλέκονται σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες, μεταξύ των οποίων η επιδιόρθωση του DNA και οι μηχανισμοί ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Οι πρωτεΐνες BRCA1 και 2 σχηματίζουν μαζί με τη RAD51 ένα σύμπλοκο απαραίτητο για την επιδιόρθωση των θραύσεων διπλής έλικας με ομόλογο ανασυνδυασμό και είναι απαραίτητες για τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα σημεία ελέγχου S και G2/M ως ανταπόκριση σε 47 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

48 βλάβη του DNA. ΕΝΔΟΓΕΝΕΙΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Metabolism (ROS), Stalled replication forks, etc. ΕΞΩΓΕΝΕΙΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Ionizing radiation Environmental mutagens, etc. ΒΛΑΒΗ DNA Single Strand Breaks Double Strand Breaks Base modifications ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ DSBs Non-Homologous End Joining (Cell cycle phase independent, error prone) Homologous Recombination (Cell cycle phase dependent (S/G2), error free) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΗ Διόρθωση ΑΤΕΛΕΣΦΟΡΗ Διόρθωση CELL CYCLE PROGRESSION CELL PROLIFERATION APOPTOSIS CANCER AGING Εικόνα 16. Απλοποιημένο διάγραμμα του δικτύου απόκρισης σε βλάβες στο DNA Ατελέσφορη διόρθωση είναι συνέπεια της δυσλειτουργίας της μεταγωγής σήματος για βλάβη 48 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

49 ή της κεντρικής διαδικασίας επιδιόρθωσης. Η παρούσα εργασία καλύπτει θέματα που αφορούν την αλληλεπίδραση των βασικών πρωτεϊνών που σχετίζονται με την κεντρική διαδικασίας επιδιόρθωσης, δηλαδή την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών RAD51, p53 και BRCA2. Β.1 Ανίχνευση βλάβης και ενεργοποίηση της επιδιόρθωσης Η βλάβη ανιχνεύεται και ενεργοποιούνται οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης με φωσφορυλίωση της Ιστόνης Η2ΑΧ. Η Ιστόνη Η2ΑΧ είναι ποικιλομορφία της Ιστόνης Η2Α. Στα θηλαστικά η Η2ΑΧ αντιπροσωπεύει το 10% της Η2Α Μετά την πρόκληση DSBs, η Η2ΑΧ φωσφορυλιώνεται στη Σερίνη 139 στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης. Αυτή η φωσφορυλιωμένη μορφή της Η2ΑΧ ονομάζεται γ-η2αχ. Η φωσφορυλίωση της Ιστόνης H2AX είναι από τα πρώτα στάδια αναγνώρισης DSBs και γίνεται από κινάσες όπως ATM και ATR. Συμβαίνει μέσα σε 1-10 min μετά τη βλάβη και εκτείνεται σε δεκάδες χιλιάδες βάσεις εκατέρωθεν του σπασίματος. Γ. Φάσεις της επιδιόρθωσης της διπλής σχάσης του DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό Το γενικό μοντέλο της επιδιόρθωσης της διπλής σχάσης του DNA με Ομόλογο Ανασυνδυασμό περιλαμβάνει τρεις φάσεις: Α) ΠΡΟΣΥΝΑΨΗ (pre-synapsis) σχηματισμός κατάλληλου υποστρώματος του ανασυνδιασμού Β) ΣΥΝΑΨΗ (synapsis) δημιουργία φυσικής σύνδεσης (θηλιά D, D-loop) μεταξύ υποστρώματος και ενός ομόλογου δίκλωνου DNA Γ) ΜΕΤΑΣΥΝΑΨΗ (post-synapsis) εκκίνηση της DNA σύνθεσης μέσω της αλυσίδας μήτρα/εκμαγείο 49 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

50 Αναγνώριση του DSB (γ-η2αχ) Αδελφή Χρωματίδα Εικόνα 17. Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης με Ομόλογο Ανασυνδυασμό: ΠΡΟΣΥΝΑΨΗ & ΣΥΝΑΨΗ (Πηγή: Wikipedia με προσαρμογή από τη συγγραφέα της εργασίας) Εικόνα 18. Ο μηχανισμός του Ομόλογου Ανασυνδυασμού: ΜΕΤΑΣΥΝΑΨΗ (DSBR & SDSA) (Double - Strand Break Repair & Synthesis - Dependent Strand Annealing) 50 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Αλληλεπίδραση πρωτεϊνών Α. Γενικά Πριν να προχωρήσω στο κύριο μέρος της εργασίας αυτής που αφορά τρεις πρωτεΐνες που παίρνουν μέρος στην επιδιόρθωση του DNA με ομόλογο ανασυνδιασμό θα αναφέρω κάποια γενικά στοιχεία που αφορούν την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών. Οι "πρωτεΐνες επικοινωνούν μεταξύ τους όπως δήλωσε ο Δρ Jeff Wrana, επικεφαλής επιστημονικής ομάδας από το Νοσοκομείο "Mount Sinai" του Τορόντο που μελέτησε τον τρόπου με τον οποίο "οι πρωτεΐνες μιλούν" για τον καρκίνο του μαστού: Οι πρωτεΐνες είναι πιθανόν να δώσουν την απάντηση στους επιστήμονες σχετικά με το πόσες πιθανότητες έχει μια γυναίκα να επιβιώσει από καρκίνο του μαστού, σύμφωνα με μια νέα έρευνα. Όπως ανακοίνωσαν Καναδοί επιστήμονες, ο τρόπος που αλληλεπιδρούν οι πρωτεΐνες σε αυτή τη μορφή καρκίνου είναι ενδεικτικός για το είδος της θεραπείας που πρέπει να ακολουθηθεί στην ασθενή. Οι Καναδοί ερευνητές ανέλυσαν πλέγμα πρωτεϊνών στους καρκινικούς ιστούς του μαστού σε 350 γυναίκες από τις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρώπη. Όπως διαπίστωσαν, στις γυναίκες που νίκησαν τη νόσο ήταν διαφορετική η δομή του πλέγματος των πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα σε σχέση με αυτές που κατέληξαν εξαιτίας της. Στην επιθεώρηση "Νature Βiotechnology", οι Καναδοί ερευνητές έγραψαν με βάση αυτό το στοιχείο πως κατάφεραν να προβλέψουν επιτυχώς στο 82% των περιπτώσεων εάν ο καρκίνος του στήθους θα ήταν θανατηφόρος ή όχι για τις ασθενείς. "Προσεγγίσαμε τον καρκίνο σαν ένα πρόβλημα του τρόπου με τον οποίο οι πρωτεΐνες επικοινωνούν μεταξύ τους ή του πώς αλληλεπιδρούν μεταξύ τους στα πλέγματα", δήλωσε ο δρ Jeff Wrana. Αυτή η προσέγγιση θα μας επιτρέψει να βρούμε την κατάλληλη θεραπεία για κάθε ασθενή ξεχωριστά. Ο δρ Wrana και οι συνεργάτες του μελέτησαν αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και στη συνέχεια απομόνωσαν έναν πυρήνα 250 πρωτεϊνών, τις οποίες θεώρησαν τις πιο σημαντικές για να προβλέψουν το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών τους. Σε περίπτωση που η πρόβλεψη ήταν αρνητική για τη ζωή της ασθενούς, ο γιατρός ακολουθούσε μια πιο επιθετική θεραπεία όπως χειρουργική επέμβαση ή χημειοθεραπεία. Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πρώτη αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών παγκοσμίως. Περίπου γυναίκες χάνουν τη ζωή τους κάθε χρόνο από αυτόν. Πηγή : ΤΑ ΝΕΑ Β. Ορισμοί Αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών συμβαίνουν όταν δύο ή περισσότερες πρωτεΐνες δεσμεύονται από κοινού, συχνά για να διεκπεραιώσουν τη βιολογική τους λειτουργία και τότε έχουμε Βιολογική Αλληλεπίδραση. Οι περισσότερες από τις πιο σημαντικές μοριακές διαδικασίες στο κύτταρο, όπως η 51 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

52 αντιγραφή του DNA πραγματοποιούνται από μεγάλες "μοριακές μηχανές" που τα συστατικά τους είναι πρωτεΐνες και η λειτουργία τους υλοποιείται από τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών τους. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών αποτελούν τον πυρήνα του συνόλου του συστήματος αλληλεπιδράσεων μεταξύ δύο ή περισσότερων βιο-μορίων, κάθε ζωντανού κύτταρου και είναι σημαντικές για την πλειοψηφία των βιολογικών λειτουργιών. Την αλληλεπίδραση μεταξύ δύο ή περισσότερων βιο-μορίων την περιγράφουμε και με τον όρο μοριακή αναγνώριση. Η αναγνώριση βασίζεται σε ένα σύνολο στοιχειωδών αλληλεπιδράσεων που δημιουργούν ένα πολύπλοκο σύστημα, όπως μεταξύ ενζύμου και υποστρώματος, ορμόνης και υποδοχέα, αντιγόνου και αντισώματος, πρωτεΐνης και νουκλεϊνικού οξέος. Για παράδειγμα, τα σήματα από το εξωτερικό του κυττάρου στο εσωτερικό του κυττάρου μεταβιβάζονται από αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών των σηματοδοτικών μορίων. Αυτή η διαδικασία, που ονομάζεται μεταγωγή σήματος, διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο σε πολλές βιολογικές διαδικασίες και στη θεραπεία πολλών ασθενειών. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών συμβαίνουν σε κάθε επίπεδο λειτουργίας του κυττάρου, των ενδοκυττάριων οργανιδίων, τον μεταφορικό μηχανισμό διαφόρων βιολογικών μεμβρανών, την οργάνωση της χρωματίνης, τα μυϊκά κύτταρα. την μεταβίβαση σήματος, την ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, και άλλα. Τα συστήματα αυτά, εξ' αιτίας της σημαντικότητας τους για την ανάπτυξη και τις ασθένειες, μελετούνται εντατικά για πολλά χρόνια. Από τις μελέτες αυτές προκύπτει το συμπέρασμα, ότι η φύση πολλές φορές αναμιγνύει και ταιριάζει δομικές ενότητες που χαρακτηρίζουν συγκεκριμένες κατηγορίες πρωτεϊνών τροποποιώντας την αμινοξική ακολουθία για να πετύχει επιλεκτικότητα για συγκεκριμένες πρωτεΐνες στόχους. Β.1 Συγγένεια ή Συνάφεια - Εξειδίκευση Συγγένεια ή Συνάφεια (affinity) ονομάζουμε την δυνατότητα δύο μορίων να αναγνωρίζονται και να αλληλεπιδρούν. Εξειδίκευση ενός μορίου (specificity) μπορεί να θεωρηθεί η ικανότητα ενός μορίου να αναγνωρίζει ή να αλληλεπιδρά με κάποιο άλλο από μία ομάδα μορίων. Για παράδειγμα μία φαρμακευτική ουσία αλληλεπιδρά με ένα υποδοχέα καλλίτερα από μία ομάδα παραγώγων χημικών ενώσεων ή ένα αντίσωμα αναγνωρίζει ένα αντιγόνο από όλα τα αντισώματα που υπάρχουν στον οργανισμό. Οι πιο πολλές έρευνες που ασχολούνται με τις πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις προσπαθούν να δημιουργήσουν "πρωτεϊνικά δίκτυα" που αφορούν κυρίως τις φυσικές αλληλεπιδράσεις, όπου οι αλληλεπιδράσεις δείχνουν τη φυσική συγγένεια και εξειδίκευση μεταξύ δυο πρωτεϊνών. Η φυσική συγγένεια / συνάφεια μεταξύ των πρωτεϊνών είναι καθοριστική για τη ρύθμιση της κυτταρικής λειτουργίας από τις πρωτεΐνες (που αλληλεπιδρούν). Η συγγένεια αυτή, ρυθμίζεται α) με την δέσμευση υποστρωμάτων, που μπορεί να είναι μικρά βιομόρια, άλλες πρωτεΐνες, πυρηνικά οξέα, ιόντα (όπως ασβεστίου, καλίου) και β) με ομοιοπολική τροποποίηση όπως επιλεκτική φωσφορυλίωση και ακετυλίωση. Για να είναι μια φυσική αλληλεπίδραση και βιολογική αλληλεπίδραση απαιτείται οι 52 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

53 αλληλεπιδρούντες "πρωτεϊνικοί εταίροι" να είναι σε συγκεκριμένες πρωτεϊνική καταστάσεις για να συμβεί η αλληλεπίδραση, αλλά και η ίδια η αλληλεπίδραση θα προκαλέσει αλλαγή στην κατάσταση του ενός ή και των δυο "εταίρων". Με τον όρο "πρωτεϊνική κατάσταση" εννοούμε όλα εκείνα τα χαρακτηριστικά όπως α) μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, β) παρουσία ή απουσία υποδοχέα, γ) ολιγομερική κατάσταση κτλ. Κάθε τύπος πρωτεϊνικής κατάστασης συμμετέχει σε ένα μόνο υποσύνολο των αλληλεπιδράσεων μιας πρωτεΐνης και ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα μετάβασης είναι η δημιουργία πρωτεϊνικού συμπλόκου. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις στο σύνολο τους αντικατοπτρίζουν ένα εκτεταμένο και πολύπλοκο δίκτυο αφού κάθε πρωτεΐνη έχει πολλούς εταίρους που με τη σειρά τους αλληλεπιδρούν με άλλες πρωτεΐνες. Έτσι η θέση μιας πρωτεΐνης στο δίκτυο μπορεί να καθορίσει πως οι βιοχημικές της δραστηριότητες χρησιμοποιούνται και ρυθμίζονται στις αντίστοιχες βιολογικές διεργασίες. Γ. Τύποι αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών Γ.1 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ ομο-ολιγομερών πρωτεϊνών Ένας μεγάλος αριθμός ενζύμων, πρωτεϊνών μεταφοράς, παραγόντων ρύθμισης της μεταγραφής κλπ. δρουν ως ομο-ολιγομερή, δηλαδή η τεταρτοταγής δομή της πρωτεΐνης αποτελείται από δύο ή περισσότερες ομόλογες (ή όμοιες) αλυσίδες. Η ενσωμάτωση μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων στο επίπεδο της τεταρτοταγούς δομής προσφέρει πλεονεκτήματα, σε σχέση με λειτουργικούς τομείς που αποτελούνται από μία πολυπεπτιδική αλυσίδα, όσον αφορά τη ρύθμιση της πρωτεΐνης. Κατ' αρχήν μπορεί να αποθηκεύεται ενέργεια στην περιοχή αλληλεπίδρασης που να χρησιμοποιείται στην δέσμευση υποστρώματος ή να τροποποιεί την πρωτεϊνική στερεοδομή με ερέθισμα από ρυθμιστικά υποστρώματα. Με αυτόν τον τρόπο η διαμόρφωση της συγγένειας των υπομονάδων δεν επηρεάζει την τριτοταγή δομή της πρωτεΐνης, αν και προσφέρει ενεργειακές δυνατότητες για την διαμόρφωση της ικανότητας δράσης. Ένα άλλο πλεονέκτημα της σύνδεσης ρυθμιστικών ιδιοτήτων και αλληλεπίδρασης πρωτεϊνικών υπομονάδων είναι ότι η δραστικότητα της πρωτεΐνης εξαρτάται από την συγκέντρωση της. Μία τέτοια ρύθμιση μπορεί να επηρεάζει την λειτουργία θετικά ή αρνητικά, με τα ολιγομερή ή τα μονομερή να επιδεικνύουν την μεγίστη δραστικότητα. Έτσι η λειτουργικότητα των ολιγομερών μπορεί να ρυθμίζεται επακριβώς με την συγκέντρωση υποστρωμάτων (συμπεριλαμβανομένων ιόντων, υποστρωμάτων αλλοστερικών υποστρωμάτων, πρωτονίων, κλπ.) και την συγκέντρωση της πρωτεΐνης (ρυθμός έκφρασης ή αποικοδόμησης). Το τετραμερές της αιμοσφαιρίνης που αποτελείται από 2 άλφα και 2 βήτα υπομονάδες, που επιδεικνύουν υψηλή ομολογία στις αμινοξικές τους ακολουθίες, είναι το κλασσικό παράδειγμα αλλοστερισμού και συνεργασίας στην δέσμευση υποστρώματος από ολιγομερείς πρωτεΐνες. 53 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

54 Γ.2 Αλληλεπιδράσεις μεταξύ ετερόλογων πρωτεϊνών Η επικοινωνία σε επίπεδο οργανισμού ή κυττάρου απαιτεί την αποκωδικοποίηση φυσικών ή χημικών σημάτων πληροφορίας, όπως η παρουσία συγκεκριμένων χημικών παραγόντων, η αλλαγή φωτισμού, η χημική τροποποίηση υπαρχόντων ουσιών, αλλαγή σε ρη ή συγκέντρωση ιόντων από μία περιοχή σε άλλη. Κατά ένα μεγάλο μέρος η επικοινωνία βασίζεται σε εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ ετερόλογων πρωτεϊνών, με ερέθισμα συγκεκριμένα χημικά ή φυσικά σήματα. Ένα μικρό ποσοστό των μηχανισμών που ρυθμίζουν την επιλεκτικότητα των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της πληθώρας των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν και ρυθμίζουν τις κυτταρικές λειτουργίες έχει γίνει κατανοητό. Σε αυτό το κεφάλαιο περιγράφονται μερικές πρωτεϊνικές δομικές ενότητες που εμπλέκονται σε ετερόλογα πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται σε παραδείγματα από τρεις κατηγορίες αλληλεπιδράσεων μεταξύ των επιφανειών πρωτεϊνών: αυτών που εμπλέκονται στην μεταβίβαση σήματος, την ρύθμιση κυτταρικών λειτουργιών και μεταξύ των παραγόντων μεταγραφής. Γ.3 Αλλά Είδη Αλληλεπιδράσεων Οι πρωτεΐνες μπορεί να αλληλεπιδρούν για μεγάλο χρονικό διάστημα αποτελώντας ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο, όπως είναι οι μοριακές ακόλουθοι. Όμως, μια πρωτεΐνη μπορεί να αλληλεπιδράσει για μικρό χρονικό διάστημα με μια άλλη πρωτεΐνη απλά και μόνο για να την τροποποιήσει (για παράδειγμα, μια πρωτεϊνική κινάση θα προσθέσει μια φωσφορική ρίζα σε μια πρωτεΐνη-στόχο). Αυτού του είδους η τροποποίηση των πρωτεϊνών μπορεί να αλλάξει την δυνατότητα αλληλεπίδρασης ή μη, με άλλες πρωτεΐνες. Γ.3.1 Μη υποχρεωτικές και υποχρεωτικές αλληλεπιδράσεις - σύμπλοκα Υπάρχουν δύο διαφορετικά είδη συμπλόκων, με βάση το αν η δέσμευση είναι υποχρεωτικά ή μη. Σε μία υποχρεωτική αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών, δεν μπορούν τα πρωτομερή να υπάρξουν από μόνα τους ως σταθερές δομές, in vivo. Τέτοια σύμπλοκα είναι υποχρεωτικά και για λειτουργικούς λόγουςπολλές από τις ετερο-ολιγομερών δομές στην PDB συμμετέχουν σε μη υποχρεωτικές αλληλεπιδράσεις των πρωτομερών που υπάρχουν ανεξάρτητα. Γ.3.2 Παροδικές και μόνιμες αλληλεπιδράσεις - σύμπλοκα Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών μπορεί επίσης να διακριθούν με βάση τη διάρκεια ζωής του συμπλόκου. Σε αντίθεση με μια μόνιμη αλληλεπίδραση που είναι συνήθως πολύ σταθερή και οι πρωτεΐνες εταίροι υπάρχουν μόνο σε μορφή συμπλόκου, μια παροδική αλληλεπίδραση συγκροτείται και διασπάται in vivo. Οι Δομικές ή Λειτουργικές υποχρεωτικές αλληλεπιδράσεις είναι συνήθως μόνιμες, ενώ οι μη υποχρεωτικές αλληλεπιδράσεις μπορεί να είναι παροδικές ή μόνιμες. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι πολλές αλληλεπιδράσεις δεν ανήκουν σε ένα από τα δύο διαφορετικά είδη αλληλεπίδρασης. Αντίθετα, υπάρχει μια συνέχεια μεταξύ μη 54 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

55 υποχρεωτικής και υποχρεωτικής αλληλεπίδρασης, και η σταθερότητα όλων των συμπλόκων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις συνθήκες και το περιβάλλον. Η αλληλεπίδραση μπορεί να είναι κυρίως παροδική in vivo, αλλά να γίνει μόνιμη, υπό ορισμένες κυτταρικές συνθήκες. Δ. Πολυδυναμική αναγνώριση Ορισμένες πρωτεΐνες είναι ετερόκλητες ως προς το ότι μπορούν να αλληλεπιδράσουν με διάφορες άλλες πρωτεΐνες, παραδείγματα των οποίων είναι διαδεδομένα στα μονοπάτια σηματοδότησης. Ένα παράδειγμα είναι η ρυθμιστική υπομονάδα της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA), η οποία μπορεί να αλληλεπιδρά με πολλούς εταίρους. Πώς μια πρωτεΐνη μπορεί να αλληλεπιδράσει με διάφορους εταίρους που χρησιμοποιούν την ίδια δεσμευτική περιβάλλον δεν είναι πλήρως κατανοητός. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι πολλές συγκεκριμένες πρωτεΐνες έχουν εξελιχθεί για να δεσμεύσει με πολλαπλούς στόχους, συμπεριλαμβανομένων και άλλων πρωτεϊνών, πεπτίδια, το DNA, και τα μικρά υποστρώματα. Επομένως η ύπαρξη ετερόκλητης, πολλαπλού σκοπού, περιοχής δέσμευσης για πολυδυναμική αναγνώριση μπορεί να είναι όχι μόνο κοινή, αλλά και απαραίτητη για την σωστή σηματοδότηση και τα μεταβολικά δίκτυα στο κύτταρο. Είναι επίσης σημαντική για την ανοσολογική απάντηση και για τη ρύθμιση της μεταγραφής και μετάφρασης. Η γνώση των μηχανισμών αναγνώρισης και αλληλεπίδρασης των ετερόκλητων πρωτεϊνών είναι ιδιαίτερα σημαντική, διότι εμπλέκονται στη θεραπεία πολλών ασθενειών, π.χ., της Alzhiemer, καρδιακές παθήσεις, και ορισμένους τύπους καρκίνου. Οι ακριβείς περιγραφές των μηχανισμών αλληλεπίδρασης απαιτούνται σήμερα για τη βελτίωση του σχεδιασμού των φαρμάκων που παρεμβαίνουν στις ανώμαλες αλληλεπιδράσεις και τη βελτίωση των μεθόδων για την πρόβλεψη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων για διευκρινίσει του σταδίου της νόσου. (Chang CA et al. 2008) Εν κατακλείδι, αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών είναι ουσιαστικής σημασίας για κάθε διαδικασία σε ένα ζωντανό κύτταρο. Πληροφορίες σχετικά με αυτές τις αλληλεπιδράσεις βελτιώνει την κατανόησή μας για τις ασθένειες και μπορεί να παράσχει τη βάση για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. 55 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

56 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 56 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Πρωτεϊνικές Αλληλεπιδράσεις κατά την HRR Όπως προαναφέρθηκε στα Κεφάλαια 4 & 5, ο ομόλογος ανασυνδυασμός είναι απαραίτητος για την επιδιόρθωση της πιο επικίνδυνης μορφής βλαβών του DNA και κρίσιμης για την επιβίωση του κυττάρου: της θραύσης και των δύο αλυσίδων του DNA (DSBs). Το κύριο σημείο της επιδιόρθωσης του DNA με ομόλογου ανασυνδυασμό (HRR ) είναι η σύναψη, η διαδικασία που φέρνει κοντά τους δύο ομόλογους DNA κλώνους. Στην σύναψη, το άθικτο DNA που δεν έχει ζημιά ταιριάζει με αυτόν που έχει. Στη συνέχεια, ο άθικτος κλώνος χρησιμοποιείται σαν μήτρα για την επιδιόρθωση του κλώνου με την ζημιά, με κύρια πρωτεΐνη την RAD51. Α. Αλληλεπιδράσεις κατά την επιδιόρθωση της DSB του DNA με HR Η κύρια αντίδραση στον ομόλογο ανασυνδυασμό του DNA είναι η αναζήτηση ομολογίας και η εφόρμηση / διείσδυση στο DNA από το σύμπλοκο RAD51 - μονόκλωνο DNA (ινίδιο προσύναψης), τοποθετώντας έτσι το 3' άκρο του DNA που διεισδύει, απέναντι από ένα δίκλωνο μόριο ομόλογου DNA που θα χρησιμεύσει ως μήτρα για την επιδιόρθωση. Στο περιβάλλον του πυρήνα, σε κάθε μονόκλωνο μόριο DNA είναι αρχικά προσδεδεμένη η πρωτεΐνη RPA (Replication Protein Α), η οποία έχει υψηλότερη χημική συγγένεια προς τα μονόκλωνα μόρια DNA απ' ότι η RAD51. Η RAD51 πρωτεΐνη προσδένεται στο μονόκλωνο DNA σε ένα τριμερές σύμπλοκο στο οποίο συμμετέχει και το ΑΤΡ. In vitro, η RPA αναστέλλει την πρόσδεση της RAD51 στο DNA. In vivo, υπάρχουν οι λεγόμενες "πρωτεΐνες εταίροι" της RAD51 ή συμπαραγόντες της RAD51 οι οποίοι υπερνικούν την ανασταλτική δράσης της RPA. Οι πρωτεΐνες αυτές (XRCC2, XRCC3, RAD51B, RAD51C, RAD51D, Rad52, Rad54 και BRCA2), καλούνται και πρωτεΐνες - διαμεσολαβητές (mediator proteins), επειδή διαμεσολαβούν για το σχηματισμό του ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης με τα μονόκλωνα τμήματα του DNA τα οποία είναι καλυμμένα με την πρωτεΐνη RPA. Το πρώτο βήμα στην επιδιόρθωση της δίκλωνης σχάσης του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό (Εικόνα 19) είναι η επεξεργασία του DNA ώστε να προκύψουν 3' - άκρα τα οποία να προεξέχουν, όπου θα ξεκινήσει η συγκρότηση του ινιδίου της RAD51. Αυτό το στάδιο του ομόλογου ανασυνδιασμού ονομάζεται προ-σύναψη (pre-synapsis). Η εκτομή του 5' - άκρου που συμβαίνει κατά το στάδιο αυτό, ώστε να προκύψουν ελεύθερα 3'- άκρα, απαιτεί το σύμπλοκο πρωτεϊνών MRX (Mrel 1-Rad50-Xrs2), καθώς επίσης και την 5' -3' εξωνουκλεάση Exo1 και το προϊόν του γονιδίου SAE2. Η αναζήτηση ομολογίας στο δίκλωνο DNA και η εφόρμηση /διείσδυση στον ομόλογο κλώνο του DNA, αποτελούν το στάδιο της σύναψης (synapsis) και πραγματοποιείται με τη βοήθεια των πρωτεϊνών ετέρων της RAD51. Σ' αυτό το στάδιο δημιουργείται η ενδιάμεση θηλιά - D, όπου το 3' - άκρο του κλώνου που διεισδύει αρχίζει τη σύνθεση του DNA με μήτρα το δίκλωνο μόριο στο οποίο έχει διεισδύσει. Στη συνέχεια, στο στάδιο της μετασύναψης (post-synapsis) ο μηχανισμός αυτός μπορεί να ακολουθήσει διάφορες πορείες. Μπορεί να δεσμεύσει και το δεύτερο άκρο του DNA στην περιοχή του δίκλωνου ρήγματος, και να αρχίσει τη σύνθεση του DNA στην περιοχή αυτή. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας διπλής διακλάδωσης Holliday (double Holliday 57 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

58 junction), η οποία θα διαλυθεί είτε από την τοποϊσομεράση ΙΙΙ σε προϊόντα χωρίς επιχιασμό (Εικόνα 19-7), είτε από μια ενδονουκλεάση σε προϊόντα με και χωρίς επιχιασμό (Εικόνα 19-6c και 6d). Σε μια άλλη πορεία, του μηχανισμού αυτού, η θηλιά D διαλύεται αφού πρώτα το ένα άκρο (αυτό που διεισδύει στο δίκλωνο μόριο DNA), πραγματοποιεί μια μικρής έκτασης σύνθεση DNA και στη συνέχεια αποδεσμεύεται και υβριδοποιείται πάλι με το άλλο άκρο του DNA που έχει υποστεί τη βλάβη. Με αυτό τον τρόπο προκύπτουν πάντα προϊόντα χωρίς επιχιασμό (Εικόνα 19-6a). Μια τελευταία πορεία που μπορεί να ακολουθήσει ο μηχανισμός επιδιόρθωσης δίκλωνων σχάσεων με ομόλογο ανασυνδυασμό είναι όταν ο κλώνος που διεισδύει στο δίκλωνο μόριο DNA δημιουργεί μια διχάλα αντιγραφής και αντιγράφει όλο το DNA που χρησιμεύει ως μήτρα από το σημείο της σχάσης και πέρα (Εικόνα 19-6b). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια ετεροζυγωτίας από το σημείο της σχάσης και μετά, με όλες τις συνέπειες που μπορεί να συνεπάγεται αυτό (ενεργοποίηση ογκογονιδίων, απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων κλπ) (Li and Heyer, 2008). Η επιδιόρθωση με ομόλογο ανασυνδυασμό θεωρείται ως ο πιο ακριβής μηχανισμός επιδιόρθωσης διότι τα άκρα του DNA τα οποία έχουν υποστεί σχάση, χρησιμοποιούν ομόλογες αλληλουχίες μέσα στο γονιδίωμα (αδελφή χρωματίδα, ομόλογα χρωμοσώματα, επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στο ίδιο το χρωμόσωμα), για να αρχίσουν την επιδιόρθωση της σχάσης. Από την άλλη, παρόλο που η μη ομόλογη ένωση άκρων θεωρείται υπεύθυνη για την πλειονότητα των χρωμοσωματικών μετατοπίσεων οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν στη δημιουργία όγκων, έχει βρεθεί ότι έχει ένα πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος και στην καταστολή της δημιουργίας όγκων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο μηχανισμός αυτός δεν λειτουργεί αδιακρίτως, αλλά αντίθετα συμβάλλει στην επιδιόρθωση των δίκλωνων σχάσεων με ένα αρκετά μεγάλο βαθμό ακρίβειας. Ως εκ τούτου και τα δύο μονοπάτια επιδιόρθωσης δίκλωνων σχάσεων DNA έχουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος και στην πρόληψη του καρκίνου (Shrivastav Μ. et al., 2008). 58 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

59 Εικόνα 19. Ο μηχανισμός επιδιόρθωσης δίκλωνων σχάσεων DNA Τα μονοπάτια ανασυνδυασμού κατά το μηχανισμό επιδιόρθωσης δίκλωνων σχάσεων DNA. Κατά το γενικό μοντέλο της επιδιόρθωσης του DNA υπάρχουν τρία στάδια: η προσύναψη 1 & 2, η σύναψη 3 και η μετασύναψη 4-7. Κατά την προσύναψη, τα άκρα της δίκλωνης σχάσης αναγνωρίζονται και υπόκεινται σε επεξεργασία από την οποία προκύπτουν 3' μονόκλωνα άκρα. Κατά τη σύναψη, το ένα άκρο βρίσκει την ομόλογή του περιοχή σε ένα άθικτο μόριο DNA, στο οποίο και διεισδύει σχηματίζοντας μια θηλιά τύπου D. Από το σημείο αυτό και μετά έχουμε τις παρακάτω επιλογές: SDSA (Synthesis dependent Strand annealing) Το άκρο του DNA που διεισδύει και αρχίζει τη σύνθεση, αποδεσμεύεται μετά από λίγο και υβριδοποιείται και πάλι με το άλλο άκρο, οδηγώντας σε προϊόντα χωρίς επιχιασμό (4a, 5a, 6a). BIR (Break - Induced Replication) Η θηλιά D εξελίσσεται σε μια διχάλα αντιγραφής, αντιγράφοντας ολόκληρο το ομόλογο χρωμόσωμα πέρα από το σημείο της σχάσης, με αποτέλεσμα την απώλεια ετεροζυγωτίας (4a, 5b, 6b). DSBR (Double - Strand Break Repair) και τα δύο άκρα της δίκλωνης σχάσης εμπλέκονται δημιουργώντας μια διπλή διακλάδωση Holliday (4b 5c 6c, d, e, 7), η οποία μπορεί να διαλυθεί από την τοποϊσομεράση ΙΙΙ οδηγώντας αποκλειστικά σε προϊόντα χωρίς επιχιασμό, ή μπορεί να διαλυθεί από μια ενδονουκλεάση και να πάρουμε προϊόντα με ή χωρίς επιχιασμό (Li and Heyer 2008). 59 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

60 Β. Αλληλεπιδράσεις Ανταλλαγής Κλώνων Οι RAD51 πρωτεΐνες, οι ευκαρυωτικές ορθόλογες της βακτηριακής πρωτεΐνης RecA, είναι απαραίτητες για τις διαδικασίες του ομόλογου ανασυνδυασμού τόσο κατά τη μείωση όσο και κατά τη μίτωση, ενώ μια άλλη ορθόλογη αυτών πρωτεΐνη, η Dmc1, αφορά το μειωτικό ομόλογο ανασυνδυασμό. Μαζί με μια πληθώρα πρωτεϊνών εταίρους όπως οι RPA, BRCA1, BRCA2, p53, Rad52, Rad54 κ.α. αποτελούν βασικά στοιχεία της επιδιόρθωσης του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό, σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς που τις συναντάμε και είναι πολύ σημαντικές και καθοριστικές για την επιβίωση του κυττάρου. Έτσι, και στον άνθρωπο, η RAD51, είναι η πρωταγωνίστρια πρωτεΐνη, στην επισκευή του DNA με ομόλογο ανασυνδυασμό. Η RAD51 επικαλλύπτει τα DNA υποστρώματα για να διαμορφώσει ελικοειδή ινίδια νουκλεοπρωτεΐνης, τα οποία εισορμούν και ζευγαρώνουν με μια ομόλογη περιοχή δίκλωνου DNA, για να ξεκινήσει η αντίδραση ανταλλαγής κλώνων που αποτελούν τη βάση του ομόλογου ανασυνδυασμού. B.1 Η λειτουργία της RAD51 κατά την ανταλλαγή των DNA κλώνων Η RAD51, όπως και η RecA, σχηματίζει ένα δεξιόστροφο ελικοειδές ινίδιο γύρω από μονόκλωνο DNA, στο οποίο θα προσδεθεί το δίκλωνο DNA. Η ικανότητα του ινιδίου της RAD51 να κρατά δύο περιοχές DNA σε κοντινή απόσταση, ευθύνεται για τον σχηματισμό των μεταξύ τους συνδέσεων. Καθένα από τα μονομερή της RAD51 διαθέτει μια ελαττωμένη συγγένεια για το μονόκλωνο DNA, η οποία αντισταθμίζεται από τη συνεργατική πρόσδεση τους στο μονόκλωνο DNA. Η RAD51 αλληλεπιδρά με το μονόκλωνο DNA σε αργό ρυθμό, γεγονός που καθιστά το νουκλεοπρωτεϊνικό ινίδιο ευπρόσβλητο σε ανταγωνιστικούς παράγοντες. Η διαμεσολαβητική πρωτεΐνη Rad52, βοηθά την εμπυρήνωση της RAD51 στο μονόκλωνο DNA, με αποτέλεσμα να ελαττώνονται τα ανασταλτικά φαινόμενα. Κατά το γενικό μοντέλο της επιδιόρθωσης των δίκλωνων σχάσεων του DNA (DSBR) (Εικόνες 17, 18, 19), ο σχηματισμός του νουκλεοπρωτεϊνικού ινιδίου κατά τη σύναψη, ακολουθείται από τη ενσωμάτωση του δίκλωνου DNA και την αναζήτηση της ομόλογης περιοχής. Το εισερχόμενο δίκλωνο DNA δεσμεύεται προσωρινά στη θέση πρόσδεσης της RAD51 και αν δεν βρεθεί ομολογία αφήνεται ελεύθερο. Οι συνεχείς δεσμεύσεις και αποδεσμεύσεις του δίκλωνου μορίου συνεχίζονται μέχρι την εύρεση της ομόλογης περιοχής. Το στάδιο της σύναψης ολοκληρώνεται με τον σχηματισμό του ενδιαμέσου, της θηλιάς D. Η δημιουργία του ενδιαμέσου διευκολύνεται από τον σχηματισμό παρανηματικών συνδέσεων μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων των δύο κλώνων. Οι συνδέσεις δημιουργούνται μακριά από τα ελεύθερα DNA άκρα και είναι πιθανότερο να σχηματιστούν όσο είναι μεγαλύτερο το ποσοστό των AT στην δίκλωνη περιοχή. Πάντως, η RecA προωθεί αποτελεσματικότερα την ανταλλαγή αλυσίδων από τη RAD51 σε αλυσίδες με χαμηλά ποσοστά GC. Με τη δημιουργία της θηλιάς D, η διαδικασία εισέρχεται στη φάση της μετασύναψης 60 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

61 όπου και ολοκληρώνεται σύμφωνα με τα διάφορα μοντέλα επιδιόρθωσης των DSBs. Κατά το αρχικό DSBR μοντέλο, λαμβάνουν χώρα η μετανάστευση των αλυσίδων, ο σχηματισμός του ενδιαμέσου Holliday και ο διαχωρισμός του - αποτέλεσμα του οποίου είναι τα προϊόντα του ανασυνδυασμού. Συνοπτικά μπορούμε να πούμε ότι: μόρια μονόκλωνου DNA (ssdna) και δίκλωνου DNA (dsdna) δεσμεύονται στο εσωτερικό του ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης της RAD51 κατά μήκος του ελικοειδούς άξονα, σχηματίζοντας έτσι το τριμερές σύμπλοκο που περιέχει ssdna, dsdna, και RAD51. Στο τριμερές σύμπλοκο, οι ομόλογες ακολουθίες μεταξύ των ssdna και dsdna είναι στοιχισμένες, και το ssdna σχηματίζει ένα ετεροδιμερές με τον συμπληρωματικό κλώνο του dsdna (ομόλογη αντιστοίχιση). Η περιοχή του ετεροδιμερούς που παράγεται από ομόλογο αντιστοίχιση, στη συνέχεια, επεκτείνεται με την μεσολάβηση της RAD51 για την ανταλλαγή κλώνων. Έτσι, οι RAD51 έχουν τουλάχιστον δύο DNA-δεσμευτικές περιοχές, όπως και η RecA στις στροφές L1 και L2 για την HsRAD51. Α) Β) Εικόνα 20. Οι στροφές L1 και L2 της πρωτεΐνης HsRAD51 Α) Σχηματική αναπαράσταση της στοίχισης των Α.Δ.Σ. της HsRAD51 με τους αντίστοιχους τομείς των Methanococcus voltae RadA (MvRadA), Saccharomyces cerevisiae RAD51 (ScRAD51) και Escherichia coli RecA (EcRecA). Οι N-τελικοί τομείς, οι συντηρημένοι τομείς ΑΤΡάσης, και οι C-τελικοί τομείς καθορίζονται από ορθογώνια διαφορετικής γκρι απόχρωσης. Οι στροφές L1 και L2 καθορίζονται από μαύρα ορθογώνια. Β) Η στοίχιση της ακολουθίας HsRAD51 με αυτές των MvRadA, Pyrococcus furiosus RAD51 (PfRAD51), και ScRAD51 στην περιοχή των L1 και L2 στροφών. Οι L1 και L2 στροφές, οι οποίες δεν είναι αόρατες στην κρυσταλλική δομή του Α.Δ.Σ. ΑΤΡase της HsRAD51 (Pellegrini L., et al. 2002), καθορίζονται από μαύρα πλαίσια, και τα κατάλοιπα Tyr Y232 και Phe F279 καθορίζονται από ορθογώνια γκρι απόχρωσης. (Σύνθεση από Yu D.S., et al. 2003) 61 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

62 Β.2 Διαμεσολαβητικές πρωτεΐνες του ανασυνδυασμού (recombination mediators) Η αρχική σύνδεση της RAD51 στο μονόκλωνο DNA (ssdna) δημιουργεί ένα τριμερές σύμπλοκο μαζί με ΑΤΡ ως εξής: Ένα (1) πρωτομερές ανά 3-4 νουκλεοτίδια και έτσι δημιουργείται το δεξιόστροφο ινίδιο με βήμα έλικας 130Å. Παρόλη την ομοιότητα της με την RecA, η RAD51 έχει διαφορές από αυτή. Η RecA εμφανίζει μια χαμηλή κινητικότητα στη σύνδεση της με δίκλωνο DNA σε σχέση με το μονόκλωνο, ενώ στη RAD51 δεν διαφέρουν πολύ οι δύο κινητικότητες αυτές. Όμως η RAD51 συνεργάζεται και με πολλές άλλες πρωτεΐνες στη διαδικασία σύνδεσης της με το DNA. Όπως προαναφέρθηκε η RPA είναι μια ssdna-δεσμευτική πρωτεΐνη. Είναι μια ετεροτριμερής πρωτεΐνη που συνδέεται στο μονόκλωνο DNA, που φυσιολογικά σχετίζεται με όλο το κανονικό μεταβολισμό του μονόκλωνου DNA. Η λειτουργία της στον ομόλογο ανασυνδυασμό είναι περίπλοκη καθώς από την μία φαίνεται να αναστέλλει την πυρήνωση και τη δημιουργία RAD51 ινιδίων, αλλά από την άλλη να ρυθμίζει τη διαδικασία του ομόλογο ανασυνδυασμού καλύπτοντας το μονόκλωνο DNA και εξαλείφοντας κάθε δευτεροταγή δομή που μπορεί να δημιουργήσει. Η αναστολή της δημιουργίας των RAD51 ινιδίων από το RPA διακόπτεται από άλλες διαμεσολαβητικές πρωτεΐνες που βοηθούν την δημιουργία των νουκλεοπρωτεϊνικών ινιδίων πάνω το μονόκλωνο DNA που έχει καλυφθεί με RPA. Η Rad55 και η Rad57 είναι δύο παράλογα της RAD51 που δημιουργούν ετεροδιμερές με βοηθητική δράση στην ενεργοποίηση του ανασυνδυασμού, του εξαρτώμενου από την RAD51, παρουσία μονόκλωνου DNA καλυμμένου με RPA. Άλλα παράλογα της RAD51 όπως RAD51B, RAD51C, RAD51D, Xrcc2, Xrcc3 φαίνεται να παίζουν ρόλο στη δημιουργία των RAD51 ινιδίων in vivo. Η Rad52 δημιουργεί ένα πολυμερικό δακτύλιο ο οποίος συνδέεται στο μονόκλωνο DNA από την εξωτερική μεριά του δακτυλιδιού μέσω του αμινοτελικού Α.Δ.Σ. σύνδεσης με DNA. Η Rad52 σε κύτταρα ζύμης έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με την RAD51 και με την RPA εκτοπίζοντας την RPA από το μονόκλωνο DNA και έτσι βοηθάει την RAD51 να πραγματοποιήσει τον ανασυνδυασμό. Μια άλλη πρωτεΐνη που σχετίζεται με τη δημιουργία των RAD51 ινιδίων είναι η BRCA2. Οι αλληλεπιδράσεις αυτής με την RAD51 αναλύονται παρακάτω. Μελέτες της δυναμικής συμπεριφοράς της RAD51 και δύο πρωτεϊνών εταίρων Rad52 και Rad54 δείχνουν ότι δεν συνυπάρχουν σε πολυπρωτεϊνικές συγκεντρώσεις, απουσία βλαβών του DNA, αλλά, κατόπιν βλάβης, συγκεντρώνονται μαζί σε πυρηνικές εστίες όπου η RAD51 και όχι η Rad52 ή Rad54, είναι η σταθερά συνιστώσα σύνδεσης. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν την πολυπλοκότητα των μηχανισμών για τη ρύθμιση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του ομόλογου ανασυνδυασμού στους ανώτερους οργανισμούς. (Yu David S. et al., 2003 Molecular Cell 12, ) Οι Rad52 και Rad54 σχετίζονται με την σταθερότητα των RAD51 προσυναπτικών ινιδίων. Η Rad54 λειτουργεί και μετά την σύναψη. Αυτή η πρωτεΐνη απομακρύνει την RAD51 από το ετεροδιμερές του DNA και έτσι γίνεται το 3' άκρο προβιβάσιμο στις πολυμεράσες (Li et al., 2007). Η ομοιότητα που έχει η πρωτεΐνη Rad54 με παράγοντες που παίζουν ρόλο στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης (Snf2) προτείνει ότι η Rad54 ίσως παίζει κάποιο ρόλο στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης κατά την διάρκεια του ομόλογου ανασυνδυασμού. Η RAD54 μοιάζει με ελικάση, με επτά συντηρημένα μοτίβα, συμπεριλαμβανομένου του μοτίβου της DNA εξαρτώμενης ΑΤΡάσης. Παρόλα αυτά, η RAD54 δεν έχει την κλασική δράση 62 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

63 μίας ελικάσης αλλά μπορεί να αλλάξει την δομή του DNA. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η RAD54 μπορεί να συνδεθεί στην RAD51 στοιχειομετρικά και να σταθεροποιήσει το σύμπλοκο πρωτεΐνης - DNA, και να διεγείρει την εισβολή της αλυσίδας. Μετά την ανταλλαγή των αλυσίδων κατά τον ομόλογο ανασυνδυασμό, η RAD51 μένει κολλημένη στο νεοδημιουργημένο ετεροκλωνο δίκλωνο DNA. Αυτό είναι ένα πρόβλημα για την διαδικασία γιατί η DNA πολυμεράση χρειάζεται να έχει πρόσβαση στο 3'-ΟΗ για να ξεκινήσει την αντιγραφή. Οι Li Χ. και Heyer WD. (2009) έδειξαν ότι στην ζύμη Saccharomyces cerevisiae αυτό το πρόβλημα λύνεται με την βοήθεια της RAD54 που αποσυνδέει την RAD51 από το dsdna. Η αντίδραση αυτή πραγματοποιείται με ειδική αλληλεπίδραση και από τις δύο πρωτεΐνες αλλά και από την δράση ΑΤΡασης της RAD54. Εικόνα 21. Κύρια πρωτεϊνικά σύμπλοκα του Ομόλογου Ανασυνδυασμού Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη PALB2: Αυτή συνδέεται με την BRCA2 και της επιτρέπει να βρίσκεται στον πυρήνα έχοντας κύριο ρόλο στην συγκέντρωση της. Τα μόρια BRCA2 και PALB2 συνεντοπίζονται. Έχει δειχτεί ότι το μόριο PALB2 συνδέει τις BRCA1 και BRCA2 σχηματίζοντας το σύμπλοκο BRCA1-PALB2-BRCA2. Η σύνδεση μεταξύ των PALB2 και BRCA1 γίνεται με μη ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ δύο Α.Δ.Σ. με δομή έλικας που έχουν. Μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη BRCA1 που εμποδίζουν την αλληλεπίδραση με την PALB2, οδηγούν σε ανικανότητα πραγματοποίησης του ομόλογου ανασυνδυασμού. 63 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

64 Εικόνα 22. Πρωτεϊνική μεσολάβηση στη ρύθμιση της αυτό-συγκρότησης της RAD51. Εικόνα που δείχνει την πρωτεϊνική μεσολάβηση στη ρύθμιση της συναρμολόγησης του ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης από τη RAD51 και της αποσυναρμολόγησης. Οι BRC επαναλήψεις της BRCA2 (πράσινα οβάλ) προωθούν τη δέσμευση της RAD51 (μπλε κύκλοι) στο μονόκλωνο ssdna και αναστέλλουν τη δέσμευση της RAD51 στο δίκλωνο dsdna. Τα ινίδια νουκλεοπρωτεΐνης της RAD51 διαμορφώνονται στο μονόκλωνο DNA και σταθεροποιούνται με τη Rad54 (κίτρινα οβάλ). Η Rad54 αναδιαμορφώνει επίσης το DNA για να επιτρέψει την αντιστοίχιση με το ομόλογο δίκλωνο DNA στόχο. Μετά την ομόλογη αντιστοίχιση και την ανταλλαγή κλώνων, η RAD51 είναι υποχρεωμένη να ετεροδιμεριστεί με δίκλωνο DNA (κόκκινο και μπλε μόρια DNA). Τότε η Rad54 προωθεί την επέκταση του ετεροδιμερούς και την αποσυναρμολόγηση του RAD51-dsDNA ινιδίου. Η Rad54 με τη μεσολάβηση της στην αποσυναρμολόγηση του RAD51-dsDNA ινιδίου επιτρέπει στις DNA πολυμεράσες και σε άλλες πρωτεΐνες να έχουν πρόσβαση στο DNA. (Πηγή: Forget and Kowalczykowski, 2010) Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53: Το γονίδιο p53 είναι σίγουρα από τα 64 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

65 σημαντικότερα γονίδια κλειδιά που ρυθμίζουν την πορεία πολλών βιοχημικών μονοπατιών που αποτελούν μέρος ποικίλων σημαντικών λειτουργιών, όπως η προώθηση της κυτταρικής διαίρεσης, η προστασία της ακεραιότητας του DNA και η ενεργοποίηση της αποπτωτικής διαδικασίας. Η πρωτεΐνη p53 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη και μετάλλαξή της έχει παρατηρηθεί σε περισσότερους από το 50% όλων των ανθρώπινων όγκων. Έλλειμμα στο γονίδιο p53 στα γαμετικά κύτταρα προκαλεί γενετική προδιάθεση για διάφορα είδη καρκίνων, κυρίως για καρκίνους συνδετικών ιστών που μπορεί να εμφανιστούν σε παιδική ηλικία. Η p53 προστατεύει το κύτταρο από το μετασχηματισμό με τους εξής τρόπους : Προσκολλάται σε ειδικά σημεία του DNA και δρα σα μεταγραφικός παράγοντας προκαλώντας τη μεταγραφή κατάλληλων γονιδίων. Όταν παρουσιαστεί βλάβη στο DNA σταματάει τον κυτταρικό κύκλο και εμποδίζει τη μετάβαση του κυττάρου από τη φάση G1 στη φάση S. Επίσης σταματάει τον κυτταρικό κύκλο και σε άλλα σημεία ελέγχου για τον ίδιο λόγο. Συνδέεται με πρωτεΐνες που παίζουν ρόλο στην επιδιόρθωση του DNA και τις ενεργοποιεί όταν υπάρχει γενετική βλάβη Όταν είναι απαραίτητο προκαλεί την έναρξη της αποπτωτικής διαδικασίας. Κατά την ενεργοποίηση της, η ρ53 μπορεί να σταματήσει τον κυτταρικό κύκλο, να δημιουργήσει πρόωρη γήρανση ή απόπτωση ενεργοποιώντας την μεταγραφή γονιδίων. Δεδομένα δείχνουν ότι η ικανότητα για καταστολή όγκων είναι μια διαδικασία που περιλαμβάνει τη μεταγραφή γονιδίων. Κύτταρα που δεν έχουν p53, συχνά, έχουν υψηλούς ρυθμούς γονιδιακών επεκτάσεων, ανώμαλους καρυότυπους όπως ανευπλοϊδίες, ελλείψεις, αναστροφές, αλλαγές στην τοποθεσία διάφορων γονιδίων. Ακόμα η p53 μπορεί να συνδεθεί και να αναστείλει τους παράγοντες ανταλλαγής κλώνων του ομόλογου ανασυνδυασμού όπως είναι οι RAD51, RecA, RPA. Διάφορες μελέτες δείχνουν ότι η p53 ρυθμίζει την δραστηριότητα του ομόλογου ανασυνδυασμού σε ένα μονοπάτι που είναι ανεξάρτητο της μεταγραφής. Η αλληλεπίδραση της p53 με την RAD51 αναλύεται παρακάτω. Γονίδια τα οποία ρυθμίζονται από την πρωτεΐνη p53 Η p53 μπορεί να δράσει σαν μεταγραφικός παράγοντας ενεργοποιώντας τη μεταγραφή γονιδίων αλλά μπορεί και να αναστέλλει τη μεταγραφή άλλων γονιδίων. Κάποια από τα γονίδια τα οποία ενεργοποιεί είναι και τα παρακάτω : CDK inhibitor p21 : Το προϊόν αυτού του γονιδίου όπως είδαμε αναστέλλει τη δράση του συμπλόκου CDK-κυκλινών και σταματάει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G1. Το γονίδιο Bax: Το προϊόν του γονιδίου αυτού εμπλέκεται στην έναρξη της αποπτωτικής διαδικασίας και ενεργοποιείται από την p53 όταν το γενετικό υλικό έχει υποστεί σοβαρές βλάβες. Θρομβοσπορίνη-1: Η θρομβοσπορίνη εμποδίζει τη δημιουργία καινούριων αιμοφόρων αγγείων και επομένως η μη μεταγραφή της λόγω δυσλειτουργίας της p53 ευνοεί την αγγειογένεση. Το γεγονός αυτό αποκτά ιδιαίτερη σημασία στα τελικά στάδια του μετασχηματισμού ενός κυττάρου σε καρκινικό. 65 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

66 Γονίδια σχετικά με το οξειδωτικό στρες: Η p53 μπορεί να ενεργοποιήσει γονίδια τα οποία προκαλούν το σχηματισμό ενεργών ριζών οξυγόνου και αυτό συσχετίζεται άμεσα με το χαρακτηριστικό της p53 να ενεργοποιεί την απόπτωση. Η p53 όμως δρα και σαν αναστολέας μεταγραφής (γονιδίων που προκαλούν μιτωτικά σήματα) και αυτό το πετυχαίνει με το να εμποδίζει το σχηματισμό του αρχικού συμπλόκου έναρξης της μεταγραφής είτε επειδή προσδένεται στο ΤΑΤΑ box είτε επειδή συνδέεται με το μεταγραφικό σύμπλοκο TFIID και εμποδίζει την πρόσδεσή του στον προαγωγέα του γονιδίου. Β.3 Ρύθμιση της RAD51 Όπως έχει αναφερθεί στο τέλος του 1 ου Κεφαλαίου μονοπάτια μεταγωγής σήματος ενεργοποιούνται γρήγορα, μετά από δίκλωνη σχάση του DNA. Η ζημιά στους κλώνους του DNA δημιουργεί αλλαγή στη δομή της χρωματίνης που με την σειρά της επάγει την ενδοκυτταρική αυτοφωσφωρυλίωση του ATM διμερούς σε ενεργά μονομερή. Αυτά τα ενεργά μονομερή είναι ελεύθερα να φωσφωρυλιώσουν πολλά υποστρώματα. Μερικές πρωτεΐνες που συνδέονται άμεσα με τον ομόλογο αναυσυνδυασμό όπως η BRCA1, RPA και p53 φωσφωρυλιώνονται άμεσα από την κινάση ATM Ο ομόλογος ανασυνδυασμός μπορεί να είναι ευνοϊκός στην S φάση του κυττάρου γιατί υπάρχει η αδερφή χρωματίδα σαν μήτρα για επιδιόρθωση. Οι Hilario et al. (2009) στην εργασία τους έδειξαν ότι η συγκέντρωση της RAD51 φτάνει αυτής του DNA περίπου κατά 65%. Η διαδικασία δημιουργίας νουκλεοπρωτεϊνικών ινιδίων γίνεται με γρήγορη δημιουργία περιοχών πυρήνωσης στον πυρήνα και μετά γίνεται επέκταση από αυτούς τους πυρήνες. Υπερέκφραση της RAD51 παρατηρείται σε κύτταρα από όγκους και σχετίζεται με αυξημένους ρυθμούς ομόλογου ανασυνδυασμού που μπορεί να είναι παράγοντας για τις παρατηρούμενες ανωμαλίες. Όπως είναι γνωστό η BRCA2 είναι μία σημαντική πρωτεΐνη για τον ομόλογο αναυσυνδυαμό καθώς επηρεάζει την RAD51. Ακόμα από παλαιότερες εργασίες έχει βρεθεί ότι με υπερέκφραση της RAD51 στο κύτταρο, αυτή εντοπίζεται στον πυρήνα και δημιουργεί χαρακτηριστικά νουκλεοπρωτεϊνικά ινίδια. Όμως σε κύτταρα που έχει απενεργοποιηθεί η BRCA2, κατά συνέπεια δεν μπορούσε να γίνει ομόλογος ανασυνδυασμός, με υπερ-έκφραση της RAD51 ο ομόλογος ανασυνδυασμός επαναφέρεται. Η είσοδος της RAD51 στον πυρήνα γίνεται με έναν τρόπο ανεξάρτητο από την BRCA2 και όταν η RAD51 υπερ- εκφράζεται δεν χρειάζεται ο ρυθμιστικός ρόλος της BRCA2 στην RAD51 για τον ομόλογο ανασυνδυασμό. (Lee SA. Et al. 2009, Schild D. και Wiese C ) Η BRCA2 φυσιολογικά μεταφέρει την RAD51 στη περιοχή της βλάβης του DNA (μέσω της αλληλεπίδρασης που έχουν οι δύο πρωτεΐνες σε 8 συντηρητικές επαναλαμβανόμενες αμινοξικές αλληλουχίες 35 αμινοξέων που ονομάζονται BRC επαναλήψεις η αλληλεπίδραση των οποίων με την RAD51 αναλύεται παρακάτω. 66 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

67 Γ. RAD51 και Καρκίνος Η RAD51 αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα πρωτεΐνης της οποίας ανεξέλεγκτη συγκέντρωση μπορεί να αλλάξει την κανονική μοίρα των κυττάρων και να οδηγήσει σε πρόωρη γήρανση ή κακοήθειες, ανάλογα με τους εμπλεκόμενους μηχανισμούς. Η RAD51 είναι μια πολύ καλά συντηρημένη πρωτεΐνη που είναι απαραίτητη για την επιβίωση των κυττάρων. Αν και δεν έχουν ανιχνευθεί μεταλλάξεις σε καρκίνους του ανθρώπου, σε πολλές μορφές καρκίνου έχει παρατηρηθεί υπό ή υπερ ρύθμιση των επίπεδων της RAD51 (Klein, 2008). Επιπλέον, υψηλό επίπεδο έκφρασης της RAD51 είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της επιβίωσης ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα (Qiao et al., 2005). Επιπλέον σε προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, όταν υπερεκφράζεται η RAD51 έχουν αυξημένα επίπεδα χρωμοσωμικών αλλαγών, παρόμοιων με αυτές που παρατηρούνται στους όγκους του αιμοποιητικού συστήματος (Francis και Richardson, 2007). Παρά το γεγονός ότι δεν έχουν βρεθεί μεταλλάξεις στο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης της, σε καρκίνους, έχει αποδειχθεί ότι βλάβες σε άλλα γονίδια του HRR διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση, και ιδιαίτερα στον καρκίνο του μαστού. Κύτταρα με μεταλλάξεις στα γονίδια των πρωτεϊνών του ομόλογου ανασυνδυασμού (BRCA1, BRCA2, RAD51, RAD54, XRCC2, XRCC3) έχουν υψηλά επίπεδα γενετικής αστάθειας και είναι ευαίσθητα σε παράγοντες που επιφέρουν καρκίνους (Schild D. και Wiese C. 2010). Στα ευκαρυωτικά κύτταρα των υψηλότερων οργανισμών, η RAD51 είναι ακόμη απαραίτητη και για την κυτταρική επιβίωση: διατάραξη του γονιδίου της RAD51 σε ποντίκια οδηγεί σε πρώιμο εμβρυϊκό θάνατο και η αδρανοποίηση του γονιδίου της RAD51 σε κύτταρα κοτόπουλου (DT40) προκαλεί κυτταρικό θάνατο, με τη συσσώρευση αυθόρμητων-αυτοφυών χρωμοσωμικών σχάσεων. (Yu D.S., et al. 2003) γενικά τα κύτταρα που δεν εκφράζουν RAD51 τελικά δεν είναι βιώσιμα. Η RAD51, λόγω της λειτουργίας της, διαδραματίζει έναν διττό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνου: η ικανότητά της για επισκευή του DNA εμποδίζει μεν, τη δημιουργία καρκίνου, αλλά, όταν ο καρκίνος έχει σχηματιστεί, προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα ενάντια στις θεραπείες του καρκίνου, όπως οι ακτινοβολίες και οι χημειοθεραπείες, οι οποίες καταστρέφουν το DNA τους για να σκοτώνουν αυτά τα κύτταρα. Η πρωτεΐνη είναι συνεπώς πιθανός στόχος της θεραπείας κατά του καρκίνου. (Nomme J. et al., 2010). Επιπλέον, η υψηλή δραστηριότητα ανασυνδυασμού χωρίς σωστή ρύθμιση θα μπορούσε να προωθήσει χρωμοσωμική μετατόπιση και την απώλεια της ετεροζυγωτίας, δημιουργώντας έτσι πιο κακοήθη καρκινικά κύτταρα. Η RAD51 συμμετέχει επίσης σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων λόγω της συμμετοχής της στο διαχωρισμό του DNA. Συχνά η RAD51 εκφράζεται υπερβολικά σε καρκινικά κύτταρα και σίγουρα συμβάλλει στη διάδοση τους. Υπάρχουν κάποιες συσχετίσεις μεταξύ της ποσότητας κυτταρικής RAD51 και την πρόοδο του καρκίνου, καθώς και μεταξύ της ποσότητας αυτής και την αντίσταση των κυττάρων σε χημειοθεραπεία. Αναστέλλοντας την παραγωγή της, επιβραδύνεται η ανάπτυξη όγκου και αυξάνεται η αποτελεσματικότητα της θεραπείας με ακτινοβολίες. Όπως προαναφέραμε, μεταλλάξεις ή βλάβες στις πρωτεΐνες του ομόλογου ανασυνδυασμού θα οδηγήσει σε μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης που είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στη γονιδιωματική αστάθεια που οδηγεί στην ανάπτυξη όγκου. Όμως έχει παρατηρηθεί ότι η RAD51 υπερεκφράζεται σε πολλούς όγκους. 67 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

68 Η μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης, επιβραδύνει την ανάπτυξη των κυττάρων. Άρα τα προκαρκινικά κύτταρα διορθώνουν / σταθεροποιούν την ανάπτυξή τους, εκ νέου, με την υπερέκφραση της RAD51 που έχει σαν αποτέλεσμα να καταστείλει βλάβες στα γονίδια HRR. Πρόσφατα, οι Schild και Wiese το 2010 προτείνουν δύο διαφορετικές θεωρίες που αφορούν RAD51 υπο-/ υπερ-κινητικότητα και κακοήθεια. Υπερέκφραση της RAD51 μπορεί να αντισταθμίσει την απώλεια της λειτουργίας των άλλων βασικών μορίων της DDR, συμπεριλαμβανομένων των γονιδίων BRCA1 και BRCA2, τα πειραματικά δεδομένα από διάφορες ερευνητικές ομάδες υποστηρίζουν δύο μοντέλα: 1. Μη φυσιολογικά επίπεδα RAD51 οδηγούν νωρίς, σε γενετική αστάθεια και στην ανάπτυξη του καρκίνου, θέτοντας έτσι την τροποποιημένη έκφραση της RAD51 ως τη κύρια αιτία της μεταμόρφωσης και 2. Η υπερέκφραση RAD51 μπορεί να προστατεύσει τα καρκινικά κύτταρα από βλάβες του DNA με αποτελεσματική επισκευή και επομένως, εμφανίζεται η RAD51 να σταθεροποίει τα καρκινικά κύτταρα και να τα κάνει πιο επιθετικά και μεταστατικά (Schild & Wiese, 2010). Τα ακριβή αίτια της RAD51 υπερέκφρασης δεν έχουν ακόμα ικανοποιητικά διερευνηθεί αλλά υπάρχει μια σειρά στοιχείων που υποδεικνύουν μεταγραφική ρύθμιση της πρωτεΐνης. Η ογκοκατασταλτική p53 που εμπλέκεται στον έλεγχο της επιδιόρθωση του DNA, εμπλέκεται στη μεταγραφική ρύθμιση του rad51 γονιδίου (Arias-Lopez et al., 2006). Η p53 είναι μεταλλαγμένη στους μισούς περίπου των καρκίνων του ανθρώπου με αποτέλεσμα να χάσει την κατασταλτική δράση της στην μεταγραφική ρύθμιση του rad51 γονιδίου. Η φυσική πρωτεΐνη p53 παίζει σημαντικό ρόλο στην καταστολή της μεταγραφικής έκφρασης του γονιδίου της RAD51 και επομένως στην καταστολή της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης RAD51 και της δραστηριότητας της. Έτσι μπορεί να εξηγηθεί η υψηλή συχνότητα των TP53 μεταλλάξεων στους ανθρώπινους καρκίνους. (Schild D. και Wiese C. 2010) 68 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Δομές των πρωτεϊνών RAD51 p53 BRCA2 Α. Γενικά για τη δομή της πρωτεΐνης RAD51 Η ανθρώπινη πρωτεΐνη RAD51 είναι μία πρωτεΐνη που αποτελείται από 339 αμινοξέα κατανεμημένα σε τρεις περιοχές Α.Δ.Σ.: Α) Ν-τελικό άκρο, κλώνος-έλικα-κλώνος, Β) C-τελικό άκρο και Γ) κεντρική περιοχή (ATPase Domain). Το 2002 παρουσιάστηκε η κρυσταλλική δομή (σε 1.7Å) του συμπλόκου RAD51-BRC4 (PDB: 1N0W) της BRC4 επανάληψης (BRC4) και του Α.Δ.Σ. της RAD51 του ομολόγου της RecA (Pellegrini L. et al. 2002). Για να ξεπεραστεί η φυσική τάση της RAD51 να διαμορφώνει ανομοιογενείς συναθροίσεις, συνδέθηκε ομοιοπολικά με την BRC4 ώστε να γίνει καθαρισμός του συμπλόκου ως πρωτεΐνη σύντηξης. Η κεντρική περιοχή του μορίου περιλαμβάνει τα συντηρημένα μοτίβα πρόσδεσης και υδρόλυσης του ΑΤΡ (Walker Α και Β). Η δομή του Α.Δ.Σ. ATPase της ανθρώπινης RAD51, επιβεβαιώνει ότι η RAD51 ανήκει στην RecA-like υπερ-οικογένεια των ρεκομπινασών (Εικόνα 23 & 24). Η αμινοξική αλληλουχία της ανθρώπινης RAD51 είναι κατά 80% ταυτόσημη με αυτή της ζύμης, ενώ είναι κατά 30% ταυτόσημη της βακτηριακής RecA. Οι καταλυτικοί τομείς της ανθρώπινης RAD51 και της βακτηριακής RecA είναι τοπολογικά ίδιοι. Τα μοτίβα πολυμερισμού (δηλαδή της αυτό-συγκρότησης της RAD51 σε ινίδια νουκλεοπρωτεΐνης) είναι υψηλά συντηρημένα μεταξύ των RecA-like ρεκομπινασών, αναδεικνύοντας την κοινή εξελικτική προέλευση για το μηχανισμό σχηματισμού των νουκλεοπρωτεϊνικών ινιδίων. 69 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

70 Α) Β) Εικόνα 23. Το κεντρικό Αυτοτελές Δομικό Στοιχείο ATPase των RecA-like ρεκομπινασών. Α) Σχηματική αναπαράσταση της αμινοξικής ακολουθίας RecA-like ρεκομπινασών από διάφορους οργανισμούς. Οι RecA-like ρεκομπινάσες μοιράζονται ένα διατηρημένο μοτίβο πολυμερισμού (PM), καθώς και τον Α.Δ.Σ. ATPase. Οι θέσεις και οι ακολουθίες του Α.Δ.Σ. όπου δεσμεύουν dsdna ποικίλλουν. Β) Στοίχιση των αμινοξικών ακολουθιών του Α.Δ.Σ. ATPase εννέα (9) προτείνων που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των RecA-like ρεκομπινασών. RadA (archaeal) από τον οργανισμό Methanococcus voltae (MvRadA) με κόκκινο χρώμα και τη δομή της πρωτεΐνης RecA (bacterial) από τον οργανισμό Escherichia coli (EcRecA) με μπλε χρώμα. Η ανθρώπινη ρεκομπινάση (HsRAD51) βρίσκεται στην 3η γραμμή. (Πηγή: Wu Yan, et al. 2005). Η διαφορά μεταξύ των πολυπεπτιδικών αλυσίδων των δύο πρωτεϊνών HsRAD51 και 70 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

71 EcRecA, εντοπίζεται στα Ν και C-τελικά άκρα. Η RAD51 εμφανίζει μεγάλο Ν-τελικό και κοντό C-τελικό άκρο. Επίσης, οι πρωτεΐνες RAD51 και RecA διαφέρουν ως προς τις περιοχές πρόσδεσης του DNA. Η RecA διαθέτει μια περιοχή σύνδεσης στο C-τελικό της άκρο, περιοχή μη συντηρημένη στη RAD51. Ο προσδιορισμός της τριτοταγούς δομής του Ν-τελικού άκρου της RAD51 με την χρήση φασματοσκοπίας NMR, ισχυροποίησε την υπόθεση για τη συμμετοχή του στη δέσμευση του DNA. Το C-τελικό άκρο της RAD51 μπορεί να μην συμμετέχει στη δέσμευση του DNA, θεωρείται πιθανό, όμως, να εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη RAD52 (Aihara H, et al. 1999). Εικόνα 24. Το σύμπλοκο RAD51-BRC4 (PDB: 1N0W). A) Η παρουσίαση της RAD51 ως κορδέλα είναι σε ματζέντα (α-έλικες) και γαλάζιο (β-κλώνοι), το μοτίβο της BRC επανάληψης είναι με πράσινο χρώμα. Τα Ν και C άκρα έχουν σημειωθεί. B) Τοπολογική αναπαράσταση. Ο συνδυασμός χρωμάτων είναι ο ίδιος όπως στο A), εκτός από το Ν- τελικό μοτίβο: κλώνος-έλικα-κλώνος της RAD51 (κίτρινο). Τα αναγραφόμενη δευτερεύοντα στοιχεία δομής στη RAD51 αποτελούν τον Α.Δ.Σ., τον ομόλογο με RecA. Οι μη κανονικές στροφές της RAD51 (διακεκομμένες γραμμές) συνδέουν τον β-κλώνο B4 με την α-έλικα Α5 (L1) και τον B5 με τον Β6 (L2). (Πηγή: Pellegrini L. et al. 2002) 71 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

72 B. Γενικά για τη δομή της πρωτεΐνης p53 Το όνομα της οφείλεται στη μοριακή της μάζα: 53 kilodalton (KDa). Η p53 είναι ένα πολυλειτουργικό μόριο που επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο, την επιδιόρθωση του DNA και την απόπτωση ρυθμίζοντας την μεταγραφή και αλληλεπιδρώντας άμεσα με άλλες πρωτεΐνες. Αυτές οι λειτουργίες επιτρέπουν στην p53 να συμβάλει στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας παρουσία μεταλλαξιογόνου περιβάλλοντος. Μετά από βλάβη στο DNA, η p53 πραγματοποιεί αναστολή του κυτταρικού κύκλου, προκειμένου να αποτρέψει την αντιγραφή των κατεστραμμένων κλώνων του DNA. Ακόμη παίρνει μέρος σε μηχανισμούς επισκευής, άμεσα. Αν η σύλληψη του κυτταρικού κύκλου και οι λειτουργίες επιδιόρθωσης του DNA αποτυγχάνουν να αποκαταστήσουν το γονιδίωμα σε κατάσταση κανονική (άγριου-τύπου), η p53 μπορεί να κατευθύνει και την εξάλειψη των κατεστραμμένων κυττάρων μέσω απόπτωσης. Ενεργεί λοιπόν ως ογκοκατασταλτικό σε πολλούς τύπους καρκίνου προκαλώντας αναστολή της ανάπτυξης ή απόπτωση, ανάλογα με τις συνθήκες και τον τύπο των κυττάρων. Άρα, η πρωτεΐνη p53 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής που διατηρεί την ακεραιότητα του γονιδιώματος με δύο τρόπους: α) μεταγραφικά μονοπάτια, τα οποία ενεργοποιούν τις διαδικασίες που οδηγούν σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση σε απάντηση σε ογκογόνο στρες, και β) μη-μεταγραφικές διαδικασίες, οι οποίες περιλαμβάνουν δέσμευση της RAD51 και ως εκ τούτου αναστολή του ομόλογου ανασυνδυασμού. Η πρωτεΐνη p53 αποτελείται από δύο διμερή που ενώνονται μεταξύ τους με ιοντικούς δεσμούς και αποτελούν ένα τετραμερές. Κάθε υπομονάδα μονομερές αποτελείται από 393 αμινοξέα. Η p53 είναι ένα συμμετρικό ομοτετραμερές που αποτελείται από διάφορες δομικές - λειτουργικές περιοχές Αυτοτελή Δομικά Στοιχεία. Αυτοί περιλαμβάνουν: Α) το Ν-τελικό Α.Δ.Σ. μεταγραφικής ενεργοποίησης (αα 1 60), Β) το ρυθμιστικό Α.Δ.Σ. πλούσιο σε προλίνη (αα 64 92), Γ) το πυρηνικό-κεντρικό Α.Δ.Σ. πρόσδεσης DNA (p53cd, αα ), Δ) το Α.Δ.Σ. τετραμερισμού (αα ) και Ε) το Α.Δ.Σ. του C-τελικού άκρου για αρνητική ρύθμιση (αα ). Το πυρηνικό Α.Δ.Σ. είναι υπεύθυνο για την δέσμευση DNA με τη συγκεκριμένη αμινοξική ακολουθία της p53. Αποτελείται από ένα β-σάντουιτς που χρησιμεύει ως σκαλωσιά για τη διεπαφή πρόσδεσης του DNA. Αυτή η διεπαφή είναι κατασκευασμένη από δύο ευέλικτες στροφές και ένα μοτίβο στροφή κλώνος έλικα. Περισσότερες από 100 πρωτεΐνες έχουν αναφερθεί ότι δεσμεύονται στην p53. Οι περισσότερες από αυτές δεσμεύονται στο Ν-τελικό Α.Δ.Σ. μεταγραφικής ενεργοποίησης ή στο C-τελικό ρυθμιστικό Α.Δ.Σ.. Λίγες μόνο πρωτεΐνες δεσμεύονται στο πυρηνικό Α.Δ.Σ. Από αυτές τις πρωτεΐνες, οι 53BP1 και 53BP2 δεσμεύονται 72 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

73 στο Α.Δ.Σ. p53cd μέσω της διεπαφής πρόσδεσης του DNA, αλληλεπιδρώντας, κυρίως, με τις L2 και L3 στροφές. Εικόνα 25. Δομή της πρωτεΐνης p53 (Πηγές: Friedler A. et al και PDB: 2OCJ) Γ. Γενικά για τη δομή της πρωτεΐνης BRCA2 Η πρωτεΐνη BRCA2, με ευαισθησία στο καρκίνο του μαστού, ελέγχει τη λειτουργία της RAD51, κατά την επιδιόρθωση του DNA μέσω του ομόλογου ανασυνδυασμού. Βλαστική σειρά μεταλλάξεων στο γονίδιο BRCA2 προκαλεί αυξημένη ευαισθησία σε καρκίνο μαστού, ωοθηκών και άλλων τύπων καρκίνου. Η πρωτεΐνη BRCA2, με 3418 αα, εντοπίζεται στον πυρήνα κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου κατά τη μίτωση, και ακόμη εκφράζεται σε μεγάλη ποσότητα, κατά τη διάρκεια της μείωσης. Η BRCA2 δεν μοιάζει πολύ με άλλες πρωτεΐνες γνωστής λειτουργίας, παραχωρώντας λίγες μόνο ενδείξεις για τη βιολογική λειτουργία της. Πηγή: Η BRCA2 περιλαμβάνει οκτώ συντηρημένα μοτίβα (ακολουθίας) - τις BRC επαναλήψεις (BRC repeats) - περίπου 30 αμινοξέα η κάθε μία, τοποθετημένες μεταξύ των 73 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

74 καταλοίπων 990 έως 2100 στην ανθρώπινη BRCA2. Αν και η συνολική ομοιότητα ακολουθίας μεταξύ των ορθολόγων της BRCA2 είναι περιορισμένη, οι BRC επαναλήψεις σε διάφορα είδη είναι καλά συντηρημένες, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές είναι απαραίτητες για την βιολογικές λειτουργίες της BRCA2. Πράγματι, οι BRC επαναλήψεις είναι τα πρωταρχικά τμήματα μέσω των οποίων η BRCA2 δεσμεύει τη RAD51. Οι BRC επαναλήψεις μιμούνται ένα μοτίβο στη RAD51 που χρησιμεύει ως μια διεπαφή για τον ολιγομερισμό μεταξύ μεμονωμένων RAD51 μονομερών, δίνοντας έτσι τη δυνατότητα στη BRCA2 ελέγχου της συναρμολόγησης του RAD51 ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης, η οποία είναι απαραίτητη στις αντιδράσεις αντιστοίχισης των κλώνων κατά τη διάρκεια ανασυνδυασμού του DNA. Τα μοτίβα ολιγομερισμού της RAD51 είναι υψηλά συντηρημένα μεταξύ των RecA-like ρεκομπινασών, αναδεικνύοντας την κοινή εξελικτική προέλευση για το μηχανισμό σχηματισμού ινιδίων νουκλεοπρωτεΐνης Ο καρκίνος που σχετίζεται με μεταλλάξεις που επηρεάζουν το μοτίβο BRC οφείλεται στην διαταραχή της προβλεπόμενης αλληλεπίδρασής της BRCA2 με τη RAD51. Όταν εκφράζονται σε in vitro, έξι από τις οκτώ BRC επαναλήψεις στη BRCA2 μπορούν να αλληλεπιδρούν άμεσα με την ρεκομπινάση RAD51. Οι BRC3 και BRC4 κωδικοποιούνται στην ανθρώπινη BRCA-2 και είναι ιδιαιτέρως αποτελεσματικές στη δέσμευση της RAD51, ενώ οι BRC5 και BRC6 δεν είναι. Η αλληλεπίδραση μεταξύ BRCA2 και RAD51 είναι κρίσιμη για τις βιολογικές λειτουργίες των δύο μορίων. Διακριτές πυρηνικές εστίες που περιέχουν RAD51 συνήθως συσσωρεύονται μέσα στον πυρήνα των κυττάρων των θηλαστικών που εκτίθενται σε βλάβη του DNA. Οι RAD51 εστίες αποτυγχάνουν να σχηματίσουν όταν υπάρχει ανεπάρκεια της BRCA2 στο κύτταρο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η BRCA2 μεταφέρει τη RAD51 στα μέρη όπου κάποια βλάβη του DNA, είναι σε επεξεργασία από ανασυνδυασμό. Πράγματι, ανεπάρκεια σε BRCA2 οδηγεί σε σοβαρή βλάβη της επισκευής των αμφίκλωνων σχάσεων του DNA (DNA double-strand breaks) με ανασυνδυασμό, και παρόμοια, ανεπάρκεια σε RAD51, προκαλεί αυθόρμητα, αστάθεια της δομής των χρωμοσωμάτων κατά την κυτταρική διαίρεση. Ειδικότερα, και σε προφανή σύγκρουση με τα δεδομένα αυτά, η δραστηριότητα της RAD51 κατά τον σχηματισμό ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης, καταστέλλεται από την αλληλεπίδρασή της με τα πεπτίδια κωδικοποίησης των BRC επαναλήψεων. Τα πειραματικά στοιχεία δείχνουν ότι τα μοντέλα στα οποία ο κυτταρικός εντοπισμός των συμπλόκων BRCA2-RAD51 και η δραστηριότητά τους στο σχηματισμό ινιδίων νουκλεοπρωτεΐνης, ρυθμίζονται μετά από βλάβη στο DNA, ίσως ως αποτέλεσμα τη μετάβαση από την «ανενεργή» σε «ενεργή» κατάσταση. Εικόνα 26. Η δομή της BRCA2 BRC4 επανάληψης 74 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Αλληλεπίδραση της RAD51 με την BRCA2 Η λειτουργική πολυπλοκότητα της αλληλεπίδρασης μεταξύ BRCA2 και RAD51 ώθησε πολλούς ερευνητές στην ανάλυση της δομής της αλληλεπίδρασης. Έτσι το 2002 παρουσιάστηκε η κρυσταλλική δομή (σε 1.7Å) του συμπλόκου της BRC 4 επανάληψης (BRC4) και του Α.Δ.Σ. της RAD51 του ομολόγου της RecA (Pellegrini et al. 2002). Για να ξεπεραστεί η φυσική τάση της RAD51 να διαμορφώνει ανομοιογενείς συναθροίσεις, συνδέθηκε ομοιοπολικά με την BRC4 ώστε να γίνει καθαρισμός του συμπλόκου ως πρωτεΐνη σύντηξης. Α. Αρχιτεκτονική και διασύνδεση-διεπαφή του RAD51-BRC4 συμπλόκου Η δομή του ATPase Α.Δ.Σ. της ανθρώπινης RAD51, επιβεβαιώνει ότι η RAD51 ανήκει στην RecA-like οικογένεια των ATPases (Εικόνα 27). Οι καταλυτικοί τομείς της ανθρώπινης RAD51 και των βακτηριακών RecA είναι τοπολογικά ίδιοι και τα αποτελέσματα της υπέρθεσης τους με μια μέση τετραγωνική απόκλιση 1.7Å (Root Mean Square Deviation) σε πάνω από 160 άτομα C a (από τους 210 που υπάρχουν στο κρυσταλλογραφικών μοντέλο). Α) Β) Γ) 75 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

76 Δ) Εικόνα 27. Το σύμπλοκο RAD51-BRC4 Α) Η παρουσίαση της RAD51 ως κορδέλα: είναι σε ματζέντα (α-έλικες) και γαλάζιο (β-κλώνοι), το μοτίβο της BRC επανάληψης είναι με πράσινο χρώμα. Τα Ν και C άκρα έχουν σημειωθεί. Β) Τοπολογικά διαγράμματα. Ο συνδυασμός χρωμάτων είναι ο ίδιος όπως στο Α), εκτός από το μοτίβο του Ν-τελικού άκρου: κλώνος-έλικα-κλώνος της RAD51 (κίτρινο). Τα αναγραφόμενη δευτερεύοντα στοιχεία δομής στη RAD51 αποτελούν το Α.Δ.Σ., το ομόλογο με τη RecA. Οι μη κανονικές στροφές της RAD51 (διακεκομμένες γραμμές) συνδέουν τον β-κλώνο B4 με την α-έλικα Α5 (L1) και τον B5 με τον Β6 (L2). Γ) Τρισδιάστατο διάγραμμα υπέρθεσης των Α.Δ.Σ. της ΑΤΡάσης της ανθρώπινης RAD51 και της βακτηριακής RecA (2REB). Τα δευτερεύοντα στοιχεία δομής είναι χρώματος κόκκινου (RAD51) ή πράσινου (RecA). (Pellegrini L. et al. 2002) Δ) Παρουσίαση του συμπλόκου BRC4-RAD51 (1N0W) ως κορδέλα. Η RAD51 είναι σε ματζέντα, και η BRC4 επανάληψη σε πράσινο. Ξεχωρίζουν οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων Phe1524 και Ala1527. (Pellegrini L. and Venkitaraman A. 2004) 76 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

77 Εικόνα 28. Η RAD51-BRC4 περιοχή αλληλεπίδρασης Α) υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με τη μεσολάβηση της α-ελικοειδούς περιοχής της BRC επανάληψης. Η RAD51 παριστάνεται ως επιφάνεια επαφής των πεπτιδίων με το διαλύτη (solvent accessible surface area - SASA). (πράσινο). Το μοτίβο BRC εμφανίζεται ως μια σπείρα καφέ, το οποίο διαθέτει μόνο τη σχετική πλευρικές αλυσίδες (ανοιχτό καφέ). Β) υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις που αφορούν την περιοχή β-φουρκέτα της BRC επανάληψης. C) ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Η RAD51 εμφανίζεται σε παράσταση κορδέλας (χρωματισμένη όπως στο Α), και το μοτίβο BRC εμφανίζεται ως ένας πράσινος σωλήνα. Οι συνεργαζόμαστε πλευρικές αλυσίδες παρουσιάζονται ως ράβδοι. Οι διάστικτες κίτρινες γραμμές αντιπροσωπεύουν δεσμούς υδρογόνου. (Pellegrini L. et al. 2002) Η BRC4 παραμένει σε συνεχή επαφή με τη RAD51 μέσω ενός τμήματος 28 αα (από Leu 1521 έως Glu 1548) (Εικόνα 27). Τα κατάλοιπα Phe 1524 έως και την Val 1532 αποτελούν μια β-φουρκέτα με 3:5 στροφή (1526-TASGK-1530) δομημένη ως στροφή Τύπου Ι που έχει ένα β-εξόγκωμα στο κατάλοιπο Gly 1529, το οποίο σχηματίζει ένα f αγκίστρι θετικής στροφής. Η φουρκέτα ευθυγραμμίζεται παράλληλα με τον Β3 β-κλώνο, επεκτείνοντας τη β- 77 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

78 πτυχωτή επιφάνεια της RAD51 με δύο μικρούς αντι-παράλληλους κλώνους. Μετά τη φουρκέτα, το BRC μοτίβο συστρέφεται γύρω από την έλικα Α4 της RAD51 μέσω ενός μικρού συνδέσμου-συνδέτη (Lys 1533 έως Ala 1535) που οδηγεί σε ένα αμφιπαθές α-ελικοειδές τμήμα (Lys 1536 έως Val 1542). Τα υπόλοιπα κατάλοιπα στο καρβοξυτελικό άκρο της BRC4 (Lys 1543 έως Glu 1548) αποτελούν μια ακανόνιστη σπείρα με στοιχεία από 3 10 έλικα που συνδέει τις Α4 και Α5 έλικες της RAD51, σχηματίζοντας γωνία 60 με τους άξονές τους. Στην Εικόνα 28 το σύμπλοκο RAD51-BRC4 θάβει 2,026 Å 2 επιφάνειας, με σημαντικές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, αλλά και πολικές επαφές υπάρχουν στη διεπαφή. Το μοτίβο BRC είναι εμπλουτισμένο με υδρόφοβα κατάλοιπα που διατηρούν στενή επαφή με τη RAD51 σε όλο το μήκος της. Τρία βασικά σημεία επαφής ξεχωρίζουν, με τη συμμετοχή των καταλοίπων Phe 1524, Ala 1527, Leu 1545 και Phe Η Phe 1524 βρίσκεται στον κλώνο της β-φουρκέτας που είναι σε επαφή με τη RAD51 και ο αρωματικός της δακτύλιος είναι θαμμένος μέσα σε μία υδρόφοβη εσωτερική κοιλότητα που σχηματίζεται από τις πλευρικές αλυσίδες των καταλοίπων της RAD51: Met 158, Ile 160, Ala 190, Ala 192, Leu 203, Ala 207 και Met 210. Η Ala 1527, στη δεύτερη θέση της στροφής της φουρκέτας, τοποθετεί τον C' άνθρακα της σε μια μικρή τσέπη που σχηματίζεται από τις πλευρικές αλυσίδες των καταλοίπων της RAD51: Phe 166, Pro 168, Leu 171, Leu 186 και Val 189. Στο καρβοξυτελικό άκρο της BRC επανάληψης, η Leu 1545 και η Phe 1546 αποτελούν μια σφήνα ενσωματωμένη μεταξύ των Α4 και Α5 ελίκων της RAD51, και περιβάλλονται από τα κατάλοιπα Leu 204, Tyr 205, Ser 208 (στην Α4 έλικα), και η Met 251, Arg 254, Leu 255, Glu 258 και Phe259 (στη A5 έλικα). Η συγγένεια μεταξύ BRC4 και RAD51 ενισχύεται περαιτέρω από υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με συμμετοχή των καταλοίπων Ile 1534 στην περιοχή του συνδέτη, και με υδρογονικούς δεσμούς στα κατάλοιπα Ser 1538, Leu 1539 και Val 1542 στην α-έλικα του Ν- τελικού άκρου. Εμφανίζονται ακόμη, ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις (πολικοί και ιοντικοί δεσμοί). Δεν είναι τόσο πολλές όσο οι υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Εικόνα 28 C. Η β-φουρκέτα της BRC4, κρατά τη BRC4 σε καλή επαφή με τη RAD51 με μια σειρά τριών συνεχών, αντι-παράλληλων δεσμών υδρογόνου κύριας αλυσίδα με κύρια αλυσίδα που συνδέουν την αμινοξική ακολουθία της BRC HTA-1527, με την ακολουθία 189-VAY- 191 στον Β3 κλώνο της RAD51. Το Asp (D) 187 της RAD51 είναι δέκτης δεσμού υδρογόνου από τη Ser 1528, που βρίσκεται στην τρίτη θέση της β-στροφής της BRC4 φουρκέτας, και αλληλεπιδρά ηλεκτροστατικά με τη Lys Το Glu (E) 213 της RAD51 είναι δέκτης δεσμού υδρογόνου από Ser 1538 της BRC4, το οποίο, πιθανώς, συνιστά μια ιδιαίτερα σημαντική επαφή, όπως είναι οι δύο πλευρικές αλυσίδες διατηρείται έτοιμη για την αλληλεπίδραση. Η θέση της πλευρικής αλυσίδας της Ser 1538 καθορίζεται από τη σωρευμένη (πολλαπλή) αλληλεπίδραση με την Ala 1535 της BRC4 και τη Val 212 της RAD51, ενώ η Glu 213 είναι συνδεδεμένη με δεσμό υδρογόνου με το άζωτο (Ν) της κύριας αλυσίδας της Ala 1535 και, μέσω ενός μορίου νερού, με το καρβονύλιο της κύριας αλυσίδας της Lys Τέλος, η Glu 1548, στο C-τελικό άκρο του BRC4 μοτίβου, αποτελεί ένα ζεύγος ιόντων με την Arg 250 της RAD Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

79 Οι αλληλεπιδράσεις που εμπλέκουν τα κατάλοιπα που δεν είναι συντηρημένα σε όλες τις BRC επαναλήψεις, βοηθούν να εξηγηθεί η μεγάλη συγγένεια της BRC4 προς την RAD51 σε σχέση με άλλους τύπους επαναλήψεων. Οι Λευκίνες Leu 1521 και 1522 είναι σε υδρόφοβη επαφή με τις πλευρικές αλυσίδες των RAD51 καταλοίπων Phe 195 και His 199, και το καρβονύλιο της κύριας αλυσίδας της Leu 1522 είναι δέκτης δεσμού υδρογόνου από τη His 199. Η His 1525 σχηματίζει ένα ψευδο-υδροφοβικό πυρήνα από το πακετάρισμα έναντι των αλειφατικών τμημάτων των πλευρικών αλυσίδων της Lys 1531 και της Thr 1520, προσδίδοντας έτσι μεγαλύτερη σταθερότητα στη δομή της β-φουρκέτας. Η διάπλαση του τμήματος δέσμευσης νουκλεοτιδίων (P-loop) διαφέρει μεταξύ RAD51 και RecA. Μια τρισδιάστατη υπέρθεση δείχνει ότι, ενώ η P-στροφή παραμένει αμετάβλητη στην δέσμευση και αποδέσμευση RecA από τη ADP, στην δέσμευση και αποδέσμευση RAD51 από τη BRCA2 υιοθετείται μια πιο κλειστή σφικτή διάπλαση που αποκλείει την τυχαία κατάληψή της από ATP. Αν και η BRC επανάληψη δεν καλύπτει άμεσα το τμήμα πρόσδεσης νουκλεοτιδίων, μπορεί να αναστείλει τη δέσμευση ΑΤΡ μέσω έμμεσης διαμορφωτικής επίδρασης.. Β. Η ρύθμιση της λειτουργίας της RAD51 από τη BRCA2 Το πρότυπο των RAD51 ελικοειδών ινιδίων νουκλεοπρωτεΐνης σε DNA υποστρώματα που καταλύουν τη στοίχιση και ανταλλαγή κλώνου μεταξύ των ομόλογων μορίων DNA, είναι ένα ουσιαστικό βήμα στον ομόλογο ανασυνδυασμό. Διαθέσιμα βιολογικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι η BRCA2 ρυθμίζει τη δραστηριότητα της RAD51 με τον έλεγχο της συγκέντρωσης της. In vitro, η επώαση (αλληλεπίδραση) με πεπτίδια BRC επαναλήψεις διατηρεί τη RAD51 σε μονομερή μορφή, αίροντας έτσι την αυθόρμητη τάση της να αυτόσυγκροτείται και να παίρνει μορφή ινιδίων νουκλεοπρωτεΐνης. In vivo, η RAD51 συσσωρεύεται σε εστίες, μέσα στον πυρήνα κατά τη διαίρεση των κυττάρων, πριν ή μετά από έκθεση σε παράγοντες βλάβης του DNA, και ο σχηματισμός εστιών καταστέλλεται από την υπερέκφραση των BRC επαναλήψεων. Η δομική βάση για το σχηματισμό ινιδίων από τη RAD51 δεν είναι γνωστή. Για να αποκτηθούν γνώσεις σχετικά με το μηχανισμό που χρησιμοποιείται από τη BRCA2 για τη ρύθμιση του σχηματισμού των RAD51 ινιδίων, αναλύθηκε η αλληλεπίδραση RAD51-BRCA2 σε σχέση με τα κρυσταλλογραφικά ινίδια της RecA (Εικόνα 29. Α). Σε κρυσταλλική μορφή, τα μόρια της RecA πακετάρονται σε μια ελικοειδή δομή που ομοιάζει πολύ με τα RecA-DNA ινίδια, όπως καθορίζεται από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Υπέρθεση των RAD51-BRCA2 συμπλόκου στη RecA, τοποθετεί τη β-φουρκέτα της BRC4 στο σημείο διεπαφής μεταξύ δύο γειτονικών μορίων RecA των κρυσταλλογραφικών ινιδίων (Εικόνα 29. Β). Συγκεκριμένα, τα BRC4 κατάλοιπα 1523-GFHTASG-1529 τοποθετούνται πολύ κοντά πάνω στην ακολουθία της RecA 25-SIMRLGE-31, η οποία αποτελεί μέρος της διεπαφής μεταξύ των RecA υπομονάδων. Τα κατάλοιπα της RecA 27-ΑΟΚ-29 προσθέτουν ένα αντι-παράλληλο β-κλώνο στην κεντρική β-πτυχωτή επιφάνεια ενός γειτονικού μορίου RecA, όπως και στην αλληλεπίδραση των BRC4 καταλοίπων 1525-HTA-1527 με τη RAD51 στο RAD51-BRCA2 σύμπλοκο. Επιπλέον, τα κατάλοιπα της RecA Ile 26 και Leu 29 δημιουργούν ανάλογες υδρόφοβες επαφές με αυτές που δημιουργούνται από τα Phe 1524 και Ala 1527 του BRC4 με τη RAD51 (Εικόνα 29. C, D). 79 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

80 Η ανάλυση της υπέρθεσης προσφέρει μια συναρπαστική ιδέα σχετικά με το μηχανισμό που ενέκρινε το BRCA2 για τη ρύθμιση RAD51 λειτουργία. Δηλαδή, η δέσμευση από τη BRCA2 αποτρέπει το σχηματισμό του ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης, παρεμβαίνοντας με μια κρίσιμη σύνδεση μεταξύ των RAD51 υπομονάδων, καθώς και με τον ειδικό ρόλο των BRC επαναλήψεων που μιμούνται τη δομή του τμήματος της RAD51 που εμπλέκεται σε μια τέτοια σύνδεση. Υπάρχει ομοιότητα στην ακολουθία μεταξύ του BRC μοτίβου και της περιοχής της RAD51 αλληλουχίας, η οποία παίζει ρόλο στον ολιγομερισμό και είναι ανάλογη με εκείνη της ακολουθίας RecA 25-SIMRLGE-31. Στην αμινοξική ακολουθία της RAD51 υπάρχουν μικρά μοτίβα που μοιάζουν με το μοτίβο των περισσοτέρων BRC "GFXTASG" (όπου X είναι οποιοδήποτε αμινοξύ), με ιδιαίτερα συντηρημένη την αλληλουχία 85-GFTTATE-91 στον RAD51 (linker) συνδέτη μεταξύ του Α.Δ.Σ. του Ν-τελικού άκρου και του καταλυτικού πυρήνα (Εικόνα 29. Ε). Β.1 Η ρύθμιση της αυτο-συγκρότησης (self association) της RAD51 από τη BRCA2 Όπως έχουμε αναφέρει ένας κρίσιμος μηχανισμός ελέγχου της RAD51 φαίνεται να εμπλέκεται με την αλληλεπίδρασή της με την πρωτεΐνη BRCA2, του οποίου η αδρανοποίηση προδιαθέτει για καρκίνο μαστού, ωοθηκών και άλλων καρκίνων. Οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες που προκαλούνται σε κύτταρα σπονδυλωτών από την αδρανοποίηση μιας εκ των δύο: BRCA2 ή RAD51, περιλαμβάνουν βλάβες που προκύπτουν κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA. Επιπλέον, η έκθεση των κυττάρων σε υδροξυουρία (HU), ένας παράγοντας που επηρεάζει την σταματημένη αντιγραφή, έχει σαν αποτέλεσμα να συνεντοπίζεται η BRCA2 με τη RAD51 σε εστίες του πυρήνα του κυττάρου που περιέχουν, επίσης, την αναπαραγωγική πρωτεΐνη PCNA. Αυτό είναι ενδεικτικό για το ρόλο τους (BRCA2, RAD51) στην επιδιόρθωση των βλαβών του DNA. Υπάρχουν δύο διαφορετικές σειρές παρατηρήσεων σχετικά με τον έλεγχο των ενζυμκών αντιδράσεων που εξαρτώνται από τη RAD51 οι οποίες απαιτούνται για την κυτταρική απάντηση σε σταματημένη-μπλοκαρισμένη αντιγραφή. Από τη μία πλευρά, η RAD51 πρέπει να αυτο-συγκροτηθεί / ολιγομεριστεί σε μια ενεργητική νουκλεοπρωτεΐνη, δια-μεσολαβώντας στα σημεία της βλάβης του DNA, προκειμένου να πραγματοποιηθούν οι αντιδράσεις του ανασυνδυασμού, μια διαδικασία για την οποία η BRCA2 εκτιμάται ότι είναι απαραίτητη. Από την άλλη, υπάρχουν βιοχημικές και βιοκυτταρικές ενδείξεις ότι η BRCA2 καταστέλλει την αυτοσυγκρότηση της RAD51. Πράγματι, δομικές αναλύσεις δείχνουν σαφώς ότι οι BRC επαναλήψεις, εμποδίζουν τον ολιγομερισμό της RAD51, παρεμβαίνοντας σε μια κρίσιμη διεπαφή μεταξύ των υπομονάδων της RAD51. Αυτές οι διαφορετικές παρατηρήσεις έχουν συγχωνευτεί σε ένα υποθετικό μοντέλο όπου το σύμπλοκο BRCA2-RAD51 ανταποκρίνεται στα σήματα που ενεργοποιούνται από βλάβες μετακινούμενο από ανενεργή σε ενεργή κατάσταση. Σε ανενεργή κατάσταση, το 80 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

81 σύμπλοκο BRCA2-RAD51 θέτει τη RAD51 σε μορφή ανίκανη να αυτο-συγκροτηθεί, αλλά κατά την ενεργοποίηση από σταματημένη αντιγραφή ή βλάβες στο DNA κινητοποιείται το σύμπλοκο BRCA2-RAD51 σε περιοχές όπου οι πρωτεΐνες που το απαρτίζουν μπορούν να συμμετέχουν σε αντιδράσεις ανασυνδυασμού. Γ. BRC4 μεταλλάξεις που σχετίζονται με καρκίνο. Η δομή του συμπλόκου RAD51-BRCA2 (BRC4) επιτρέπει την εκλογίκευση του μοτίβου της συντηρημένης ακολουθίας που παρατηρήθηκε στις BRC επαναλήψεις που ανήκουν σε διαφορετικούς τύπους επαναλήψεων και οργανισμών (ΠΙΝΑΚΑΣ 3). Επιπλέον, εξηγείται η δυνητικά καρκινογόνος φύση των σημειακών μεταλλάξεων που επηρεάζουν τα κατάλοιπα της BRCA2 τα σημαντικά για τη δέσμευση της RAD51 (Breast Cancer Information Core database Το πιο συντηρημένο κατάλοιπο προς το αμινοτελικό μέρος είναι η Γλυκίνη Gly 1523 (G), κατά πολύ συντηρημένη που βρίσκεται σε ένα χωρικά περιορισμένο περιβάλλον στη διεπαφή μεταξύ των πρωτεϊνών. Η εμφάνιση Γλυκίνης ή Σερίνης σε αυτή τη θέση αντιπροσωπεύει το 60% των περιπτώσεων. Τα κατάλοιπα F(Phe) H(His) T(Thr) A(Ala) S(Ser) G(Gly) K(Lys)-1530, με εξαίρεση την Ιστιδίνη 1525 (His - Η), αποτελούν μια συνεχόμενη περιοχή από πολύ συντηρημένα αμινοξέα. Η δομή δείχνει ότι έχουν εμπλακεί σε κρίσιμες υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις (η Phe 1524 και η Ala 1527, εμφανίζονται κατά 89% και 82% των BRC ακολουθιών, αντίστοιχα) και ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις (τα πολικά Ser 1528 και Lys 1530, το 59% και 70%, αντίστοιχα) με τη RAD ΠΙΝΑΚΑΣ 3. BRC4 Συντηρημένα Κατάλοιπα β β β β β β α α α α α α α K E P T L L G F H T A S G K K V K I A K E S L D K V K N L F D E K E Q G F x T A S G S N K o i x i S o o S A L x K A V S K R x i a F L o D E ΠΙΝΑΚΑΣ 3. Η ακολουθία της BRC4 επανάληψης, από τη Λευκίνη Leu 1521 μέχρι το Γλουταμικό οξύ Glu 1548 εμφανίζεται οριζόντια στον πίνακα. Τα κατάλοιπα με στοιχεία δευτεροταγούς δομής είναι σε γκρι φόντο με α και β πάνω από αυτά που δείχνουν ότι ανήκουν σε α-έλικα και β-κλώνο, αντίστοιχα. Στην τελευταία γραμμή του πίνακα περιέχεται ένα είδος "μοτίβου" που έχει προκύψει από την αλληλουχία και τα συντηρημένα κατάλοιπα από ένα σύνολο με 56 BRC επαναλήψεις από 7 διαφορετικούς οργανισμούς. Συμβολίζονται με "i" τα υδρόφοβα κατάλοιπα, με "o" τα υδρόφιλα, με "a" τα αρωματικά και με "x" οποιοδήποτε κατάλοιπο, χωρίς καμία προτίμηση. Μια σημειακή μετάλλαξη της Θρεονίνης 1526 σε Αλανίνη (Thr 1526 Ala) παρακωλύει την ικανότητα ενός πεπτιδίου της BRC4 να δεσμεύει τη RAD51. Οι μεταλλάξεις που 81 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

82 σχετίζονται με καρκίνος αφορούν την ισοδύναμη θέση στις BRC1 (Thr 1011 Arg), BRC2 (Ser 1221Pro) και BRC7 (Thr 1980 Ile). Η δομή δείχνει ότι η Θρεονίνη Thr 1526 δέχεται ένα δεσμό υδρογόνου από το άζωτο της κύριας αλυσίδας της Lys 1530 που είναι απαραίτητη για τη διαμορφωτική σταθερότητα της στροφής στη φουρκέτα. Έτσι, οι BRC επαναλήψεις στις οποίες η Θρεονίνη Thr είναι μεταλλαγμένη είναι απίθανο να διαμορφώσει τη σωστή φουρκέτα που είναι απαραίτητα για την αποτελεσματική σύνδεση με τη RAD51. Η Θρεονίνη Thr 1526, επίσης, είναι δότης ενός δεσμούς υδρογόνου στο υδροξύλιο της Σερίνης Ser 1528, που την κάνει ικανή για αλληλεπίδραση με το Ασπαρτικό Asp 187 της RAD51. Η Θρεονίνη ή η Σερίνη αντιπροσωπεύουν το 93% των περιπτώσεων στη θέση Μία κοινή μετάλλαξη του καρκίνου του μαστού σχετίζεται με την αλλαγή της Γλυκίνης Gly 1529, στην τέταρτη θέση της στροφής της φουρκέτας, με Αργινίνη Arg. Οι δομικοί περιορισμοί σχετικά με τη θέση 1529 οδηγούν σε επιλογή εκείνων των αμινοξέων των ικανών να δημιουργήσουν "f" αγκίστρι, θετικής γωνίας. Έχει βρεθεί στη θέση 1529 Γλυκίνη, Σερίνη ή Ασπαραγίνη με ποσοστό εμφάνισης 93%. Αντικατάσταση της Γλυκίνης από Αργινίνη θα διαταράξει τη διάπλαση της β-φουρκέτας στην BRC επανάληψη, αποδυναμώνοντας τη πρόσδεση της RAD51. Στην περιοχή πρόσδεσης που συνδέει τη β-φουρκέτα της BRC4 στην α-έλικα Α4 της RAD51, η Βαλίνη Val 1532 και η Ισολευκίνη Ile 1534 συμβάλουν στη συνεχή προσκόλληση του BRC4 μοτίβου στην επιφάνεια της RAD51 μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων με τη Met 210 της RAD51 (με ποσοστό εμφάνισης 80% και 93%, αντίστοιχα, για τις θέσεις 1532 και 1534 των αλειφατικών καταλοίπων Ισολευκίνη, Λευκίνη και Βαλίνη). Μια Σερίνη Ser βρίσκεται στη θέση 1535 με ποσοστό εμφάνισης της 70%, η οποία καλύπτει την α-έλικα του N άκρου. Μέσα στα συντηρημένα κατάλοιπα της αμφιπαθούς έλικας, συμπεριλαμβάνεται η Ser 1538 (με προτίμηση 50%) και η Leu 1539 (με προτίμηση 89% για Λευκίνη, Ισολευκίνη ή Βαλίνη) δημιουργώντας υδροφοβικό και υδρογονικό πλέγμα αλληλεπιδράσεων με τη RAD51. Η επιλογή ενός μικρού αμινοξέων ικανού για υδρόφοβη αλληλεπίδραση στη θέση 1542 (με προτίμηση 79% για Βαλίνη, Αλανίνη ή Σερίνη) εξηγείται από τη στενή επαφή μεταξύ της BRC4 και της A4 έλικας της RAD51. Η ισχυρή προτίμηση για τη Λυσίνη Lys στη θέση 1541 (79%) είναι ενδιαφέρουσα, καθώς η πλευρική της αλυσίδα εκτίθεται σε διαλύτη, και δημιουργεί την εντύπωση ότι η συντηρημένη ακολουθία της BRC δεν υπαγορεύεται, αποκλειστικά, από την αλληλεπίδραση της με τη RAD51. Η Leu 1545 και η Phe 1546 είναι μέρος μιας μεγάλης υδροφοβικής διεπαφής στην οποία συνεισφέρουν επίσης, τα κατάλοιπα στις έλικες Α4 και Α5 της RAD51. Πράγματι υδρόφοβα κατάλοιπα εμφανίζονται έντονα σε αυτές τις θέσεις (89% και 93%, συντήρηση, αντίστοιχα). Η δομή αποδεικνύει περαιτέρω ότι, ενώ η Leu 1545 είναι εν μέρει εκτεθειμένη σε διαλύτη, η πλευρική αλυσίδα της Phe 1546 διεισδύει βαθιά στη διεπαφή RAD51-BRC4. Κατά συνέπεια, η θέση 1545 δείχνει μόνο μια γενική υδρόφοβη προτίμηση, ενώ η θέση του 1546 απαιτεί Φαινυλαλανίνη ή Λευκίνη. Το πιο κοντινή θέση προς το C-τελικό άκρο δείχνει μια καθαρή προτίμηση, είναι η 1548, η οποία επιλέγει ένα όξινο κατάλοιπο (με 80% συνδυασμένη συντήρηση σε Ασπαρτικό ή Γλουταμινικό οξύ). Στην κρυσταλλική δομή, το Glu 1548 δημιουργεί ιοντικό δεσμό με την Arg 250 της RAD51. Το μοτίβο BRC θυμίζει μία ταινία Velcro (διπλής επικόλλησης) με τον τρόπο που συμμορφώνεται προς τη RAD51, δηλαδή, μέσα από ένα μεγάλο αριθμό επαφών που είναι σχετικά ανεξάρτητες η μία από την άλλη. Οι BRC επαναλήψεις πολύ διαφορετικές από τη 82 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

83 πλειοψηφία των περιπτώσεων, μπορούν να διατηρούν υπόλοιπο συγγένειας προς τη RAD51, ακόμη και αν η εξάλειψη ενός ή μερικών σημείων επαφής θα αποδυναμώσει τη δέσμευση, χωρίς όμως να την καταργεί τελείως. Το BRC μοτίβο ενδέχεται να προέκυψε εξελικτικά ως ένα μοριακό πλαίσιο αμινοξικής αλληλουχίας κατάλληλο για ένα ευρύ φάσμα συγγένειες με τη RAD51, με εμπλοκή στη ρύθμιση της λειτουργίας της RAD51 από τη BRCA2. Εικόνα 29. Η BRCA2 αναστέλλει το σχηματισμό ινιδίων της RAD51 Α) Το κρυσταλλογραφικό ινίδιο της RecA. Β) Η υπέρθεση του RAD51-BRC4 συμπλόκου με μια υπομονάδα του κρυσταλλογραφικού ινιδίου της RecA (παραλείποντας για λόγους σαφήνειας τη RAD51). Οι θέσεις της BRC επανάληψης (πράσινο) στη διεπαφή μεταξύ γειτονικών υπομονάδων RecA (σε μπλε και ροζ χρώμα). C) Λεπτομέρεια από την υπομονάδα διεπαφής στο κρυσταλλογραφικό ινίδιο της RecA. Η ακολουθία RecA 26-IMRL-29 μεσολαβεί στον πολυμερισμού μέσω συνδυασμού αντιπαράλληλων β-κλώνων. Τα κατάλοιπα Ile 26 και Leu 29 αντιπροσωπεύουν τα σημεία της επαφής μεταξύ των υδρόφοβων υπομονάδων. D) Λεπτομέρεια από τη διεπαφή μεταξύ RAD51 (μπλε) και BRC4 (ροζ). Η BRCA2 ακολουθία 1524-FHTA-1527, αλληλεπιδρά με RAD51 μέσω συνδυασμού αντιπαράλληλων β- κλώνων. Τα κατάλοιπα Phe 1524 και Ala 1527 έρχονται σε επαφή τη RAD51 υδροφοβικά. Ε) Η εξελικτική συντήρηση των αμινοξέων που προβλέπεται ότι θα μεσολαβήσουν στο σχηματισμό των ινιδίων στις RecA-like ρεκομπινάσες. Η σχετική ακολουθία BRC4 στοιχίζεται επίσης. Ο αστερίσκος σηματοδοτεί τις θέσεις των δύο κρίσιμων υδρόφοβων καταλοίπων. (H. sapiens - Homo sapiens, C. griseus - Cricetulus griseus, X. laevis - Xenopus laevis, D. melanogaster - Drosophila melanogaster, S. cerevisiae - Saccharomyces cerevisiae P. furiosus - Pyrococcus furiosus, E. coli - Escherichia coli.) 83 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

84 Εικόνα 30. Η αλληλεπίδραση της BRCA2 με τη RAD51. Α) Σχηματική αναπαράσταση της δομής δύο Α.Δ.Σ. της ρεκομπινάσης RAD51. Οι συντηρημένες αμινοξικές ακολουθίες, μεταξύ των Α.Δ.Σ., της ανθρώπινης RAD51, της RADA (η ορθόλογη της RAD51 από Pyrococcus furiosus), καθώς και της ανθρώπινης BRCA2 BRC4 (αριθμός επανάληψης 4, μιας μικρής συντηρημένης αλληλουχίας αμινοξέων που δεσμεύει την RAD51 και εμφανίζεται σε πολλαπλά αντίγραφα στη BRCA2 των σπονδυλωτών). Αυτό το μοτίβο αποτελεί ένα κρίσιμο μέρος της διασύνδεσης υπομονάδας-υπομονάδας μεταξύ των γειτονικών υπομονάδων της ρεκομπινάσης στο ινίδιο νουκλεοπρωτεΐνης, και μιμείται τη BRC4 επανάληψη της BRCA2 που δεσμεύει τη RAD51. Οι αστερίσκοι δηλώνουν τα συντηρημένα κατάλοιπα φαινυλαλανίνης και αλανίνης που εμπλέκονται στην θεμελιώδη υδρόφοβη επαφή στις διεπαφές μεταξύ πρωτεϊνών. Β) Παρουσίαση του BRCA2 BRC4-RAD51 συμπλόκου (PDB κωδικός: 1N0W). Η RAD51 είναι σε ματζέντα, και η BRC4 επανάληψη σε πράσινο. Κίτρινοι κύκλοι τονίζουν τις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων Phe1524 και Ala1527. C) Παρουσίαση του ολιγομερούς RADA από Pyrococcus furiosus (PDB κωδικός: 1PZN). Μόνο μια λεπτομέρεια της διασύνδεσης μεταξύ δύο γειτονικών υπομονάδων (σε ματζέντα και πράσινο) της επταμερούς δακτύλιου είναι. Κίτρινοι κύκλοι τονίζουν οι πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων Phe97 και Ala100. (Pellegrini L. and Venkitaraman A. 2004) 84 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

85 Γ.1 Πειραματικές μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη λειτουργία της RAD51. Μεταλλάξεις όπου τα βασικά κατάλοιπα εντός του πυρηνικού Α.Δ.Σ. αντικαταστάθηκαν για να διαταραχτεί η αλληλεπίδραση με το μοτίβο του linker και, επομένως, να καταργηθεί η ικανότητα της RAD51 τόσο να αυτο-συγκροτείται όσο και να δεσμεύεται στις BRC επαναλήψεις: ΠΡΩΤΗ ΜΕΤΆΛΛΑΞΗ F86E ή A89E Η Phe86 ή η Ala89 στο τμήμα του συνδέτη αντικαταστάθηκε με Glu ώστε να δημιουργηθούν RAD51 μεταλλάξεις (F86E ή A89E) που δεν έχουν την ικανότητα να αυτοσυγκροτούνται, αλλά διατηρούν την ικανότητα να δεσμεύονται στη BRCA2. Στην εργασία του Luca Pellegrini (Nature ) για τον έλεγχο του μοντέλο ολιγομερισμού της RAD51 που έδειξε η κρυσταλλογραφική ανάλυση, κατασκευάστηκαν μεταλλαγμένα μόρια RAD51 στα οποία τα αμινοξέα Phe 86 και Ala 89, από την ακολουθία 85-GFTTATE-91 αντικαταστάθηκαν από γλουταμινικό οξύ. Κάθε μια από αυτές τις αλλαγές εξάλειψε μια κρίσιμη υδρόφοβη επαφή κατά τη διεπαφή τωνrad51 υπομονάδων και, επομένως, καταργείται ή μειώνεται σημαντικά η ικανότητα των μορίων της RAD51 να σχηματίσουν ινίδια. Οι RAD51 μεταλλάξεις ήταν σημασμένες στα Ν άκρα τους σε μια πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), πριν τη μεταβίβασή τους σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Η ακεραιότητα των αα Phe 86 και Ala 89 είναι απαραίτητη ώστε να έχει η RAD51 την ικανότητα να αυτο-συγκροτείται. Ακόμη οι μεταλλάξεις F86E και A89E επιδρούν στην ικανότητα της RAD51 να σχηματίσουν εστίες στον πυρήνα. Η απλούστερη εξήγηση για την καταστολή του σχηματισμού-εστιών από τις BRC επαναλήψεις, από άποψη της γνωστής ιδιότητας τους να διαλύει τις συγκεντρώσεις της RAD51 in vitro, είναι ότι η συσσώρευση της RAD51 σε εστίες εξαρτάται από την ικανότητά της να ολιγομερίζεται. Διαπιστώθηκε ότι και οι RAD51 μεταλλάξεις F86E και A89E έχουν μια παρόμοια ανασταλτική δράση, δεν μπορούν να σχηματίσουν εστίες και κατανέμονται, διάχυτα, σε όλο τον πυρήνα. Επομένως η κρυσταλλογραφική ανάλυσή για το ανθρώπινο σύμπλοκο RAD51-BRCA2 απέδειξε ότι το συντηρημένο μοτίβο αλληλουχίας GFHTASG-1529 της BRC4 μιμείται δομικά την ακολουθία 85-GFTTATE-91της ανθρώπινης RAD51 που βρέθηκε στη διεπαφή μεταξύ υπομονάδων της RAD51. Η αντικατάσταση των Phe 86 ή Ala 89 με γλουταμινικό οξύ δημιουργεί RAD51 μεταλλάξεις που δεν είναι πλέον ικανές να αυτο-συγκροτούνται ή να σχηματίζουν εστίες στον πυρήνα, όταν εκφράζεται στα κύτταρα των θηλαστικών. Έτσι, η BRCA2 αλληλεπιδρά με τη RAD51 μιμούμενη το δομικό μοτίβο που δίνει τη δυνατότητα στη RAD51 να ολιγομερίζεται, αποτρέπει την ενσωμάτωσή της σε ινίδια νουκλεοπρωτεΐνης. Ειδικότερα, η ακολουθία που μεσολαβεί για τη σύνδεση μεταξύ των υπομονάδων στο RAD51 ινίδιο, είναι συντηρημένη στη βακτηριακή RecA, στη RADA των αρχαίων και στις DMC1 πρωτεϊνικές οικογένειες (Εικόνα 29), 85 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

86 το οποίο δείχνει μια κοινή εξελικτική προέλευση του μηχανισμού σχηματισμού ινιδίων νουκλεοπρωτεΐνης, ένα κρίσιμο ενδιάμεσο στάδιο στον γενετικό ανασυνδυασμό. Δομική ανάλυση του καρκίνου που σχετίζονται με μεταλλάξεις που επηρεάζουν την BRC επανάληψη αποκαλύπτει ότι η αποδυνάμωση της συγγένειας της RAD51 με μία μόνο επανάληψη είναι αρκετή για να αυξήσει την ευαισθησία του μαστού καρκίνου. Γιατί οι υπόλοιπες επτά BRC επαναλήψεις δεν επαρκούν για την διατήρηση της λειτουργίας; Μία εξήγηση είναι ότι και οι οκτώ επαναλήψεις συνεργάζονται ως RAD51 προσδέτης των οποίων η συνολική τοπολογία είναι κρίσιμη για τη λειτουργία αυτή. Με ταυτόχρονη αλληλεπίδραση μέσω των διαδοχικών BRC επαναλήψεων, η BRCA2 μπορεί, συνεπώς, να βοηθήσει στην διάταξη της χωρικής κατανομής των μορίων της RAD51 όταν φορτώνονται στο DNA κατά τη διάρκεια του σχηματισμού νημάτων νουκλεοπρωτεΐνης, ή κατά την απομάκρυνσή τους από δημιουργημένα ινίδια. Αλλοιώσεις που μειώνουν τη δεσμευτική ικανότητα και μόνο μίας από τις οκτώ BRC επαναλήψεις μπορεί να διαταράξει τα καθήκοντα αυτά, παρεμβαίνοντας στις χωρικές σχέσεις μεταξύ των μορίων της RAD51 που δεσμεύονται από τη BRCA2. Η ρύθμιση της λειτουργίας της RAD51 από τη BRCA2 μπορεί επίσης να κλιμακωθεί από φυσιολογικές μετατροπές. Η φωσφορυλίωση της Thr 1526 θα μειώσει πιθανότατα τη συγγένεια με τη RAD51, με το να αποσταθεροποιήσει τη δομή της BRC επανάληψης, ενώ η φωσφορυλίωση της σερίνης Ser 1528 ή της σερίνης Ser 1538 θα διατάρασσε τις πολικές επαφές με το ασπαρτικό Asp 187 ή το γλουταμικό Glu 213, αντιστοίχως, στη RAD51. Άρα, πολλά κατάλοιπα των BRC επαναλήψεων αν τροποποιηθούν επηρεάζουν τον πολύπλοκο σχηματισμό RAD51-BRCA2. Αυτό είναι ενδεικτικό για το πως τα μονοπάτια που σηματοδοτούν οι βλάβες του DNA, μπλοκάρουν την αναπαραγωγή ή την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζοντας την αλληλεπίδραση RAD51-BRCA2. Επομένως, η αλληλεπίδραση RAD51-BRCA2 είναι ιδιαίτερα ευάλωτη σε αναστολείς μικρών μορίων, επειδή εξαρτάται καθοριστικά από τις χωρικά περιορισμένες υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις με συμμετοχή τριών BRCA2 κατάλοιπων, Phe 1524, Phe 1546 και Ala 1527, συντηρημένες μεταξύ των διαφόρων BRC επαναλήψεων. Επειδή BRCA2 και RAD51 συμμετάσχει στην επισκευή της διάσπασης-σχάσης του DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφή του DNA, τέτοιοι αναστολείς μπορούν να αποδειχθούν χρήσιμοι βοηθοί στη θεραπεία με ακτινοβολία ή με αντικαρκινικά φάρμακα που προκαλούνται από βλάβη στο DNA ή παρεμβολή στην αντιγραφή. ΔΕΥΤΕΡΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ A190L και Α192L Όπως έχει αναφερθεί σημαντική περιοχή της διεπαφής της RAD51 BRCA2 είναι μία υδρόφοβη εσωτερική κοιλότητα που σχηματίζεται από τις πλευρικές αλυσίδες των καταλοίπων της RAD51: Met 158, Ile 160, Ala 190, Ala 192, Leu 203, Ala 207 και Met 210 όπου θάβεται ο αρωματικός της δακτύλιος της Phe 1524 που βρίσκεται στη β-φουρκέτα της BRC4. Η ίδια αυτή περιοχή της RAD51 χρησιμεύει για την σύνδεση των μονομερών της RAD51 και τότε εκεί θάβεται ο αρωματικός της δακτύλιος της Phe 86 του άλλου μονομερούς. Η Ala190 και η Ala192 στην αλληλουχία αμινοξέων 190-Ala-Tyr-Ala-192 αντικαθίστανται με Leu. Αυτή εισάγει ογκωδέστερα κατάλοιπα ώστε να κλείσει την υδρόφοβη κοιλότητα όπου θάβεται η Phe86 από το τμήμα του συνδέτη ή την αντίστοιχη Phe στην BRC επανάληψη. 86 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

87 ΤΡΙΤΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ SAM LEA Η ακολουθία 208-Ser-Ala-Met-210 αντικαθίσταται με κατάλοιπα ογκωδέστερο (Leu) και φορτισμένο (Glu). Τα κατάλοιπα αυτά βρίσκονται σε σημεία της στενή επαφή με την BRC επανάληψη, και οι μεταλλάξεις είχαν ως στόχο το άνοιγμα της κοιλότητας (Ala) στην οποία θάβεται η Phe86 από το τμήμα του συνδέτη ή η αντίστοιχη Phe στην BRC επανάληψη. ΤΕΤΑΡΤΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ SA ED Η ακολουθία 208-Ser-Ala-209 αντικαθίσταται με αρνητικά φορτισμένα κατάλοιπα Glu και Asp. Η μετάλλαξη αυτή, αδυνατεί να δεσμευτεί στην BRC επανάληψη, αλλά διατηρεί την ικανότητα να αυτό-συγκροτείται. Η Ser208 και η Ala209 μέσα στο πυρηνικό Α.Δ.Σ. (αλλά εκτός της υδρόφοβης κοιλότητα) αντικαταστάθηκαν με Glu και Asp να εισαχθούν φορτισμένα και ογκωδέστερα κατάλοιπα στα σημεία της στενή επαφή με τις BRC επαναλήψεις. ΠΙΝΑΚΑΣ 4. Πειραματικών Μεταλλάξεων RAD51 και Αντίστοιχη Αναφορά ΑΝΑΦΟΡΑ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗ ΠΕΡΙΟΧΉ Nature Luca Pellegrini Mol Cell David S. Yu Phe ή Ala σε Glu F86E A89E Ala σε Leu A190L Α192L Σχηματίζει ολιγομερή Δεσμεύονται στη BRCA2 Συνδέτης ΟΧΙ ΝΑΙ Υδρόφοβη εσωτερική κοιλότητα όπου θάβεται η Phe 86 ή η Phe 1524 ΟΧΙ ΟΧΙ SAM LEA Στενή επαφή με την ΟΧΙ ΟΧΙ SA ED BRC επανάληψη ΝΑΙ ΟΧΙ 87 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

88 Εικόνα 31. Τα μοντέλα για την διεπαφή RAD51-BRC 4 και RAD51-RAD51. Α) Παρουσίαση κορδέλας του Α.Δ.Σ. ΑΤΡάσης και της αμινο-τελικής περιοχής της RAD51 (σε πράσινο) και της BRC4 επανάληψης της BRCA2 (σε ροζ). Επισημαίνονται τα κατάλοιπα Phe1524 και Ala1527, που δημιουργούν υδρόφοβες επαφές με τη RAD51. B) Παρουσίαση κορδέλας δύο γειτονικών RAD51 υπομονάδων. Επισημαίνονται τα κατάλοιπα Phe86 και Ala89, στο τμήμα του συνδέτη (linker) μεταξύ του αμινοτελικού και του Α.Δ.Σ. ΑΤΡάσης, που αποτελούν τα σημεία των υδρόφοβων επαφών μεταξύ γειτονικών υπομονάδων. C) Μια λεπτομέρεια της διασύνδεσης μεταξύ RAD51 (μπλε) και BRCA2 BRC4 repeat (ροζ) αναδεικνύοντας το ρόλο των RAD51 καταλοίπων Ser208, Ala209, Met210, Ala190 και Ala192 στη δέσμευση από τη BRCA2. Η Phe1524 της BRC επανάληψης εφαρμόζει σε μια υδρόφοβη κοιλότητα που σχηματίζεται, εν μέρει, από τα αα Met210, Ala190 και Ala192. D) Μια λεπτομέρεια της διασύνδεσης μεταξύ γειτονικών RAD51 υπομονάδων. Η Phe86 της μιας υπομονάδας RAD51 ταιριάζει σε μια υδρόφοβη κοιλότητα που σχηματίζεται, εν μέρει, από τα αα Met210, Ala190 και Ala192 της γειτονικής υπομονάδας. 88 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

89 Δ. Αναστολή λειτουργίας RAD51 από πεπτίδιο από BRC-μοτίβο της BRCA2 Όπως έχει αναφερθεί παραπάνω, η κρυσταλλική δομή του BRC4- RAD51 συμπλόκου (Pellegrini et al. 2002) δείχνει ότι τα κατάλοιπα από το 1521 μέχρι 1549 της BRCA2 που συμμετέχουν στην αλληλεπίδραση. Επισημαίνεται ότι από την RAD51 απουσιάζει τμήμα περίπου 100 αα από το Ν-τελικό της άκρο Σε μεταγενέστερη εργασία (Julian Nomme et al. 2008) επιβεβαιώθηκε η παρακάνω αλληλεπίδραση με συμμετοχή ολόκληρου του μορίου της RAD51. Έχει παρατηρηθεί in vitro, αναστολή του σχηματισμό του ινιδίου νουκλεοπρωτεΐνης (RAD51-DNA), χρησιμοποιώντας ένα πεπτίδιο περίπου 70 αμινοξέων (Davies et al. 2001) που προέρχεται από τα μοτίβα BRC. Ακόμη για την προετοιμασία αναστολέων της ανθρώπινης RAD51, εξετάστηκε η ανασταλτική επίδραση μικρών πεπτιδίων που προέρχονται από το BRCμοτίβο της BRCA2. Χρησιμοποιήθηκαν το πεπτίδιο: BRC4-28 από 28 αμινοξέα που εκτείνονται στα κατάλοιπα της BRCA2. Δεδομένου ότι το πεπτίδιο, δομικά, μπορεί να χωρίζεται σε δύο μέρη (β-φουρκέτα και α-έλικα) και κάθε τμήμα αλληλεπιδρά ξεχωριστά με τη RAD51, δημιουργήθηκαν τα πεπτίδια και BRC4-15 με τα αα και έγινε έλεγχος της ανασταλτικής επίδρασης του κάθε πεπτιδίου. Εικόνα 32. Διεπαφή μεταξύ της BRC4 και της RAD51. Η περιοχή αλληλεπίδρασης του πεπτιδίου της BRC4 επανάληψης (κορδέλα) / RAD51 (δίχτυ), είναι από τη δομή του συμπλόκου τους. Οι ζώνες ισχυρής επαφής σημειώνονται στις 3-D δομές και στην αμινοξική αλληλουχία των 28 αα. Η δευτεροταγής δομή του πεπτιδίου σημειώνεται παράλληλα με την ακολουθία. 89 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

90 Οι αλληλεπιδράσεις των πεπτιδίων με την RAD51 μελετήθηκαν με παρακολούθηση των μεταβολών στην ανισοτροπία φθορισμού φλουορεσκεΐνης που συνδέθηκε ομοιοπολικά με τα πεπτίδια. (Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τόσο με την παρουσία και την απουσία της ATP. ) Εντούτοις, αναφέρθηκε ότι ένα πεπτίδιο από 69 αμινοξέα που προέρχονται από το BRC3 μοτίβο συνδέεται κυρίως με το Α.Δ.Σ. του Ν-τελικού άκρου της RAD51 αντί της διεπαφής υπομονάδας-υπομονάδας (Galkin et al. 2005). Η αποσύνδεση του ινιδίου RAD51- DNA εμφανίστηκε μόνο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις του πεπτιδίου. Η διαφορά αυτή με την κρυσταλλογραφική ανάλυση θα μπορούσε να οφείλεται στην απουσία του Ν-τελικού Α.Δ.Σ. της RAD51 ή λόγω της χρήσης ενός μικρότερου πεπτιδίου (33 αντί των 69 αμινοξέων) στην κρυσταλλογραφική ανάλυση, ή την αδυναμία πρόσβασης της διεπαφής υπομονάδαυπομονάδα στο σύμπλοκο με το DNA. Διαπιστώθηκε ότι όταν χωρίζεται σε δύο τμήματα, το BRC4-28 πεπτίδιο δεν μπορούσε να αλληλεπιδράσει με RAD51. Έτσι, αμφότερα τα μέρη του BRC4-28 απαιτούνται για την αποτελεσματική αλληλεπίδραση, γεγονός που υποδηλώνει ότι τόσο το Ν-τελικό όσο και C- τελικό άκρο εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση αυτή, όπως επισήμανε η κρυσταλλογραφική ανάλυση του συμπλόκου RAD51-BRC4 (Pellegrini et al. 2002). Ακόμη μεγάλη συγκέντρωση του πεπτιδίου BRC4-28 αποδεικνύεται πειραματικά ότι αναστέλλει την αυτο-συγκρότηση της RAD51καθώς και την πρόσδεση στο DNA. Εικόνα 33. Η δομή του BRC4 μοτίβου και επιμέρους διεπαφές με την RAD51. Η αμινοξική ακολουθία του BRC4 μοτίβου σημειώνεται με τη δευτεροταγή δομή της στο σύμπλοκο με τη RAD51). Τα κατάλοιπα που βρίσκονται σε μεγαλύτερη επαφή με RAD51 σημειώνονται σε μια πιο έντονα σκούρο χρώμα. Παρουσιάζεται, επίσης, η 3D δομή του πεπτιδίου στο σύμπλοκο 90 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

91 ΠΙΝΑΚΑΣ 5. Αλληλεπίδραση BRC4 με περιοχές της RAD51 BRC4 * * * * K E P T L L G F H T A S G K K V K I A K E S L D K V K N L F D E K E Q Στροφή Τύπου Ι β-φουρκέτα Παράλληλη Ευθυγράμμιση με τον κλώνο συνδέτ ης Συστρο φή περί Αμφιπαθές α-ελικοειδές τμήμα Σπείρα με στοιχεία από 3 10 έλικα που συνδέει τις έλικες RAD51 Β3 Α4 Α4 & Α5 Η ακολουθία της BRC4 από τη Leu 1521 μέχρι το Γλουταμικό οξύ Glu 1548 εμφανίζεται οριζόντια στον πίνακα με κατάλοιπα ομαδοποιημένα με στοιχεία δευτεροταγούς δομής και αλληλεπίδρασης με περιοχές της RAD51 (στην τελευταία γραμμή του πίνακα). Στην πρώτη γραμμή του πίνακα οι αστερίσκοι αντιστοιχούν στα σπουδαιότερα κατάλοιπα για την αλληλεπίδραση. Για να επιβεβαιωθεί η ιδιαιτερότητα του πεπτιδίου για την αναστολή της RAD51, έγινε έλεγχος της ανασταλτικής δράσης του πεπτιδίου που η Θρεονίνη στη θέση 1526 είχε αντικατασταθεί με Αλανίνη (Thr 1526 Ala). Η Θρεονίνη συμβάλλει στην αλληλεπίδραση με RAD51 σύμφωνα με την κρυσταλλογραφική ανάλυση (Pellegrini et al. 2002). Επιπλέον, η αντίστοιχη αντικατάσταση στο πεπτίδιο του BRC3-μοτίβου αναφέρεται ότι καταργεί την ανασταλτική δράση (Davies et al. 2001). Η αντικατάσταση επηρέασε επίσης την ανασταλτική επίδραση του BRC4-28 πεπτιδίου: το τροποποιημένο πεπτίδιο δεν θα μπορούσε να αναστείλει το σχηματισμό ινιδίων νουκλεοπρωτεΐνης της RAD51 απουσία ή παρουσία ATP. 91 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

92 Εικόνα 34. Επίδραση της αντικατάστασης αμινοξέων στην διεπαφή με RAD51. Α) η αντικατάσταση της Ala1535 από Ser σερίνη δημιουργεί μια νέα σύνδεση υδρογόνου με Glu213 της RAD51. Β) η αντικατάσταση της Leu 1545 από φαινυλαλανίνη ενισχύει την αλληλεπίδραση με την υδρόφοβη τσέπη της RAD51 (γκρίζα επιφάνεια). 92 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

93 ΠΙΝΑΚΑΣ 6. Αλληλεπίδραση της RAD51 με περιοχές της BRC4 RAD51 Nature / Luca Pellegrini BRCA2 - BRC4 Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις Met 158 Ile 160 Ala 190 Ala 192 Leu 203 Ala 207 Met 210 Phe 166 Pro 168 Leu 171 Leu 186 Val 189 Phe 195 υδρόφοβη εσωτερική κοιλότητα μικρή τσέπη από Β2 κλώνος 157-KAMYID-161 Phe 1524 Β3 κλώνος 189-VAYAR-193 Α4 έλικα 197- TDHQLLYQASAMMVE-213 Α2 έλικα 168-PERLLAVAER-177 Α3 έλικα 182-GSDVLD-187 Β3 κλώνος 189-VAYAR-193 (μεταξύ Β3 κλώνου & Α4 έλικας) υδρόφοβη επαφή με (ή Phe 86 της RAD51 για σύνδεση γειτονικών υπομονάδων ) Ala 1527 Leu 1521 His 199 (από Α4 έλικα) υδρόφοβη επαφή με Leu 1522 Leu 204 Tyr 205 Ser 208 Met 251 Arg 254 Leu 255 Glu 258 Phe GFTTATE-91 Συνδέτης (linker) Phe 86 Ala 89 Από Α4 έλικα (από Thr 197 έως Glu 213) Α5 έλικα (από Leu 238 έως Phe 259) 238-LSARQMHLARFLRMLLRLADEF-259 Μοιάζει με το μοτίβο των BRC "GFXTASG" BRC4: 1523-GFHTASG-1529 Αντικαταστάθηκαν με γλουταμινικό οξύ F86E, A89E και ΔΕΝ σχηματίζει ολιγομερή, αλλά δεσμεύονται στη BRCA2 Leu 1545 Phe 1546 Ile 1534 (ή Met 210 της RAD51) 107-KELDKL-112 Υδρογονικοί δεσμοί με την α-έλικα του Ν- άκρου Ser 1538 Leu 1539 Val 1542 Ηλεκτροστατικές Αλληλεπιδράσεις (πολικοί, ιοντικοί, Van der Waals δεσμοί) 189-VAY-191 από Β3 κλώνο Asp 187 από Β3 κλώνο Val 212 από Α4 έλικα Glu 213 από Α4 έλικα Arg 250 από Α5 έλικα His 199 από Α4 έλικα τρεις συνεχείς, αντι-παράλληλοι δεσμοί υδρογόνου κύριας αλυσίδα με κύρια αλυσίδα 1525-HTA-1527 δέκτης δεσμού υδρογόνου από τη Ser 1528 δέκτης δεσμού υδρογόνου από τη Ser 1538 είναι συνδεδεμένη με δεσμό υδρογόνου με το άζωτο (Ν) της κύριας αλυσίδας της Ala 1535 ιοντικός δεσμός με Glu 1548 Δότης δεσμού- υδρογόνου στο καρβονύλιο της κύριας αλυσίδας της Leu Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

94 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Αλληλεπίδραση της RAD51 με την p53 Α. Γενικά Τα κατάλοιπα της RAD51 διαμεσολαβούν στην δέσμευση της στο κεντρικό Α.Δ.Σ. της p53 ( p53cd: κατάλοιπα και ). Η περιοχή p53cd συμπίπτει με συγκεκριμένη θέση δέσμευσης του DNA και είναι αρκετά ετερόκλητη, δεδομένου ότι δεσμεύει επίσης πεπτίδια που προέρχονται από διάφορες πρωτεΐνες όπως οι 53BP1, 53BP2, HIF-1alpha, και BCL-X (L) σε επικαλυπτόμενες περιοχές. Η δέσμευση διαμεσολαβείται κυρίως από μια ισχυρή, όχι ειδική, ηλεκτροστατική συνιστώσα και είναι καλά ορισμένη από συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις. Ο ανταγωνισμός διαφορετικών πρωτεϊνών μεταξύ τους και συγκεκριμένου DNA για μια θέση στην p53 θα μπορούσε να είναι ένας παράγοντας στη ρύθμιση της δραστηριότητας της. Οι θέσεις σύνδεσης μεταξύ RAD51 και p53cd είχαν αρχικά, χαρτογραφηθεί, με χρήση μεταλλάξεων διαγραφής της p53 και έδειξαν ότι τα αμινοξέα και στο p53cd Α.Δ.Σ. δεσμεύουν τα κατάλοιπα της RAD51. Η σύνδεση της p53 με τη RAD51 αναστέλλει τον ολιγομερισμό της RAD51 και, κατά συνέπεια, αναστέλλει τον ομόλογο ανασυνδυασμό (Buchhop S. et al. 1997) Χαρτογράφηση Πεπτιδίων Πρόσδεσης της RAD51: Το 2005 με σύνθεση σημασμένων πεπτιδίων με φλουορεσκεΐνη, με αλληλεπικαλυπτόμενες αλληλουχίες που αντιστοιχούν στην παραπάνω περιοχή πρόσδεσης της RAD51 ( ) με την p53 καθορίστηκε η περιοχή της αλληλεπίδρασης μεταξύ της p53 και RAD51και προέκυψε ότι τα κατάλοιπα της RAD51 δεσμεύονται στην p53 (Friedler et al. 2005). Το πεπτίδιο FL-CDB55 (RAD ) (ΠΙΝΑΚΑΣ 7) δεσμεύεται στο κεντρικό Α.Δ.Σ. της p53. ΠΙΝΑΚΑΣ 7. Χαρτογράφηση των Πεπτιδίων της RAD51 στη διεπαφή της με την p53. Σειρά αλληλεπικαλυπτόμενων πεπτιδίων της RAD51. Η δεσμευτική ικανότητα των πεπτιδίων της RAD51 στο κεντρικό Α.Δ.Σ. της p53, δοκιμάστηκε με χρήση NMR, ανισοτροπία φθορισμού, και αναλυτική υψηλής ταχύτητας φυγοκέντρηση. (από Friedler et al. 2005). RAD51 Πεπτίδια Ακολουθία Κατάλοιπα FL-CDB50 FL-MFGEFRTGKTQICHTL FL-CDB51 FL-QICHTLAVTCQLPIDR FL-CDB52 FL-QLPIDRGGGEGKAMYI FL-CDB53 FL-GKAMYIDTEGTFRPER FL-CDB54 FL-TFRPERLLAVAERYGL FL-CDB55 FL-AERYGLSGSDVLDNVA FL-CDB56 FL-VLDNVAYARAFNTDHQ FL-CDB57 FL-FNTDHQTQLLYQASAM FL-CDB58 FL-YQASAMMVESRYALLI FL-CDB80 FL-AERYGLSGS FL-CDB81 FL-GLSGSDVLD FL-CDB82 FL-GSDVLDNVA Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

95 Β. Η διεπαφή πρόσδεσης DNA του p53cd Α.Δ.Σ. δεσμεύει τα RAD51 Πεπτίδια ΠΙΝΑΚΑΣ 8. Τα κατάλοιπα του Α.Δ.Σ. p53cd ( & ), τα σημαντικά για τη δέσμευση της RAD51. Στοιχείο Δευτευτοταγούς Δομής Κατάλοιπα από το N άκρο: Thr102, Tyr103, Gly105 από την L1 στροφή: Leu114, His115, Ser 116, Lys 120, Val122 από τον S2 κλώνο: Tyr126 από τον S3 κλώνο: Thr140, Val143, Gln 144 από την H1έλικα: His179 από τον S5 κλώνο: Glu198, Gly199 από τον S6 κλώνο: Leu206, Asp207 από τον S7 κλώνο: Ser215 από την L3 στροφή: Asn239, Met243, Gly244 από τον S9 κλώνο: Ile254 από τον S10 κλώνο: Leu265, Arg267, Val272 από την Η2 έλικα: Cys277, Gly279, Arg280, Arg282, Arg283, Glu286 Σύνθεση από Friedler et al και τα αποτελέσματα Docking, με χρήση του web server WHATIF και της υπηρεσίας αυτού "Interatomic contacts ". Τα κατάλοιπα Leu114, Val122 και Thr140 είναι τα κοινά κατάλοιπα και των δύο μεθόδων. Τα κατάλοιπα Ser 116, Lys 120 και Gln 144 προέρχονται από το Docking. Αυτά τα κατάλοιπα μπορούν να ταξινομηθούν σε κατάλοιπα εκτεθειμένα στην επιφάνεια και κατάλοιπα που θάβονται. Τα κατάλοιπα τα εκτεθειμένα στην επιφάνειαδημιουργούν ένα σαφώς καθορισμένο σημείο δέσμευσης για τη RAD51 στην επιφάνεια της p53 (Εικόνα 36). Αυτή η περιοχή επικαλύπτει εν μέρει τις θέσεις δέσμευσης για το DNA και για τις πρωτεΐνες, όπως η 53BP2, HIF-1α, και BCL-X L, αλλά εκτείνεται προς την πλευρά της L1 στροφής στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. 95 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

96 Εικόνα 35. Η περιοχή σύνδεσης του Α.Δ.Σ. p53cd της RAD51. Η p53-δεσμευτική περιοχή της RAD51 τονισμένη σχετικά με τη δομή της ανθρώπινης RAD51. Τα p53-δεσμευτικά κατάλοιπα (αα ) της ανθρώπινης RAD51, από την Α3 έλικα (κατάλοιπα 181 έως 188) και ένα μέρος του Β3 κλώνου (κατάλοιπα ), επισημαίνονται με μπλε χρώμα. Εικόνα 36. Η γενική θέση δέσμευσης πρωτεΐνης στο κεντρικό Α.Δ.Σ. της p53. Αριστερά το σημείο σύνδεσης του πεπτιδίου FL-CDB81 στο κεντρικό Α.Δ.Σ. της p53. Τα σημαντικά κατάλοιπα με κόκκινο χρώμα. Δεξιά το χωροπληρωτικό μοντέλο της FL-CDB81 θέσης δέσμευσης στον πυρηνικό Α.Δ.Σ. p53. Τα ηλεκτροστατικά συστατικά της πρόσδεσης Η DNA-δεσμευτική διασύνδεση του Α.Δ.Σ. p53cd χρησιμεύει ως μια γενική περιοχή δέσμευσης πρωτεϊνών. Αυτή η περιοχή περιέχει πολλά κατάλοιπα Αργινίνης (Arg R) που συμμετέχουν επίσης στην δέσμευση DNA. Η περιοχή πρόσδεσης DNA είναι θετικά φορτισμένη. Αυτό οδηγεί στο ερώτημα κατά πόσον η διασύνδεση δέσμευσης DNA του 96 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

97 κεντρικού Α.Δ.Σ. p53cd λειτουργεί με μια γενική ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση ή με ειδική σύνδεση με κάθε πρωτεΐνη-στόχο. Τα πεπτίδια που περιέχουν Asp184 και Asp187 δεσμεύονται στο Α.Δ.Σ. p53cd πολύ πιο σφιχτά από ότι τα άλλα πεπτίδια. Αυτό δείχνει ότι η RAD51-p53CD αλληλεπίδραση επίσης διαμεσολαβείται από μεγάλες ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, με τα αρνητικά φορτισμένα κατάλοιπα να συμβάλουν στη σύνδεση της RAD51 με το Α.Δ.Σ. p53cd. Εικόνα 37. Μοντέλο Αλληλεπίδρασης p53(96-279) - RAD51( ). Πίνακας 9. Κατάλοιπα που αλληλεπίδρούν στο Μοντέλο Αλληλεπίδρασης RAD51-p53 p53 Leu 114 Phe 166 Pro 168 His 115 Leu 186 Ser 116 Asp 187 Lys 120 Val 189 Val 122 Ala 190 RAD51 Thr 140 Tyr 191, Arg 193 Gln 144 Glu Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

98 Γ. Μια πολλαπλού σκοπού, ετερόκλητη θέση δέσμευσης Πολλές περιοχές διασύνδεσης πρωτεΐνης με πρωτεΐνη περιέχουν κατάλοιπα που είναι ζωτικής σημασίας για την συγγένεια με άλλες πρωτεΐνες και είναι ετερόκλητες. Οι περιοχές αυτές είναι ιδιαίτερα προσαρμόσιμες, και πολλές πρωτεΐνες τις χρησιμοποιούν για να δεσμεύσουν πολυάριθμους εταίρους. Αυτή η προσαρμοστικότητα μπορεί να επιτευχθεί με δομικές αλλαγές στις ετερόκλητες περιοχές που προκαλούνται από την δέσμευση και είναι διαφορετικές για κάθε δεσμευτική εταίρο. Η DNA-δεσμευτική διασύνδεση του Α.Δ.Σ. p53cd χρησιμεύει ως μια τέτοια ετερόκλητη πολλαπλού σκοπού περιοχή δέσμευσης πρωτεϊνών. Αυτή η περιοχή μεσολαβεί για τη δέσμευση της πλειονότητας των p53cd-δεσμευτικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων των RAD51, HIF-1α, Bcl-XL, CTF2, 53BP1, και 53BP2. Η DNA-δεσμευτική διασύνδεση του Α.Δ.Σ. p53cd έχει πολλά χαρακτηριστικά μιας ετερόκλητης δεσμευτικής περιοχής για αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Περιέχει αρκετές περιοχές στροφών, οι οποίες μπορούν να προσαρμοστούν σε διαφορετικές πρωτεΐνες εταίρους, και περιέχει πολλά κατάλοιπα αργινίνης, που ως γνωστό είναι συχνή η εμφάνισή τους σε αυτές τις ετερόκλητες δεσμευτικές περιοχές. Έχει ήδη δηχθεί τη χρήση NMR ότι η DNA-δεσμευτική διασύνδεση του Α.Δ.Σ. p53cd είναι ευέλικτη, και την κάνει γενικά πιο κατάλληλη για σύνδεση με τις πρωτεΐνες. Η ετερόκλητη περιοχή σύνδεσης στο Α.Δ.Σ. p53cd περιέχει δύο υποπεριοχές: 1) Οι L1 στροφή και Η2 έλικα, από τη μία άκρη της DNA-δεσμευτικής διεπαφής, αποτελούν μια καλά καθορισμένη περιοχή που βρέθηκε με μελέτες NMR ότι δεσμεύει τις πρωτεΐνες RAD51, HIF-1α και 53BP2. Αυτή η δευτερεύουσα τοποθεσία φαίνεται στην Εικόνα 25 και Εικόνα 36. 2) Οι L2 και L3 στροφές, που βρίσκεται στην άλλη άκρη της DNA-δεσμευτικής διεπαφής, βρέθηκε από την κρυσταλλογραφία να συμμετέχουν σε δέσμευση των 53BP1 και 53BP2, με χρήση NMR να συμμετέχουν σε δέσμευση της Bcl-XL και με μεθόδους κυτταρικής βιολογίας ότι συμμετέχουν σε δέσμευση CTF2. Είναι ενδιαφέρον, αν και κάθε μία από αυτές τις δευτερεύουσες τοποθεσίες αρκεί για να δεσμεύσει πρωτεΐνη, η πλήρης DNA-δεσμευτική διεπαφή (που περιέχει και τις δύο δευτερεύουσες τοποθεσίες) είναι απαραίτητη για δέσμευση του DNA. Μάλιστα, μεταλλάξεις καταλοίπων σε μια από αυτές τις δευτερεύουσες τοποθεσίες είναι αρκετές για να καταστείλουν τη δέσμευση του DNA. Η ετερόκλητη περιοχή σύνδεσης του p53cd μεσολαβεί στη δέσμευση των πρωτεϊνών με μια ισχυρή ηλεκτροστατική συνιστώσα εξαρτώμενη από την ιοντική ισχύ. Ανάλυση αυτής αποδεικνύει ότι τα ηλεκτροστατικά αποτελέσματα είναι λειτουργικά και κυρίαρχα. Υπάρχουν συγκεκριμένες δεσμευτικές αλληλεπιδράσεις υπερτερώντας της γενικής ηλεκτροστατικής συνιστώσας. Για πολλές αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών - πρωτεϊνών, υπάρχει ένας αρχικός (πρώιμος) σχηματισμός ενός συγκεκριμένου, ασθενούς, συμπλόκου, μέσω 98 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

99 ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, που ακολουθείται από μια ακριβή "λεπτή ρύθμιση" για να σχηματίσουν σύμπλοκο υψηλής συγγένειας. Γενικά, οι πρωτεΐνες που συνδέονται στην περιοχή αυτή, έχουν σωστή αναλογία μεταξύ των καταλοίπων τους ώστε μέρος των καταλοίπων να συμβάλλουν στην ηλεκτροστατική ένωση και τα υπόλοιπα κατάλοιπα να συμβάλλουν στην ακριβή σύνδεσης. Η δέσμευση DNA της ετερόκλητη περιοχής σύνδεσης στον p53cd έχει παρόμοια χαρακτηριστικά με την πρωτεϊνική σύνδεση και επίσης γίνεται με τη μεσολάβηση ενός συνδυασμού των ηλεκτροστατικών και συγκεκριμένων αλληλεπιδράσεων. Γ.1 Θέσεις δέσμευσης p53 και RAD51. Τα κατάλοιπα δέσμευσης της RAD51 στη p53 αντιστοιχούν με τη DNA-δεσμευτική διεπαφή της, κυρίως μεταξύ των καταλοίπων από την L1στροφή και την Η2 έλικα. Αυτή η θέση δέσμευσης συμφωνεί και με παλαιότερη μελέτη που προσδιόρισε την κατανομή των δεσμευτικών καταλοίπων να είναι μεταξύ 94 και 160 (τα οποία περιλαμβάνουν την L1 στροφή) και (τα οποία περιλαμβάνουν την H2 έλικα). Αρχικά οι δυο αυτές περιοχές περιγράφονταν ως δύο χωριστές θέσεις δέσμευσης, αλλά μελέτες με NMR αποκάλυψαν ότι οι περιοχές αυτές είναι συνεχόμενες, αποτελούν ένα σημείο πρόσδεσης. Στις μελέτες με NMR τα κατάλοιπα έξω από την περιοχή αυτή, όπως στην στροφή L3 Asn239, Met243, και Gly244 παρατηρήθηκε ότι αποτελούν μέρος μιας εκτεταμένης δέσμευσης, η οποία δεν ήταν εμφανής και στις προηγούμενες μελέτες, οι οποίες χρησιμοποιούνται για τις διαφορετικές δομές της p53. Στη RAD51, διαπιστώθηκε ότι η p53-δεσμευτική διεπαφή αποτελείται από τα κατάλοιπα Αυτά τα κατάλοιπα μορφοποιούν την έλικας που αποτελείται από τα κατάλοιπα 181 έως 188 (Α10 κατά τον Friedler / Α3 κατά τον Pellegrini) και το Ν-τελικό μισό του κλώνου Β3 (κατάλοιπα ). Τα κατάλοιπα που αποτελούν την p53- δεσμευτική διεπαφή μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες. Το Ν-τελικό άκρο της δέσμευσης, το οποίο είναι κυρίως ελικοειδές, είναι εκτεθειμένο στο διαλύτη και δεν φαίνεται να συμμετέχει σε δέσμευση άλλων πρωτεϊνών. Ωστόσο, το C-τελικό τμήμα της p53- δεσμευτικής διεπαφής επικαλύπτει τη θέση ολιγομερισμού της RAD51 (Εικόνα 37. Β) καθώς και το σημείο δέσμευσής της με τη BRCA2 (Εικόνα 37. C), καθιστώντας το μια ετερόκλητη περιοχή δέσμευσης πρωτεϊνών. Ο κλώνος Β3 είναι ένα μέρος της διεπαφής ολιγομερισμό μεταξύ RAD51 μονομερή και βρέθηκε να είναι θαμμένος στη δομή του RAD51 ολιγομερούς. Η Α3 έλικα, η μεγάλη p53-δεσμευτική περιοχή, είναι εκτεθειμένη στο διαλύτη ακόμα και στα RAD51 ολιγομερή. Ακόμη, τα κατάλοιπα Leu186, Val189, και Ala190 συμμετέχουν στο σχηματισμό υδρόφοβης τσέπης που δεσμεύει BRCA2, ενώ Asp187, Val189, Ala190, και Tyr191 σχηματίζουν μια σειρά από δεσμούς υδρογόνου με τα κατάλοιπα της BRCA2 όπως θα δούμε και παρακάτω. Εν ολίγοις, η p53-rad51 αλληλεπίδραση γίνεται με τη μεσολάβηση ετερόκλητων περιοχών και στις δύο πρωτεΐνες. Επομένως η p53 αναστέλλει τον ολιγομερισμό της RAD51 δεσμευόμενη στην άκρη της περιοχής ολιγομερισμό της RAD51, στον Β3 κλώνο. Έτσι μπορεί να εξηγηθεί γιατί 99 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

100 μεταλλάξεις στον πυρηνικό Α.Δ.Σ. της p53, στα κατάλοιπα 175, 248, και 273 έχουν δείξει να τονώνουν, αντί να αναστέλλουν, την λειτουργία της RAD51 στον ομόλογο ανασυνδυασμό. Αυτές οι μεταλλάξεις είναι κοντά στη RAD51 δεσμευτική διεπαφή και επομένως αναστέλλουν την αλληλεπίδραση με τη RAD51. Ομοίως, η RAD51 μετάλλαξη L186P παρουσιάζει μειωμένη δέσμευση από την p53, και οι p53 μεταλλάξεις R273H και R249S εμφανίζουν μειωμένη δέσμευση από την RAD51, επειδή οι μεταλλάξεις είναι στη δεσμευτική διεπαφή. Γ.2 Σύνοψη Θέσεων δέσμευσης p53 και RAD51 Στην p53 L1 στροφή 114-LHSGTAKSVT-123 με σημαντικότερα : Leu114, His115, και Val122, Η2 έλικα 277-CPGRDRRTEEEN-288 με σημαντικότερα: Cys277, Gly279, Arg280, Arg282, Arg283, και Glu286. Σημαντικά κατάλοιπα που ενισχύουν τη δέσμευση είναι ακόμη τα: o Tyr126 από τον S2 κλώνο o Thr140 και Val143 από τον S3 κλώνο o His179 από την H1έλικα o Glu198 από τον S5 κλώνο o Gly244 από την L3 στροφή και o Val272 από τον S10 κλώνο Στην RAD51 Α3 έλικα 182-GSDVLD-187 με σημαντικότερα : Asp 184, Leu 186, Asp 187 Β3 κλώνος (μέρος) 189-VA-190. Δ. Συμπεράσματα για την ετερόκλητη θέση δέσμευσης στην p53. Δεν είναι μόνο ότι το Α.Δ.Σ. p53cd δεσμεύει τις πρωτεΐνες εταίρους της p53 μέσω μιας γενικού σκοπού ετερόκλητης θέσης δέσμευσης, αλλά φαίνεται επίσης ότι ορισμένες από τις πρωτεΐνες εταίρους της, χρησιμοποιούν την ίδια στρατηγική. Έτσι λοιπόν, η RAD51 χρησιμοποιεί μια γενική πρωτεϊνική διασύνδεση, κοντά στην διεπαφή ολιγομερισμό της, για να δεσμευτεί στο Α.Δ.Σ. p53cd. Η χρήση αυτών των γενικών δεσμευτικών περιοχών στο μονοπάτι της p53 σημαίνει ότι οι αλληλεπιδράσεις στο μονοπάτι της p53 δεν θα πρέπει να μελετηθούν μεμονωμένα, αλλά ως ανταγωνιστικές διαδικασίες για τις ίδιες θέσεις δέσμευσης. Η παρουσία της ετερόκλητης περιοχής δέσμευσης πρωτεϊνών στο μονοπάτι της p53 μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για την ρύθμιση της. Η p53 μπορεί να ρυθμιστεί σε δύο 100 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

101 επίπεδα: την άμεση, με τη δέσμευση των πρωτεϊνών με το πυρηνικό Α.Δ.Σ., την έμμεση, με τη δέσμευση των πρωτεϊνών σε ρυθμιστικούς τομείς, όπως στο Α.Δ.Σ. του C-τελικού άκρου και με μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των εν λόγω Α.Δ.Σ.. Οι περισσότερες p53-δεσμευτικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με αυτήν, εκτός του πυρηνικού Α.Δ.Σ. και έμμεσα, ρυθμίζεται η δέσμευση του p53cd στο DNA, με μετα-μεταγραφική τροποποίηση που είναι ένας βασικός παράγοντας για αυτή την έμμεση ρύθμιση. Άμεση ρύθμιση με τη δέσμευση στο πυρηνικό Α.Δ.Σ. είναι τόσο αποτελεσματική διότι, μια πρωτεΐνη που συνδέεται με το πυρηνικό Α.Δ.Σ. θα αναστείλει τη δέσμευση DNA και ως εκ τούτου τη μεταγραφική δραστηριότητα της. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί μόνο μερικές πρωτεΐνες δεσμεύουν το πυρηνικό Α.Δ.Σ. και γιατί σε αυτές τις πρωτεΐνες είναι τόσο διαφορετικά μεταξύ τους τα εμπλεκόμενα διάφορα μονοπάτια. Για παράδειγμα, η σύνδεση της 53BP2/ASPP θα ενεργοποιήσει την απόπτωση, ενώ η σύνδεση της RAD51 θα αναστείλει τον ομόλογο ανασυνδυασμό και να ενεργοποιήσετε τη μη-μεταγραφική απάντηση της p53. Η σχετική συγγένεια των δεσμευτικών πρωτεϊνών προς τον p53cd Α.Δ.Σ. θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην επιλογή για την ανταπόκριση της p53. Για παράδειγμα, η διαφορετική συγγένεια των p53cd και RAD51 σε σχέση με άλλες δεσμευτικές πρωτεΐνες θα μπορούσε να καθορίσει αν η απάντηση p53 θα προχωρήσει μέσω του μεταγραφικού ή μη-μεταγραφικού μονοπατιού. Ένα τέτοιο μοντέλο εξηγεί και την έλλειψη των μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων στο χώρο του πυρήνα αφού άμεσα ρυθμίζονται από τη δέσμευση πρωτεϊνών που αναστέλλουν τη σύνδεση του DNA. Δ.1 Αποφυγή μεταλλάξεων της p53 και σχεδιασμός φαρμάκων. Η ετερόκλητη περιοχή πρόσδεσης πρωτεϊνών στο Α.Δ.Σ. p53cd συχνά μεταλλάσσεται σε καρκίνο, και οι έξι πιο συχνά σχετιζόμενες με καρκίνο μεταλλάξεις στο p53 ("hot-spot μεταλλάξεις") χαρτογραφούνται σε αυτή την περιοχή. Τα συχνά μεταλλαγμένα κατάλοιπα (Gly245, Arg248, και Arg249 στη L3 στροφή, Arg282 στη Η2 έλικα, Arg175 και Arg273) είναι σημαντικά όχι μόνο για τη σύνδεση του DNA και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης, αλλά συμμετέχουν επίσης στην πρωτεϊνική σύνδεση. Η αδρανοποίηση της p53 οφείλεται σε μεταλλάξεις όχι μόνο λόγω της απώλειας της δυνατότητας δέσμευσης DNA, αλλά επίσης λόγω της απώλειας της δυνατότητας να δεσμεύουν τις πρωτεΐνες εταίρους. Πράγματι, είχε διαπιστωθεί ότι οι hot-spot μεταλλάξεις της p53 δείχνουν μειωμένη δυνατότητα δέσμευσης της RAD51 και ενθαρρύνουν αντί να αναστέλλουν τον ομόλογο ανασυνδυασμό. Ακόμη, οι μεταλλαγμένες p53 δεν είναι σε θέση να δεσμεύουν 53BP2. Επομένως, μεταλλαγμένη p53 στερείται της ικανότητάς της να επιλέγει την απάντησή της σε βλάβη του DNA και δεν είναι σε θέση να προχωρήσει και στις δύο μεταγραφικές και μη-μεταγραφικές της δραστηριότητές. Αφού το Α.Δ.Σ. p53cd είναι μεταλλαγμένο σε ποσοστό άνω του 50% στους καρκίνους του ανθρώπου, η σωτηρία από μεταλλάξεις της p53 είναι ένας σημαντικός στόχος στη θεραπεία του καρκίνου. Πολλές από τις ογκογενετικές μεταλλάξεις της p53 προκαλούν αναδιάταξη του πυρηνικού Α.Δ.Σ. σε θερμοκρασία σώματος. 101 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

102 Δ.2 Ποια περιοχή στο p53cd θα μπορούσε να είναι στόχος για χημική ακόλουθο; Το Α.Δ.Σ. p53cd δεν περιέχει προφανείς τσέπες δέσμευσης για μικρά μόρια, και οι αλληλεπιδράσεις του με πρωτεΐνες και το DNA διαμεσολαβείται από μια μεγάλη διεπαφή. Οι δύο πιθανές περιοχές στόχοι για χημικές ακολούθους είναι η ετερόκλητη διεπαφή δέσμευσης πρωτεϊνών ή το σχετικά αδρανές β-σάντουιτς. Η χημική ακόλουθος όπως η FL-CDB3 (FL- REDEDEIEW), που δεσμεύεται στη γενική περιοχή σύνδεσης πρωτεϊνών p53cd, πρέπει να ενώνεται αρκετά ισχυρά ώστε να μπορεί να σταθεροποιεί την p53, αλλά αρκετά ασθενώς έτσι ώστε να μην εμποδίζουν τη σύνδεση με DNA ή πρωτεΐνες. Θα ήταν ωφέλιμο να έχουμε μια υποθετική χημική ακόλουθο που δεσμεύεται έξω από την ετερόκλητη περιοχή δέσμευσης ώστε να μπορεί να δεσμεύσει ταυτόχρονα την πρωτεΐνη εταίρο ή το DNA. Ωστόσο, φαίνεται ότι η DNA-δεσμευτική διασύνδεση στον p53cd είναι η κύρια επιφάνεια για τη δέσμευση συνδέτη (ligand), και μεσολαβεί στη σύνδεση των συνδετών όλων των τύπων: πρωτεΐνες, DNA, και πεπτίδια. Δεδομένου ότι είναι η μόνη περιοχή στην p53 που φαίνεται να περιέχουν τις θερμές περιοχές για την πρόσδεση, αυτή η περιοχή θα πρέπει να χρησιμεύσει ως στόχος για φάρμακα για την σταθεροποίηση της p53 αλλά όχι την παρεμπόδιση. 102 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

103 Εικόνα 38. Οι Συνέπειες της ετερόκλητης περιοχής δέσμευσης πρωτεϊνών. Α) Η γενική θέση δέσμευσης πρωτεΐνης στον πυρηνικό Α.Δ.Σ. της p53. Τα κατάλοιπα που δημιουργούν το σημείο πρόσδεσης είναι με κόκκινο χρώμα. Αυτά αποτελούνται από Leu114, His115, Gly117, Thr118, Val122, και Thr123 στη στροφή 1, Arg280, Arg282, Arg283, Thr284, και Glu286 στην έλικα 2, και Tyr126, Thr140, και Glu198 από το υπόλοιπο της πρωτεΐνης. Τα κατάλοιπα Val143, His179, Asn239, Gly244, Val272, Cys277, και Gly279 είναι επίσης στο σημείο πρόσδεσης, αλλά είναι κρυμμένα στην εικόνα. Β) Τα p53-δεσμευτικά κατάλοιπα στο περιβάλλον του ολιγομερούς της RAD51. Φαίνεται το ολιγομερές της ομολόγου RAD51 από Pyrococcus furiosus. Τα p53-δεσμευτικά κατάλοιπα επισημαίνονται με μπλε χρώμα. Η έλικα Α3 είναι εκτεθειμένα, ενώ ο Β3 κλώνος είναι θαμμένος στις διασυνδέσεις ολιγομερισμού μεταξύ των μονομερών (τα διάφορα RAD51 μονομερή είναι με διαφορετικά χρώματα). C) Τα p53-δεσμευτικά κατάλοιπα της RAD51 συμμετέχουν επίσης στη δέσμευση BRCA2. Η δομή της ανθρώπινης RAD51 (σε κόκκινο) με την p53-δεσμευτική περιοχή σε μπλε χρώμα, σε σύμπλοκο με το BRC4 πεπτίδιο της BRCA2 (σε πράσινο). D) Ένα γενικό μοντέλο για τη ρύθμιση της απόκρισης της p53 με τη γενική θέση δέσμευσης. Ο πυρηνικός Α.Δ.Σ. p53 (κίτρινο) αλληλεπιδρά με το γενικό σημείο σύνδεσης (κόκκινο χρώμα) με p53-δεσμευτικές πρωτεΐνες, όπως η 53BP1 (πράσινο, p53-δεσμευτικά κατάλοιπα σε κόκκινο χρώμα), 53BP2 (μπλε, p53-δεσμευτικά κατάλοιπα σε κόκκινο χρώμα), και RAD51 (κόκκινο, p53- δεσμευτικά κατάλοιπα σε μπλε), το DNA που ανταγωνίζεται για την ίδια περιοχή καθώς και μικρό μόριο φάρμακου για p53-σταθεροποίηση που θα πρέπει να στοχεύει, επίσης, στην ίδια περιοχή. 103 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

104 ΠΡΑΚΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 104 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

105 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ Α. Γενικά Στην παρούσα εργασία εξετάστηκαν οι "Μοριακές Αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης RAD51 με τη πρωτεΐνη BRCA2 και τη πρωτεΐνη p53" μέσα από τα διάφορα πειραματικά δεδομένα που υπάρχουν. Στόχος στο πρακτικό μέρος είναι η οπτικοποίηση των δομών και των αλληλεπιδράσεων ώστε να συμπληρωθεί η υπάρχουσα πληροφορία για τις δομές και τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Εξ' αιτίας της εξελικτικής σύγκλισης της λειτουργίας των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA με ομόλογο ανσυνδυασμό, ειδικός στόχος είναι η εύρεση και σημείωση των υψηλά συντηρημένων αα, των καθοριστικών για την αλληλεπίδραση. Τα προγράμματα που χρησιμοποιήθηκαν αναλύονται παρακάτω. Οι δομές δύο Α.Δ.Σ. της ανθρώπινης RAD51 (HsRAD51) είναι διαθέσιμες στην PDB: Η κρυσταλλική δομή του κεντρικού Α.Δ.Σ. της RAD51 του ομολόγου της RecA, ως μια συμπλόκου με την BRC 4 επανάληψη της BRCΑ2 (Pellegrini L. et al. 2002) και Η NMR δομή του Α.Δ.Σ. του N-τερματικού άκρου (Aihara H. et al. 1999). Όμως μέχρι σήμερα δεν υπάρχει η ολοκληρωμένη τρισδιάστατη δομή της ανθρώπινης RAD51. Ακόμη σχετικά με την αλληλεπίδραση της RAD51 με την p53 δεν έχει μοντελοποιηθεί η μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Τι υπάρχει στην PDB: Α. 1 Δευτεροταγής δομή της RAD51 (αα ) PDB: 1N0W 32% helical (8 helices; 78 residues) 23% beta sheet (13 strands; 58 residues) 105 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

106 Α.2 Δευτεροταγής δομή του N-Terminal Domain της RAD51 (αα 1-114) - PDB: 1B22 29% helical (5 helices; 34 residues), 1% beta sheet (2 strands; 2 residues) Α.3 Δευτεροταγής δομή της BRCA2 BRC4 repeat (αα )- PDB: 1N0W-b 25% helical (2 helices; 9 residues), 8% beta sheet (2 strands; 3 residues) Α.4 Δευτεροταγής δομή της p53 (αα )- PDB: 2OCJ 8% helical (3 helices; 18 residues), 29% beta sheet (12 strands; 65 residues) 106 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

107 Β. Χρήση Jpred3 για ενδεικτική πρόβλεψη δευτεροταγούς δομής Χρησιμοποιήθηκε το Jpred3 για ενδεικτική πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής της RAD51 και της p53: Β.1 RAD MAMQMQLEANADTSVEEESFGPQPISRLEQCGINANDVKKLEEAGFHTVEAVAYAPKKELINIKGISEAKADKILAEAAK HHHHHHHHH----HHHHHH----HHHHHHH----HHHHHHHHHHHH LVPMGFTTATEFHQRRSEIIQITTGSKELDKLLQGGIETGSITEMFGEFRTGKTQICHTLAVTCQLPIDRGGGEGKAMYI HHHHHHH HHHHHHH EEEEEE-----HHHHHHHHHHHHHHHHHH------EEEEE DTEGTFRPERLLAVAERYGLSGSDVLDNVAYARAFNTDHQTQLLYQASAMMVESRYALLIVDSATALYRTDYSGRGELSA 240 EE-----HHHHHHHHHH------H-----EEEE----HHHHHHHHHHHHHHH-----EEEEE HH RQMHLARFLRMLLRLADEFGVAVVITNQVVAQVDGAAMFAADPKKPIGGNIIAHASTTRLYLRKGRGETRICKIYDSPCL 320 HHHHHHHHHHHHHHHHHH---EEEEEEEEE HHHHHH-EEEEEEE----EEEEEEEE---- PEAEAMFAINADGVGDAKD EEEEEEE---EE---- Β.2 p MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAP HHHHHHHHH EE APAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMT EEEEE EEE-----EEEE-----EEEEEEEE EEEEEEEE EVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTII -HHHH EEEEE-----EEEEE-----EEEEEE EEEEEEEEEEE EEEEEEE TLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEM EEE-----EEEEEEEEEEEEE-----HHHHHHHH EEEEEEE--HHHHH FRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD HHHHHHHHHHHHH HHHHHHH HHHHHEE Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

108 Γ. Χρήση του ClustalW για στοίχιση της RAD51 Χρησιμοποιήθηκε το ClustalW2 για στοίχιση των αμινοξικών ακολουθιών της RAD51 με εννέα (9) πρωτεΐνες που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των RecA-like ρεκομπινασών. Το CLUSTALW είναι το πιο διαδεδομένο πρόγραμμα πολλαπλής στοίχισης βιολογικών ακολουθιών. Το πρόγραμμα χρησιμοποιεί έναν ιδιαίτερα πολύπλοκο αλγόριθμο προοδευτικής στοίχισης (progressive alignment) για να κάνει σταδιακή στοίχιση πολλαπλών πρωτεϊνικών ή νουκλεοτιδικών (DNA) ακολουθιών. Όλες οι ακολουθίες πρέπει να είναι ένα αρχείο, η μία μετά την άλλη. Το πρόγραμμα CLUSTALW βρίσκεται στο EBI (European Bioinformatics Institute) Τα αποτελέσματα παρατίθενται από κάτω: CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment sp Q06609 RAD51_HUMAN MAMQMQLEAN sp P36601 RAD51_SCHPO MADTEVEMQVSAADTNNN sp Q99133 RAD51_USTMA MSQNAQDP sp P25454 RAD51_YEAST MSQVQEQHISESQLQYGNGSLMSTVPADLSQSVVDGNGNGSSEDIEATNG 50 sp Q40134 RAD51_SOLLC MEQQHRNQKSMQDQ sp Q27297 RAD51_DROME MEKLTNVQAQ sp P50265 DLH1_CANAL MSVED sp P25453 DMC1_YEAST MSVTGT sp O42634 DMC1_SCHPO MEEFAE sp Q14565 DMC1_HUMAN MKEDQVVAEEP L I D sp Q06609 RAD51_HUMAN ADTSVEEESFG--PQPISRLEQCGINANDVKKLE 42 sp P36601 RAD51_SCHPO --ENGQAQSNYEYDVNVQDEEDEAAAG--PMPLQMLEGNGITASDIKKIH 64 sp Q99133 RAD51_USTMA AQIGEDDMGEAFG--PLPVSKLEEFGISSSDCKKLA 42 sp P25454 RAD51_YEAST SGDGGGLQEQAEAQGEMEDEAYDEAALGSFVPIEKLQVNGITMADVKKLR 100 sp Q40134 RAD51_SOLLC NDEIEDVQHG--PFPVEQLQASGIAALDVKKLK 45 sp Q27297 RAD51_DROME QEEEEEEG--PLSVTKLIGGSITAKDIKLLQ 39 sp P50265 DLH1_CANAL SIISIDSLQDQGINAGDINKLK 27 sp P25453 DMC1_YEAST EIDSDTAKNILSVDELQNYGINASDLQKLK 36 sp O42634 DMC1_SCHPO GND-DEQMIFSDIEDLTAHGIGMTDIIKLK 35 sp Q14565 DMC1_HUMAN GFQDEEESLFQDIDLLQKHGINVADIKKLK 41 : *.* * : L G K A F A sp Q06609 RAD51_HUMAN EAGFHTVEAVAYAPKKELINIKGISEAKADKILAEAAKLVPMGFTTATEF 92 sp P36601 RAD51_SCHPO EAGYYTVESIAYTPKRQLLLIKGISEAKADKLLGEASKLVPMGFTTATEY 114 sp Q99133 RAD51_USTMA ESGYNTVESIAFTPKKQLLLVKGVSEAKADKILAEAARLVPMGFTTATEF 92 sp P25454 RAD51_YEAST ESGLHTAEAVAYAPRKDLLEIKGISEAKADKLLNEAARLVPMGFVTAADF 150 sp Q40134 RAD51_SOLLC DAGLCTVESVVYAPRKELLQIKGISEAKVDKIIEAASKLVPLGFTSASQL Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

109 sp Q27297 RAD51_DROME QASLHTVESVANATKKQLMAIPGLGGGKVEQIITEANKLVPLGFLSARTF 89 sp P50265 DLH1_CANAL SAGICSITSVLSTTRRNLTKIKGLSEIKVEKIKEAAGKIKKYGFLPATIV 77 sp P25453 DMC1_YEAST SGGIYTVNTVLSTTRRHLCKIKGLSEVKVEKIKEAAGKIIQVGFIPATVQ 86 sp O42634 DMC1_SCHPO QAGVCTVQGVHMSTKRFLLKIKGFSEAKVDKLKEAASKMCPANFSTAMEI 85 sp Q14565 DMC1_HUMAN SVGICTIKGIQMTTRRALCNVKGLSEAKVDKIKEAANKLIEPGFLTAFEY 91.. : : :.:: * : *.. *.::: * ::.*.* R GS L GG ITE GEFR GK Q HTL V sp Q06609 RAD51_HUMAN HQRRSEIIQITTGSKELDKLLQGGIETGSITEMFGEFRTGKTQICHTLAV 142 sp P36601 RAD51_SCHPO HIRRSELITITTGSKQLDTLLQGGVETGSITELFGEFRTGKSQICHTLAV 164 sp Q99133 RAD51_USTMA HARRNELISITTGSKNLDAILGGGMETGSITELYGEFRTGKSQLCHTLAV 142 sp P25454 RAD51_YEAST HMRRSELICLTTGSKNLDTLLGGGVETGSITELFGEFRTGKSQLCHTLAV 200 sp Q40134 RAD51_SOLLC HAQRLEIIQITSGSKELDKILEGGIETGSITEIYGEFRCGKTQLCHTLCV 145 sp Q27297 RAD51_DROME YQMRADVVQLSTGSKELDKLLGGGIETGSITEIFGEFRCGKTQLCHTLAV 139 sp P50265 DLH1_CANAL AESRTKVFHITTGSKQFDEILGGGIQSMSITEVFGEFRCGKTQLCHTLCV 127 sp P25453 DMC1_YEAST LDIRQRVYSLSTGSKQLDSILGGGIMTMSITEVFGEFRCGKTQMSHTLCV 136 sp O42634 DMC1_SCHPO SQNRKKVWSISTGSEALNGILGGGIQSMSITEVFGEFRCGKTQMSHTLCV 135 sp Q14565 DMC1_HUMAN SEKRKMVFHITTGSQEFDKLLGGGIESMAITEAFGEFRTGKTQLSHTLCV 141 * : :::**: :: :* **: : :*** :**** **:*:.***.* Q P G ID E TFRP R A N sp Q06609 RAD51_HUMAN TCQLPIDRGGGEGKAMYIDTEGTFRPERLLAVAERYGLSGSDVLDNVAYA 192 sp P36601 RAD51_SCHPO TCQLPIDMGGGEGKCLYIDTEGTFRPVRLLAVADRYGLNGEEVLDNVAYA 214 sp Q99133 RAD51_USTMA TCQLPVDMGGGEGKCLYIDTENTFRPTRLLAVAERFGLNGEEVLDNVAYA 192 sp P25454 RAD51_YEAST TCQIPLDIGGGEGKCLYIDTEGTFRPVRLVSIAQRFGLDPDDALNNVAYA 250 sp Q40134 RAD51_SOLLC TCQLPLDQGGGEGKAMYIDAEGTFRPQRLLQIADRYGLNGPDVLENVAYA 195 sp Q27297 RAD51_DROME TCQLPISQKGGEGKCMYIDTENTFRPERLAAIAQRYKLNESEVLDNVAFT 189 sp P50265 DLH1_CANAL AAQLPTDMGGGEGRVAYIDTEGTFRPDRIRSIAERYGVDADICLENISYA 177 sp P25453 DMC1_YEAST TTQLPREMGGGEGKVAYIDTEGTFRPERIKQIAEGYELDPESCLANVSYA 186 sp O42634 DMC1_SCHPO TAQLPRDMGGAEGKVAFIDTEGTFRPDRIKAIAERFGVDADQAMENIIVS 185 sp Q14565 DMC1_HUMAN TAQLPGAGGYPGGKIIFIDTENTFRPDRLRDIADRFNVDHDAVLDNVLYA 191 : *:* *: :**:*.**** *: :*: : :. : *: : RA Q L DS R D GRGEL sp Q06609 RAD51_HUMAN RAFNTDHQTQLLYQASAMMVE--SRYALLIVDSATALYRTDYSGRGELSA 240 sp P36601 RAD51_SCHPO RAYNADHQLELLQQAANMMSE--SRFSLLVVDSCTALYRTDFSGRGELSA 262 sp Q99133 RAD51_USTMA RAYNADHQLQLLMQASAMMAE--SRFSLLIVDSLTSLYRTDFSGRGELSA 240 sp P25454 RAD51_YEAST RAYNADHQLRLLDAAAQMMSE--SRFSLIVVDSVMALYRTDFSGRGELSA 298 sp Q40134 RAD51_SOLLC RAYNTDHQSRLLLEAASMMVE--TRFALMIVDSATALYRTDFSGRGELSA 243 sp Q27297 RAD51_DROME RAHNSDQQTKLIQMAAGMLFE--SRYALLIVDSAMALYRSDYIGRGELAA 237 sp P50265 DLH1_CANAL RALNSEHQIELVEQLGNELAE--GTFRLLIVDSIMACFRVDYSGRGELNE 225 sp P25453 DMC1_YEAST RALNSEHQMELVEQLGEELSS--GDYRLIVVDSIMANFRVDYCGRGELSE 234 sp O42634 DMC1_SCHPO RAYNSEQQMEYITKLGTIFAED-GQYRLLIVDSIMALFRVDYSGRGELSE Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

110 sp Q14565 DMC1_HUMAN RAYTSEHQMELLDYVAAKFHEEAGIFKLLIIDSIMALFRVDFSGRGELAE 241 **.:::*. :. :. : *:::** : :* *: ***** RQ L L AV TNQ KK IG sp Q06609 RAD51_HUMAN RQMHLARFLRMLLRLADEFGVAVVITNQVVAQVDGAAMFAADP-KKPIGG 289 sp P36601 RAD51_SCHPO RQMHLARFMRTLQRLADEFGIAVVITNQVVAQVDG-ISFNPDP-KKPIGG 310 sp Q99133 RAD51_USTMA RQMHLAKFLRGLMRLADEFGVAVVITNQVVAQVDGATAFTADA-KKPIGG 289 sp P25454 RAD51_YEAST RQMHLAKFMRALQRLADQFGVAVVVTNQVVAQVDGGMAFNPDP-KKPIGG 347 sp Q40134 RAD51_SOLLC RQMHLAKFLRSLQKLADEFGVAVVITNQVVAQVDGSAVFAGPQ-IKPIGG 292 sp Q27297 RAD51_DROME RQNHLGLFLRMLQRLADEFGVAVVITNQVTASLDG-APGMFDA-KKPIGG 285 sp P50265 DLH1_CANAL RQQKLNQHLSNLTRVAEDYNIAVFLTNQVQSDPGASALFAAADGRKPVGG 275 sp P25453 DMC1_YEAST RQQKLNQHLFKLNRLAEEFNVAVFLTNQVQSDPGASALFASADGRKPIGG 284 sp O42634 DMC1_SCHPO RQQKLNIMLARLNHISEEFNVAVFVTNQVQADPGAAMMFASND-RKPVGG 283 sp Q14565 DMC1_HUMAN RQQKLAQMLSRLQKISEEYNVAVFVTNQMTADPGATMTFQADP-KKPIGG 290 ** :* : * ::::::.:**.:***: :... **:** AH S TR KG R SP E I G D sp Q06609 RAD51_HUMAN NIIAHASTTRLYLRKGRGETRICKIYDSPCLPEAEAMFAINADGVGDAKD 339 sp P36601 RAD51_SCHPO NILAHSSTTRLSLRKGRGEQRICKIYDSPCLPESEAIFAINSDGVGDPKE 360 sp Q99133 RAD51_USTMA NIVAHASTTRLSLRKGRGNQRICRIADSPCLPEADAVFAIGPEGIIDPVD 339 sp P25454 RAD51_YEAST NIMAHSSTTRLGFKKGKGCQRLCKVVDSPCLPEAECVFAIYEDGVGDPRE 397 sp Q40134 RAD51_SOLLC NIMAHASTTRLALRKGRAEERICKVVSSPCLAEAEARFQISVEGVTDVKD 342 sp Q27297 RAD51_DROME HIMAHSSTTRLYLRKGKGETRICKIYDSPCLPESEAMFAILPDGIGDARE 335 sp P50265 DLH1_CANAL HVLAHASATRILLRKGRGEERVAKLQDSPNMPEKECVYVIGEGGIKDTD- 324 sp P25453 DMC1_YEAST HVLAHASATRILLRKGRGDERVAKLQDSPDMPEKECVYVIGEKGITDSSD 334 sp O42634 DMC1_SCHPO HVMAHASATRLLLRKGRGEERVAKLNDSPDMPEAECSYVITPGGIADVS- 332 sp Q14565 DMC1_HUMAN HILAHASTTRISLRKGRGELRIAKIYDSPEMPENEATFAITAGGIGDAKE 340 :::**:*:**: ::**:. *:.::.** :.* :. : * *: * sp Q06609 RAD51_HUMAN sp P36601 RAD51_SCHPO IIAPV 365 sp Q99133 RAD51_USTMA sp P25454 RAD51_YEAST EDE sp Q40134 RAD51_SOLLC sp Q27297 RAD51_DROME S sp P50265 DLH1_CANAL sp P25453 DMC1_YEAST sp O42634 DMC1_SCHPO sp Q14565 DMC1_HUMAN * = αυτή η στήλη της στοίχισης περιέχει ίδιο το αμινοξικό κατάλοιπο σε όλες τις ακολουθίες (ή όμοιες βάσεις αν στοιχίζονται ακολουθίες DNA) : = αυτή η στήλη της στοίχισης περιέχει διαφορετικά αλλά υψηλά διατηρημένα (παρόμοια) αμινοξέα. 110 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

111 . = αυτή η στήλη της στοίχισης περιέχει διαφορετικά αμινοξέα τα οποία είναι κατά κάποιον τρόπο όμοια. Η στοίχιση αυτή μας επιβεβαίωσε την υψηλή συντήρηση, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των πρωτεϊνών του ανασυνδιασμού, αρχής γενομένης από την βακτηριακή ορθόλογη RecA. Το γεγονός ότι η RecA δεν φαίνεται να είναι πρόγονος της RAD51 αλλά αυτά τα δύο μόρια θεωρείται ότι έχουν εξελιχθεί μέσα από εξελικτική σύγκλιση, δείχνει ότι οι πρωτεΐνες αυτές είναι ζωτικής σημασίας για τη συγκεκριμένη λειτουργία ανασυνδυασμού και δεν μπορούν να αντέξουν τροποποιήσεις. Αυτή η αντίληψη ενισχύεται περαιτέρω από την απουσία μεταλλάξεων στην περιοχή που κωδικοποιεί την RAD51 σε καρκινικά κύτταρα. Ακολουθεί ο πίνακας των αποτελεσμάτων της στοίχισης ανά δύο: SeqA Name Length SeqB Name Length Score 1 sp Q06609 RAD51_HUMAN sp P50265 DLH1_CANAL sp Q06609 RAD51_HUMAN sp P25453 DMC1_YEAST sp Q06609 RAD51_HUMAN sp O42634 DMC1_SCHPO sp Q06609 RAD51_HUMAN sp Q14565 DMC1_HUMAN sp Q06609 RAD51_HUMAN sp Q27297 RAD51_DROME sp Q06609 RAD51_HUMAN sp Q40134 RAD51_SOLLC sp Q06609 RAD51_HUMAN sp P36601 RAD51_SCHPO sp Q06609 RAD51_HUMAN sp Q99133 RAD51_USTMA sp Q06609 RAD51_HUMAN sp P25454 RAD51_YEAST sp P50265 DLH1_CANAL sp P25453 DMC1_YEAST sp P50265 DLH1_CANAL sp O42634 DMC1_SCHPO sp P50265 DLH1_CANAL sp Q14565 DMC1_HUMAN sp P50265 DLH1_CANAL sp Q27297 RAD51_DROME sp P50265 DLH1_CANAL sp Q40134 RAD51_SOLLC sp P50265 DLH1_CANAL sp P36601 RAD51_SCHPO sp P50265 DLH1_CANAL sp Q99133 RAD51_USTMA sp P50265 DLH1_CANAL sp P25454 RAD51_YEAST sp P25453 DMC1_YEAST sp O42634 DMC1_SCHPO sp P25453 DMC1_YEAST sp Q14565 DMC1_HUMAN sp P25453 DMC1_YEAST sp Q27297 RAD51_DROME sp P25453 DMC1_YEAST sp Q40134 RAD51_SOLLC sp P25453 DMC1_YEAST sp P36601 RAD51_SCHPO sp P25453 DMC1_YEAST sp Q99133 RAD51_USTMA sp P25453 DMC1_YEAST sp P25454 RAD51_YEAST sp O42634 DMC1_SCHPO sp Q14565 DMC1_HUMAN sp O42634 DMC1_SCHPO sp Q27297 RAD51_DROME sp O42634 DMC1_SCHPO sp Q40134 RAD51_SOLLC Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

112 SeqA Name Length SeqB Name Length Score 4 sp O42634 DMC1_SCHPO sp P36601 RAD51_SCHPO sp O42634 DMC1_SCHPO sp Q99133 RAD51_USTMA sp O42634 DMC1_SCHPO sp P25454 RAD51_YEAST sp Q14565 DMC1_HUMAN sp Q27297 RAD51_DROME sp Q14565 DMC1_HUMAN sp Q40134 RAD51_SOLLC sp Q14565 DMC1_HUMAN sp P36601 RAD51_SCHPO sp Q14565 DMC1_HUMAN sp Q99133 RAD51_USTMA sp Q14565 DMC1_HUMAN sp P25454 RAD51_YEAST sp Q27297 RAD51_DROME sp Q40134 RAD51_SOLLC sp Q27297 RAD51_DROME sp P36601 RAD51_SCHPO sp Q27297 RAD51_DROME sp Q99133 RAD51_USTMA sp Q27297 RAD51_DROME sp P25454 RAD51_YEAST sp Q40134 RAD51_SOLLC sp P36601 RAD51_SCHPO sp Q40134 RAD51_SOLLC sp Q99133 RAD51_USTMA sp Q40134 RAD51_SOLLC sp P25454 RAD51_YEAST sp P36601 RAD51_SCHPO sp Q99133 RAD51_USTMA sp P36601 RAD51_SCHPO sp P25454 RAD51_YEAST sp Q99133 RAD51_USTMA sp P25454 RAD51_YEAST Ακόμη παρατηρούμε την υψηλή ομολογία μεταξύ των πρωτεϊνών αυτών. Ιδιαιτέρως μεταξύ των HsRAD51 και ScRAD51 όπου συγκριτικά στοιχεία δείχνουν 89% ομολογία αλληλουχίας, με 68% ίδια κατάλοιπα. Ακολουθεί λίστα με πολύ συντηρημένα αμινοξικά κατάλοιπα τα οποία είναι: (*) 82/229 ~36% L28 I33 D37 L61 G66 K70 A79 F86 A89 R95 G105 S106 L113 G115 G116 I122 T123 E124 G127 E128 F127 R130 G132 K133 Q135 H138 T139 L140 V142 Q145 P147 G155 I160 D161 E163 T165 F166 R167 P168 R170 A175 N188 R193 A194 Q200 L218 D222 S223 R229 D231 G234 R235 G236 E237 L238 R241 Q242 L245 L252 A262 V263 T266 N267 Q268 K284 K285 I287 G288 A293 H294 S296 T298 R299 K304 G305 R310 S317 P218 E322 I329 G333 D336 και (:) 80 /229 ~ 35 % Σε αντιπαραβολή των στοιχείων αυτών με τα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα παρατηρούμε ότι βρίσκονται στις επιμέρους περιοχές αλληλεπίδρασης με τους υπόλοιπους παράγοντες ανασυνδυασμού ή με το DNA. 112 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

113 Δ. Μοντελοποίηση της δομής της RAD51 με Homology Modelling Δ.1 Γενικά για τις μεθόδους Πρόγνωσης διπλώματος Πρωτεϊνών Η Γνώση της δομής μιας πρωτεΐνης είναι σημαντική για να καταλάβουμε τη λειτουργία της αλλά και να για την στοχεύσουμε με φάρμακα. Μία μικρή πρωτεΐνη μπορεί να αποτελείται από 100 αμινοξέα, αλλά οι ανθρώπινες πρωτεΐνες είναι συνήθως πολύ μεγαλύτερες. Ακόμα και οι μικρότερες πρωτεΐνες μπορούν να αναδιπλωθούν στο χώρο με πάρα πολλούς τρόπους γιατί έχουν πολλούς βαθμούς ελευθερίας, το οποίο είναι ευρέως γνωστό ως παράδοξο του Levinthal. Δηλαδή ότι ο αριθμός των δυνατών διαμορφώσεων στο χώρο μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας είναι τόσο μεγάλος, που η αξιολόγηση όλων των περιπτώσεων είναι αδύνατη. Οι υπολογιστικές μέθοδοι που έχουν αναπτυχθεί μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε μεθόδους πρόγνωσης με ομολογία (homology modelling), ύφανσης πρωτεϊνών (protein threading) και απαρχής μεθόδους (ab initio). Οι δύο πρώτες μέθοδοι είναι ευριστικές, δηλαδή χρησιμοποιούν, ήδη προσδιορισμένες δομές για να προσδιορίσουν τη δομή μιας ακολουθίας αγνώστου δομής. Είναι προσεγγίσεις βασισμένες στην υπάρχουσα γνώση (knowledge based) που αποκτούν ολοένα και περισσότερο ενδιαφέρον. Αντίθετα οι απαρχής μέθοδοι δεν βασίζονται σε προηγούμενη γνώση, αλλά χρησιμοποιούν φυσικές αρχές (physics based methods). Όλες οι μέθοδοι πρόγνωσης της δομής των πρωτεϊνών αξιολογούνται κάθε δυο χρόνια με απαρχή το 1994, στα πλαίσια του διαγωνισμού CASP (Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction). Δ.2 Μέθοδος πρόγνωσης διπλώματος Πρωτεϊνών με Ομολογία (Homology Modelling) H μέθοδος πρόγνωσης με ομολογία εφαρμόζεται σε μια άγνωστη δομή, αν βρεθεί ομόλογή της με γνωστή δομή. Με την προσέγγιση αυτή, προσπαθούμε να προσδιορίσουμε θεωρητικά την άγνωστη δομή μιας πρωτεΐνης. Γενικά, πρωτεΐνες με ομοιότητα στην ακολουθία άνω του 30%, η οποία εκτείνεται σε μήκος μεγαλύτερο των 80 καταλοίπων, θεωρείται πως διπλώνουν στο χώρο με παρόμοιο τρόπο. Τουλάχιστον αυτό ισχύει για τις περιοχές μη τυχαίας δευτεροταγούς δομής. Η γνωστή δομή λέγεται Template (οδηγός), ενώ η άγνωστη Model (μοντέλο). Με τον τρόπο αυτό έγινε δυνατόν να μεγαλώσει το πλήθος των "γνωστών" 3D-δομών. Η δυσκολία βρίσκεται στη σωστή προσαρμογή των πλευρικών αλυσίδων, πρόβλημα του οποίου η επίλυση επιβάλει τη χρήση ενεργειακών υπολογισμών, καθώς και δεδομένων για όλες τις διευθετήσεις πλευρικών αλυσίδων σε λυμένες πρωτεϊνικές δομές. Αναλυτικότερα η διαδικασία της πρόγνωσης με ομολογία ακολουθεί τα εξής βήματα: Εντοπισμός της ακολουθίας του μοντέλου (άγνωστη δομή) στις βάσεις δεδομένων Εύρεση μιας κατάλληλης πρωτεΐνης που να ικανοποιεί τις απαιτήσεις ομολογίας με την ακολουθία του μοντέλου Εντοπισμός της πειραματικά προσδιορισμένης δομής-οδηγού στις βάσεις δεδομένων και έλεγχος της αξιοπιστίας της Στοίχιση των δύο ακολουθιών 113 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

114 Δημιουργία του μοντέλου, με ειδικό λογισμικό το οποίο δέχεται ως δεδομένα τη δομήοδηγό και τη στοίχιση των ακολουθιών Οπτική παρατήρηση του μοντέλου, και έλεγχος για πιθανές ανεπίτρεπτες αποστάσεις μεταξύ ατόμων Ενδεχόμενη βελτίωση της στοίχισης των ακολουθιών, με σκοπό τη βελτίωση του μοντέλου Δημιουργία του νέου μοντέλου Δ.3 WHATIF και MODELLER Χρησιμοποιήθηκαν δυο προγράμματα Homology Modelling: η αντίστοιχη επιλογή μέσω του web server WHATIF και το πρόγραμμα MODELLER. Και για τα δύο προγράμματα προηγήθηκε στοίχιση των δύο δομών με το CLUSTALW επιλέγοντας κατάλληλη μορφοποίηση αποτελεσμάτων. Δ.3.1 WHATIF Αρχικά χρησιμοποιήθηκε για μοντελοποίηση της δομής της RAD51 ο web server WHATIF ( με πρωτεΐνες οδηγούς: την 3HR8 και την 3LDA Για να ελεγχθεί πως μεταλλάξεις στην RAD51 μπορεί να επηρεάσουν το δίπλωμα της πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε αρχικά, ο web server WHATIF. Όμως δεν έδωσε αποτελέσματα και έτσι αντ' αυτού χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα MODELLER Δ.3.2 Λίγα λόγια για το πρόγραμμα MODELLER Το MODELLER είναι ένα πρόγραμμα πρόγνωσης του διπλώματος Πρωτεϊνών με Ομολογία (Homology Modelling), είναι ένα πρόγραμμα οµόλογης μοντελοποίησης της 114 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

115 πρωτεϊνικής δομής κάνοντας χρήση των χωρικών συντεταγμένων της πρωτεΐνης "οδηγού" και των βιολογικών χωρικών περιορισμών. Το MODELLER είναι γραμμένο σε γλώσσα Fortran-90 από τους Andrej Sali et. al, η έκδοση 9.9 το 2011 και είναι διαθέσιμο ελεύθερα από το MODELLER website ( Το Modeller δεν έχει γραφικό περιβάλλον αλλά λειτουργεί µέσω εντολών από τη γραμμή -εντολών. Το πρόγραμμα χρειάζεται για να λειτουργήσει τρία αρχεία: 1. Το.pdb αρχείο της πρωτεΐνης "οδηγού". 2. Το αρχείο της στοίχισης των δύο πρωτεϊνών "alignment.ali". Π.χ. όπως αυτό που ακολουθεί. >P1;3HR8 structurex:3hr8:4 : : : :3HR8:: : -EKQKKSVLEKALKRIEENFGKGSIMILGDETQVQPVEVIPTGSLAIDIATGVGGYPRGR IVEIFGQESSGKTTLALHAIAEAQKMGGVAAFIDAEHALDPVYAKNLGVDLKSLLISQPD HGEQALEIVDELVRSGVVDLIVVDSVAALVPRAEIEGAMGDMQVGLQARLMSQALRKIAG SVNKSKAVVIFTNQIRMKIGVMFGSPETTTGGLALKFYATMRMEVRRGEPIKEGKDVIGN VISVKIVKNKVAPPFKTAQTYIIYGKGIDREYELFNIAVNEGIVDRKGSWYYYTTLK--- -GEEVSLGQGSSNAVQFLKDNPEIAGEIER-RIREKYGLLSVEKEEQR---- * >P1;RAD51 sequence:rad51:1 : :340 : :RAD51:: : MAMQMQLEANADTSVEEESFGPQPISRL-EQCGINANDVKKLEEAGFHTVEAVAYAPKKE LINIKG-ISEAKADKILAEAAKLVPMGFTTATEFHQRRSEIIQITTGSKELDKLLQGGIE TG--SITEMFGEFRTGKTQICHTLAVTCQLPIDRGGGEGKAMYIDTEGTFRPERLLAVAE RYGLSGSDVLDN VAYARAFNTDHQTQLLYQASAMMVESRYALLIVDSATALY RTDYSGRGELSARQMHLARFLRMLLR-LADEFGVAVVITNQVVAQVDGAAMFAADPKKPI GGNIIAHASTTRLYLRKGRGETRICKIYDSPCLPEAEAMFAINADGVGDAKD 3. Το script αρχείο με τις παραμέτρους για το πρόγραμμα "model.py". Π.χ. όπως αυτό που ακολουθεί. from modeller.automodel import * # Load the automodel class log.verbose() # request verbose output env = environ() # create a new MODELLER environment to build this model in # directories for input atom files env.io.atom_files_directory = './:../atom_files' a = automodel(env, alnfile = 'alignment.ali', # alignment filename knowns = '3HR8', # codes of the templates sequence = 'RAD51') # code of the target a.starting_model= 1 # index of the first model a.ending_model = 5 # index of the last model # (determines how many models to calculate) a.make() # do the actual homology modelling Το πρόγραμμα MODELLER εκτελείται σε περιβάλλον "γραμμής εντολών" και απαιτεί την εγκατάσταση της open source γλώσσας προγραμματισμού Python. Για τη συγκεκριμένη εργασία εγκαταστάθηκε και λειτούργησε σε Windows XP. 115 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

116 Τα αποτελέσματα που δίνει είναι αρχεία.pdb για τα μοντέλα που έχει φτιάξει καθώς και αρχεία κειμένου που παρουσιάζουν τα δεδομένα από τη διεργασία της οµόλογης μοντελοποίησης Το πρόγραμμα MODELLER χρησιμοποιήθηκε γιατί παρέχει μεγαλύτερη ευελιξία και δίνοντας αποτελέσματα για έλεγχο μεταλλάξεων. Δημιουργήθηκαν τα ακόλουθα.pdb αρχεία με πρωτεΐνες οδηγούς: την 3HR8 την 3LDA και την 1N0W, τα οποία βρίσκονται στο CD της εργασίας. RAD51 Mod-3HR8, RAD51-A89E, RAD51-A190&192L, RAD51-D187A, RAD51-F86E RAD51-F166A, RAD51-R130A, RAD51-R250A, RAD51-SA ED, RAD51-SAM LEA, RAD51 Mod-2GDJ, Mod1-1N0W-D187A, Mod2-1N0W-R250A Ενδεικτικά παρατίθεται η δομή RAD51 Mod-3HR8 με οδηγό την RecA N 116 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

117 Όμως σημαντική είναι η δομή RAD51-F166Α με μεταλλαγμένη την Phe 166 σε Αla με οδηγό την 1Ν0W που επιβεβαιώνει τα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα του εργαστηρίου του Δρ. Κ. Βοργιά. Εικόνα 39. Η δομή RAD51-F166Α με οδηγό την 1Ν0W Με μπλε εμφανίζονται τα αα που αποτελούν τη μικρή τσέπη APLLV που υποδέχεται την την Ala 1527 του BRC4 της πρωτεΐνης BRCA2: A 166, P 168, L 171, L 186, V Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

118 C Ala 250 N Εικόνα 40. Η δομή RAD51- R250A με οδηγό την 1Ν0W N C 118 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

119 Ε. Προσομοίωση της αλληλεπίδρασης των p53-rad51 με προγράμματα "docking" Ε.1 Γενικά για τις μεθόδους Μοντελοποίησης Αλληλεπίδρασης Πρωτεϊνών Docking είναι η μέθοδος μέσα από την οποία γίνεται πρόβλεψη αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο µορίων. Προσδιορίζεται η ύπαρξη πρόσδεσης και ο προσανατολισμός του ενός µορίου σε σχέση µε το άλλο όταν δημιουργείται ένα σταθερό σύµπλοκο. Η γνώση της πληροφορίας προσανατολισμού συμβάλλει στην πρόβλεψη της ισχύος πρόσδεσης µε τη χρήση διάφορων συναρτήσεων βαθμολογίας. Η μέθοδος του docking χρησιμοποιείται συχνά για την πρόβλεψη αλληλεπίδρασης μεταξύ μιας πρωτεΐνης και ενός υποψήφιου φαρμάκου για να διαπιστωθεί η περιοχή πρόσδεσης και η ενεργότητα στη θέση αυτή του μικρού µορίου, και συνεπώς, παίζει σημαντικό ρόλο στην ορθολογική σχεδίαση φαρμάκων. Φαίνεται έτσι ότι η αξία της μεθόδου στην φαρμακευτικής καθώς και στις βιολογικές διεργασίες είναι σημαντική, για αυτό και γίνονται προσπάθειες βελτιστοποίησης της μεθόδου docking. Docking γίνεται μεταξύ ενός υποδοχέα/µόριο-δέκτης (receptor) πάνω στο οποίο προσδένεται ένα µόριο-προσδέτης (ligand) που μπορεί να είναι ένα μικρό µόριο, µια πρωτεΐνη ή νουκλεϊκό οξύ. Η μέθοδος docking για αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών προσπαθεί να απαντήσει σε ορισμένα ερωτήματα. Αναλύοντας την υπόθεση ύπαρξης ή µη πρόσδεσης μεταξύ των πρωτεϊνών ανιχνεύεται και ο προσανατολισμός των πρωτεϊνών όταν είναι συνδεδεμένες προβλέποντας παράλληλα και την ισχύ της πρόσδεσης. Εάν δε διαπιστωθεί αλληλεπίδραση εξετάζεται το ενδεχόμενο πιθανής αλληλεπίδρασης µέσω μεταλλάξεων. Επιπλέον επειδή η µέθοδος του docking στηρίζεται καθαρά σε φυσικές παραμέτρους και κανόνες, ακόµα και πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργίας µπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εξακρίβωση υποθέσεων πιθανής λειτουργίας. Μοναδική προϋπόθεση είναι να έχει προσδιοριστεί η τριτοταγής δομή των πρωτεϊνών είτε µέσω πειραμάτων (κρυσταλλογραφία, NMR) είτε µε προγράμματα πρόβλεψης δομής (πχ τεχνική της ομόλογης μοντελοποίησης). Ε.2 Το HADDOCK Software web portal Το HADDOCK (High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing) είναι ένα δημοφιλές πρόγραμμα Μοντελοποίησης Αλληλεπίδρασης που υιοθετεί μια προσέγγιση με γνώμονα τα δεδομένα για να docking, με υποστήριξη για ένα ευρύ φάσμα των πειραματικών δεδομένων. Ο HADDOCK web server, διευκολύνοντας την μοντελοποίηση των βιο-μοριακών συμπλόκων για μια μεγάλη κοινότητα. Η κύρια διεπαφή Ιστού είναι φιλική προς το χρήστη, απαιτώντας σαν είσοδο, μόνο τις δομές των επιμέρους μορίων και μια λίστα με τα κατάλοιπα που αλληλεπιδρούν. Πρόσθετες διασυνδέσεις επιτρέπουν στον έμπειρο χρήστη να αξιοποιήσει το πλήρες φάσμα των πειραματικών δεδομένων που υποστηρίζονται από το HADDOCΚ για να προσαρμόσει το μοντέλο. Ο HADDOCΚ διακομιστής έχει πρόσβαση στους πόρους της μιας ειδικής υπο-ομάδας του e-nmr δικτύου. Ως εκ τούτου, μια τυπική λειτουργία σύνδεσης διαρκεί μόνο λίγα λεπτά για την προετοιμασία και λίγες ώρες για να ολοκληρωθεί. 119 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

120 Η υλοποίηση του "docking" της p53 με την αντίστοιχη περιοχή αλληλεπίδρασης της RAD51 έγινε μέσω του web server HADDOCK με URL Για το docking προσαρμόστηκαν τα.pdb αρχεία των δυο πρωτεϊνών ώστε: να μην δημιουργούν πρόβλημα στη λειτουργία του προγράμματος να γίνει στοχευμένη μοντελοποίηση της αλληλεπίδρασης χρησιμοποιώντας τα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα του Κεφαλαίου 10. Δόθηκαν ως είσοδος οι αλληλεπιδρώντες τομείς των δυο πρωτεϊνών σε διάφορους συνδυασμούς : και από την p53 και από την RAD από την p53 (2OCJ) και Active residues (directly involved in the interaction): 102, 103, 105, 114, 115, 122, 126, 140, 143, 179, 198, 199, 206, 207, 215, 239, 243, 244, 254, 265, 267, 272, 277, 279, 280, 282, 283, από την RAD51 (1N0W) και Active residues (directly involved in the interaction) : 184, 186, 187, 189, 190 / Passive residues (surrounding surface residues) : 182, 183, 185, 188, 191, 192, από την p53 (2OCJ) και Active residues (directly involved in the interaction): 102, 103, 105, 114, 115, 122, από την RAD51 (1N0W) και Active residues (directly involved in the interaction) : 184, 186, 187, 189, από την p53 (2OCJ) και Active residues (directly involved in the interaction): 265, 267, 272, 273, 277, 279, 280, 282, 283, από την RAD51 (1N0W) και Active residues (directly involved in the interaction) : 184, 186, 187, 189, Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

121 121 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

122 Ε.3 Το GRAMM Software web portal Το GRAMM (Global Range Molecular Matching) είναι ένα δημοφιλές πρόγραμμα Μοντελοποίησης Αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Για την πρόβλεψη της δομής ενός συμπλόκου, απαιτεί μόνο τις ατομικές συντεταγμένες των δύο μορίων (δεν είναι απαραίτητη καμία πληροφορία σχετικά με τα σημεία πρόσδεσης). Το πρόγραμμα εκτελεί μια "εξαντλητική αναζήτηση" 6-διάστασεων μέσω των σχετικών θέσεων και περιστροφών των μορίων. Τα μοριακά ζεύγη μπορεί να είναι: δύο πρωτεΐνες, πρωτεΐνη και ένα μικρό μόριο,, κλπ. Το Gramm μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε υψηλής ανάλυσης μόρια, με γνωστές 3-Δ δομές (όπου είναι γνωστά μόνο τα δομικά χαρακτηριστικά). Η υλοποίηση του "docking" της p53 με την αντίστοιχη περιοχή αλληλεπίδρασης της RAD51 έγινε μέσω του GRAMM-X Protein-Protein Docking Web Server v με URL Όπως και για το HADDOCK προσαρμόστηκαν τα.pdb αρχεία των δυο πρωτεϊνών ώστε να μην δημιουργούν πρόβλημα στη λειτουργία του προγράμματος και να γίνει στοχευμένη μοντελοποίηση της αλληλεπίδρασης χρησιμοποιώντας τα υπάρχοντα πειραματικά δεδομένα. 122 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

123 Ε.4 Τα αποτελέσματα του docking Τα αποτελέσματα του docking βρίσκονται στο CD της εργασίας. Ενδεικτικά παραθέτω τα κάτωθι: Εικόνα 41. HADDOC Μοντέλο Αλληλεπίδρασης p53 (96-279) - RAD51 ( ). 123 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

124 Εικόνα 42. GRAMM Μοντέλο Αλληλεπίδρασης p53 (96-136) - RAD51 ( ) Εικόνα 43. HADDOC Μοντέλο Αλληλεπίδρασης p53 (96-136) - RAD51 ( ). 124 Διπλωματική Εργασία Σ.Α.

125 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Το Αυτοτελές Δομικό Στοιχείο ATPase της HsRAD51 Η ετερόκλητη, πολλαπλού σκοπού, περιοχή δέσμευσης πρωτεϊνών (ATPase domain) της RAD51 (αα ) και τα σημαντικά κατάλοιπα αυτής ως προς την δέσμευση RAD51, DNA, BRC4 και p53. Εικόνα 44. To Α.Δ.Σ. ATPase της HsRAD51. Στοίχιση των αμινοξικών ακολουθιών της ATPase περιοχής, 9 προτείνων που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των RecA-like ρεκομπινασών. Η εικόνα προέρχεται από την εργασία των Wu Yan, et al και η πρωτότυπη, περιελήφθη στην εργασία αυτή στην σελίδα 71. Αυτή η εικόνα έχει προσαρμοστεί από τη συγγραφέα της εργασίας ώστε να δείχνει τα στοιχεία δευτεροταγούς δομής του ATPase Α.Δ.Σ. της ανθρώπινης RAD51 με βάση την δομή αυτού από την PDB: 1N0W και τις εργασία των Pellegrini L., et al και Yu D.S., et al Διπλωματική Εργασία Σ.Α.