Platelia CMV IgG AVIDITY

Transcript

1 Platelia CMV IgG AVIDITY ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΙΣΧΥΟΣ ΔΕΣΜΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ- ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ IgG ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΓΑΛΟΪΟΥ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ ΜΕ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ /01

2 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 2. ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ 3. ΑΡΧΗ 4. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 6. ΔΕΙΓΜΑΤΑ 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 8. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 9. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 10. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 11. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ 12. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2 [GR]

3 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Η εξέταση Platelia CMV IgG AVIDITY είναι µια ανοσοενζυµική ανάλυση για τον προσδιορισµό της ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος IgG έναντι του κυτταροµεγαλοϊού στον ανθρώπινο ορό. Η ανάλυση Platelia CMV IgG AVIDITY θα πρέπει να χρησιµοποιείται σε συνδυασµό µε το κιτ Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). 2. ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Ο ανθρώπινος κυτταροµεγαλοϊός (CMV) είναι ένας ιός που απαντάται σε κάθε γεωγραφική περιοχή παγκοσµίως και σε κάθε κοινωνικοοικονοµική οµάδα. Ο ιός CMV ανήκει στην οικογένεια των ερπητοϊών και µεταδίδεται µέσω των βιολογικών υγρών κατά τις στενές διαπροσωπικές επαφές (ούρα, σίελος, µητρικό γάλα, αίµα, δάκρυα, σπέρµα και κολπικές εκκρίσεις). Μετά τη µόλυνση, ο ιός CMV µπορεί να παραµείνει σε λανθάνουσα κατάσταση για αρκετά χρόνια στον οργανισµό των µολυσµένων ασθενών και στη συνέχεια να επαναδραστηριοποιηθεί, προκαλώντας υποτροπιάζουσες λοιµώξεις µε πιθανή µετάδοση σε άλλα άτοµα. Η πρωτογενής λοίµωξη προκαλείται µε διαφορετικούς τρόπους µετάδοσης και σε διαφορετικές περιόδους της ζωής (συγγενείς λοιµώξεις, µεταγεννητικές λοιµώξεις). Μετά τη λανθάνουσα φάση, οι δευτερογενείς λοιµώξεις ενδέχεται να προκληθούν είτε µέσω εκ νέου µόλυνσης από έναν εξωγενή ιό είτε µέσω της επαναδραστηριοποίησης του λανθάνοντος ιού. Το 50 έως 85% του πληθυσµού προσβάλλεται από τον ιό πριν από την ενηλικίωση, ωστόσο οι περισσότερες λοιµώξεις παραµένουν ασυµπτωµατικές, καθώς µόνο το 2% των ασθενών εµφανίζουν άτυπα συµπτώµατα, όπως πυρετός, εξασθένιση, πόνοι στους µύες ή τις αρθρώσεις. Ωστόσο, η λοίµωξη από τον ιό CMV µπορεί να είναι σοβαρή όταν προσβάλλει έγκυες γυναίκες, νεογνά ή ξενιστές µε ανοσοκαταστολή. Κατά τη διάρκεια της κύησης, 1 έως 3% των γυναικών προσβάλλονται από τον ιό CMV, ενώ η µετάδοση του ιού στο έµβρυο µέσω του πλακούντα παρατηρείται στο 40 έως 50% των ασθενών. Το 95% των εµβρυϊκών λοιµώξεων είναι ασυµπτωµατικές, ενώ στο 5% των περιπτώσεων εµφανίζονται ιδιαιτέρως σοβαρές επιπλοκές, όπως: ηπατοσπληνοµεγαλία, µικροκεφαλία, υδροκεφαλία, προωρότητα, ψυχοκινητική καθυστέρηση και εµβρυϊκός θάνατος. Στο 10% των ασυµπτωµατικών λοιµώξεων, τα νεογνά εµφανίζουν καθυστερηµένες επιπλοκές, όπως µερική ή ολική κώφωση ή τύφλωση. Οι ασθενείς µε ανοσοκαταστολή (AIDS, δέκτες µοσχευµάτων, λεµφοϋπερπλαστικά νοσήµατα ή καρκίνος) εµφανίζουν σοβαρές επιπλοκές που σχετίζονται µε διάσπαρτη και/ή σπλαχνική λοίµωξη: σπληνοµεγαλία, χοριοαµφιβληστροειδίτιδα, ηπατίτιδα, πνευµονία, µυοκαρδίτιδα, εγκεφαλίτιδα. Σε αυτούς τους ασθενείς, η λοίµωξη µπορεί να είναι θανάσιµη. Μερικές εβδοµάδες µετά τη λοίµωξη από τον ιό CMV, η αντίδραση του ανοσοποιητικού οδηγεί στην εµφάνιση ειδικών αντισωµάτων IgM, ενώ µετά από µερικές ηµέρες εµφανίζονται ειδικά αντισώµατα IgG. Η ορολογική διάγνωση της λοίµωξης CMV καταδεικνύεται από οροµετατροπή ή σηµαντική αύξηση του τίτλου αντισωµάτων IgG. Ωστόσο, η διαφορική διάγνωση µεταξύ πρόσφατης και παρελθούσας λοίµωξης δυσχεραίνεται ορισµένες φορές λόγω της παραµονής των αντισωµάτων IgM anti- CMV ή της επανεµφάνισής τους σε περίπτωση εκ νέου µόλυνσης ή εκ νέου ενεργοποίησης µιας λανθάνουσας λοίµωξης ή µη ειδικής διέγερσης του 3 [GR]

4 ανοσοποιητικού συστήµατος. Στις περιπτώσεις αυτές, η µέτρηση της ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος IgG µε ανοσοενζυµική µέθοδο µπορεί να συµβάλλει στη διαφοροποίηση µεταξύ µιας οξείας και µιας παρελθούσας λοίµωξης. Ο προσδιορισµός αυτός βασίζεται στην εξέλιξη της ωριµότητας της αντίδρασης του ανοσοποιητικού, η οποία µεταφράζεται στη σύνθεση αντισωµάτων IgG µε χαµηλή ισχύ δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος κατά τις πρωτογενείς λοιµώξεις και αντισωµάτων IgG µε υψηλή ισχύ δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος κατά τις παρελθούσες λοιµώξεις. 3. ΑΡΧΗ Η εξέταση αυτή εκτελείται χρησιµοποιώντας την ανάλυση Platelia CMV IgG AVIDITY (Αρ. αναφ ) σε συνδυασµό µε την ανάλυση Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). Η αρχή της µεθόδου αυτής βασίζεται στη µέτρηση της ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος IgG έναντι του ιού CMV. Με τη χρήση ενός παράγοντα (όπως η ουρία) για το διαχωρισµό του δεσµού αντιγόνου/αντισώµατος παράλληλα µε τη συνήθη τεχνική µέτρησης των αντισωµάτων IgG είναι δυνατή η σύγκριση της οπτικής πυκνότητας (OD) που λαµβάνεται µετά τη δράση διαχωρισµού του παράγοντα και της οπτικής πυκνότητας (OD) χωρίς τη δράση διαχωρισµού του παράγοντα. Η ισχύς δεσµού θεωρείται χαµηλή, όταν ο διαχωρισµός του δεσµού αντιγόνου/αντισώµατος πραγµατοποιείται εύκολα. Η ισχύς δεσµού θεωρείται υψηλή, όταν ο διαχωρισµός του δεσµού αντιγόνου/αντισώµατος δεν πραγµατοποιείται εύκολα. Η εξέταση αυτή πρέπει να πραγµατοποιείται µόνο σε θετικά δείγµατα µε συγκέντρωση αντισωµάτων IgG anti-cmv υψηλότερη από 0,5 AU/ml µε την ανάλυση Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). Βήµα 1 Οι οροί ελέγχου ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος και οι οροί ασθενή µε συγκέντρωση αντισωµάτων IgG anti-cmv µεταξύ 0,5 και 1,5 AU/ml αραιώνονται σε αναλογία 1/21. Οι οροί ασθενή µε συγκέντρωση αντισωµάτων IgG anti-cmv ίση ή µεγαλύτερη από 1,5 AU/ml αραιώνονται σε αναλογία 1/101. Τα αραιωµένα δείγµατα κατανέµονται, στη συνέχεια, δύο φορές στα µικροβυθίσµατα της µικροπλάκας που είναι επικαλυµµένα µε αντιγόνο CMV. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης µίας ώρας στους 37 C, τα αντισώµατα IgG έναντι του ιού CMV, που υπάρχουν στο δείγµα, δεσµεύονται στο αντιγόνο CMV, µε το οποίο έχουν επικαλυφθεί τα µικροβυθίσµατα της µικροπλάκας. Μετά την επώαση, τα αδέσµευτα, µη ειδικά αντισώµατα και άλλες πρωτεΐνες ορού αποµακρύνονται µε πλύσεις. Βήµα 2 Κάθε ορός ελέγχου ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος και κάθε ορός ασθενή υποβάλλονται σε διπλή επεξεργασία: το διάλυµα ελέγχου προστίθεται στο ένα µικροβύθισµα και το διάλυµα διαχωρισµού στο άλλο. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης 15 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου ( C), το διάλυµα διαχωρισµού προσπαθεί να διαχωρίσει τα συµπλέγµατα αντιγόνου/αντισώµατος. Μετά την επώαση, τα δύο διαλύµατα και τα αντισώµατα IgG που έχουν διαχωριστεί αποµακρύνονται µε πλύσεις. 4 [GR]

5 Βήµα 3 Ο συζεύκτης (πολύκλωνο αντίσωµα επισηµασµένο µε υπεροξειδάση, ειδικό για ανθρώπινες γ-αλυσίδες) προστίθεται στα µικροβυθίσµατα της µικροπλάκας. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης µίας ώρας στους 37 C, το επισηµασµένο αντίσωµα δεσµεύεται στο IgG ορού που καθηλώνεται από το αντιγόνο CMV. Ο αδέσµευτος συζεύκτης αποµακρύνεται µε πλύσεις στο τέλος της επώασης. Βήµα 4 Η παρουσία ανοσοσυµπλεγµάτων (αντιγόνο CMV, αντισώµατα IgG έναντι του ιού CMV, συζεύκτης anti-igg) καταδεικνύεται από την προσθήκη σε κάθε µικροβύθισµα ενός ενζυµατικού διαλύµατος ανάπτυξης. Βήµα 5 Μετά την επώαση 30 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου ( C), η ενζυµική αντίδραση διακόπτεται µε την προσθήκη ενός διαλύµατος θειικού οξέος 1N. Η ένδειξη οπτικής πυκνότητας που λαµβάνεται µε φασµατοφωτόµετρο ρυθµισµένο σε µήκος κύµατος 450/620 nm είναι ανάλογη της ποσότητας αντισωµάτων IgG έναντι του ιού CMV που υπάρχουν στο µικροβύθισµα. 4. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για την εκτέλεση 48 εξετάσεων µε το κιτ Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. Ετικέτα Φύση των αντιδραστηρίων Παρουσίαση R5a R5b Ορός ελέγχου χαµηλής ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος Ορός ελέγχου υψηλής ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος R12 Διάλυµα ελέγχου R13 Διάλυµα διαχωρισµού Ορός ελέγχου χαµηλής ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώµατα IgG έναντι του ιού CMV και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: <1,5% ProClin 300 Ορός ελέγχου υψηλής ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώµατα IgG έναντι του ιού CMV και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: <1,5% ProClin 300 Διάλυµα ελέγχου Ρυθµιστικό διάλυµα TRIS-NaCl (ph 7,6 ± 0,2), 0,1% Tween 20 και πράσινη χρωστική Συντηρητικό: <1,5% ProClin 300 Διάλυµα διαχωρισµού Ρυθµιστικό διάλυµα TRIS-NaCl (ph 7,6 ± 0,2), ουρία, 0,1% Tween 20 και κίτρινη χρωστική Συντηρητικό: 0,001% ProClin x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 28 ml 1 x 13 ml 5 [GR]

6 Για τις συνθήκες αποθήκευσης και την ηµεροµηνία λήξης, ανατρέξτε στις ενδείξεις που αναγράφονται στη συσκευασία. 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τη σωστή εφαρµογή της ακόλουθης ορθής εργαστηριακής πρακτικής: Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Μην αναµιγνύετε και µη συνδυάζετε σε µια συγκεκριµένη ανάλυση αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Πριν από τη χρήση, περιµένετε 30 λεπτά, ώστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερµοκρασία δωµατίου ( C). Χρησιµοποιείτε υλικά από γυαλί που έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά µε απιονισµένο νερό ή κατά προτίµηση υλικά µίας χρήσης. Για κάθε δείγµα χρησιµοποιείτε νέο ακροφύσιο πιπέτας. Ελέγχετε αν οι πιπέτες και ο υπόλοιπος εξοπλισµός λειτουργούν σωστά και µε ακρίβεια. Τηρείτε αυστηρά τη διαδικασία ανάλυσης. Ανατρέξτε, επίσης, στο ένθετο προϊόντος της ανάλυσης Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). Σηµείωση: Το κιτ Platelia CMV IgG AVIDITY µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε διαφορετικές παρτίδες της ανάλυσης Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). Οδηγίες για την υγιεινή και την ασφάλεια Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιήθηκε στην προετοιµασία αντιδραστηρίων εξετάστηκε και βρέθηκε αρνητικό στην παρουσία αντιγόνου επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), αντισωµάτων κατά του ιού της ηπατίτιδας C (anti-hcv) και του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (anti-hiv1 και anti HIV2). Καθώς καµία µέθοδος δεν µπορεί να εγγυηθεί απολύτως την απουσία µολυσµατικών παραγόντων, πρέπει να χειρίζεστε τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης και τα δείγµατα ασθενή ως εν δυνάµει µολυσµατικά: Οποιοδήποτε υλικό, συµπεριλαµβανοµένων των διαλυµάτων πλύσης, που έρχεται σε άµεση επαφή µε δείγµατα και αντιδραστήρια που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης, θα πρέπει να θεωρείται εν δυνάµει µολυσµατικό. Χρησιµοποιείτε γάντια µίας χρήσης κατά το χειρισµό δειγµάτων και αντιδραστηρίων. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Αποφεύγετε τη διαρροή δειγµάτων ή διαλυµάτων που περιέχουν µολυσµατικά υλικά. Τυχόν κηλίδες πρέπει να καθαρίζονται µε λευκαντικό αραιωµένο κατά 10%. Στην περίπτωση κηλίδων οξέος, οι κηλίδες πρέπει αρχικά να εξουδετερωθούν µε διττανθρακικό νάτριο και, στη συνέχεια, να καθαριστούν µε λευκαντικό αραιωµένο κατά 10% και να σκουπιστούν µε απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιµοποιήθηκε για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για µολυσµένα απορρίµµατα. Τα δείγµατα ασθενών, τα αντιδραστήρια που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και τα µολυσµένα υλικά και προϊόντα θα πρέπει να απορρίπτονται αποκλειστικά µετά την απολύµανση. Ο χειρισµός και η απόρριψη χηµικών ουσιών και βιολογικών απορριµµάτων πρέπει να εκτελείται σύµφωνα µε την ορθή εργαστηριακή πρακτική. 6 [GR]

7 Όλα τα αντιδραστήρια που περιλαµβάνονται στο κιτ προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. Ανατρέξτε, επίσης, στο ένθετο προϊόντος της ανάλυσης Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). Για συστάσεις αναφορικά µε τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται µε κάποια χηµικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήµατα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδοµένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση 6. ΔΕΙΓΜΑΤΑ 1. Ο ορός είναι ο µοναδικός συνιστώµενος τύπος δείγµατος. 2. Τηρείτε τις παρακάτω συστάσεις για το χειρισµό, την επεξεργασία και την αποθήκευση δειγµάτων αίµατος: Συλλέγετε όλα τα δείγµατα αίµατος τηρώντας τις συνήθεις προφυλάξεις για φλεβοκέντηση. Περιµένετε µέχρι τα δείγµατα να πήξουν πλήρως πριν από τη φυγοκέντρηση. Διατηρείτε τα σωληνάρια κλειστά διαρκώς. Μετά τη φυγοκέντρηση, διαχωρίζετε τον ορό από το πήγµα ή τα ερυθρά αιµοσφαίρια σε αεροστεγώς σφραγισµένο σωληνάριο αποθήκευσης. Τα δείγµατα µπορούν να αποθηκευτούν στους +2-8 C, εάν η εξέταση πραγµατοποιηθεί εντός 7 ηµερών. Εάν η εξέταση δεν πρόκειται να ολοκληρωθεί εντός 7 ηµερών ή τα δείγµατα πρόκειται να αποσταλούν, καταψύξτε τα στους -20 C ή σε χαµηλότερη θερµοκρασία. Μη χρησιµοποιείτε δείγµατα που έχουν αποψυχθεί περισσότερες από πέντε φορές. Τα δείγµατα που έχουν καταψυχθεί πρόσφατα θα πρέπει να αναµιγνύονται καλά (Vortex) µετά την απόψυξή τους και πριν από την εξέταση. 3. Τα δείγµατα που περιέχουν 90 g/l λευκωµατίνης ή 100 mg/l µη συζευγµένης χολερυθρίνης, τα λιπαιµικά δείγµατα που περιέχουν 36 g/l τριελαΐνης (τριγλυκεριδίων) και τα αιµολυµένα δείγµατα που περιέχουν έως και 10 g/l αιµοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. 4. Μη θερµαίνετε τα δείγµατα. 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 7.1 Απαιτούµενα υλικά που δεν παρέχονται Ανατρέξτε στο ένθετο προϊόντος της ανάλυσης Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). 7.2 Ανασύσταση αντιδραστηρίων R5a, R5b: Ο ορός ελέγχου χαµηλής ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (R5a) και ο ορός ελέγχου υψηλής ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (R5b) πρέπει να αραιώνονται σε αναλογία 1/21 µε το αραιωτικό R7 που παρέχεται µε την ανάλυση Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). R12, R13: Το διάλυµα ελέγχου (R12) και το διάλυµα διαχωρισµού (R13) είναι έτοιµα για χρήση. 7 [GR]

8 Για άλλα αντιδραστήρια, ανατρέξτε στο ένθετο προϊόντος της ανάλυσης Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). 7.3 Αποθήκευση και εγκυρότητα ανοικτών και/ή ανασυσταµένων αντιδραστηρίων Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους +2-8 C. Όταν το κιτ αποθηκεύεται στους +2-8 C πριν από το άνοιγµα, κάθε συστατικό µπορεί να χρησιµοποιηθεί έως την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στην εξωτερική ετικέτα του κιτ. R5a, R5b: Μετά το άνοιγµα και εάν δεν παρατηρηθεί µόλυνση, τα αντιδραστήρια που είναι αποθηκευµένα στους +2-8 C παραµένουν σταθερά έως και για 8 εβδοµάδες. R12, R13: Μετά το άνοιγµα και εάν δεν παρατηρηθεί µόλυνση, τα αντιδραστήρια που είναι αποθηκευµένα στους +2-8 C παραµένουν σταθερά έως και για 8 εβδοµάδες. Ανατρέξτε, επίσης, στο ένθετο προϊόντος της ανάλυσης Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ). 7.4 Διαδικασία Τηρείτε αυστηρά τη διαδικασία ανάλυσης και την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Χρησιµοποιείτε ορούς ελέγχου χαµηλής ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (R5a) και υψηλής ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (R5b) µε κάθε ανάλυση, ώστε να διασφαλιστεί η εγκυρότητα των αποτελεσµάτων της ανάλυσης. Το κιτ Platelia CMV IgG (Αρ. αναφ ) περιλαµβάνει επίσης άλλα αντιδραστήρια που προορίζονται για χρήση (R1, R2, R6, R7, R9 και R10). Σηµείωση: πριν από τη χρήση, αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερµοκρασία δωµατίου ( C), ειδικά τα αντιδραστήρια R12 και R Καθορίστε προσεκτικά το διάγραµµα κατανοµής και ταυτοποίησης για ορούς ελέγχου και δείγµατα ασθενών. 2. Προετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα πλύσης (R2). 3. Αφαιρέστε το δίσκο µεταφοράς και τις ταινίες (R1) από το προστατευτικό σακουλάκι. 4. Σε κατάλληλα επισηµασµένα σωληνάρια, αραιώστε σε αναλογία 1/21 µε αραιωτικό (R7) τους ορούς ελέγχου ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (R5a, R5b) και τα δείγµατα ασθενών (S1, S2 ) µε συγκέντρωση αντισωµάτων IgG anti- CMV µεταξύ 0,5 και 1,5 AU/ml [25µl δείγµατος και 0,5 ml αραιωτικού (R7)]. Οι οροί ασθενών µε συγκέντρωση αντισωµάτων IgG anti-cmv µεγαλύτερη από 1,5 AU/ml αραιώνονται σε αναλογία 1/101 [5µl δείγµατος και 0,5 ml αραιωτικού (R7)]. Στροβιλίστε τα αραιωµένα δείγµατα. 5. Ακολουθώντας αυστηρά την παρακάτω σειρά, διοχετεύστε σε κάθε µικροβύθισµα 200µl αραιωµένων ορών ελέγχου και δειγµάτων ασθενών: 8 [GR]

9 A R5a R5a S7 S7 B R5b R5b C S1 S1 D S2 S2 E S3 S3 F S4 S4 G S5 S5 H S6 S6 6. Καλύψτε τη µικροπλάκα µε ένα αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας και, στη συνέχεια, πιέστε σταθερά την πλάκα, ώστε να διασφαλιστεί στεγανή σφράγιση. Επωάστε τη µικροπλάκα αµέσως σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερµοστάτη ή σε ξηρό επωαστή για 1 ώρα ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 7. Στο τέλος της πρώτης περιόδου επώασης, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των µικροβυθισµάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). 8. Διοχετεύστε γρήγορα 200 µl διαλύµατος ελέγχου (R12) σε κάθε µικροβύθισµα µονών ταινιών. Στη συνέχεια, διοχετεύστε γρήγορα 200 µl διαλύµατος διαχωρισµού (R13) σε κάθε µικροβύθισµα ζυγών ταινιών. 9. Επωάστε τη µικροπλάκα για 15 λεπτά ± 2 σε θερµοκρασία δωµατίου ( C). 10. Πριν από την ολοκλήρωση της περιόδου επώασης, προετοιµάστε το διάλυµα συζεύκτη εργασίας (R6+R7). 11. Στο τέλος της περιόδου επώασης, αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των µικροβυθισµάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τη µικροπλάκα 2 φορές µε 350 µl διαλύµατος πλύσης (R2). Αναστρέψτε τη µικροπλάκα και σκουπίστε απαλά µε απορροφητικό χαρτί, για να αφαιρεθεί το υπολειπόµενο υγρό. 12. Διοχετεύστε αµέσως 200 µl διαλύµατος συζεύκτη εργασίας (R6+R7) σε όλα τα µικροβυθίσµατα. Το διάλυµα πρέπει να αναδεύεται απαλά πριν από τη χρήση. 13. Καλύψτε τη µικροπλάκα µε ένα αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας και, στη συνέχεια, πιέστε σταθερά την πλάκα, ώστε να διασφαλιστεί στεγανή σφράγιση. Επωάστε τη µικροπλάκα αµέσως σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερµοστάτη ή σε ξηρό επωαστή για 1 ώρα ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 14. Στο τέλος της περιόδου επώασης, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε το περιεχόµενο όλων των µικροβυθισµάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τη µικροπλάκα 4 φορές µε 350 µl διαλύµατος πλύσης (R2). Αναστρέψτε τη µικροπλάκα και σκουπίστε απαλά µε απορροφητικό χαρτί, για να αφαιρεθεί το υπολειπόµενο υγρό. 15. Διοχετεύστε γρήγορα 200 µl διαλύµατος χρωµογόνου (R9) σε κάθε µικροβύθισµα και µακριά από το φως. H αντίδραση θα πρέπει να πραγµατοποιηθεί σε σκοτεινό µέρος για 30 ± 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου ( C). Μη χρησιµοποιείτε αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας κατά τη διάρκεια της συγκεκριµένης περιόδου επώασης. 16. Διακόψτε την ενζυµική αντίδραση προσθέτοντας 100 µl διαλύµατος αναστολής (R10) σε κάθε µικροβύθισµα. Η κατανοµή θα πρέπει να εκτελεστεί µε την ίδια σειρά και συχνότητα όπως για το διάλυµα ανάπτυξης. 9 [GR]

10 17. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος της πλάκας. Διαβάστε την τιµή οπτικής πυκνότητας στα 450/620 nm χρησιµοποιώντας µια συσκευή ανάγνωσης πλάκας εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. Οι ταινίες πρέπει να φυλάσσονται πάντα µακριά από το φως πριν από την ανάγνωση. 18. Πριν από την αναφορά των αποτελεσµάτων, ελέγξτε την αντιστοιχία µεταξύ της ένδειξης και του διαγράµµατος κατανοµής της πλάκας και των δειγµάτων. 8. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 8.1 Υπολογισµός του δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (ΑΙ) Ο δείκτης ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (ΑΙ) ενός δείγµατος είναι ο λόγος των οπτικών πυκνοτήτων (ΟD) που έχουν µετρηθεί µε το διάλυµα διαχωρισµού (R13) και το διάλυµα ελέγχου (R12): AI = OD Δείγµατος R13 / OD Δείγµατος R12 Ο υπολογισµός του δείκτη ΑΙ ενός δείγµατος µπορεί να πραγµατοποιηθεί, εάν η τιµή OD που έχει ληφθεί µε το δείγµα ελέγχου είναι µεγαλύτερη από 0,2. Για δείγµατα που έχουν αραιωθεί σε αναλογία 1/101 και για τα οποία η τιµή OD που έχει ληφθεί µε το διάλυµα ελέγχου είναι χαµηλότερη ή ίση µε 0,2, συνιστάται η επανεξέταση του δείγµατος µε αραίωση σε αναλογία 1/21. Για δείγµατα που έχουν αραιωθεί σε αναλογία 1/21 και για τα οποία η τιµή OD που έχει ληφθεί µε το διάλυµα ελέγχου είναι χαµηλότερη ή ίση µε 0,2, η συγκέντρωση αντισωµάτων IgG anti-cmv είναι υπερβολικά χαµηλή και δεν είναι δυνατή η εξέταση της ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος IgG του δείγµατος. 8.2 Ποιοτικός έλεγχος Συµπεριλάβετε όλους τους ορούς ελέγχου για κάθε µικροπλάκα και για κάθε ανάλυση και αναλύστε τα αποτελέσµατα που έχουν ληφθεί. Για να θεωρηθεί έγκυρη η ανάλυση, θα πρέπει να πληρούνται τα εξής κριτήρια: Τιµές οπτικής πυκνότητας µε το διάλυµα ελέγχου (R12): OD R5a 0,250 OD R5b 0,750 Δείκτες ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος: AI R5a < 0,35 AI R5b 0,60 Εάν αυτά τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου δεν πληρούνται, η ανάλυση θα πρέπει να επαναληφθεί. 10 [GR]

11 8.3 Ερµηνεία αποτελεσµάτων Δείκτης ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος (ΑΙ) AI < 0,40 0,40 AI < 0,55 AI 0,55 Ερµηνεία Ζώνη χαµηλής ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος Γκρίζα ζώνη ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος Ζώνη υψηλής ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος Σε περίπτωση εµφάνισης δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος χαµηλότερου από 0,40, υπάρχουν περισσότερες πιθανότητες πρόσφατης πρωτογενούς λοίµωξης σε ένα διάστηµα µικρότερο από 3 µήνες. Ωστόσο, µε τα αποτελέσµατα αυτά δεν είναι δυνατή η επιβεβαίωση της διάγνωσης αυτής µε απόλυτη βεβαιότητα. Σε περίπτωση εµφάνισης δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος µεγαλύτερου ή ίσου µε 0,55, υπάρχουν περισσότερες πιθανότητες παρελθούσας λοίµωξης σε ένα διάστηµα µεγαλύτερο από 3 µήνες. Ωστόσο, µε τα αποτελέσµατα αυτά δεν είναι δυνατός ο αποκλεισµός µε απόλυτη βεβαιότητα του ενδεχόµενου πρόσφατης πρωτογενούς λοίµωξης σε ένα διάστηµα µικρότερο από 3 µήνες. Σε περίπτωση που υπάρχει υποψία για πρόσφατη λοίµωξη ή ο δείκτης ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος βρίσκεται στην γκρίζα ζώνη, µπορεί να εξεταστεί ένα δεύτερο δείγµα (ανατρέξτε στην τρέχουσα νοµοθεσία σχετικά µε την παρακολούθηση των ασθενών). 8.4 Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων Η µη επαλήθευση ή επανάληψη των αντιδράσεων συχνά οφείλεται σε: Ακατάλληλη θερµοκρασία αντιδραστηρίων Ανεπαρκή πλύση της µικροπλάκας. Εσφαλµένη αραίωση δειγµάτων Μόλυνση αρνητικών δειγµάτων από ορό µε υψηλό τίτλο αντισωµάτων. Μόλυνση του διαλύµατος ανάπτυξης από χηµικούς οξειδωτικούς παράγοντες (λευκαντικό, µεταλλικά ιόντα...). Μόλυνση του διαλύµατος αναστολής. 9. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 9.1 Κλινικές µελέτες Tα χαρακτηριστικά απόδοσης της εξέτασης Platelia CMV IgG AVIDITY έχουν αξιολογηθεί σε 1 τοποθεσία στη Γαλλία, χρησιµοποιώντας συνολικά 366 δείγµατα από έγκυες γυναίκες. Πραγµατοποιήθηκε µια προοπτική µελέτη µε 144 δείγµατα που βρέθηκαν αρχικά θετικά µε την ανάλυση Platelia CMV IgG (72810). Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης Platelia CMV IgG AVIDITY συγκρίθηκαν µε τα αποτελέσµατα που λήφθηκαν µε 11 [GR]

12 ανοσοενζυµική ανάλυση (ΕΙΑ) ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος IgG του εµπορίου, η οποία θεωρήθηκε µέθοδος αναφοράς. Η συµφωνία µεταξύ των δύο εξετάσεων ήταν 98,6% (142/144). Σε δύο δείγµατα εµφανίστηκαν µικρές διαφορές: µέση ισχύς δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος µε την ανάλυση Platelia CMV IgG AVIDITY και υψηλή ισχύς δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος µε την εξέταση του εµπορίου (n=1), υψηλή ισχύς δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος µε την ανάλυση Platelia CMV IgG AVIDITY και µέση ισχύς δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος µε το κιτ του εµπορίου (n=1). Πραγµατοποιήθηκε µια αναδροµική µελέτη µε έναν πίνακα 200 δειγµάτων µε παρελθούσες λοιµώξεις CMV: 100 δείγµατα θετικά για αντισώµατα IgG anti-cmv, αρνητικά για αντισώµατα IgM anti-cmv και µε υψηλό δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος χρησιµοποιώντας ανοσοενζυµική ανάλυση (ΕΙΑ) ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος IgG του εµπορίου. 100 δείγµατα θετικά για αντισώµατα IgG anti-cmv, θετικά για αντισώµατα IgM anti-cmv και µε υψηλό δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος χρησιµοποιώντας ανοσοενζυµική ανάλυση (ΕΙΑ) ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος IgG του εµπορίου. Όλα τα δείγµατα παρελθούσας λοίµωξης που ήταν αρνητικά για αντισώµατα IgΜ anti-cmv (100/100) παρουσίασαν υψηλό δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος µε την ανάλυση Platelia CMV IgG AVIDITY. Από τα δείγµατα παρελθούσας λοίµωξης που ήταν θετικά για αντισώµατα IgΜ anti- CMV, 97 δείγµατα παρουσίασαν υψηλό δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος που επιβεβαιώθηκε µε µια ανοσοενζυµική ανάλυση (ΕΙΑ) ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος IgG του εµπορίου. Τα υπόλοιπα 3 δείγµατα παρουσίασαν µέση ισχύ δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος µε το κιτ Platelia CMV IgG AVIDITY. Επίσης, αναλύθηκαν 22 δείγµατα µε πρωτογενείς λοιµώξεις CMV συµπεριλαµβανοµένων 4 οροµετατροπών. Σε 21 από αυτά ο δείκτης ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος ήταν χαµηλός. Μόνο ένα δείγµα παρουσίασε µέσο δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος (AI=0,41). Σε προηγούµενο δείγµα του ίδιου ασθενή που είχε ληφθεί πριν από 48 ηµέρες, ο δείκτης ισχύος δεσµού αντιγόνουαντισώµατος ήταν χαµηλός. Επίσης, εξετάστηκαν 3 πίνακες οροµετατροπής του εµπορίου (PTC901, RP003 and RP019). Τα δείγµατα που είχαν ληφθεί σε διάστηµα 80 ηµερών µετά το τελευταίο αρνητικό δείγµα σε αντισώµατα IgG παρουσίασαν χαµηλό δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος. 9.2 Ακρίβεια Πραγµατοποιήθηκαν µελέτες ακρίβειας σε 3 δείγµατα που ήταν θετικά σε αντισώµατα IgG anti-cmv, αραιωµένα σε αναλογία 1/101, και σε 3 δείγµατα που ήταν θετικά σε αντισώµατα IgG anti-cmv, αραιωµένα σε αναλογία 1/21. Ακρίβεια εντός της ανάλυσης (επαναληψιµότητα): 12 [GR]

13 Για να αξιολογηθεί η επαναληψιμότητα εντός της ανάλυσης, τα έξι δείγματα εξετάστηκαν 30 φορές κατά τη διάρκεια της ίδιας ανάλυσης. Για κάθε δείγμα καθορίστηκαν οι δείκτες ισχύος δεσμού αντιγόνου-αντισώματος. Η μέση τιμή AI, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%CV) για κάθε δείγμα αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα: Ακρίβεια εντός της ανάλυσης (επαναληψιµότητα) N=30 Μέση τιµή Χαµηλή τιµή AI 1/101 Μέση τιµή AI 1/101 Υψηλή τιµή AI 1/101 Χαµηλή τιµή AI 1/21 Μέση τιµή AI 1/21 Υψηλή τιµή AI 1/21 0,25 0,55 0,88 0,20 0,49 0,70 SD 0,018 0,015 0,037 0,008 0,020 0,015 %CV 7,3% 2,7% 4,3% 4,0% 4,1% 2,2% Ακρίβεια µεταξύ των αναλύσεων (αναπαραγωγιµότητα): Για να αξιολογηθεί η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων, τα έξι δείγµατα εξετάστηκαν εις διπλούν σε δύο αναλύσεις την ηµέρα για περίοδο 20 ηµερών. Για κάθε δείγµα καθορίστηκαν οι δείκτες ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος. Η µέση τιµή AI, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής µεταβλητότητας (%CV) για κάθε δείγµα αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα: Ακρίβεια µεταξύ των αναλύσεων (αναπαραγωγιµότητα) N=80 Μέση τιµή Χαµηλή τιµή AI 1/101 Μέση τιµή AI 1/101 Υψηλή τιµή AI 1/101 Χαµηλή τιµή AI 1/21 Μέση τιµή AI 1/21 Υψηλή τιµή AI 1/21 0,24 0,49 0,82 0,13 0,41 0,61 SD 0,026 0,032 0,045 0,015 0,029 0,035 %CV 10,6% 6,4% 5,5% 12,0% 6,9% 5,7% 10. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η διάγνωση της λοίµωξης CMV θα πρέπει να βασίζεται αποκλειστικά σε ένα συνδυασµό κλινικών και βιολογικών στοιχείων. Το αποτέλεσµα µίας µόνο εξέτασης τιτλοποίησης αντισωµάτων IgG anti-cmv και η µέτρηση του δείκτη ισχύος δεσµού αντιγόνου-αντισώµατος δεν αποτελούν επαρκή απόδειξη για τη διάγνωση πρόσφατης λοίµωξης από τον κυτταροµεγαλοϊό. 13 [GR]

14 11. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα παρασκευασµένα αντιδραστήρια προετοιµάζονται σύµφωνα µε το σύστηµα ποιότητας που διαθέτουµε, από την παραλαβή των πρώτων υλών έως την εµπορευµατοποίηση του τελικού προϊόντος. Κάθε παρτίδα υποβάλλεται σε αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου και διατίθεται στην αγορά µόνο εφόσον διασφαλιστεί ότι συµµορφώνεται µε τα προκαθορισµένα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία που σχετίζονται µε την παραγωγή και τους ελέγχους κάθε µεµονωµένης παρτίδας φυλάσσονται εντός των εγκαταστάσεων της Bio-Rad. 12. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S Demmler G.J Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: Revello M.L., Gerna G Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306: [GR]

15 15 [GR]

16 16 [GR]

17 17 [GR]

18 18 [GR]