PLATELIA ASPERGILLUS EIA ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ

Transcript

1 PLATELIA ASPERGILLUS EIA ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Η PLATELIA ASPERGILLUS EIA ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΑΣ ΤΥΠΟΥ «SANDWICH» ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ GALACTOMANNAN ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΟΥ ΣΕ ΟΡΟ. 1 ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Η Platelia Aspergillus EIA είναι μια ανοσοενζυμική ανάλυση μικροπλάκας τύπου «sandwich» για την ανίχνευση αντιγόνου galactomannan ασπεργίλλου σε δείγματα ορού. 2 ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΧΡΗΣΗΣ Η Platelia Aspergillus EIA είναι μία εξέταση η οποία όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες όπως η μικροβιολογική καλλιέργεια, η ιστολογική εξέταση δειγμάτων βιοψίας και η διερεύνηση ακτινογραφικών ενδείξεων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βοήθεια στη διάγνωση της Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Οι λοιμώξεις από Ασπέργιλλο συνήθως συμβαίνουν έπειτα από εισπνοή σπόρων Ασπεργίλλου που υπάρχουν στο περιβάλλον. Οι διηθητικές μορφές που έχουν αυξηθεί τα τελευταία 10 έτη, αποτελούν τις σοβαρότερες λοιμώξεις. Συναντώνται κυρίως σε ουδετεροπενικούς ασθενείς (που ακολουθούν αντικαρκινική αγωγή) και σε ασθενείς που ακολουθούν αγωγή με ανοσοκατασταλτικά (μεταμοσχεύσεις οργάνων, ειδικά μεταμόσχευσης μυελού των οστών) και κορτικοστεροειδή 7. Ο Ασπέργιλλος σπάνια απομονώνεται από την καλλιέργεια αίματος. Η διάγνωση συχνά βασίζεται σε μη ειδικές διαγνωστικές ή ακτινολογικές ενδείξεις (κλινικά συμπτώματα, αξονικές τομογραφίες, ακτινογραφία θώρακος, κλπ.) Προς το παρόν, η εξέταση για διαλυτό αντιγόνο galactomannan σε ορό φαίνεται να είναι μια ορολογική μέθοδος ικανή να βοηθήσει στη διάγνωση της Διηθητικής Ασπεργίλλωσης 6, 9, 14, 34, ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 27 Η Platelia Aspergillus EIA είναι μια ανοσοενζυμική ανάλυση μικροπλάκας τύπου «sandwich» ενός σταδίου που ανιχνεύει το galactomannan σε ανθρώπινο ορό. Η ανάλυση χρησιμοποιεί τα μονοκλωνικάα αντισώματα αρουραίων ΕΒΑ-2, που κατευθύνονται κατά του galactomannan του Ασπεργίλλου, και έχουν χαρακτηριστεί σε προηγούμενες μελέτες 16, 28. Τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιούνται (1) για να επικαλύψουν τα μικροβυθίσματα της μικροπλάκας και να δεσμεύσουν το αντιγόνο και (2) για να ανιχνεύσουν το αντιγόνο που έχει δεσμευτεί στην ευαισθητοποιημένη μικροπλάκα (αντιδραστήριο σύζευξηςζεύκτη: μονοκλωνικά αντισώματα που συνδέονται με υπεροξειδάση). Τα δείγματα του ορού υποβάλλονται σε θερμική επεξεργασία με EDTA για να διαχωριστούν τα ανοσοσυμπλέγματα και να καθιζάνουν οι πρωτεΐνες του ορού που θα μπορούσαν να παρεμβληθούν στην εξέταση 15. Τα επεξεργασμένα δείγματα ορού και αντιδραστηρίου σύζευξης προστίθενται στα μικροβυθίσματα που επικαλύπτονται με μονοκλωνικά αντισώματα και επωάζονται. Ένα σύμπλεγμα μονοκλωνικού αντισώματος - galactomannan μονοκλωνικού αντισώματος / υπεροξειδάσης σχηματίζεται παρουσία του αντιγόνου galactomannan. Οι λωρίδες πλένονται για να απομακρυνθεί κάθε αδέσμευτο υλικό. Στη συνέχεια, προστίθεται το διάλυμα υποστρώματος, το οποίο θα αντιδράσει με τα συμπλέγματα που έχουν δεσμευτεί στο μικροβύθισμα σχηματίζοντας μία αντίδραση μπλε χρώματος. Η ενζυμική αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη οξέος, το οποίο αλλάζει το μπλε χρώμα σε κίτρινο. Η οπτική απορρόφηση των δειγμάτων και των ορών ελέγχων προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο ρυθμισμένο σε μήκος κύματος 450 και 620 nm. 1

2 5 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Ασπέργιλλος Platelia (Platelia Aspergillus): αρ. προϊόντος (96 Εξετάσεις) Αποθηκεύστε το κιτ στους 2-8 C. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου (18-25 C) πριν από τη χρήση. Επαναφέρατε όλα τα αντιδραστήρια, εκτός από τους ορούς ελέγχου, στους 2-8 C αμέσως μετά τη χρήση. Μετά από την ανασύσταση, Αρνητικοί Οροί Ελέγχου, Οροί Ελέγχου Αναφοράς και Θετικοί Οροί Ελέγχου που δεν χρησιμοποιήθηκαν πρέπει να καταψυχθούν στους -20 C. Επανατοποθετήστε τις λωρίδες/πλάκες που δεν χρησιμοποιήθηκαν στο σακουλάκι και επανασφραγίστε. Μην αφαιρείτε το αποξηραντικό υλικό. Οι λωρίδες πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 5 εβδομάδων αφότου ανοιχθεί και επανασφραγιστεί το σακουλάκι. Μετά από την αραίωση, το διάλυμα πλύσης μπορεί να διατηρηθεί για 14 ημέρες στους 2-8 C. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης μετά το άνοιγμα. Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για την εκτέλεση 96 εξετάσεων το ανώτερο σε 9 παρτίδες. R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 Συστατικό Περιεχόμενα Ποσότητα Πλάκα λωρίδων μικροβυθίσματος Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης Αρνητικός Ορός Ελέγχου Ορός Ελέγχου Αναφοράς Θετικός Ορός Ελέγχου Διάλυμα σύζευξης Διάλυμα Επεξεργασίας Ορού TMB Ρυθμιστικό Διάλυμα Υποστρώματος Χρωμογόνο: Διάλυμα TMB Διάλυμα Αναστολής Αυτοκόλλητες ταινίες Μικροπλάκα: -96 μικροβυθίσματα (12 λωρίδες των 8 μικροβυθισμάτων η καθεμία) επικαλυμμένα με μονόκλωνα αντισώματα anti-galactomannan Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (10Χ): -Ρυθμιστικό διάλυμα Tris NaCI -1% Tween 20-0,01% thimerosal Αρνητικός Ορός Ελέγχου: -Αφυδατωμένος υπό ψύξη ανθρώπινος ορός αρνητικός για galactomannan -Αρνητικός για αντισώματα anti-hiv1, anti-hiv2, anti- HCV και αντιγόνο HBs Ορός Ελέγχου Αναφοράς: -Αφυδατωμένος υπό ψύξη ανθρώπινος ορός που περιέχει galactomannan -Αρνητικός για αντισώματα anti-hiv1, anti-hiv2, anti- HCV και αντιγόνο HBs Θετικός Ορός Ελέγχου: -Αφυδατωμένος υπό ψύξη ανθρώπινος ορός που περιέχει galactomannan -Αρνητικός για αντισώματα anti-hiv1, anti-hiv2, anti-hcv και αντιγόνο HBs Διάλυμα σύζευξης (έτοιμο για χρήση): -με επισήμανση από Αnti-galactomannan μονόκλωνο αντίσωμα / υπεροξειδάση -Συντηρητικό : 0,01% thimerosal Διάλυμα επεξεργασίας ορού (έτοιμο για χρήση): -διάλυμα οξέος EDTA, Ρυθμιστικό Διάλυμα υποστρώματος TMB (έτοιμο για χρήση): -Διάλυμα κιτρικού οξέος και οξικού νατρίου -0,009% υπεροξείδιο υδρογόνου -4% Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) Διάλυμα Χρωμογόνου ΤΜΒ (συμπυκνωμένο): -90% διάλυμα διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) που περιέχει 0,6% τετραμεθυλοβενζιδίνη (TMB) Διάλυμα Αναστολής (έτοιμο για χρήση): - 1,5 N Θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) -Αυτοκόλλητες ταινίες για μικροπλάκες 1 Πλάκα / 12 x 8 Μικροβυθίσματα 1 x 100 ml 3 x qs*1 ml 3 x qs*1ml 3 x qs*1 ml 1 x 8 ml 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml 1 x 12 ml 1 x 8 φύλλα Σημείωση: Η TMB (Τετραμεθυλοβενζιδίνη) είναι μη καρκινογόνο και μη μεταλλαξογόνο χρωμογόνο για υπεροξειδάση. *Σημείωση: qs: Επαρκής ποσότητα 2

3 6 ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Δεν συνιστάται η χρήση του κιτ εξέτασης με άλλα δείγματα εκτός του ανθρώπινου ορού. 4. Για την παρασκευή του Θετικού Ορού Ελέγχου, του Ορού Ελέγχου Τιμής Ορίου και του Αρνητικού Ορού Ελέγχου έχει χρησιμοποιηθεί ανθρώπινος ορός, ο οποίος έχει ελεγχθεί και έχει βρεθεί μη αντιδρών για επιφανειακό αντιγόνο ηπατίτιδας Β HBsAg και αντισώματα HIV-1, HIV-2 και HCV με δοκιμασίες που φέρουν τη σήμανση CE. Ωστόσο, όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να χειρίζονται ως δυνητικώς μολυσματικά. Όλες οι εξετάσεις θα πρέπει να διενεργούνται σύμφωνα με το Πρότυπο OSHA για τα Αιματογενώς Μεταδιδόμενα Παθογόνα, Επίπεδο Βιοασφάλειας 2 ή σύμφωνα με άλλες κατάλληλες πρακτικές βιοασφάλειας. 5. Φοράτε προστατευτική ενδυμασία που περιλαμβάνει εργαστηριακή ρόμπα, συσκευή προστασίας ματιών/προσώπου και γάντια μίας χρήσης (συνιστάται η χρήση συνθετικών γαντιών χωρίς λάτεξ) και χειρίζεστε τα αντιδραστήρια του κιτ εξέτασης και τα δείγματα των ασθενών σύμφωνα με τις Ορθές Εργαστηριακές Πρακτικές. Πλένετε σχολαστικά τα χέρια σας μετά τη διενέργεια της εξέτασης. 6. Μη χρησιμοποιείτε την προχοΐδα (πιπέτα) δια μέσω του στόματος. 7. Μην καπνίζετε, τρώτε ή πίνετε σε περιοχές χειρισμού των αντιδραστηρίων του κιτ. 8. Αποφεύγετε το πιτσίλισμα των δειγμάτων ή διαλυμάτων. 9. Οι κηλίδες βιολογικών υγρών που δεν περιέχουν οξέα θα πρέπει να καθαρίζονται επιμελώς με αποτελεσματικό απολυμαντικό παράγοντα. Ως απολυμαντικός παράγοντας μπορεί να χρησιμοποιηθεί, μεταξύ άλλων, ένα διάλυμα με 10% χλώριο (0,5% διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου), 70% αιθανόλη ή 0,5% Wescodyne Plus. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για την απομάκρυνση των κηλίδων θα πρέπει να απορρίπτονται ως βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μην τοποθετείτε τα διαλύματα που περιέχουν χλώριο σε κλίβανο. 10. Οι κηλίδες που περιέχουν οξέα θα πρέπει να απομακρύνονται με ενδεδειγμένο τρόπο ή να εξουδετερώνονται με διττανθρακικό διάλυμα νατρίου και η περιοχή να ξεπλένεται και να σκουπίζεται. Στην περίπτωση των βιολογικά επικίνδυνων υλικών, η περιοχή θα πρέπει να καθαρίζεται με χημικό απολυμαντικό. 11. Απορρίπτετε όλα τα δείγματα και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τη διενέργεια της εξέτασης ως δυνητικώς μολυσματικούς παράγοντες. Τα εργαστηριακά χημικά και βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα θα πρέπει να χειρίζονται και να απορρίπτονται σύμφωνα με τους τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισμούς. 12. ΠΡΟΣΟΧΗ: Παρακάτω παρατίθεται λίστα με τους πιθανούς χημικούς κινδύνους που ενέχουν ορισμένα από τα συστατικά στοιχεία του κιτ εξέτασης (ανατρέξτε στην ενότητα 5- ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ): Το διάλυμα ανάσχεσης 1,5 Ν Θειικό Οξύ (7,2% H2SO4) είναι διαβρωτικό, ικανό να προκαλέσει εγκαύματα στα μάτια και το δέρμα. Είναι επιβλαβές όταν καταπίνεται ή όταν έρχεται σε επαφή με το δέρμα. Μπορεί να προκαλέσει σοβαρές βλάβες στα μάτια, συμπεριλαμβανομένης της μόνιμης εξασθένησης της όρασης ή της τύφλωσης. Φυλάσσετε μακριά από ισχυρές βάσεις και αναγωγικούς παράγοντες. C- Διαβρωτικό Το R34-41 προκαλεί εγκαύματα. Κίνδυνος σοβαρής βλάβης στα μάτια. S24/ /37/ Αποφεύγετε την επαφή με το δέρμα και τα μάτια. Σε περίπτωση επαφής με τα μάτια, ξεπλύντε αμέσως με άφθονο νερό και ζητήστε ιατρική συμβουλή. Ποτέ μην προσθέτετε νερό σε αυτό το προϊόν. Φοράτε κατάλληλη προστατευτική ενδυμασία, γάντια και συσκευή προστασίας ματιών/προσώπου. Το υλικό αυτό και ο περιέκτης του πρέπει να απορρίπτονται ως επικίνδυνα απόβλητα. Τα απόβλητα αυτού του υλικού θεωρούνται επικίνδυνα όξινα απόβλητα, ωστόσο, εάν επιτρέπεται από τους τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισμούς, ενδέχεται να εξουδετερωθούν σε ph 6-9 για την απόρριψή τους ως μη επικίνδυνα υλικά, εφόσον έχει προηγηθεί η κατάλληλη εκπαίδευση και υπάρχει ο κατάλληλος εξοπλισμός. Το 0,01% Thimerosal (μερθειολικό νάτριο), ένα οργανοϋδραργυρικό βιοκτόνο συντηρητικό με δράση στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), είναι μία τοξική για την αναπαραγωγή ουσία και σημαντικός ευαισθητοποιητής. Η παρατεταμένη ή επαναλαμβανόμενη έκθεση μπορεί να προκαλέσει αλλεργική αντίδραση σε ορισμένα ευαίσθητα άτομα. Έχουν αναφερθεί πολλές περιπτώσεις ευαισθητοποίησης ως αποτέλεσμα της έκθεσης σε αραιωμένα διαλύματα Thimerosal. Αποφεύγετε την ελευθέρωσή του στο περιβάλλον, κίνδυνος αθροιστικών επιδράσεων. Τα χρησιμοποιημένα διαλύματα που περιέχουν υδράργυρο σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 0,2 ppm πρέπει να απορρίπτονται ως επικίνδυνα απόβλητα, σύμφωνα με την ομοσπονδιακή νομοθετική πράξη RCRA των ΗΠΑ (D009), ωστόσο, η απόρριψη όλων των αποβλήτων θα πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τους τοπικούς, περιφερειακούς και εθνικούς κανονισμούς. (Σημείωση: ένα μόριο Thimerosal αποτελείται κατά 49,55% από υδράργυρο (Hg), κατά συνέπεια, ένα στοιχείο με 0,01% Thimerosal περιέχει ~0,005% (~50 ppm) υδράργυρο w/v). Σε περίπτωση επαφής με το δέρμα, ξεπλύντε αμέσως με άφθονο νερό. Προειδοποίηση: Στην Πολιτεία της Καλιφόρνια, το Thimerosal είναι γνωστό ότι προκαλεί τοξικότητα κατά την αναπαραγωγή. 13. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφάλειας Υλικού (MSDS) διατίθεται κατόπιν αιτήματος. 3

4 7 ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. ΚΑΤΕΨΥΓΜΕΝΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ ΠΟΥ ΑΠΟΘΗΚΕΥΤΗΚΑΝ ΥΠΟ ΑΓΝΩΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΕΝΔΕΧΕΤΑΙ ΝΑ ΔΩΣΟΥΝ ΨΕΥΔΗ ΘΕΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΛΟΓΩ ΤΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΑΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ ΚΑΙ/Ή ΒΑΚΤΗΡΙΑ. 2. Μην χρησιμοποιείτε το κιτ ή αντιδραστήρια του κιτ μετά το πέρας της αναγραφόμενης ημερομηνίας λήξης. 3. Εκτός από το Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (R2) και το Διάλυμα Αναστολής (R10), μην αναμιγνύετε αντιδραστήρια από άλλα κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας. 4. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. 5. Αναμίξτε καλά κατά την ανασύσταση των αντιδραστηρίων, δίνοντας ιδιαίτερη προσοχή ώστε να αποφευχθεί μικροβιακή μόλυνση. 6. Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης, που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυμική δραστηριότητα του συζεύκτη. 7. Χρησιμοποιείτε καθαρά, μίας χρήσης πλαστικά δοχεία πολυπροπυλενίου για να ετοιμάσετε το διάλυμα Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου. Εάν πρέπει να χρησιμοποιηθούν υλικά από γυαλί, θα πρέπει πρώτα να πλυθούν σε υδροχλωρικό οξύ 1Ν, να ξεπλυθούν με αποσταγμένο νερό και να στεγνώσουν. 8. Για χειροκίνητη μεταφορά με πιπέτα των ορών ελέγχου και των δειγμάτων, χρησιμοποιείτε ξεχωριστά ακροφύσια πιπέτας, για να αποφεύγετε την επιμόλυνση των δειγμάτων. 9. Για να εξασφαλίσετε επαρκές πλύσιμο των μικροβυθισμάτων, τηρήστε το συνιστώμενο αριθμό κύκλων πλύσης και βεβαιωθείτε ότι όλα τα μικροβυθίσματα είναι πλήρως γεμάτα και, στη συνέχεια, άδεια. Το πλύσιμο δεν πρέπει να εκτελείται χειροκίνητα με συμπιεζόμενη φιάλη. 10. Μην αφήνετε τη μικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστημα από το τέλος του κύκλου πλύσης και μέχρι την προσθήκη των αντιδραστηρίων. 11. Μη χρησιμοποιείτε το ίδιο δοχείο για τα διαλύματα συζεύκτη και υποστρώματος. 12. Μην αφήνετε τα διαλύματα Σύζευξης ή Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου να έλθουν σε επαφή με μέταλλο ή μεταλλικά ιόντα. 13. Αποφεύγετε την έκθεση του Χρωμογόνου ή του Διαλύματος Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου σε δυνατό φωτισμό κατά την αποθήκευση ή την επώαση. Μην αφήνετε τα διαλύματα χρωμογόνου να έλθουν σε επαφή με οξειδωτικό παράγοντα. 14. Αποφεύγετε την επαφή του Διαλύματος Αναστολής με οποιονδήποτε οξειδωτικό παράγοντα. Μην αφήνετε το Διάλυμα Αναστολής να έλθει σε επαφή με μέταλλο ή μεταλλικά ιόντα. 15. Χρησιμοποιείτε καθαρά υλικά, χωρίς σκόνη (σωλήνες, ακροφύσια, δοχεία, κλπ.) για να ελαχιστοποιήσετε την πιθανότητα μόλυνσης με σπόρους Ασπεργίλλου από το περιβάλλον. Επειδή το galactomannan είναι σταθερό στη θερμότητα, η αποστείρωση των υλικών που χρησιμοποιούνται δεν εγγυάται την απουσία του μολυσματικού αντιγόνου. Τα μη πυρετογόνα υλικά είναι τα βέλτιστα, αλλά με επαρκείς προφυλάξεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν τυπικά υλικά. 16. Περιορίστε την έκθεση των διαλυμάτων (ορός, διάλυμα επεξεργασίας, διάλυμα σύζευξης ) ή ανοικτών δοχείων (πλάκες, σωλήνες, πιπέτες) στον αέρα. 17. Μην επιστρέφετε το συζεύκτη που δεν χρησιμοποιήθηκε στο αρχικό δοχείο. 18. Το Διάλυμα Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου πρέπει να είναι άχρωμο. Η εμφάνιση ενός μπλε χρώματος μετά από την αραίωση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο είναι μολυσμένο και δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί. Απορρίψτε το και ετοιμάστε νέο αντιδραστήριο. 8 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟΥ Πλάκα λωρίδων με μικροβυθίσματα (R1) Αφού ανοιχθεί το σακουλάκι της πλάκας, οι λωρίδες με μικροβυθίσματα είναι σταθερές για 5 εβδομάδες στους +2-8 C στην αρχική τους σακούλα, προσεκτικά κλεισμένη και με αποξηραντικό. Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (R2) Ετοιμάστε το Διάλυμα Πλύσης Εργασίας όπως απαιτείται προσθέτοντας ένα μέρος Συμπυκνωμένου Διαλύματος Πλύσης σε 9 μέρη αποστειρωμένου απιονισμένου ή αποσταγμένου νερού. Το Διάλυμα Πλύσης Εργασίας μπορεί να αποθηκευτεί για 14 ημέρες στους 2-8 C. Ετοιμάστε επαρκή ποσότητα Διαλύματος Πλύσης Εργασίας για να ολοκληρώσετε την ανάλυση (80 ml για μία λωρίδα: 8 ml R ml αποσταγμένο νερό). Μετά από το άνοιγμα, το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης αποθηκεύεται στους C, όπου αν δεν υπάρξει μόλυνση, είναι σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. 4

5 Αρνητικός Ορός Ελέγχου (R3) Ανασυστήστε τα περιεχόμενα μίας φιάλης ορού ελέγχου με 1000 µl (1 ml) αποστειρωμένου, καθαρού νερού (κατά προτίμηση νερό χωρίς πυρετογόνο). Οι οροί πρέπει να επανενυδατωθούν ακριβώς πριν από την εκτέλεση της εξέτασης. Αναμίξτε καλά, αφού αφήσετε 2-3 λεπτά για την επανενυδάτωση του ορού. Κλάσμα δείγματος 300 µl σε καθένα από τα 3 σωληνάρια πολυπροπυλενίου μικροφυγόκεντρου. Καταψύξτε αμέσως στους -20 C κάθε υπολειπόμενο σωληνάριο πολυπροπυλενίου μικροφυγόκεντρου που δεν θα χρησιμοποιηθεί μετά την επανενυδάτωση. Σημείωση: Οροί ελέγχου που έχουν επανενυδατωθεί πρόσφατα και καταψύχθηκαν αμέσως στους -20 C μπορούν να αποψυχθούν και να χρησιμοποιηθούν χωρίς περαιτέρω επανενυδάτωση. Οι κατεψυγμένοι επανενυδατωμένοι οροί ελέγχου μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C μέχρι πέντε εβδομάδες. Χειριστείτε τους ορούς ελέγχου με τον ίδιο τρόπο όπως τα δείγματα ασθενών (300µL ορού + 100µL διάλυμα επεξεργασίας, κλπ...). Ορός Ελέγχου Αναφοράς (R4) και Θετικός Ορός Ελέγχου (R5) Προετοιμάστε όπως περιγράφηκε παραπάνω για τον Αρνητικό Ορό Ελέγχου. Διάλυμα Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου (R8 + R9) Προετοιμάστε το Διάλυμα Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου προσθέτοντας ένα μέρος Συμπυκνωμένο Διάλυμα Χρωμογόνου ΤΜΒ, R9 σε 50 μέρη Ρυθμιστικού Διαλύματος Υποστρώματος ΤΜΒ, R8. Ετοιμάστε 2 ml Διαλύματος Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου για κάθε λωρίδα: 40 µl του R9 + 2 ml του R8. Το διάλυμα είναι σταθερό για 6 ώρες όταν αποθηκευτεί σε σκοτεινό μέρος και σε θερμοκρασία δωματίου ( C). Μετά από το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια R8 και R9 αποθηκεύονται στους +2-8 C, όπου εάν δεν υπάρξει μόλυνση, είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Συζεύκτης (R6), Διάλυμα Επεξεργασίας Ορού (R7) και Διάλυμα Αναστολής (R10) Μετά από το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια R6, R7 και R10 αποθηκεύονται στους +2-8 C, όπου αν δεν υπάρξει μόλυνση, είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που υποδεικνύεται στην ετικέτα. 9 ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Συλλέξτε δείγματα αίματος σύμφωνα με τις τυπικές εργαστηριακές διαδικασίες. Η εξέταση εκτελείται σε ορό. Τα δείγματα ορού πρέπει να μην είναι μολυσμένα από σπόρους μυκήτων και/ή βακτήρια. Μεταφέρετε και αποθηκεύετε τα δείγματα σε σφραγισμένα σωληνάρια, που δεν εκθέτονται στον αέρα. Δείγματα που δεν ανοίχθηκαν μπορούν να αποθηκευτούν στους 2-8 C έως και για 5 ημέρες πριν από την εξέταση. Μετά από το αρχικό άνοιγμα, τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στους 2-8 C για 48 ώρες πριν από την εξέταση. Για μακρόχρονη αποθήκευση, αποθηκεύστε τον ορό τους -70 C. Τα δείγματα ορού μπορούν να υποβληθούν το ανώτερο σε 4 κύκλους ψύξης / απόψυξης. Πρόσφατα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιγνύονται καλά μετά από την απόψυξή τους πριν από την εξέταση. Τα αποτελέσματα δεν επηρεάζονται από δείγματα που περιέχουν 20mg/L χολερυθρίνης, λιπαιμικά δείγματα που περιέχουν 2g/L τριολεΐνης (τριγλυκερίδιο) ή από αιμολυμένα δείγματα που περιέχουν 165 mg/l αιμοσφαιρίνης. Παρεμβολές που σχετίζονται με πλεόνασμα λευκωματίνης δεν έχουν εξεταστεί. Μην αποσυνθέτετε τον ορό. 10 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Παρεχόμενα υλικά Βλ. την ενότητα ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ. Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται 1. Αποστειρωμένο αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό, για αραίωση του Διαλύματος Πλύσης. 2. Αποστειρωμένο κεκαθαρμένο νερό για ανασύσταση των ορών ελέγχου. 3. Απορροφητικό χαρτί. 4. Γάντια μίας χρήσης. 5. Προστατευτικά γυαλιά. 6. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διττανθρακικό νάτριο. 7. Πιπέτες ή πολλαπλές πιπέτες ρυθμιζόμενες ή σταθερές, για να μετρούν και να διοχετεύουν 50 µl, 100 µl, 300 µl, και 1000 µl. 8. Σωληνάρια πολυπροπυλενίου μικροφυγόκεντρου 1,5mL με αεροστεγή πώματα, που έχουν τη δυνατότητα να αντέχουν σε θερμοκρασία 120 C (θερμαντική συσκευή) ή 100 C (βραστό υδατόλουτρο). α. Σωληνάρια με βιδωτά καπάκια: Κωνικά σωληνάρια 1,5 ml, Bio-Rad Αρ. Κατ ή αντίστοιχα. β. Σωληνάρια με κουμπωτά καπάκια: Μικροσωληνάρια Εξέτασης EZ, 1,5 ml, Bio-Rad Αρ. Κατ ή αντίστοιχα. 5

6 9. Καπάκια ασφαλείας μικροσωληναρίων (VWR Αρ. Κατ ή αντίστοιχα). Αυτές οι ασφάλειες σφραγίζουν καλά τα σωληνάρια με κουμπωτά καπάκια, εμποδίζοντάς τα να ανοίξουν κατά τις μεταβολές θερμοκρασίας και πίεσης και επίσης επιτρέπουν στα σωληνάρια να ανασηκώνονται εύκολα από τη θερμαντική συσκευή ή το βραστό υδατόλουτρο. 10. Επιτραπέζια φυγόκεντρος εργαστηρίου για σωληνάρια πολυπροπυλενίου με χωρητικότητα g. 11. Στρογγυλή, αφαιρούμενη υποδοχή μικροφυγοκέντρου για ποτήρι ζέσης 1 L. 12. Αναδευτήρας τύπου Vortex. 13. Θερμαντική συσκευή. Συστήνονται τα παρακάτω μοντέλα θερμαντικής συσκευής: α. μοντέλο συσκευής 1 μονάδας: Grant Αρ. Κατ. QBD1 (VWR Αρ. Κατ. # ) β. μοντέλο συσκευής 2 μονάδων: Grant Αρ. Κατ. QBD2 (VWR Αρ. Κατ. # ) 14. Μονάδα για θερμαντική συσκευή: και οι δύο θερμαντικές μονάδες πρέπει να χρησιμοποιούνται με τη συσκευή Grant Αρ. Κατ. QB-E1 (VWR Αρ. Κατ. # ) 15. Βραστό υδατόλουτρο στους 100 C 16. Επωαστής μικροπλάκας στους 37 ± 1 C. 17. Ημιαυτόματη ή αυτόματη συσκευή πλύσης μικροπλάκας. 18. Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με φίλτρα 450 και 620 nm. Παρατηρήσεις Διαδικασίας Οι Αρνητικοί, Θετικοί και οι Οροί Ελέγχου Αναφοράς πρέπει να εξετάζονται σε κάθε ανάλυση, προκειμένου να εξασφαλίζεται η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων της εξέτασης. Επεξεργασία των ορών Όλοι οι οροί ελέγχου: αρνητικοί(r3), αναφοράς(r4) και θετικοί(r5) πρέπει να επεξεργάζονται συγχρόνως με τα δείγματα εξέτασης: 1. Διοχετεύστε με πιπέτα 300 µl κάθε ορού της εξέτασης και ορού ελέγχου σε χωριστά σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml. 2. Προσθέστε 100 µl Διαλύματος Επεξεργασίας Ορού (R7) σε κάθε σωληνάριο. 3. Αναμίξτε τα σωληνάρια σχολαστικά με έντονη ανάμιξη ή στροβιλισμό για να αναμιχθούν καλά. Κλείστε σφιχτά το σωληνάρια για να αποφευχθεί το άνοιγμα κατά τη θέρμανση, για τα σωληνάρια με κουμπωτό καπάκι: χρησιμοποιήστε ασφάλεια καπακιού. Μην τρυπάτε το πώμα. 4. Θερμαντική πλάκα: Θερμάνετε τα σωληνάρια για 6 λεπτά στη θερμαντική συσκευή στους 120 o C. Τα σωληνάρια πρέπει να τοποθετηθούν μέσα στη συσκευή μόνο όταν επιτευχθεί η καθορισμένη θερμοκρασία.(*) Ή Υδατόλουτρο: Εάν χρησιμοποιείτε βραστό υδατόλουτρο: θερμάνετε τα σωληνάρια για 3 λεπτά στους 100 o C. (*) 5. Απομακρύνετε προσεκτικά τα καυτά σωληνάρια από τη θερμαντική συσκευή ή το βραστό υδατόλουτρο και τοποθετήστε τα σε φυγόκεντρο. Φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια στα x g για 10 λεπτά. 6. Το υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιείται για ανίχνευση του αντιγόνου galactomannan. 7. Ελέγξτε τα υπερκείμενα υγρά ακολουθώντας την παρακάτω διαδικασία. Μετά από την προετοιμασία, το υπερκείμενο υγρό μπορεί να αφαιρεθεί και να αποθηκευτεί στους 2-8 C έως και 48 ώρες πριν από την εξέταση. Εάν η ανάλυση των αποτελεσμάτων υποδεικνύει ότι απαιτείται επανεξέταση, πρέπει να υποβληθεί σε επεξεργασία άλλο κλάσμα ορού. (*) Η αυστηρή τήρηση της συνιστώμενης θερμοκρασίας και του συνιστώμενου χρόνου εξαγωγής αποτελεσμάτων καθώς και η χρήση του συνιστώμενου υλικού είναι βασικές για την επιτυχία της εξέτασης. Μην εμπιστεύεστε τη θερμοκρασία που δείχνει η συσκευή, παρακαλούμε ελέγξτε αν η θερμοκρασία συμφωνεί με τις προδιαγραφές χρησιμοποιώντας βαθμονομημένο θερμόμετρο, το οποίο προσαρμόζεται σε σωλήνα που περιέχει ορυκτέλαιο: σε μια θερμαντική συσκευή, η θερμοκρασία στο εσωτερικό του σωλήνα πρέπει να ανέλθει στους 120 C και σε νερό υδατόλουτρου που βράζει στους 100 C. Διαδικασία Ανοσοενζυμικής Ανάλυσης (ΕΙΑ) Τηρείτε αυστηρά το προτεινόμενο πρωτόκολλο. Τηρήστε την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. 1. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου (18-25 C) για 15 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. 2. Ετοιμάστε το Διάλυμα Πλύσης, το Διάλυμα Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου και τους Αρνητικούς, Θετικούς και τους Ορούς Ελέγχου Αναφοράς. 3. Ετοιμάστε έναν πίνακα για ταυτοποίηση των ορών εξέτασης και ελέγχου στη μικροπλάκα. Χρησιμοποιήστε ένα μικροβύθισμα για τον Αρνητικό Ορό Ελέγχου (R3), δύο μικροβυθίσματα για τον Ορό Ελέγχου Αναφοράς (R4) και ένα μικροβύθισμα για το Θετικό Ορό Ελέγχου (R5). 4. Αφαιρέστε τη βάση της πλάκας και τις λωρίδες μικροβυθίσματος (R1) από το σακουλάκι της πλάκας. Επανατοποθετήστε τις λωρίδες που δεν θα χρησιμοποιηθούν στο σακουλάκι, με το αποξηραντικό και επανασφραγίστε το σακουλάκι. 6

7 5. Αναμίξτε τα περιεχόμενα της φιάλης Σύζευξης Συζεύκτη (R6) αναστρέφοντας πριν από τη χρήση. Προσθέστε 50 µl Συζεύκτη (R6) σε κάθε μικροβύθισμα. Έπειτα, προσθέστε 50 µl υπερκείμενου υγρού επεξεργασμένου ορού σε κάθε μικροβύθισμα, όπως καθορίστηκε παραπάνω. Μην προσθέτετε δείγματα ορού στα μικροβυθίσματα πριν από το συζεύκτη. 6. Καλύψτε την πλάκα με αυτοκόλλητη ταινία ή άλλα μέσα για να εμποδίσετε την εξάτμιση, διασφαλίζοντας ότι ολόκληρη η επιφάνεια είναι καλυμμένη και υδατοστεγής. 7. Επωάστε τη μικροπλάκα σε ξηρό επωαστή μικροπλάκας για 90 ± 5 λεπτά στους 37 C (± 1 C). 8. Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη ταινία. Αναρροφήστε τα περιεχόμενα όλων των μικροβυθισμάτων σε ένα δοχείο αποβλήτων (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε την πλάκα 6 φορές, χρησιμοποιώντας τουλάχιστον 370 µl Διαλύματος Πλύσης Εργασίας. Μετά από την τελευταία πλύση, αναστρέψτε τη μικροπλάκα και σκουπίστε απαλά με απορροφητικό χαρτί για να αφαιρεθεί το υγρό που απέμεινε. 9. Προσθέστε γρήγορα 200 µl Διαλύματος Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου (R8 + R9) σε κάθε μικροβύθισμα, αποφεύγοντας την έκθεση σε δυνατό φως. 10. Αφήστε τη μικροπλάκα να επωαστεί σε σκοτεινό μέρος σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 25 C) για 30 ± 5 λεπτά. Μη χρησιμοποιείτε αυτοκόλλητη ταινία κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης. 11. Προσθέστε 100 µl Διαλύματος Αναστολής (R10) σε κάθε μικροβύθισμα, χρησιμοποιώντας την ίδια σειρά για την προσθήκη Διαλύματος Υποστρώματος. Αναμίξτε καλά. 12. Σκουπίστε καλά το κάτω μέρος κάθε πλάκας. 13. Διαβάστε την ένδειξη οπτικής πυκνότητας κάθε μικροβυθίσματος στα 450 nm (φίλτρο αναφοράς 620 nm). Οι μικροπλάκες πρέπει να διαβαστούν εντός 30 λεπτών από την προσθήκη του Διαλύματος Αναστολής. 11 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑΣ) Ορός Ελέγχου Αναφοράς: Η οπτική πυκνότητα (O.D.) κάθε Ορού Ελέγχου Αναφοράς πρέπει να είναι 0,300 και 0,800 Θετικός Ορός Ελέγχου: Ο δείκτης του Θετικού Ορού Ελέγχου πρέπει να είναι μεγαλύτερος από 2,00. Οπτική Πυκνότητα (OD) Θετικός Ορός Ελέγχου (R5) I = > 2,00 Μέση Οπτική Πυκνότητα Ορού Ελέγχου Αναφοράς Αρνητικός Ορός Ελέγχου: Ο δείκτης του Αρνητικού Ορού Ελέγχου πρέπει να είναι μικρότερος από 0,40. Οπτική Πυκνότητα (OD) Αρνητικός Ορός Ελέγχου (R3) I = < 0,40 Μέση Οπτική Πυκνότητα Ορού Ελέγχου Αναφοράς Η αποτυχία οποιουδήποτε από τους ορούς ελέγχου να ανταποκριθεί στα κριτήρια εγκυρότητας που περιγράφηκαν παραπάνω, καθιστά την ανάλυση άκυρη και τα αποτελέσματα του δείγματος ασθενή δεν πρέπει να αναφερθούν. Ο χειριστής μπορεί να αποφασίσει αν θα επαναλάβει την ανάλυση, αφού επανεξετάσει τη διαδικασία ή αν θα επικοινωνήσει με τον κατασκευαστή για βοήθεια. Εάν εκτελεστεί επαναληπτική ανάλυση, τότε στην επαναληπτική ανάλυση πρέπει να χρησιμοποιηθεί ένα νέο κλάσμα του ίδιου δείγματος. Παράδειγμα Υπολογισμού: Δείγμα Απορρόφηση (OD) Αρνητικός Ορός Ελέγχου (R3) OD 0,117 Ορός Ελέγχου Αναφοράς (R4) OD 0,596 0,576 Θετικός Ορός Ελέγχου (R5) OD 2,602 Υπολογισμοί Μέση Τιμή Ορού Ελέγχου Αναφοράς Για να υπολογίσετε τη μέση τιμή Οπτικής Πυκνότητας Ορού Ελέγχου Αναφοράς (R4), προσθέστε τις τιμές οπτικής πυκνότητας για κάθε αντίγραφο Ορού Ελέγχου Αναφοράς και διαιρέστε το αποτέλεσμα δια 2: (0, ,576) 2 = 0,586 Δείκτης Αρνητικού Ορού Ελέγχου Για να υπολογίσετε το δείκτη του Αρνητικού Ορού Ελέγχου, διαιρέστε την οπτική πυκνότητα του Αρνητικού Ορού Ελέγχου με τη μέση τιμή της οπτικής πυκνότητας του Ορού Ελέγχου Αναφοράς: 0,117 I = 0,586 = 0,20 7

8 Δείκτης Θετικού Ορού Ελέγχου Για να υπολογίσετε το δείκτη του Θετικού Ορού Ελέγχου, διαιρέστε την οπτική πυκνότητα του Θετικού Ορού Ελέγχου με τη μέση οπτική πυκνότητα του Ορού Ελέγχου Αναφοράς: 2,602 I = 0,586 = 4,44 Εγκυρότητα Στο παραπάνω παράδειγμα: Η οπτική πυκνότητα (OD) κάθε Ορού Ελέγχου Αναφοράς είναι 0,300 και 0,800, υποδεικνύοντας ότι ο Ορός Ελέγχου Αναφοράς είναι έγκυρος. Ο δείκτης του Αρνητικού Ορού Ελέγχου είναι < 0,40, υποδεικνύοντας ότι ο Αρνητικός Ορός Ελέγχου είναι έγκυρος. Ο δείκτης του Θετικού Ορού Ελέγχου είναι > 2,00, υποδεικνύοντας ότι ο Θετικός Ορός Ελέγχου είναι έγκυρος. Η ανάλυση εξέτασης σε αυτό το παράδειγμα θεωρείται έγκυρη εφόσον τα αποτελέσματα πληρούν τα κριτήρια εγκυρότητας για κάθε ορό ελέγχου. 12 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η παρουσία ή η απουσία του αντιγόνου galactomannan στο δείγμα εξέτασης προσδιορίζεται με τον υπολογισμό ενός δείκτη για το κάθε δείγμα ασθενή. Ο Δείκτης (I), είναι η τιμή οπτικής πυκνότητας του δείγματος διαιρεμένη με τη μέση οπτική πυκνότητα των μικροβυθισμάτων που περιέχουν Ορό Ελέγχου Αναφοράς. Υπολογισμός της μέσης οπτικής πυκνότητας Ορού Ελέγχου Αναφοράς: Προσθέστε τις οπτικές πυκνότητες των δύο μικροβυθισμάτων που περιέχουν Ορό Ελέγχου Αναφοράς (R4) και διαιρέστε το σύνολο με 2. Υπολογισμός δείκτη (Ι) για κάθε ορό εξέτασης: Υπολογίστε τον παρακάτω λόγο για κάθε ορό εξέτασης: Οπτική Πυκνότητα Δείγματος I = Μέση Οπτική Πυκνότητα Ορού Ελέγχου Αναφοράς Οροί με δείκτη < 0,50 θεωρούνται αρνητικοί για αντιγόνο galactomannan. Σημείωση: Ένα αρνητικό αποτέλεσμα είναι πιθανόν να υποδεικνύει ότι το αποτέλεσμα του ασθενή είναι κάτω από το ανιχνεύσιμο επίπεδο της ανάλυσης. Σημείωση: Τα αρνητικά αποτελέσματα δεν αποκλείουν τη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. Εάν το αποτέλεσμα είναι αρνητικό, συνιστάται επανάληψη της εξέτασης, ενώ υπάρχει υποψία για τη νόσο. Οροί με δείκτη 0,50 θεωρούνται θετικοί για αντιγόνο galactomannan. Για όλους τους θετικούς ασθενείς συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης σε υποπολλαπλάσιο μέρος του ιδίου δείγματος, καθώς και η συλλογή νέου δείγματος από τον ασθενή για τη διενέργεια εξετάσεων παρακολούθησης. Σημείωση: μία τιμή απορρόφησης μικρότερη από 0,000 μπορεί να αποτελεί ένδειξη διαδικαστικού σφάλματος ή σφάλματος οργάνου μέτρησης, το οποίο θα πρέπει να αξιολογηθεί. Αυτό το αποτέλεσμα θεωρείται άκυρο και το δείγμα πρέπει να επανεξεταστεί. Συνιστάται ο τακτικός προληπτικός έλεγχος (screening) (δις εβδομαδιαίως) των ασθενών υψηλού κινδύνου για την αύξηση της ευαισθησίας και της πρώιμης θετικότητας της εξέτασης. Σημείωση: η δοκιμασία Platelia Aspergillus EIA προορίζεται για χρήση ως διαγνωστικό βοήθημα στη διάγνωση της εν τω βάθει ασπεργίλλωσης. Τα θετικά αποτελέσματα που λαμβάνονται μέσω της δοκιμασίας Platelia Aspergillus EIA θα πρέπει να εξετάζονται σε συνδυασμό και με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες, όπως η μικροβιολογική καλλιέργεια, η ιστολογική εξέταση των δειγμάτων βιοψίας και οι ακτινογραφικές ενδείξεις. Παράδειγμα Υπολογισμού: Δείγμα Απορρόφηση (OD) Οπτική Πυκνότητα Αρνητικού Ορού Ελέγχου (R3) 0,117 Οπτική Πυκνότητα Ορού Ελέγχου Αναφοράς (R4) 0,596 0,576 Οπτική Πυκνότητα Θετικού Ορού Ελέγχου (R5) 2,602 Δείγμα Ασθενή Αρ. 1 0,134 Δείγμα Ασθενή Αρ. 2 0,436 Δείγμα Ασθενή Αρ. 3 1,196 Υπολογισμοί Ανατρέξτε στην ενότητα Ποιοτικός Έλεγχος (Κριτήρια Εγκυρότητας) για το παράδειγμα υπολογισμών που προσδιορίζουν την εγκυρότητα των ορών ελέγχου της ανάλυσης. 8

9 Μέση Τιμή Ορού Ελέγχου Αναφοράς Για να υπολογίσετε τη μέση τιμή Οπτικής Πυκνότητας Ορού Ελέγχου Αναφοράς (R4), προσθέστε τις τιμές οπτικής πυκνότητας για κάθε αντίγραφο Ορού Ελέγχου Αναφοράς και διαιρέστε το αποτέλεσμα δια 2: (0, ,576) 2 = 0,586 Δείγμα Ασθενή Αρ. 1 Για να υπολογίσετε το δείκτη του Δείγματος Ασθενή αρ. 1, διαιρέστε την οπτική πυκνότητα του Δείγματος Ασθενή αρ. 1 με τη μέση οπτική πυκνότητα του Ορού Ελέγχου Αναφοράς: 0,134 I = 0,586 = 0,23 Στο παράδειγμα αυτό, το Δείγμα Ασθενή αρ. 1 είναι αρνητικό εφόσον ο Δείκτης 0,23 είναι < 0,50. Δείγμα Ασθενή Αρ. 2 Για να υπολογίσετε το δείκτη του Δείγματος Ασθενή αρ. 2, διαιρέστε την οπτική πυκνότητα του Δείγματος Ασθενή αρ. 2 με τη μέση οπτική πυκνότητα του Ορού Ελέγχου Αναφοράς: 0,436 I = 0,586 = 0,74 Στο παράδειγμα αυτό, το Δείγμα Ασθενή αρ. 2 είναι θετικό εφόσον ο Δείκτης 0,74 είναι 0,50. Δείγμα Ασθενή Αρ. 3 Για να υπολογίσετε το δείκτη του Δείγματος Ασθενή αρ. 3, διαιρέστε την οπτική πυκνότητα του Δείγματος Ασθενή αρ. 3 με τη μέση οπτική πυκνότητα του Ορού Ελέγχου Αναφοράς: 1,196 I = 0,586 = 2,04 Στο παράδειγμα αυτό, το Δείγμα Ασθενή αρ. 3 είναι θετικό εφόσον ο Δείκτης 2,04 είναι 0, ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Μία εξέταση με αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει τη διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. Ασθενείς με κίνδυνο εμφάνισης Διηθητικής Ασπεργίλλωσης πρέπει να εξετάζονται δύο φορές την εβδομάδα. 2. Η διαδικασία και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων της Ανάλυσης Platelia Aspergillus πρέπει να τηρούνται κατά την εξέταση των δειγμάτων για την παρουσία αντιγόνου galactomannan. Σε κάθε χρήστη αυτού του κιτ συνιστάται η προσεκτική ανάγνωση του ένθετου συσκευασίας πριν από την εκτέλεση της εξέτασης. Συγκεκριμένα, η διαδικασία εξέτασης πρέπει να τηρείται προσεκτικά για τη μεταφορά δειγμάτων και αντιδραστηρίων με πιπέτα, για την πλύση πλάκας και για το χρονισμό των βημάτων επώασης. 3. Η αποτυχία προσθήκης των δειγμάτων ή των αντιδραστηρίων σύμφωνα με τις οδηγίες που περιγράφονται στη διαδικασία ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Η επαναληπτική εξέταση πρόσθετων δειγμάτων πρέπει να υπολογίζεται όπου υπάρχει κλινική υποψία Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ή σφάλματος διαδικασίας. 4. Η μόλυνση μικροβυθισμάτων αρνητικού δείγματος ασθενή με θετικό ορό ελέγχου/μικροβυθίσματα δείγματος ασθενή είναι πιθανή, αν τα περιεχόμενα ενός μικροβυθίσματος διαρρεύσουν σε άλλο μικροβύθισμα λόγω αμελούς χειρισμού της μικροπλάκας ή κακής τεχνικής μεταφοράς με πιπέτα κατά την προσθήκη αντιδραστηρίων. 5. Η απόδοση της Platelia Aspergillus EIA δεν έχει αξιολογηθεί με δείγματα ορού παιδιατρικής ή νεογνών. 6. Η Platelia Aspergillus EIA μπορεί να επιδεικνύει μειωμένη ανίχνευση galactomannan σε ασθενείς με χρόνια κοκκιωματώδη νόσο (CGD) και σύνδρομο Job s 36, Η συνακόλουθη χρήση αντιμυκητισιακής θεραπείας δραστικής κατά της μούχλας σε μερικούς ασθενείς με Διηθητική Ασπεργίλλωση μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη ευαισθησία στην Platelia Aspergillus EIA Η Platelia Aspergillus EIA δεν έχει αξιολογηθεί για χρήση με πλάσμα ή άλλους τύπους δείγματος όπως ουρία, βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) ή ΕΝΥ (εγκεφαλονωτιαίο υγρό). 9. Η απόδοση της Platelia Aspergillus EIA δεν έχει αξιολογηθεί για χειροκίνητη ανάλυση και/ή οπτικό προσδιορισμό αποτελέσματος. 10. Άλλα γένη μυκήτων, όπως τα Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum και Histoplasma έχει διαπιστωθεί ότι αντιδρούν με τα μονοκλωνικά αντισώματα EBA-2 των ποντικών, τα οποία χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση γαλακτομαννάνης ασπεργίλλων. Η ιστοπλάσμωση θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σε ενδημικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένων και περιοχών των Ηνωμένων Πολιτειών 23, 32, 38. 9

10 11. Θετικές αντιδράσεις χωρίς κλινικές ενδείξεις: Λαμβάνοντας υπόψη την πρόωρη ανίχνευση του αντιγόνου galactomannan στον ορό ακόμη πριν και από την εμφάνιση κλινικών και/ή ακτινολογικών στοιχείων, συνήθως παρατηρούνται θετικές αντιδράσεις χωρίς κλινικές ενδείξεις: αντιστοιχούν σε «αληθώς θετικές» εξετάσεις σε ασθενείς για τους οποίους έγινε αργότερα Αποδεδειγμένη ή Πιθανή διάγνωση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης. Ωστόσο, σε κάποιες ειδικές περιπτώσεις, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη μερικοί παράγοντες κατά την ερμηνεία της εξέτασης: α. Έχουν αναφερθεί θετικές αντιδράσεις χωρίς κλινικές ενδείξεις, ειδικά σε νέα παιδιά 26. Αν και μερικές από τις περιπτώσεις αυτές θα μπορούσαν να συσχετιστούν με πραγματική κυκλοφορία αντιγόνων Ασπεργίλλου 5, οι περισσότερες περιπτώσεις μπορούν να θεωρηθούν ψευδείς θετικές. β. Η λακτοφουρανόζη έχει αποδειχθεί σε διάφορες τροφές, ιδιαίτερα στα δημητριακά, προϊόντα δημητριακών και επιδόρπια κρέμας 1,17. Αντίθετα με το ανθρώπινο γάλα, τα ανθρώπεια γάλατα συχνά περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις galactomannan 10. Για το λόγο αυτό θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ο διαιτητικός παράγοντας στην ερμηνεία της πορείας της αντιγοναιμίας σε νέα παιδιά και γενικότερα σε όλους τους ασθενείς με μεταβολή της εντερικής φραγής 4, 10. Κάθε περιστατικό θετικό σε αντιγοναιμία που δεν συνοδεύεται από κλινικές ενδείξεις, πρέπει να ερμηνεύεται ακόμη πιο προσεκτικά σε αυτό τον πληθυσμό ασθενών 17. γ. Υπήρξαν αναφορές θετικών αποτελεσμάτων στην εξέταση για galactomannan σε ασθενείς που παίρνουν πιπερακιλίνη/ταζομπακτάμη. Επίσης υπάρχουν αναφορές συγκεκριμένων παρτίδων πιπερακιλίνης/ταζομπακτάμης που έχουν βρεθεί θετικές για αντιγόνο galactomannan. Συνεπώς, τα θετικά αποτελέσματα της εξέτασης σε ασθενείς που λαμβάνουν πιπερακιλίνη / ταζομπακτάμη θα πρέπει να ερμηνευτούν προσεκτικά και να επιβεβαιωθούν με άλλες διαγνωστικές μεθόδους. Ανίχνευση galactomannan έχει αναφερθεί σε ορισμένες παρτίδες αμοξυκιλλίνης που συνδέονται με παρεντερικά σκευάσματα κλαβουλανικού οξέος. Για το λόγο αυτό, θεραπείες με ημισυνθετική β- λακτάμη πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ερμηνεία της εξέτασης 1, 21. Παρόλα αυτά, καθώς Platelia Aspergillus EIA μπορεί να ανιχνεύσει το αντιγόνο galactomannan πριν εμφανιστούν κλινικές ή ακτινολογικές ενδείξεις, η εμφάνιση Διηθητικής Ασπεργίλλωσης δεν μπορεί να αποκλειστεί. Συνεπώς, οι ασθενείς που δέχονται αγωγή με πιπερακιλίνη/ ταζομπακτάμη με θετικά αποτελέσματα εξέτασης, πρέπει να παρακολουθούνται προσεκτικά. δ. Ενδέχεται να παρατηρηθούν θετικές αντιδράσεις απουσία κλινικών σημείων σε ασθενείς που λαμβάνουν, είτε παρεντερικά, είτε από το στόμα (παρουσία αλλοίωσης στον εντερικό φραγμό) σκευάσματα που περιέχουν γαλακτομαννάνη. Η παρουσία της γαλακτομαννάνης σε αυτά τα σκευάσματα σε πολλές περιπτώσεις μπορεί να εξηγηθεί από τη χρήση διαδικασίας ζύμωσης με βάση μυκητιακούς μικροοργανισμούς. Ωστόσο, δεν αναμένεται να παρατηρηθεί θετικό αποτέλεσμα στον ασθενή, εκτός εάν η συγκέντρωση ορού της εξωγενούς γαλακτομαννάνης φτάσει ή υπερβεί το όριο ανίχνευσης της δοκιμασίας. Συνεπώς, σε περίπτωση ύποπτου θετικού αποτελέσματος απουσία άλλων ενδεικτικών σημείων, συνιστάται ο έλεγχος των σκευασμάτων που λαμβάνει ο ασθενής, με έμφαση στις διαδικασίες παρασκευής τους και στην προέλευση των πρώτων υλών που χρησιμοποιήθηκαν 11, 24, ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ Η αναμενόμενη συχνότητα εμφάνισης της Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ποικίλλει ανάλογα με τον πληθυσμό ασθενών. Έχουν αναφερθεί τιμές από 5-20% 7, 13. Διεξήχθη μία κλινική μελέτη σε σύνολο 4873 δειγμάτων ορού από 239 επισόδεια (203 ασθενείς) με αιματολογική κακοήθεια ή διάγνωση μοσχεύματος μητρικών αιμοποιητικών κυττάρων, με ή χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση, σε δύο κέντρα εξέτασης στην Ευρώπη για να προσδιοριστούν τα χαρακτηριστικά απόδοσης της Platelia Aspergillus EIA. Καθώς ο ασθενής μπορούσε να συμπεριληφθεί στη μελέτη σε περισσότερες από μία περιπτώσεις, η ανάλυση εκτελέστηκε σύμφωνα με τα επειδόσια ανά θεραπεία. Επεισόδιο θεωρείται η χρονική περίοδος που περιβάλλει το κλινικό συμβάν (π.χ. Μεταμόσχευση, Νόσος μοσχεύματος κατά ξενιστή (GVHD) κλπ.). Ως αποτέλεσμα, ενδέχεται να παρατηρηθούν για έναν ασθενή περισσότερα από ένα επεισόδια. Ο μέσος όρος συχνότητας της νόσου για τη μελέτη αυτή ήταν 16% (38/239). Η κατανομή των τιμών δείκτη για τους πληθυσμούς αυτούς απεικονίζεται στους παρακάτω πίνακες. 10

11 Ασθενείς που διαγνώσθηκαν χωρίς Διηθητική Ασπεργίλλωση (πληθυσμός ελέγχου) Συνολικά 3691 δείγματα ορού που λήφθηκαν από 201 επεισόδια (168 ασθενείς) σε δύο κέντρα εξέτασης στην Ευρώπη εξετάστηκαν με την Platelia Aspergillus EIA. Η κατανομή των τιμών δείκτη απεικονίζεται στον παρακάτω πίνακα. Kατανομή των τιμών δείκτη ορού από τον πληθυσμό ασθενών ελέγχου N= Αριθμός ορών >1.5 Δείκτης Αυτό το σκεδαστικό διάγραμμα απεικονίζει τα αποτελέσματα της ανάλυσης για galactomannan σε 3691 δείγματα ορού από 201 επεισόδια (168 ασθενείς ελέγχου) σε αυτή τη μελέτη (ασθενείς που υποβάλλονται σε ανοσοκατασταλτική θεραπεία για μεταμόσχευση μητρικών αιμοποιητικών κυττάρων (HSCT) ή θεραπευτική αγωγή για αιματολογική κακοήθεια). ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ: ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΔΕΙΚΤΗ / ΕΠΕΙΣΟΔΙΩΝ (Ν= 201 επισόδεια από 168 ασθενείς) 2 1,5 Δείκτης 1 0, Αριθμός επισοδείων 11

12 Ασθενείς που διαγνώσθηκαν με Διηθητική Ασπεργίλλωση Αυτό το σκεδαστικό διάγραμμα απεικονίζει τα αποτελέσματα της ανάλυσης για galactomannan σε 1182 δείγματα ορού από 38 επεισόδια (35 ασθενείς) σε αυτή τη μελέτη που διαγνώστηκαν με αποδεδειγμένη ή πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση όπως καθορίζεται από τους ορισμούς EORTC (Ευρωπαϊκή Οργάνωση για την Έρευνα και τη Θεραπεία του Καρκίνου)/NIAID (Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργίας και Λοιμωδών Νόσων). Δεν αναμένεται κάθε δείγμα ορού από κάθε ασθενή να είναι θετικό. Η αναμενόμενη συχνότητα εμφάνισης της Διηθητικής Ασπεργίλλωσης ποικίλλει. Ανάλογα με τον πληθυσμό ασθενών έχουν αναφερθεί τιμές από 5-20% 7, 13. Το ποσοστό συχνότητας της νόσου για τη μελέτη αυτή ήταν 16%. ΑΠΟΔΕΔΕΙΓΜΕΝΗ / ΠΙΘΑΝΗ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗ ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΩΣΗ: ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΔΕΙΚΤΗ / ΕΠΙΣΟΔΕΙΩΝ (N=38 επισόδεια από 35 ασθενείς) Δείκτης 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0, Αριθμός επισοδείων Αναφορά 0,5 Τα παρακάτω γραφήματα αναπαριστούν παραδείγματα ασθενή χωρίς κλινικές ενδείξεις ή συμπτώματα Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (αρνητικός για Ασπέργιλλο) και ενός ασθενή με αποδεδειγμένη Διηθητική Ασπεργίλλωση (θετικός για Ασπέργιλλο) αντίστοιχα. Αρνητικός ασθενής: ΑΣΘΕΝΗΣ ΕΛΕΓΧΟΥ δείκτης 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ημέρες 12

13 Θετικός Ασθενής ΑΣΘΕΝΗΣ ΑΠΟΔΕΔΕΙΓΜΕΝΗΣ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗΣ ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΩΣΗΣ δείκτης 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, ημέρες 15 ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ A Μελέτες Αναπαραγωγιμότητας Η διαφοροποίηση της Platelia Aspergillus EIA μεταξύ αναλύσεων και εντός ανάλυσης προσδιορίστηκε σε μία μελέτη που χρησιμοποίησε ένα πάνελ 6 συγκεντρωθέντων δειγμάτων ορών ασθενή (ένα αρνητικό, ένα ελαφρά θετικό, δύο θετικά και δύο υψηλά θετικά) που λήφθηκαν από τρία εργαστήρια κλινικής δοκιμής στη Βόρεια Αμερική. Κάθε μέλος από τα 6 του πάνελ εξετάσθηκε εις τριπλούν (x3) σε 3 διαφορετικές ημέρες, σε μία παρτίδα σε δύο εργαστήρια (συνολικός αριθμός αντιγράφων σε κάθε εργαστήριο = 9). Κάθε μέλος από τα 6 του πάνελ εξετάσθηκε εις διπλούν (x2) σε τρεις διαφορετικές ημέρες, σε 1 παρτίδα σε ένα τρίτο εργαστήριο (συνολικός αριθμός αντιγράφων στο τρίτο εργαστήριο = 6). Ένας (1) χειριστής εκτέλεσε όλους τους ελέγχους ακριβείας σε κάθε εργαστήριο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν σύμφωνα με τα Πρότυπα NCCLS (Διεθνής Επιτροπή για τα Κλινικά Εργαστηριακά Πρότυπα). Η μέση οπτική πυκνότητα (OD) και η μέση τιμή δείκτη, η τυπική απόκλιση (SD), ο ποσοστιαίος συντελεστής μεταβλητότητας (%CV) της ακρίβειας μίας ανάλυσης (εντός ανάλυσης) και της ακρίβειας του εργαστηρίου (μεταξύ αναλύσεων) για κάθε μέλος του πάνελ σε κάθε εργαστήριο απεικονίζονται στους παρακάτω πίνακες. Εργαστήριο 1 Στοιχείο Αρν. Χαμ. Συγκ. Θετ. Θετ. #1 Θετ. #2 Υψ. Συγκ. Θετ. #1 Υψ. Συγκ. Θετ.#2 Αρν. Ορ. Ορ. Ελέγχου Θετ. Ορ. Ελέγχου πάνελ Ελέγχου Αναφ. OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης N Μέση 0,052 0,09 0,045 0,74 0,702 1,17 0,931 1,563 1,227 2,06 2,887 4,83 0,046 0,08 0,606 1,00 2,216 3,67 Εντός της 0,002 0,00 0,022 0,03 0,059 0,09 0,044 0,08 0,051 0,09 0,089 0,17 N/A N/A 0,02 0,03 N/A N/A ανάλυσης (εντός της ανάλυσης) 1 SD %CV N/A N/A 4,8% 4,4% 8,4% 7,6% 4,7% 5,1% 4,2% 4,4% 3,1% 3,6% N/A N/A 3,7% 3,4% N/A N/A Συνολική 0,036 0,04 0,051 0,08 0,070 0,14 0,044 0,25 0,058 0,29 0,169 0,58 N/A N/A 0,102 0,03 0,317 0,12 (μεταξύ των αναλύσεων) 2 SD %CV N/A N/A 11,5% 10,4% 10,0% 11,6% 4,7% 15,7% 15,7% 4,7% 5,9% 11,9% N/A N/A 16,9% 2,8% 14,3% 3,3% 13

14 Εργαστήριο 2 Στοιχείο πάνελ Αρν. Χαμ. Συγκ. Θετ. Θετ. #1 Θετ. #2 Υψ. Συγκ. Θετ. #1 Υψ. Συγκ. Θετ.#2 Αρν. Ορ. Ελέγχου Ορ. Ελέγχου Αναφ. Θετ. Ορ. Ελέγχου OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης N Μέση 0,040 0,10 0,280 0,70 0,364 0,89 0,602 1,49 0,801 2,01 1,361 3,43 0,074 0,18 0,15 1,00 1,197 2,97 Εντός της 0,006 0,01 0,041 0,09 0,023 0,07 0,045 0,11 0,046 0,10 0,047 0,11 N/A N/A ,01 N/A N/A ανάλυσης (εντός της ανάλυσης) 1 SD %CV N/A N/A 14,5% 13.0% 7,6% 7,6% 7,5% 7,1% 5,7% 4,8% 3,5% 3,2% N/A N/A 1,1% 1,1% N/A N/A Συνολική 0,06 0,03 0,058 0,19 0,083 0,18 0,057 0,28 0,042 0,53 0,079 1,00 N/A N/A 0,094 0,01 0,068 0,54 (μεταξύ των αναλύσεων) 2 SD %CV N/A N/A 20,8% 27,0% 22,7% 19,8% 9,5% 18,7% 5,3% 26,5% 5,8% 29,2% N/A N/A 22,7% 0,9% 5,7% 18,2% Εργαστήριο 3 Στοιχείο πάνελ Αρν. Χαμ. Συγκ. Θετ. Θετ. #1 Θετ. #2 Υψ. Συγκ. Θετ. #1 Υψ. Συγκ. Θετ.#2 Αρν. Ορ. Ελέγχου Ορ. Ελέγχου Αναφ. Θετ. Ορ. Ελέγχου OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης OD Δείκτης N Μέση 0,049 0,10 0,388 0,81 0,652 1,36 0,830 1,73 1,158 2,41 2,378 4,96 0,059 0,18 0,415 1,00 1,197 2,97 Εντός της 0,003 0,01 0,009 0,02 0,082 0,17 0,068 0,14 0,094 0,20 0,126 0,25 N/A N/A 0,028 0,06 N/A N/A ανάλυσης (εντός της ανάλυσης) 1 SD %CV N/A N/A 2,4% 2,4% 12,5% 12,2% 8,2% 8,2% 8,1% 8,2% 5,3% 5,1% N/A N/A 5,8% 5,8% N/A N/A Συνολική 0,012 0,03 0,078 0,13 0,068 0,15 0,104 0,25 0,082 0,15 0,111 0,34 N/A N/A 0,028 0,04 0,056 0,23 (μεταξύ των αναλύσεων) 2 SD %CV N/A N/A 20,0% 15,8% 10,5% 11,1% 12,5% 14,3% 7,1% 6,2% 4,7% 6,8% N/A N/A 5,8% 4,1% 3,4% 6,6% N/A = δεν εφαρμόζεται 1 NCCLS EP5-A, Τόμος 19, Αρ. 2, Σελίδα 24, Equation (C2) 2 NCCLS EP5-A, Τόμος 19, Αρ. 2, Σελίδα 25, Equation (C-3) and Equation (C4) B Διασταυρούμενη Αντιδραστικότητα Διεξήχθη μία μελέτη για την αξιολόγηση της επίπτωσης των εν δυνάμει παρεμβαλλόμενων ιατρικών συνθηκών που δεν έχουν σχέση με τη Διηθητική Ασπεργίλλωση, σε μία παρτίδα του κιτ Platelia Aspergillus EIA. Εξετάστηκαν τα παρακάτω δείγματα ορού για διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με την Platelia Aspergillus EIA. Συνολικά εξετάστηκαν 151 οροί. Παθολογία Αριθμός Εξετασθέντων Δειγμάτων Αριθμός Θετικών Ρευματοειδής Παράγοντας 10 0 Θετικό ΑΝΑ (αντιπυρηνικό αντίσωμα) 10 0 IgG Υπεργαμμασφαιριναιμία 10 0 IgΜ Υπεργαμμασφαιριναιμία 10 0 Καρκίνος.* 11 0 Μη ιογενής κίρρωση (πρωτοπαθής χολική, αλκοολική, προκαλούμενη από φάρμακα) 10 0 Πολλαπλές Μεταγγίσεις 10 0 Πολύτοκες Γυναίκες 10 0 HAV (Ηπατίτιδα ιού Α) 10 0 HCV (Ηπατίτιδα ιού C) 10 0 Ερυθρά 10 0 CMV (κυτταρομεγαλοϊός) 10 0 Σύφιλη (RPR+) 10 0 Τοξοπλάσμωση 10 0 Μυκητόπλασμα 10 0 * Καθένα από τα παρακάτω: ουροδόχος κύστη, μαστός (2), κόλον, ενδομήτριο, πνεύμονας, προστάτης, νεφρικό και πλακώδες (3). 14

15 Γ Κλινική Εξέταση Διεξήχθη κλινική εξέταση για να αξιολογηθεί η ευαισθησία, ειδικότητα και η προγνωστική τιμή του Ασπεργίλλου Platelia, σε δύο εργαστήρια που βρίσκονται στο Βέλγιο και στην Ολλανδία. Η μελέτη διεξήχθη αναδρομικά χρησιμοποιώντας συνολικά 4873 δείγματα ορού που συλλέχθηκαν από 203 ασθενείς από τους παρακάτω πληθυσμούς*: ασθενείς χωρίς ενδείξεις Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου) ασθενείς με πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση ασθενείς με αποδεδειγμένη Διηθητική Ασπεργίλλωση * Η IFICG (Ομάδα Συνεργασίας για Διηθητικές Μυκητισιακές Λοιμώξεις) του EORTC (Ευρωπαϊκή Οργάνωση για την Έρευνα και τη Θεραπεία του Καρκίνου και η MSG (Ομάδα Μελέτης Μυκητιάσεων) του NIAID (Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργίας και Λοιμωδών Νόσων) καθόρισε κριτήρια για τη διάγνωση της Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (IA) σε ασθενείς με αιματολογική κακοήθεια ή μεταμόσχευση μητρικών αιμοποιητικών κυττάρων 2. Αποδεδειγμένη Διηθητική Ασπεργίλλωση καθορίζεται από θετική μικροβιολογική καλλιέργεια που λαμβάνεται με αποστειρωμένη διαδικασία από την πληγείσα θέση, και ιστοπαθολογική εκδήλωση της κατάλληλης μορφολογίας σε ξενιστή με συμπτώματα που αποδίδονται σε μυκητιασική λοίμωξη. Πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση καθορίζεται τουλάχιστον ένα μικροβιολογικό κριτήριο και ένα κύριο ή δύο δευτερεύοντα κλινικά κριτήρια από θέση παρόμοια με λοίμωξη, σε ξενιστή με συμπτώματα που αποδίδονται σε μυκητιασική λοίμωξη. Πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση καθορίζεται τουλάχιστον από ένα μικροβιολογικό κριτήριο ή ένα κύριο ή δύο δευτερεύοντα κλινικά κριτήρια από θέση παρόμοια με λοίμωξη, σε ξενιστή με συμπτώματα που αποδίδονται σε μυκητιασική λοίμωξη. Λόγω της σχετικής σπανιότητας της Πιθανής και Αποδεδειγμένης Διηθητικής Ασπεργίλλωσης, παρέχουμε τον παρακάτω ορισμό κλινικής ευαισθησίας και ειδικότητας για τους σκοπούς αυτής της μελέτης. ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Αποτελέσματα αυτής της μελέτης αναλύθηκαν σχετικά με την ευαισθησία ασθενή. Η εξέταση ευαισθησίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον Ασπέργιλλο Platelia σε δύο εργαστήρια σε συνδυασμένο σύνολο 38 επεισοδίων, εκ των οποίων 35 ασθενείς με μεταμόσχευση νωτιαίου μυελού (ΒΜΤ) και με Λευχαιμία για τους οποίους διαγνώσθηκε Αποδεδειγμένη ή Πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση. 1. Αποδεδειγμένη Ασπεργίλλωση (όπως ορίζεται από IFICG (Ομάδα Συνεργασίας για τις Διηθητικές Μυκητιασικές Λοιμώξεις) / EORTC (Ευρωπαϊκή Οργάνωση για την Έρευνα και τη Θεραπεία του Καρκίνου); βλ παραπάνω) Συνδυασμένα Εργαστήρια N = 19 επεισόδια από 16 ασθενείς Ευαισθησία: 100% (19/19). Σημείωση: Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% δεν μπόρεσε να υπολογιστεί λόγω του ανεπαρκούς μεγέθους του δείγματος. 2. Πιθανή Ασπεργίλλωση (όπως ορίζεται από IFICG (Ομάδα Συνεργασίας για τις Διηθητικές Μυκητιασικές Λοιμώξεις) / EORTC (Ευρωπαϊκή Οργάνωση για την Έρευνα και τη Θεραπεία του Καρκίνου), βλ παραπάνω) Συνδυασμένα Εργαστήρια N = 19 επεισόδια από 19 ασθενείς Ευαισθησία: 94.7% (18/19). Σημείωση: Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% δεν μπόρεσε να υπολογιστεί λόγω του ανεπαρκούς μεγέθους του δείγματος. 3. Συνδυασμένη Αποδεδειγμένη και Πιθανή Ασπεργίλλωση (όπως ορίζεται από IFICG (Ομάδα Συνεργασίας για τις Διηθητικές Μυκητιασικές Λοιμώξεις) / EORTC (Ευρωπαϊκή Οργάνωση για την Έρευνα και τη Θεραπεία του Καρκίνου), βλ παραπάνω) Συνδυασμένα Εργαστήρια N = 38 επεισόδια από 35 ασθενείς Ευαισθησία: 97.4% (37/38). Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% ήταν 86,2-99,9%. ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Η εξέταση ειδικότητας διεξήχθη χρησιμοποιώντας τον Ασπέργιλλο Platelia σε δύο εργαστήρια σε συνδυασμένο σύνολο 3691 δειγμάτων από 201 επεισόδια (168 ασθενείς) χωρίς ενδείξεις Διηθητικής Ασπεργίλλωσης (ασθενείς ελέγχου). 15

16 Εργαστήριο 1: N = 3060 δείγματα από 103 επεισόδια (70 ασθενείς) Ειδικότητα : 92,2% (95/103) Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% ήταν 85,3-96,6%. Εργαστήριο 2: N = 631 δείγματα από 98 επεισόδια (98 ασθενείς) Ειδικότητα : 88.8% (87/98) Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% ήταν %. Συνδυασμένα Εργαστήρια N = 3691 δείγματα από 201 επεισόδια (168 ασθενείς) Ειδικότητα : 90,5% (182/201) Το διάστημα εμπιστοσύνης 95% ήταν 85,6-94,2%. ΠΡΟΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΞΙΑ Θετικές και Αρνητικές Προγνωστικές Αξίες (PPV, NPV) αναλύθηκαν για πληθυσμό ασθενών αυτής της μελέτης, βάσει του πραγματικού μέσου όρου 16% της συχνότητας εμφάνισης της νόσου που παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη. PPV (Θετική Προγνωστική Αξία): 66.1% (37/56) NPV (Αρνητική Προγνωστική Αξία): 99.4% (182/183) Η ανάλυση εκτελέστηκε επίσης θεωρώντας θετικά αποτελέσματα όταν 2 διαδοχικά δείγματα είχαν δείκτη ανώτερο ή ίσο με 0,5. Η απόδοση παρουσιάζεται συνοπτικά στον παρακάτω πίνακα: Ευαισθησία* Ειδικότητα PPV NPV Συνδυασμένα εργαστήρια υπολογίζοντας 1 δείγμα 0,5 Συνδυασμένα εργαστήρια υπολογίζοντας 2 διαδοχικά δείγματα 0,5 97.4% (37/38) 92.1% (35/38) 90.5% (182/201) 97.5% (196/201) *: η ευαισθησία υπολογίστηκε σε Αποδεδειγμένη και Πιθανή Διηθητική Ασπεργίλλωση 66.1% (37/56) 87.5% (35/40) 99.4% (182/183) 98.5% (196/199) 16 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα παρασκευασμένα αντιδραστήρια προετοιμάζονται σύμφωνα με το Σύστημα Ποιότητας που διαθέτουμε, ξεκινώντας από την παραλαβή των πρώτων υλών μέχρι την τελική εμπορευματοποίηση του προϊόντος. Κάθε παρτίδα υποβάλλεται σε αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου και διατίθεται στην αγορά μόνο αφού διασφαλιστεί ότι συμμορφώνεται με προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία που σχετίζονται με την παραγωγή και τον έλεγχο κάθε μεμονωμένης παρτίδας φυλάσσονται εντός των εγκαταστάσεων της Bio-Rad. 17 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p

17 5. Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis Invasive aspergillosis. Medical Mycology 38: p Erjavec, Z. and P. E. Verweij Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox Plasmalyte as a Cause of falsepositive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p Latge, J. P Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p Latge, J. P Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par Platelia Aspergillus : antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p Nareddy, S., P. H. Chandrasekar False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer Intravenous PLASMA-LYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p

18 25. Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude False positive results in premature infants with the Platelia Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41 : p Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p Surmont,I., W. Stockman Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of falsepositive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p Verweij, P. E. and J. F. Meis Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl.Infect.Dis. 2: p Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p Yeo, S. F. and B. Wong Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /