PLATELIA HSV 2 IgG 1 Πλακέτα ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgG ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΙΟΥ HSV 2 ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΠΛΑΣΜΑ ΜΕ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ

Transcript

1 PLATELIA HSV 2 IgG 1 Πλακέτα ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgG ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΙΟΥ HSV 2 ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΠΛΑΣΜΑ ΜΕ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ /11 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Η εξέταση Platelia HSV 2 IgG είναι μια έμμεση ανοσοενζυμική ανάλυση ELISA για τον ποιοτικό καθορισμό αντισωμάτων IgG έναντι του ιού του απλού έρπητα τύπου 2 σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα. 2. ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Ο ιός του απλού έρπητα (HSV) είναι ένας κοινός ανθρώπινος παθογόνος ιός που απαντάται παγκοσμίως. Έχουν περιγραφεί δύο ορολογικοί υπότυποι του HSV: HSV-1 και HSV-2. Ο HSV-1 συνδέεται κυρίως με τη λοίμωξη στη γλώσσα, το στόμα, τα χείλη, το φάρυγγα και τα μάτια, ενώ ο HSV-2 συνδέεται κυρίως με τη λοίμωξη στα γεννητικά όργανα και τη νεογνική λοίμωξη. Ωστόσο, και οι δύο τύποι μπορούν να προκαλέσουν λοιμώξεις στα γεννητικά όργανα, ενώ ο HSV-1 αναγνωρίζεται ολοένα και περισσότερο ως αιτία συμπτωμάτων των γεννητικών οργάνων. Ο ιός του απλού έρπητα μεταδίδεται μέσω άμεσης επαφής με τις εκκρίσεις ενός μολυσμένου ατόμου, που ενδέχεται να παρουσιάζει συμπτώματα της νόσου εκείνη τη χρονική στιγμή. Στην πραγματικότητα, οι περισσότερες λοιμώξεις στα γεννητικά όργανα μεταδίδονται κατά την περίοδο μη εμφάνισης συμπτωμάτων. Η πρωτογενής λοίμωξη με HSV μπορεί να εμφανιστεί σε οποιαδήποτε ηλικία, δηλαδή μπορεί να προσβάλλει νεογνά, παιδιά και ενήλικες. Μετά την πρωτογενή λοίμωξη, ο HSV παραμένει δια βίου σε λανθάνουσα κατάσταση στα γάγγλια των αισθητήριων νεύρων και συνεπώς προκαλείται επανεμφάνιση των συμπτωμάτων, όταν επαναδραστηριοποιηθεί ο λανθάνων ιός. Οι μητέρες που μολύνονται με τον ιό HSV τύπου 1 ή τύπου 2 κατά τη διάρκεια της κύησης μπορούν να μεταδώσουν τον ιό στο βρέφος πριν από τον τοκετό ή κατά τη διάρκεια αυτού. Οι ενδομήτριες λοιμώξεις συνδέονται με την αυτόματη αποβολή και τον πρόωρο τοκετό. Το μεγαλύτερο κίνδυνο για νεογνικό έρπητα διατρέχουν τα βρέφη, οι μητέρες των οποίων προσβάλλονται από λοίμωξη στα γεννητικά όργανα κατά το τελευταίο τρίμηνο της κύησης. Ο συγγενής και νεογνικός HSV μπορεί να εμφανιστεί με πρωτογενή ή υποτροπιάζουσα, συμπτωματική ή ασυμπτωματική μητρική λοίμωξη HSV και μπορεί να προκαλέσει λοίμωξη στο δέρμα, τα μάτια ή το στόμα καθώς και βλάβες στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Στις πρωτογενείς λοιμώξεις HSV, τα αντισώματα IgM εμφανίζονται συνήθως μεταξύ τρίτης και έβδομης ημέρας μετά την εμφάνιση των συμπτωμάτων. Η μέγιστη τιμή του τίτλου αντισωμάτων IgM παρατηρείται στις τέσσερις έως έξι εβδομάδες και μειώνεται συνήθως σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα μετά από δύο μήνες. Αντισώματα IgM έναντι του HSV μπορούν ορισμένες φορές να εντοπιστούν σε υποτροπιάζουσες λοιμώξεις. Ωστόσο, η παραγωγή και ανίχνευση των αντισωμάτων IgM έναντι του HSV σε ασθενείς με υποτροπιάζουσες λοιμώξεις δεν μπορεί να προβλεφθεί με βεβαιότητα και μπορεί να σχετίζεται με τη σοβαρότητα της λοίμωξης. Τα αντισώματα IgG έναντι του HSV εμφανίζονται συνήθως μία έως δύο εβδομάδες μετά την έναρξη της λοίμωξης και παραμένουν σε διάφορα επίπεδα δια βίου. Για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του HSV έχουν αναπτυχθεί διάφορες ορολογικές διαδικασίες. Οι διαδικασίες αυτές περιλαμβάνουν τη σύνδεση συμπληρώματος, το αντίσωμα άμεσου ανοσοφθορισμού, την ουδετεροποίηση πλάκας και την ανάλυση ELISA. Σε σύγκριση με άλλες ορολογικές εξετάσεις η ανάλυση ELISA είναι μια ιδιαίτερα εξειδικευμένη, ευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδο για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του HSV. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις ορολογικές μεθόδους για την αξιολόγηση της ορολογικής κατάστασης χρησιμοποιούν ως αντιγόνα ιικά προϊόντα λύσης. Λόγω της σημαντικής διασταυρούμενης αντιδραστικότητας μεταξύ του HSV-1 και του HSV-2 και την ιδιαίτερα υψηλή συχνότητα εμφάνισης της λοίμωξης HSV-1, δεν είναι δυνατή με τις αναλύσεις ιικών προϊόντων λύσης η επαρκής διαφοροποίηση των λοιμώξεων HSV- 1 από τις λοιμώξεις HSV-2 (2). Πρόσφατα, έχουν αναπτυχθεί ορολογικές αναλύσεις ειδικές για κάθε τύπο HSV που χρησιμοποιούν τη σημαντική διαφορά μεταξύ της πρωτεΐνης gg-1 του HSV-1 και της πρωτεΐνης gg-2 του HSV-2 (2). Το κιτ Platelia TM HSV 2 IgG χρησιμοποιεί ένα συνθετικό πεπτιδικό τμήμα γλυκοπρωτεΐνης gg-2 ακινητοποιημένο σε μικροβυθίσματα, ώστε να διασφαλίζεται βέλτιστη ειδικότητα και αξιόπιστη διαφοροποίηση των λοιμώξεων HSV-2 από τις λοιμώξεις HSV ΑΡΧΗ Η εξέταση Platelia HSV 2 IgG είναι μια ποιοτική εξέταση για την ανίχνευση αντισωμάτων IgG έναντι του ιού HSV 2 σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα με χρήση μιας έμμεσης ανοσοενζυμικής ανάλυσης ELISA. Για την επικάλυψη της μικροπλάκας χρησιμοποιούνται συνθετικά τμήματα της γλυκοπρωτεΐνης gg-2. Ως συζεύκτης χρησιμοποιείται ένα πολυκλωνικό αντίσωμα επισημασμένο με υπεροξειδάση το οποίο είναι ειδικό για ανθρώπινες γ-αλυσίδες (anti-igg). Η δοκιμή περιλαμβάνει τα παρακάτω βήματα: 1

2 Βήμα 1 Τα δείγματα των ασθενών και οι οροί ελέγχου αραιώνονται σε αναλογία 1/21 και, στη συνέχεια, κατανέμονται στα μικροβυθίσματα της μικροπλάκας. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης διάρκειας μίας ώρας στους 37 C, τα αντισώματα IgG έναντι του HSV 2 που υπάρχουν στο δείγμα δεσμεύονται στο συνθετικό πεπτιδικό τμήμα της γλυκοπρωτεΐνης gg-2 που χρησιμοποιείται ως επικάλυψη των μικροβυθισμάτων της μικροπλάκας. Μετά την επώαση, τα αδέσμευτα, μη ειδικά αντισώματα και άλλες πρωτεΐνες ορού απομακρύνονται με πλύσεις. Βήμα 2 Ο συζεύκτης (μονόκλωνο αντίσωμα επισημασμένο με υπεροξειδάση, ειδικό για ανθρώπινες γ-αλυσίδες) προστίθεται στα μικροβυθίσματα της μικροπλάκας. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης διάρκειας μίας ώρας στους 37 C, το επισημασμένο μονόκλωνο αντίσωμα δεσμεύεται στο IgG ορού που καθηλώνεται από το τμήμα της γλυκοπρωτεΐνης gg-2. Ο αδέσμευτος συζεύκτης απομακρύνεται με πλύσεις στο τέλος της επώασης. Βήμα 3 Η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων (τμήμα γλυκοπρωτεΐνης gg-2, αντισώματα IgG έναντι του ιού HSV 2, συζεύκτης anti-igg) καταδεικνύεται από την προσθήκη σε κάθε μικροβύθισμα ενός ενζυματικού διαλύματος ανάπτυξης. Βήμα 4 Μετά την επώαση σε θερμοκρασία δωματίου ( C), η ενζυμική αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη ενός διαλύματος θειικού οξέος 1N. Η ένδειξη οπτικής πυκνότητας που λαμβάνεται με φασματοφωτόμετρο ρυθμισμένο σε μήκος κύματος 450/620 nm είναι ανάλογη του αριθμού των αντισωμάτων IgG έναντι του ιού HSV 2 που υπάρχουν στο δείγμα. 4. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για την εκτέλεση 96 εξετάσεων. Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. Ετικέτα Φύση των αντιδραστηρίων Παρουσίαση R1 Microplate Μικροπλάκα (έτοιμη για χρήση) 12 ταινίες με 8 εύθραυστα μικροβυθίσματα, επικαλυμμένα με συνθετικό τμήμα γλυκοπρωτεΐνης gg-2 R2 Concentrated Washing Solution (20X) Συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης (20x) Διάλυμα TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Συντηρητικό: 0,04% ProClin 300 R3 Negative Control Αρνητικός ορός ελέγχου Ανθρώπινος ορός, αρνητικός για αντισώματα IgG έναντι του ιού HSV 2 και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: 0,10% ProClin 300 R4 Calibrator Βαθμονομητής Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώματα IgG έναντι του ιού HSV 2 και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό : 0,10% ProClin 300 R5 Positive Control Θετικός ορός ελέγχου Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώματα IgG έναντι του ιού HSV 2 και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: 0,10% ProClin 300 R6 Conjugate (51x) Συζεύκτης (51x) Πολυκλωνικά αντισώματα αίγας σε ανθρώπινες γ-αλυσίδες συνδεδεμένα σε υπεροξειδάση ραφανίδας Συντηρητικό: 0,15% ProClin 300 R7 Diluent Αραιωτικό για δείγματα και συζεύκτη (έτοιμο για χρήση) Tris-NaCl (ph 7,7), εμβρυϊκός όρος μόσχου, ερυθρό της φαινόλης Συντηρητικό: 0,11% ProClin 300 R9 Chromogen TMB Χρωμογόνο (έτοιμο για χρήση) τετραμεθυλοβενζιδίνη (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) R10 Stopping Solution Διάλυμα αναστολής (έτοιμο για χρήση) Διάλυμα θειικού οξέος 1 N 1 μικροπλάκα 70 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,7 ml 80 ml 28 ml 28 ml Για τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης, ανατρέξτε στις ενδείξεις που αναγράφονται στη συσκευασία. 2

3 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από τη σωστή εφαρμογή της ακόλουθης ορθής εργαστηριακής πρακτικής: Μη χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Μην αναμιγνύετε ή συνδυάζετε σε μία συγκεκριμένη ανάλυση εξέτασης αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Για το διάλυμα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20x, πράσινου χρώματος), χρωμογόνο (R9, αναγνώριση ετικέτας: TMB, γαλαζοπράσινου χρώματος) και το διάλυμα αναστολής (R10, αναγνώριση ετικέτας: 1N κόκκινου χρώματος) μπορείτε να χρησιμοποιήσετε άλλες παρτίδες από αυτές που περιλαμβάνονται στο κιτ, με την προϋπόθεση ότι αυτά τα αντιδραστήρια είναι απολύτως ισοδύναμα και ότι σε μια συγκεκριμένη ανάλυση εξέτασης θα χρησιμοποιηθεί η ίδια παρτίδα. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Επιπλέον, το διάλυμα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20x, πράσινου χρώματος) μπορεί να αναμιχθεί με τα υπόλοιπα 2 διαλύματα πλύσης που συμπεριλαμβάνονται σε διάφορα κιτ αντιδραστηρίων της Bio-Rad (R2, στοιχεία ετικέτας: 10x, μπλε χρώματος ή 10x, πορτοκαλί χρώματος), μετά από κατάλληλη ανασύσταση και με την προϋπόθεση ότι θα χρησιμοποιηθεί μόνο ένα μίγμα σε μια συγκεκριμένη ανάλυση. Πριν από τη χρήση, περιμένετε 30 λεπτά, ώστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου ( C). Ανασυστήστε προσεκτικά ή αραιώστε τα αντιδραστήρια αποφεύγοντας τυχόν μόλυνση. Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυμική δραστηριότητα του συζεύκτη. Χρησιμοποιείτε υλικά από γυαλί, που έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά με απιονισμένο νερό ή κατά προτίμηση υλικά μίας χρήσης. Η πλύση της μικροπλάκας αποτελεί ιδιαίτερα σημαντικό στάδιο σε αυτήν τη διαδικασία: τηρείτε το συνιστώμενο αριθμό κύκλων πλύσης και βεβαιωθείτε ότι όλα τα μικροβυθίσματα είναι πλήρως γεμάτα και, στη συνέχεια, άδεια. Οι εσφαλμένες πλύσεις ενδέχεται να οδηγήσουν σε ανακριβή αποτελέσματα. Μην αφήνετε τη μικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστημα από το τέλος των πλύσεων και μέχρι την κατανομή των αντιδραστηρίων. Μη χρησιμοποιείτε ποτέ το ίδιο δοχείο για την κατανομή του συζεύκτη και του διαλύματος ανάπτυξης. Η ενζυμική αντίδραση είναι πολύ ευαίσθητη σε οποιοδήποτε μέταλλο ή μεταλλικό ιόν. Επομένως, κανένα μεταλλικό στοιχείο δεν πρέπει να έρχεται σε επαφή με τα διάφορα διαλύματα που περιέχουν τον συζεύκτη ή το χρωμογόνο. Το διάλυμα χρωμογόνου (R9) θα πρέπει να είναι άχρωμο. Η εμφάνιση μπλε χρώματος δηλώνει ότι το αντιδραστήριο δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί και πρέπει να αντικατασταθεί. Για κάθε δείγμα χρησιμοποιείτε νέο ακροφύσιο πιπέτας. Ελέγχετε αν οι πιπέτες και ο υπόλοιπος εξοπλισμός λειτουργεί σωστά και με ακρίβεια. Οδηγίες υγιεινής και ασφαλείας Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιήθηκε στην προετοιμασία αντιδραστηρίων εξετάστηκε και βρέθηκε αρνητικό στην παρουσία αντιγόνου επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), αντισωμάτων για τον ιό ηπατίτιδας Γ (anti-hcv) και κατά του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (anti-hiv1 και anti HIV2). Επειδή καμία μέθοδος δεν μπορεί να εγγυηθεί απολύτως την απουσία μολυσματικών παραγόντων, χειριστείτε τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης και τα δείγματα ασθενή ως εν δυνάμει μολυσματικά. Οποιοδήποτε υλικό, συμπεριλαμβανομένων των διαλυμάτων πλύσης, που έρχεται σε άμεση επαφή με δείγματα και αντιδραστήρια που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρούνται ως εν δυνάμει μολυσματικά. Χρησιμοποιείτε γάντια μίας χρήσης κατά το χειρισμό των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. Αποφεύγετε τη διαρροή δειγμάτων ή διαλυμάτων που περιέχουν μολυσματικά υλικά. Τυχόν κηλίδες πρέπει να καθαρίζονται με λευκαντικό αραιωμένο κατά 10 %. Στην περίπτωση κηλίδας οξέος, οι κηλίδες πρέπει αρχικά να εξουδετερωθούν με διττανθρακικό νάτριο και, στη συνέχεια, να καθαριστούν με λευκαντικό αραιωμένο κατά 10% και να σκουπιστούν με απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για μολυσμένα απορρίμματα. Τα δείγματα ασθενών, τα αντιδραστήρια που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και τα μολυσμένα υλικά και τα προϊόντα πρέπει να απορρίπτονται μετά την απολύμανση αποκλειστικά: - είτε με εμβάπτιση σε λευκαντικό τελικής συγκέντρωσης 5% υποχλωριώδους νατρίου εντός 30 λεπτών, - είτε με αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για τουλάχιστον 2 ώρες. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μην εισάγετε στο αυτόκαυστο διαλύματα που περιέχουν υποχλωριώδες νάτριο Αποφεύγετε την επαφή του χρωμογόνου και του διαλύματος αναστολής με το δέρμα και τους βλεννογόνους (κίνδυνος τοξικότητας, ερεθισμού ή εγκαυμάτων). Ο χειρισμός και η απόρριψη χημικών ουσιών και βιολογικών απορριμμάτων θα πρέπει να εκτελείται σύμφωνα με την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Όλα τα αντιδραστήρια που περιλαμβάνονται στο κιτ προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. Για συστάσεις αναφορικά με τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται με κάποια χημικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήματα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση 3

4 6. ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ, ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ 1. Ο ορός και το πλάσμα (EDTA, ηπαρίνη ή κιτρικό οξύ) είναι οι συνιστώμενοι τύποι δείγματος. 2. Τηρήστε τις παρακάτω συστάσεις για το χειρισμό, την επεξεργασία και την αποθήκευση των δειγμάτων αίματος: Συλλέξτε όλα τα δείγματα αίματος τηρώντας τις προφυλάξεις ρουτίνας για φλεβοκέντηση. Για τον ορό, αφήστε τα δείγματα να πήξουν εντελώς πριν από τη φυγοκέντρηση. Διατηρείτε τα σωληνάρια κλειστά διαρκώς. Μετά τη φυγοκέντρηση, διαχωρίστε τον ορό ή το πλάσμα από το πήγμα ή τα ερυθρά αιμοσφαίρια σε ένα αεροστεγώς σφραγισμένο σωλήνα αποθήκευσης. Τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στους +2-8 C, εάν η εξέταση πραγματοποιηθεί εντός 7 ημερών. Εάν η εξέταση δεν πρόκειται να ολοκληρωθεί εντός 7 ημερών ή τα δείγματα πρόκειται να αποσταλούν, καταψύξτε τα στους -20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Μη χρησιμοποιείτε δείγματα που έχουν αποψυχθεί περισσότερες από πέντε φορές. Τα δείγματα που έχουν καταψυχθεί πρόσφατα πρέπει να αναμιγνύονται καλά (Vortex) μετά την απόψυξή τους και πριν από την εξέταση. 3. Τα δείγματα που περιέχουν 90 g/l λευκωματίνης ή 100 mg/l μη συζευγμένης χολερυθρίνης, τα λιπαιμικά δείγματα που περιέχουν 36 g/l τριελαΐνης (τριγλυκεριδίων) και τα αιμολυμένα δείγματα που περιέχουν έως και 10 g/l αιμοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσματα. 4. Μη θερμαίνετε τα δείγματα. 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 7.1 ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Αναδευτήρας τύπου Vortex. Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με φίλτρα 450 και 620 nm (*). Επωαστής μικροπλάκας με θερμοστατική ρύθμιση στους 37 ± 1 C (*). Αυτόματη, ημιαυτόματη ή χειροκίνητη συσκευή πλύσης μικροπλάκας (*). Αποστειρωμένο, αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Γάντια μίας χρήσης. Γυαλιά ασφαλείας. Απορροφητικό χαρτί. Αυτόματες ή ημιαυτόματες, ρυθμιζόμενες ή σταθερές πιπέτες ή πολυ-πιπέτες για τη μέτρηση και τη διοχέτευση ποσοτήτων 10 µl έως 1000 µl και 1 ml, 2 ml και 10 ml. Βαθμονομημένοι κύλινδροι χωρητικότητας 25 ml, 50 ml, 100 ml και 1000 ml. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διττανθρακικό νάτριο. Δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Σωληνάρια μίας χρήσης. (*) Για αναλυτικές πληροφορίες σχετικά με το συνιστώμενο εξοπλισμό, επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής υποστήριξης. 7.2 ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ R1: Πριν ανοίξετε τη σακούλα, αφήστε τη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ( C). Αφαιρέστε το δίσκο μεταφοράς, επιστρέψτε αμέσως τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στη σακούλα και βεβαιωθείτε ότι υπάρχει αποξηραντικό υλικό. Σφραγίστε ξανά προσεκτικά τη σακούλα και αποθηκεύστε την στους +2-8 C. R2: Αραιώστε το διάλυμα πλύσης R2 με αποσταγμένο νερό σε αναλογία 1/20: για παράδειγμα, 50 ml R2 και 950 ml αποσταγμένου νερού, για να λάβετε το έτοιμο για χρήση διάλυμα πλύσης. Προετοιμάστε 350 ml αραιωμένου διαλύματος πλύσης για μία πλάκα 12 ταινιών, εάν η πλύση εκτελείται χειροκίνητα. R3, R4, R5: Αραιώστε σε αναλογία 1/21 σε αραιωτικό (R7) (παράδειγμα: 15 µl R µl R7). R6+R7: Ο συζεύκτης (R6) είναι συμπυκνωμένος 51x και πρέπει να ομογενοποιηθεί πριν από τη χρήση. Αραιώστε σε αναλογία 1/51 σε αραιωτικό (R7). Για μία πλάκα, αναμίξτε 0,5 ml συζεύκτη (R6) σε 25 ml αραιωτικού (R7). Διαιρέστε αυτούς τους όγκους με το 5, για να λάβετε τον όγκο που απαιτείται για δύο ταινίες. 7.3 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΚΑΙ ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ ΑΝΟΙΚΤΩΝ Ή/ΚΑΙ ΑΝΑΣΥΣΤΑΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους +2-8 C. Όταν το κιτ αποθηκεύεται στους +2-8 C πριν από το άνοιγμα, κάθε συστατικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί έως την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην εξωτερική ετικέτα του κιτ. R1: Μετά το άνοιγμα, οι ταινίες παραμένουν σταθερές για 8 εβδομάδες εάν αποθηκευτούν στους +2-8 C στην ίδια προσεκτικά κλεισμένη σακούλα (ελέγξτε αν υπάρχει αποξηραντικό υλικό). R2: Μετά την αραίωση, το διάλυμα πλύσης μπορεί να διατηρηθεί για 2 εβδομάδες στους C. Εάν το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης αποθηκευτεί στους C και δεν υπάρξει μόλυνση, παραμένει σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. R3, R4, R5, R6, R7: Μετά το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, τα αντιδραστήρια που είναι αποθηκευμένα στους +2-8 C παραμένουν σταθερά έως και για 8 εβδομάδες. R6+R7: Μετά την αραίωση, το διάλυμα συζεύκτη παραμένει σταθερό για 8 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ( C) ή 24 ώρες στους +2-8 C. R9: Μετά το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευμένο στους +2-8 C παραμένει σταθερό έως και για 8 εβδομάδες. R10: Μετά από το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευμένο στους +2-8 C παραμένει σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. 4

5 7.4 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Τηρείτε αυστηρά τη διαδικασία ανάλυσης και την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Πριν από τη χρήση, αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου ( C). Εάν χρησιμοποιείτε εύθραυστα μικροβυθίσματα απαιτείται ειδική προσοχή κατά το χειρισμό. Χρησιμοποιείτε αρνητικούς και θετικούς ορούς ελέγχου και τους ορούς ελέγχου αναφοράς με κάθε ανάλυση, προκειμένου να εξασφαλίσετε την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων της ανάλυσης. 1. Καθορίστε προσεκτικά το διάγραμμα κατανομής και ταυτοποίησης για ορούς ελέγχου και δείγματα ασθενών. 2. Προετοιμάστε το αραιωμένο Διάλυμα Πλύσης (R2) [Ανατρέξτε στην ενότητα 7.2]. 3. Αφαιρέστε το δίσκο μεταφοράς και τις ταινίες (R1) από το προστατευτικό σακουλάκι [Ανατρέξτε στην ενότητα 7.2]. 4. Αραιώστε τους ορούς ελέγχου R3, R5, το βαθμονομητή R4 και τα δείγματα ασθενών (S1, S2 ) σε αραιωτικό (R7) σε αναλογία 1/21: 15 µl δείγματος και 300 µl αραιωτικού (R7). Στροβιλίστε τα αραιωμένα δείγματα. 5. Ακολουθώντας αυστηρά την παρακάτω διαδικασία, διοχετεύστε σε κάθε μικροβύθισμα 200µl αραιωμένους ορούς ελέγχου και δείγματα ασθενών: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Καλύψτε τη μικροπλάκα με ένα αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας και, στη συνέχεια, πιέστε σταθερά την πλάκα για να εξασφαλίσετε στεγανή σφράγιση. Επωάστε τη μικροπλάκα αμέσως σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερμοστάτη ή σε ξηρό επωαστή για 1 ώρα 5 λεπτά στους 37 C 1 C. 7. Στο τέλος της πρώτης περιόδου επώασης, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε το περιεχόμενο όλων των μικροβυθισμάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τη μικροπλάκα 4 φορές με 350 µl διαλύματος πλύσης (R2). Αναστρέψτε τη μικροπλάκα και σκουπίστε απαλά με απορροφητικό χαρτί για να αφαιρεθεί το υγρό που απέμεινε. 8. Προετοιμάστε το διάλυμα συζεύκτη εργασίας (R6+R7) [Ανατρέξτε στην ενότητα 7.2]. Διοχετεύστε αμέσως 200 µl διαλύματος συζεύκτη εργασίας (R6+R7) σε όλα τα μικροβυθίσματα. Το διάλυμα πρέπει να αναδεύεται απαλά πριν από τη χρήση. 9. Καλύψτε τη μικροπλάκα με ένα αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας και, στη συνέχεια, πιέστε σταθερά την πλάκα για να εξασφαλίσετε στεγανή σφράγιση. Επωάστε τη μικροπλάκα αμέσως σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερμοστάτη ή σε ξηρό επωαστή για 1 ώρα 5 λεπτά στους 37 C 1 C. 10. Στο τέλος της δεύτερης περιόδου επώασης, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε το περιεχόμενο όλων των μικροβυθισμάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τη μικροπλάκα 4 φορές με 350 µl διαλύματος πλύσης (R2). Αναστρέψτε τη μικροπλάκα και σκουπίστε απαλά με απορροφητικό χαρτί για να αφαιρεθεί το υγρό που απέμεινε. 11. Κατανείμετε γρήγορα σε κάθε μικροβύθισμα και μακριά από το φως 200 µl διαλύματος χρωμογόνου (R9). H αντίδραση θα πρέπει να πραγματοποιηθεί σε σκοτεινό μέρος για 30 ± 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ( C). Μη χρησιμοποιείτε αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας κατά τη διάρκεια της συγκεκριμένης επώασης. 12. Σταματήστε την ενζυμική αντίδραση προσθέτοντας 100 µl Διαλύματος Αναστολής (R10) σε κάθε μικροβύθισμα. Χρησιμοποιείτε την ίδια ακολουθία και συχνότητα κατανομής με αυτές του διαλύματος ανάπτυξης. 13. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω μέρος της πλάκας. Διαβάστε την τιμή οπτικής πυκνότητας στα 450/620 nm χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. Οι ταινίες πρέπει να φυλάσσονται πάντα μακριά από το φως πριν από την ανάγνωση. 14. Πριν αναφέρετε τα αποτελέσματα, ελέγξτε την αντιστοιχία μεταξύ της ένδειξης και του διαγράμματος κατανομής της πλάκας και των δειγμάτων. 8 ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 8.1 Υπολογισμός τιμής αναφοράς (CO) Η τιμή αναφοράς (CO) αντιστοιχεί στη μέση τιμή των οπτικών πυκνοτήτων (OD) των διπλών εξετάσεων βαθμονομητή (R4): τιμή αναφοράς (CO) = μέση τιμή οπτικής πυκνότητας (OD) R4 8.2 Υπολογισμός του λόγου δείγματος Το αποτέλεσμα του δείγματος εκφράζεται ως λόγος με τον παρακάτω τύπο: Λόγος δείγματος = OD δείγματος / CO 5

6 8.3 Ποιοτικός Έλεγχος Συμπεριλάβετε όλους τους ορούς ελέγχου για κάθε μικροπλάκα και για κάθε ανάλυση και αναλύστε τα αποτελέσματα που λαμβάνετε. Για την εγκυρότητα της ανάλυσης, θα πρέπει να πληρούνται τα εξής κριτήρια: Τιμές οπτικής πυκνότητας: - CO 0,300-0,80 x CO < OD R4 αντίγραφο 1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 αντίγραφο 2 < 1,20 x CO (Η μεμονωμένη οπτική πυκνότητα κάθε αντιγράφου του βαθμονομητή (R4) δεν πρέπει να διαφέρει περισσότερο από 20% της τιμής CO). Λόγοι οπτικής πυκνότητας: - Λόγος R3 (OD R3 / CO) 0,50 - Λόγος R5 (OD R5 / CO) 1,80 Εάν αυτά τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου δεν πληρούνται, η ανάλυση της εξέτασης θα πρέπει να επαναληφθεί. 8.4 Ερμηνεία αποτελεσμάτων Λόγος δείγματος Αποτέλεσμα Ερμηνεία Λόγος < 0,90 Αρνητικό Το δείγμα θεωρείται αρνητικό στην παρουσία αντισωμάτων IgG έναντι του ιού HSV 2. 0,90 Λόγος < 1,10 Διφορούμενο Το δείγμα θεωρείται διφορούμενο στην παρουσία αντισωμάτων IgG έναντι του ιού HSV 2. Το αποτέλεσμα θα πρέπει να επιβεβαιωθεί με επανάληψη της εξέτασης σε δεύτερο δείγμα που λαμβάνεται 4 έως 12 εβδομάδες μετά το πρώτο. Λόγος 1,10 Θετικό Το δείγμα θεωρείται θετικό στην παρουσία αντισωμάτων IgG έναντι του ιού HSV 2. Εάν υπάρχει υποψία για λοίμωξη, συμπληρωματικές ορολογικές εξετάσεις όπως η ανίχνευση αντισωμάτων IgM anti-hsv μπορούν να αποδειχθούν χρήσιμες για την επιβεβαίωση της διάγνωσης. 8.5 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Αντιδράσεις που δεν επαληθεύονται ή δεν επαναλαμβάνονται συχνά προκαλούνται από: Ανεπαρκή πλύση της μικροπλάκας. Μόλυνση αρνητικών δειγμάτων από ορό ή πλάσμα με υψηλό τίτλο αντισωμάτων. Μόλυνση του διαλύματος ανάπτυξης από χημικούς οξειδωτικούς παράγοντες (λευκαντικό, μεταλλικά ιόντα...). Μόλυνση του Διαλύματος Αναστολής. 9 - ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ To Platelia HSV 2 IgG έχει αξιολογηθεί σε 2 διαφορετικές τοποθεσίες, σε συνολικά 751 φρέσκα και κατεψυγμένα δείγματα.τα αποτελέσματα που προέκυψαν με το Platelia HSV 2 IgG συγκρίθηκαν με εκείνα που λήφθηκαν με άλλες ανοσοενζυμικές αναλύσεις (ΕΙΑ) του εμπορίου. 9.1 Συχνότητα εμφάνισης Ο προσδιορισμός της συχνότητας εμφάνισης των αντισωμάτων IgG έναντι του ιού του απλού έρπητα τύπου 2 στον ανθρώπινο ορό διεξήχθη χρησιμοποιώντας έναν πίνακα 180 δειγμάτων που λήφθηκαν από έγκυες γυναίκες. Προέκυψαν τα παρακάτω αποτελέσματα: 155 αρνητικοί και 25 θετικοί οροί. Με την ανάλυση Platelia HSV 2 IgG η συχνότητα εμφάνισης καθορίστηκε στο 13,9% (25/180). 6

7 9.2 Ειδικότητα Η ειδικότητα υπολογίστηκε σε ένα σύνολο 558 ορών: στην τοποθεσία 1, ένας πίνακας 312 ορών από δότη αίματος, έγκυες γυναίκες & πίνακες εμπορίου (CDC (A) /BBI (B) ). στην τοποθεσία 2, ένας πίνακας 247 ορών από ασθενείς υπό νοσοκομειακή περίθαλψη. Και στις δύο τοποθεσίες, τα δείγματα επιλέχθηκαν σύμφωνα με τα αρνητικά αποτελέσματα που λήφθηκαν με ανοσοενζυμική ανάλυση (ΕΙΑ) του εμπορίου που θεωρείται μέθοδος αναφοράς. Πίνακας ορών Αρνητικό Διφορούμενο (1) Θετικό Ειδικότητα Τοποθεσία 1 N = ,4% (305/310) [96,3%-99,5%] Τοποθεσία 2 N = ,1% (231/243) [91,5%-97,4%] Σύνολο N = ,9% (536/553) [95,1%-98,2%] (1) τα διφορούμενα αποτελέσματα εξαιρέθηκαν από τον υπολογισμό της ειδικότητας IC 95%: διάστημα εμπιστοσύνης 95%. (A): Center for Disease Control, (B) BBI πίνακας HSV μικτού τίτλου 9.3 Ευαισθησία Η ευαισθησία υπολογίστηκε σε ένα σύνολο 172 ορών: στην τοποθεσία 1, ένας πίνακας 135 ορών από δότη αίματος, έγκυες γυναίκες & πίνακες εμπορίου (CDC (A) /BBI (B) ). στην τοποθεσία 2, ένας πίνακας 57 ορών από ασθενείς υπό νοσοκομειακή περίθαλψη. Και στις δύο τοποθεσίες, τα δείγματα επιλέχθηκαν σύμφωνα με τα αρνητικά αποτελέσματα που λήφθηκαν με ανοσοενζυμική ανάλυση (ΕΙΑ) του εμπορίου που θεωρείται μέθοδος αναφοράς. Πίνακας ορών Αρνητικό Διφορούμενο (1) Θετικό Ευαισθησία Τοποθεσία 1 N = ,2% (131/132) [95,8%-100%] Τοποθεσία 2 N = % (57/57) [94,9%-100%] Σύνολο N = ,5% (188/189) [97,1%-100%] (1) τα διφορούμενα αποτελέσματα εξαιρέθηκαν από τον υπολογισμό της ειδικότητας 7

8 9.4 Ακρίβεια Ακρίβεια εντός της ανάλυσης (επαναληψιμότητα) : Για να αξιολογηθεί η επαναληψιμότητα εντός της ανάλυσης, εξετάστηκαν ένα αρνητικό, ένα διφορούμενο και ένα θετικό δείγμα, 30 φορές κατά τη διάρκεια της ίδιας ανάλυσης. Ο λόγος (OD δείγματος / CO) καθορίστηκε για κάθε δείγμα. Η μέση τιμή λόγου, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%CV) για κάθε ένα από τα τρία δείγματα αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα: N=30 Αρνητικό δείγμα Διφορούμενο δείγμα Λόγος (OD δείγματος / τιμή αναφοράς) Θετικό δείγμα χαμηλής συγκέντρωσης Μέση τιμή 0,82 0,97 1,30 SD 0,08 0,10 0,09 %CV 9,99% 9,87% 7,26% Ακρίβεια μεταξύ των αναλύσεων (αναπαραγωγιμότητα): Για να αξιολογηθεί η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των αναλύσεων, εξετάστηκαν εις διπλούν ένα αρνητικό και τρία θετικά δείγματα (θετικά δείγματα χαμηλής, μεσαίας και υψηλής συγκέντρωσης) σε δύο αναλύσεις την ημέρα, για περίοδο 20 ημερών. Ο λόγος (OD δείγματος / CO) καθορίστηκε για κάθε δείγμα. Η μέση τιμή λόγου, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%CV) για κάθε ένα από τα τέσσερα δείγματα αναφέρεται στον παρακάτω πίνακα: N=80 Αρνητικό δείγμα Θετικό δείγμα χαμηλής συγκέντρωσης Θετικό δείγμα μέσης συγκέντρωσης Θετικό δείγμα υψηλής συγκέντρωσης Λόγος (OD δείγματος / τιμή αναφοράς) Μέση τιμή 0,17 1,56 2,74 3,44 SD 0,02 0,16 0,33 0,38 %CV 13,1% 10,2% 11,9% 11,0% 9.5 Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα 105 δείγματα με χαρακτηριστικά που θα μπορούσαν ενδεχομένως να οδηγήσουν σε μη ειδικές αντιδράσεις εξετάστηκαν με την ανάλυση Platelia HSV 2 IgG. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας VZV (Ιός ανεμευλογιάς έρπητα ζωστήρα) Αριθμός δειγμάτων Επιβεβαίωση θετικών Διφορούμεν ο (1) Θετικό αποτελεσμάτων σύμφωνα με ορολογία αναφοράς /2 CMV (κυτταρομεγαλοϊός) /3 EBV (Ιός Έπσταϊν-Μπαρ) /1 Ρευματοειδής παράγοντας /4 Ετερόφιλα αντισώματα (HAMA) /2 Αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA) /2 HHV 6 (Ιός του έρπητα 6) /2 HIV (Ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας) /8 Παρωτίτιδα /2 Ιλαρά /1 ΣΥΝΟΛΟ /27 (1) Τα διφορούμενα αποτελέσματα εξαιρέθηκαν από την αξιολόγηση της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας. Όλα τα θετικά αποτελέσματα με την ανάλυση Platelia HSV 2 IgG επιβεβαιώθηκαν ως θετικά με την ανοσοενζυμική ανάλυση (ΕΙΑ) του εμπορίου. 8

9 10 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η διάγνωση της λοίμωξης από τον ιό του απλού έρπητα θα πρέπει να βασίζεται αποκλειστικά σε συνδυασμό κλινικών και βιολογικών στοιχείων. Το αποτέλεσμα μίας μόνο εξέτασης ανίχνευσης αντισωμάτων IgG anti-hsv δεν αποτελεί επαρκή απόδειξη για τη διάγνωση της λοίμωξης από τον ιό του απλού έρπητα. 11 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα παρασκευασμένα αντιδραστήρια προετοιμάζονται σύμφωνα με το Σύστημα Ποιότητας που διαθέτουμε, ξεκινώντας από την παραλαβή των πρώτων υλών μέχρι την εμπορευματοποίηση του τελικού προϊόντος. Κάθε παρτίδα υποβάλλεται σε αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου και διατίθεται στην αγορά μόνο εφόσον διασφαλιστεί ότι συμμορφώνεται με τα προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία που σχετίζονται με την παραγωγή και τους ελέγχους κάθε μεμονωμένης παρτίδας φυλάσσονται εντός των εγκαταστάσεων της Bio-Rad. 12 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Centers for Disease Control and Prevention. Sexually transmitted diseases treatment guidelines MMWR 2002:51 (No. RR-6). 2. Arvin, A, C Prober. Herpes Simplex Viruses In Murray, P, E Baron, M Pfaller, F Tenover, and R Yolkenet (eds.). Manual of Clinical Microbiology. 6th Ed. ASM, Washington, D.C. (1995) 9

10 10

11 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)