/11 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ

Transcript

1 PLATELIA Toxo IgM 1 Πλακέτα ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgM ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ TOXOPLASMA GONDII ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΠΛΑΣΜΑ ΜΕ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ /11 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Η εξέταση Platelia Toxo IgM είναι μια ανοσοενζυμική ανάλυση που χρησιμοποιεί τη μέθοδο ανοσοκαθήλωσης για την ποιοτική ανίχνευση αντισωμάτων IgG έναντι του παρασίτου Toxoplasma gondii στον ανθρώπινο ορό ή πλάσμα. 2. ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Το παράσιτο T. gondii είναι ένα πρωτόζωο που προκαλεί λοιμώξεις σε πολλά είδη θηλαστικών και πτηνών. Η τοξοπλάσμωση, μια λοίμωξη που απαντάται συχνά σε ανθρώπους και ζώα, είναι συνήθως ασυμπτωματική. Η συχνότητα εμφάνισης της λοίμωξης αυτής στον πληθυσμό, που καθορίστηκε με ορολογικές εξετάσεις, ενδέχεται να διαφέρει ανάλογα με τη χώρα προέλευσης και την ηλικία. Η τοξοπλάσμωση κατά τη διάρκεια της κύησης θεωρείται υπεύθυνη για σοβαρές συγγενείς ανωμαλίες (πιο συγκεκριμένα, διαταραχή εγκεφαλικών λειτουργιών) και ορισμένες φορές για θνησιγένεια. Η παρουσία του αντισώματος Toxo IgG στις γυναίκες πριν από τη σύλληψη διασφαλίζει την προστασία του εμβρύου έναντι ενδεχόμενης τοξοπλάσμωσης κατά τη διάρκεια της κύησης. Τα άτομα που πάσχουν από το Σύνδρομο Επίκτητης Ανοσοποιητικής Ανεπάρκειας (AIDS) ή αντιμετωπίζουν άλλες καταστάσεις ανοσοκαταστολής παρουσιάζουν συχνά προδιάθεση για σοβαρή τοξοπλάσμωση. Οι λοιμώξεις αυτές οφείλονται κυρίως στην επανενεργοποίηση των κύστεων του παρασίτου T. gondii που προϋπήρχαν της λοίμωξης HIV. Η ειδική διάγνωση της λοίμωξης από T. gondii μπορεί να είναι περίπλοκη και η απομόνωση του παρασίτου είναι σπάνια. Η ορολογική επιβεβαίωση του αντισώματος T. gondii αποτελεί ένδειξη της έκθεσης στο παράσιτο και είναι ευρέως αποδεκτή ως μέσο καθορισμού της ανοσολογικής κατάστασης και της ευαισθησίας στη λοίμωξη. Η ανίχνευση διαφόρων ισοτύπων καθιστά δυνατή είτε τη χρονολόγηση του παρασίτου T. gondii και τη χορήγηση της κατάλληλης θεραπευτικής αγωγής σε περίπτωση πρόσφατης λοίμωξης, είτε τη σύσταση μέτρων προφύλαξης, όπως: οδηγίες υγιεινής διατροφής σε εγκύους, χημειοπροφύλαξη σε άτομα με ανοσοκαταστολή. 3. ΑΡΧΗ Η εξέταση Platelia Toxo IgM είναι μια ποιοτική εξέταση για ανίχνευση αντισωμάτων IgM έναντι του παρασίτου T. gondii στον ανθρώπινο ορό ή πλάσμα με ανοσοενζυμική ανάλυση και καθήλωση του IgM στη στερεά φάση. Τα αντι-ανθρώπινα αντισώματα μ-αλυσίδων είναι επικαλυμμένα στη στερεά φάση (μικροβυθίσματα της μικροπλάκας). Ως συζεύκτης χρησιμοποιείται ένα μίγμα αντιγόνου T. gondii και μονόκλωνου αντισώματος anti-t. gondii, επισημασμένο με υπεροξειδάση. Η εξέταση περιλαμβάνει τα παρακάτω βήματα: Βήμα 1 Τα δείγματα των ασθενών, οι βαθμονομητές και οι οροί ελέγχου αραιώνονται σε αναλογία 1/21 και, στη συνέχεια, κατανέμονται στα μικροβυθίσματα της μικροπλάκας. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης μίας ώρας στους 37 C, τα αντισώματα IgM που υπάρχουν στο δείγμα δεσμεύονται στα αντισώματα anti-µ με τα οποία έχουν επικαλυφθεί τα μικροβυθίσματα της μικροπλάκας. Μετά την επώαση, τα αντισώματα IgG και άλλες πρωτεΐνες ορού απομακρύνονται με πλύσεις. 1

2 Βήμα 2 Ο συζεύκτης (μίγμα αντιγόνου T. gondii και μονόκλωνου αντισώματος anti-t. gondii, επισημασμένο με υπεροξειδάση) προστίθεται στα μικροβυθίσματα της μικροπλάκας. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης μίας ώρας στους 37 C, ο συζεύκτης δεσμεύεται στα ειδικά αντισώματα IgM anti-t. gondii που καθηλώνονται τελικά στη μικροπλάκα. Ο αδέσμευτος συζεύκτης απομακρύνεται με πλύσεις στο τέλος της επώασης. Βήμα 3 Η παρουσία ανοσοσυμπλεγμάτων (αντι-ανθρώπινα αντισώματα μ-αλυσίδων / IgM anti-t. gondii / αντιγόνο T. gondii / μονόκλωνο αντίσωμα T. gondii επισημασμένο με υπεροξειδάση) καταδεικνύεται από την προσθήκη σε κάθε μικροβύθισμα ενός ενζυματικού διαλύματος ανάπτυξης. Βήμα 4 Μετά την επώαση σε θερμοκρασία δωματίου ( C), η ενζυμική αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη ενός διαλύματος θειικού οξέος 1N. Η ένδειξη οπτικής πυκνότητας που λαμβάνεται με φασματοφωτόμετρο ρυθμισμένο σε μήκος κύματος 450/620 nm είναι ανάλογη της ποσότητας αντισωμάτων IgM έναντι του παρασίτου T. gondii που υπάρχουν στο δείγμα. 4. ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για την εκτέλεση 96 εξετάσεων. Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. Ετικέτα Φύση των αντιδραστηρίων Παρουσίαση R1 Μικροπλάκα Μικροπλάκα: (Έτοιμο για χρήση): 12 ταινίες με 8 αποσπώμενα μικροβυθίσματα, R2 R3 Συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης (20x) Αρνητικός ορός ελέγχου επικαλυμμένα με αντι-ανθρώπινα αντισώματα μ-αλυσίδων Συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης (20x): Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Συντηρητικό: 0,04% ProClin 300 Αρνητικός ορός ελέγχου: Ανθρώπινος ορός, αρνητικός για αντισώματα IgM έναντι του παρασίτου T. gondii και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: 0,098% ProClin 300 R4 Βαθμονομητής Βαθμονομητής: Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώματα IgM έναντι του παρασίτου T. gondii και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti- HIV1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: 0,098% ProClin 300 R5 Θετικός ορός ελέγχου Θετικός ορός ελέγχου: Ανθρώπινος ορός, θετικός για αντισώματα IgM έναντι του παρασίτου T. gondii και αρνητικός για αντιγόνα HBs, anti- HIV1, anti- HIV2 και anti-hcv Συντηρητικό: 0,098% ProClin 300 R6a Αντιγόνο Αντιγόνο T. gondii: Λυοφιλιωμένο αντιγόνο T. gondii: R6b Συζεύκτης (101x) Συζεύκτης (101x): Μονόκλωνα αντισώματα ποντικού anti-t. gondii (P30) επισημασμένα με υπεροξειδάση Συντηρητικό: 0,159% ProClin x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2 x qsp. 14 ml 1 x 0,4 ml 2

3 Ετικέτα Φύση των αντιδραστηρίων Παρουσίαση R7 Αραιωτικό Αραιωτικό για δείγματα και συζεύκτη (έτοιμο για χρήση): Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS-NaCl (ph 7,7), λευκωματίνη βόειου ορού, 0,1% Tween 20 και ερυθρό της φαινόλης. Συντηρητικό: 0,148% ProClin 300 R9 R10 Χρωμογόνο TMB Διάλυμα αναστολής Χρωμογόνο (έτοιμο για χρήση): τετραμεθυλοβενζιδίνη (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) Διάλυμα αναστολής (έτοιμο για χρήση): Διάλυμα θειικού οξέος 1 N 1 x 80 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Για τις συνθήκες αποθήκευσης και την ημερομηνία λήξης, ανατρέξτε στις ενδείξεις που αναγράφονται στη συσκευασία. 5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η αξιοπιστία των αποτελεσμάτων εξαρτάται από τη σωστή εφαρμογή της ακόλουθης ορθής εργαστηριακής πρακτικής: Μη χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Μην αναμιγνύετε και μη συνδυάζετε σε μια συγκεκριμένη ανάλυση αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Για το διάλυμα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20x, πράσινου χρώματος), χρωμογόνο (R9, στοιχεία ετικέτας: TMB, γαλαζοπράσινου χρώματος) και το διάλυμα αναστολής (R10, στοιχεία ετικέτας: 1N, κόκκινου χρώματος) μπορείτε να χρησιμοποιήσετε διαφορετικές παρτίδες από εκείνες που περιλαμβάνονται στο κιτ, με την προϋπόθεση ότι αυτά τα αντιδραστήρια είναι απολύτως ισοδύναμα και ότι θα χρησιμοποιηθεί η ίδια παρτίδα σε μια συγκεκριμένη ανάλυση. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Επιπλέον, το διάλυμα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20x, πράσινου χρώματος) μπορεί να αναμιχθεί με τα υπόλοιπα 2 διαλύματα πλύσης που συμπεριλαμβάνονται σε διάφορα κιτ αντιδραστηρίων της Bio-Rad (R2, στοιχεία ετικέτας: 10x, μπλε χρώματος ή 10x, πορτοκαλί χρώματος), μετά από κατάλληλη ανασύσταση και με την προϋπόθεση ότι θα χρησιμοποιηθεί μόνο ένα μίγμα σε μια συγκεκριμένη ανάλυση. Πριν από τη χρήση, περιμένετε 30 λεπτά, ώστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου ( C). Ανασυστήστε προσεκτικά ή αραιώστε τα αντιδραστήρια αποφεύγοντας τυχόν μόλυνση. Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυμική δραστηριότητα του συζεύκτη. Χρησιμοποιείτε υλικά από γυαλί που έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά με απιονισμένο νερό ή κατά προτίμηση υλικά μίας χρήσης. Η πλύση της μικροπλάκας αποτελεί ιδιαίτερα σημαντικό στάδιο σε αυτήν τη διαδικασία: τηρείτε το συνιστώμενο αριθμό κύκλων πλύσης και βεβαιωθείτε ότι όλα τα μικροβυθίσματα είναι πλήρως γεμάτα και, στη συνέχεια, άδεια. Οι εσφαλμένες πλύσεις ενδέχεται να οδηγήσουν σε ανακριβή αποτελέσματα. Μην αφήνετε τη μικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστημα από το τέλος των πλύσεων και μέχρι την κατανομή των αντιδραστηρίων. Μη χρησιμοποιείτε ποτέ το ίδιο δοχείο για την κατανομή του συζεύκτη και του διαλύματος ανάπτυξης. Η ενζυμική αντίδραση είναι εξαιρετικά ευαίσθητη σε μέταλλα ή μεταλλικά ιόντα. Επομένως, κανένα μεταλλικό στοιχείο δεν πρέπει να έρχεται σε επαφή με τα διάφορα διαλύματα που περιέχουν συζεύκτη ή χρωμογόνο. Το διάλυμα χρωμογόνου (R9) θα πρέπει να είναι άχρωμο. Η εμφάνιση μπλε χρώματος δηλώνει ότι το αντιδραστήριο δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί και πρέπει να αντικατασταθεί. Για κάθε δείγμα χρησιμοποιείτε νέο ακροφύσιο πιπέτας. Ελέγχετε αν οι πιπέτες και ο υπόλοιπος εξοπλισμός λειτουργούν σωστά και με ακρίβεια. 3

4 Οδηγίες για την υγιεινή και την ασφάλεια Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιήθηκε στην προετοιμασία αντιδραστηρίων εξετάστηκε και βρέθηκε αρνητικό στην παρουσία αντιγόνου επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), αντισωμάτων κατά του ιού της ηπατίτιδας C (anti-hcv) και του ιού της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (anti-hiv1 και anti HIV2). Καθώς καμία μέθοδος δεν μπορεί να εγγυηθεί απολύτως την απουσία μολυσματικών παραγόντων, πρέπει να χειρίζεστε τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης και τα δείγματα ασθενή ως εν δυνάμει μολυσματικά: Οποιοδήποτε υλικό, συμπεριλαμβανομένων των διαλυμάτων πλύσης, που έρχεται σε άμεση επαφή με δείγματα και αντιδραστήρια που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης, θα πρέπει να θεωρείται εν δυνάμει μολυσματικό. Χρησιμοποιείτε γάντια μίας χρήσης κατά το χειρισμό δειγμάτων και αντιδραστηρίων. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. Αποφεύγετε τη διαρροή δειγμάτων ή διαλυμάτων που περιέχουν μολυσματικά υλικά. Τυχόν κηλίδες πρέπει να καθαρίζονται με λευκαντικό αραιωμένο κατά 10%. Στην περίπτωση κηλίδων οξέος, οι κηλίδες πρέπει αρχικά να εξουδετερωθούν με διττανθρακικό νάτριο και, στη συνέχεια, να καθαριστούν με λευκαντικό αραιωμένο κατά 10% και να σκουπιστούν με απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για μολυσμένα απορρίμματα. Τα δείγματα ασθενών, τα αντιδραστήρια που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και τα μολυσμένα υλικά και προϊόντα θα πρέπει να απορρίπτονται μετά την απολύμανση αποκλειστικά: - με εμβάπτιση σε λευκαντικό τελικής συγκέντρωσης 5% υποχλωριώδους νατρίου εντός 30 λεπτών, - ή με αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για τουλάχιστον 2 ώρες. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μην τοποθετείτε στο αυτόκαυστο διαλύματα που περιέχουν υποχλωριώδες νάτριο Αποφεύγετε τυχόν επαφή του δέρματος και του βλεννογόνου με τα αντιδραστήρια, συμπεριλαμβανομένων όσων δεν θεωρούνται επικίνδυνα. Ο χειρισμός και η απόρριψη χημικών ουσιών και βιολογικών απορριμμάτων πρέπει να εκτελείται σύμφωνα με την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Για συστάσεις αναφορικά με τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται με κάποια χημικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήματα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση 6. ΔΕΙΓΜΑΤΑ 1. Ο ορός και το πλάσμα (EDTA, ηπαρίνη ή κιτρικό οξύ) είναι οι συνιστώμενοι τύποι δείγματος. 2. Τηρείτε τις παρακάτω συστάσεις για το χειρισμό, την επεξεργασία και την αποθήκευση δειγμάτων αίματος: Συλλέγετε όλα τα δείγματα αίματος τηρώντας τις συνήθεις προφυλάξεις για φλεβοκέντηση. Για τον ορό, περιμένετε μέχρι τα δείγματα να πήξουν πλήρως πριν από τη φυγοκέντρηση. Διατηρείτε τα σωληνάρια κλειστά διαρκώς. Μετά τη φυγοκέντρηση, διαχωρίζετε τον ορό ή το πλάσμα από το πήγμα ή τα ερυθρά αιμοσφαίρια σε αεροστεγώς σφραγισμένο σωληνάριο αποθήκευσης. Τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στους +2-8 C, εάν η εξέταση πραγματοποιηθεί εντός 7 ημερών. Εάν η εξέταση δεν πρόκειται να ολοκληρωθεί εντός 7 ημερών ή τα δείγματα πρόκειται να αποσταλούν, καταψύξτε τα στους -20 C ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Μη χρησιμοποιείτε δείγματα που έχουν αποψυχθεί περισσότερες από 3 φορές. Τα δείγματα που έχουν καταψυχθεί πρόσφατα θα πρέπει να αναμιγνύονται καλά (Vortex) μετά την απόψυξή τους και πριν από την εξέταση. 3. Τα δείγματα που περιέχουν 90 g/l λευκωματίνης ή 100 mg/l μη συζευγμένης χολερυθρίνης, τα λιπαιμικά δείγματα που περιέχουν 36 g/l τριελαΐνης (τριγλυκεριδίων) και τα αιμολυμένα δείγματα που περιέχουν έως και 10 g/l αιμοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσματα. 4. Μη θερμαίνετε τα δείγματα. 4

5 7. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 7.1 Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Αναδευτήρας τύπου Vortex. Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με φίλτρα 450 και 620 nm (*). Επωαστής μικροπλάκας με θερμοστατική ρύθμιση στους 37 ± 1 C (*). Αυτόματη, ημιαυτόματη ή χειροκίνητη συσκευή πλύσης μικροπλάκας (*). Αποστειρωμένο, αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Γάντια μίας χρήσης. Γυαλιά ασφαλείας. Απορροφητικό χαρτί. Αυτόματες ή ημιαυτόματες, ρυθμιζόμενες ή σταθερές πιπέτες ή πολυ-πιπέτες για τη μέτρηση και τη διοχέτευση 10 µl έως 1000 µl και 1 ml, 2 ml και 10 ml. Βαθμονομημένοι κύλινδροι χωρητικότητας 25 ml, 50 ml, 100 ml και 1000 ml. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διττανθρακικό νάτριο. Δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Σωληνάρια μίας χρήσης. (*) Για αναλυτικές πληροφορίες σχετικά με το συνιστώμενο εξοπλισμό, επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής υποστήριξης. 7.2 Ανασύσταση αντιδραστηρίων R1: Αφήστε τη μικροπλάκα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ( C) πριν ανοίξετε τη σακούλα. Αφαιρέστε το δίσκο μεταφοράς, τοποθετήστε αμέσως τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στη σακούλα και βεβαιωθείτε ότι υπάρχει αποξηραντικό υλικό. Σφραγίστε ξανά προσεκτικά τη σακούλα και αποθηκεύστε την στους +2-8 C. R2: Αραιώστε το διάλυμα πλύσης R2 με αποσταγμένο νερό σε αναλογία 1/20: για παράδειγμα, 50 ml R2 και 950 ml αποσταγμένου νερού, για να δημιουργηθεί το έτοιμο για χρήση διάλυμα πλύσης. Προετοιμάστε 350 ml αραιωμένου διαλύματος πλύσης για μία πλάκα 12 ταινιών, εάν η πλύση εκτελείται χειροκίνητα. R3, R4, R5: Αραιώστε σε αναλογία 1/21 με αραιωτικό (R7) (παράδειγμα: 300 μl R µl βαθμονομητή ή ορού ελέγχου). R6a: Το αντιγόνο T. gondii είναι λυοφιλιωμένο. Για την ανάλυση 6 ταινιών, ανασυστήστε ένα φιαλίδιο λυοφιλιωμένου αντιγόνου προσθέτοντας 14 ml αραιωτικού (R7). Αναμίξτε καλά. Μετά την αραίωση, το διάλυμα αντιγόνου (R6a+R7) θα πρέπει να είναι πλήρως διαυγές. R6 (R6a+R6b) - Διάλυμα συζεύκτη εργασίας: Προσθέστε 140 μl συζεύκτη (R6b) σε κάθε φιαλίδιο ανασυσταμένου αντιγόνου T. gondii (αραιωμένο R6a). Αναμίξτε καλά. Το διάλυμα συζεύκτη εργασίας πρέπει να ανασυσταθεί τουλάχιστον 1 ώρα πριν από τη χρήση. 7.3 Αποθήκευση και εγκυρότητα ανοικτών και/ή ανασυσταμένων αντιδραστηρίων Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται στους +2-8 C. Όταν το κιτ αποθηκεύεται στους +2-8 C πριν από το άνοιγμα, κάθε συστατικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί έως την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην εξωτερική ετικέτα του κιτ. R1: Μετά το άνοιγμα, οι ταινίες παραμένουν σταθερές έως και για 8 εβδομάδες, εάν αποθηκευτούν στους +2-8 C στην ίδια προσεκτικά κλεισμένη σακούλα (ελέγξτε αν υπάρχει αποξηραντικό υλικό). R2: Μετά την αραίωση, το διάλυμα πλύσης μπορεί να διατηρηθεί για 2 εβδομάδες στους C. Μετά το άνοιγμα, εάν το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης αποθηκευτεί στους C και δεν παρατηρηθεί μόλυνση, παραμένει σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. R3, R4, R5, R6b, R7: Μετά το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, τα αντιδραστήρια που είναι αποθηκευμένα στους +2-8 C παραμένουν σταθερά έως και για 8 εβδομάδες. R6 (R6a+R6b): Μετά την ανασύσταση, το διάλυμα συζεύκτη εργασίας παραμένει σταθερό για 8 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου ( C) ή 4 εβδομάδες στους +2-8 C. R9: Μετά το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευμένο στους +2-8 C παραμένει σταθερό έως και για 8 εβδομάδες. R10: Μετά από το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευμένο στους +2-8 C παραμένει σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. 5

6 7.4 Διαδικασία Τηρείτε αυστηρά τη διαδικασία ανάλυσης και την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Πριν από τη χρήση, αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου ( C). Εάν χρησιμοποιείτε εύθραυστα μικροβυθίσματα απαιτείται ειδική προσοχή κατά το χειρισμό. Χρησιμοποιείτε όλους τους βαθμονομητές με κάθε ανάλυση, ώστε να διασφαλιστεί η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων της ανάλυσης. 1. Καθορίστε προσεκτικά το διάγραμμα κατανομής και ταυτοποίησης για βαθμονομητές και δείγματα ασθενών. 2. Προετοιμάστε το αραιωμένο διάλυμα πλύσης (R2) [Ανατρέξτε στην ενότητα 7.2]. 3. Αφαιρέστε το δίσκο μεταφοράς και τις ταινίες (R1) από το προστατευτικό σακουλάκι [Ανατρέξτε στην ενότητα 7.2]. 4. Προετοιμάστε το διάλυμα συζεύκτη εργασίας R6 (R6a+R6b) [Ανατρέξτε στην ενότητα 7.2]. 5. Σε κατάλληλα επισημασμένα σωληνάρια, αραιώστε το βαθμονομητή (R4), τους ορούς ελέγχου (R3, R5) και τα δείγματα ασθενών (S1, S2 ) με αραιωτικό (R7) σε αναλογία 1/21: 300 µl αραιωτικού (R7) και 15 μl δείγματος. Στροβιλίστε τα αραιωμένα δείγματα. 6. Ακολουθώντας αυστηρά την παρακάτω σειρά, διοχετεύστε σε κάθε μικροβύθισμα 200µl αραιωμένων βαθμονομητών και δειγμάτων ασθενών: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Καλύψτε τη μικροπλάκα με ένα αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας και, στη συνέχεια, πιέστε σταθερά την πλάκα, ώστε να διασφαλιστεί στεγανή σφράγιση. Επωάστε τη μικροπλάκα αμέσως σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερμοστάτη ή σε ξηρό επωαστή για 1 ώρα ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 8. Στο τέλος της πρώτης περιόδου επώασης, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε το περιεχόμενο όλων των μικροβυθισμάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τη μικροπλάκα 4 φορές με 350 μl διαλύματος πλύσης (R2). Αναστρέψτε τη μικροπλάκα και σκουπίστε απαλά με απορροφητικό χαρτί, για να αφαιρεθεί το υπολειπόμενο υγρό. 9. Διοχετεύστε αμέσως 200 μl διαλύματος συζεύκτη εργασίας (R6) σε όλα τα μικροβυθίσματα. Το διάλυμα πρέπει να αναδεύεται απαλά πριν από τη χρήση. 10. Καλύψτε τη μικροπλάκα με ένα αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας και, στη συνέχεια, πιέστε σταθερά την πλάκα, ώστε να διασφαλιστεί στεγανή σφράγιση. Επωάστε τη μικροπλάκα αμέσως σε υδατόλουτρο που ελέγχεται από θερμοστάτη ή σε ξηρό επωαστή για 1 ώρα ± 5 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 11. Στο τέλος της δεύτερης περιόδου επώασης, αφαιρέστε το αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε το περιεχόμενο όλων των μικροβυθισμάτων σε ένα δοχείο για βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τη μικροπλάκα 4 φορές με 350 μl διαλύματος πλύσης (R2). Αναστρέψτε τη μικροπλάκα και σκουπίστε απαλά με απορροφητικό χαρτί, για να αφαιρεθεί το υπολειπόμενο υγρό. 12. Διοχετεύστε γρήγορα 200 μl διαλύματος χρωμογόνου (R9) σε κάθε μικροβύθισμα και μακριά από το φως. H αντίδραση θα πρέπει να πραγματοποιηθεί σε σκοτεινό μέρος για 30 ± 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ( C). Μη χρησιμοποιείτε αυτοκόλλητο σφραγιστικό πλάκας κατά τη διάρκεια της συγκεκριμένης περιόδου επώασης. 13. Διακόψτε την ενζυμική αντίδραση προσθέτοντας 100 μl διαλύματος αναστολής (R10) σε κάθε μικροβύθισμα. Η κατανομή θα πρέπει να εκτελεστεί με την ίδια σειρά και συχνότητα όπως για το διάλυμα ανάπτυξης. 14. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω μέρος της πλάκας. Διαβάστε την τιμή οπτικής πυκνότητας στα 450/620 nm χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. Οι ταινίες πρέπει να φυλάσσονται πάντα μακριά από το φως πριν από την ανάγνωση. 15. Πριν από την αναφορά των αποτελεσμάτων, ελέγξτε την αντιστοιχία μεταξύ της ένδειξης και του διαγράμματος κατανομής της πλάκας και των δειγμάτων. 6

7 8 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 8.1 Υπολογισμός τιμής αναφοράς (CO) Η τιμή αναφοράς (CO) αντιστοιχεί στη μέση τιμή των οπτικών πυκνοτήτων (OD) των εξετάσεων εις διπλούν ορού ελέγχου αναφοράς (R4): 8.2 Υπολογισμός του λόγου δείγματος CO = μέση τιμή OD R4 Το αποτέλεσμα του δείγματος εκφράζεται ως λόγος χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: 8.3 Ποιοτικός έλεγχος Λόγος δείγματος = OD δείγματος / CO Συμπεριλάβετε το βαθμονομητή και τους ορούς ελέγχου για κάθε μικροπλάκα και για κάθε ανάλυση και αναλύστε τα αποτελέσματα που έχουν ληφθεί. Για να θεωρηθεί έγκυρη η ανάλυση, θα πρέπει να πληρούνται τα εξής κριτήρια: Τιμές οπτικής πυκνότητας: - CO 0,300-0,80 x CO < OD R4 αντίγρ.1 < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 αντίγρ.2 < 1,20 x CO (Η μεμονωμένη τιμή OD κάθε αντιγράφου του ορού ελέγχου αναφοράς (R4) δεν πρέπει να διαφέρει πάνω από 20% της τιμής CO). Λόγοι οπτικής πυκνότητας: - Λόγος R3 (OD R3 / CO) 0,30 - Λόγος R5 (OD R5 / CO) 1,80 Εάν αυτά τα κριτήρια ποιοτικού ελέγχου δεν πληρούνται, η ανάλυση θα πρέπει να επαναληφθεί. 8.4 Ερμηνεία αποτελεσμάτων Λόγος δείγματος Αποτέλεσμα Ερμηνεία Λόγος < 0,80 Αρνητικό 0,80 Λόγος < 1,00 Διφορούμενο Λόγος 1,00 Θετικό Το δείγμα θεωρείται αρνητικό στην παρουσία αντισωμάτων IgM έναντι του παρασίτου T. gondii. Το δείγμα θεωρείται διφορούμενο στην παρουσία αντισωμάτων IgM έναντι του παρασίτου T. gondii. Το αποτέλεσμα πρέπει να επιβεβαιωθεί με επανάληψη της εξέτασης σε δεύτερο δείγμα που θα ληφθεί τουλάχιστον 3 εβδομάδες μετά την πρώτη εξέταση. Το δείγμα θεωρείται θετικό στην παρουσία αντισωμάτων IgM έναντι του παρασίτου T. gondii. 8.5 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων Η μη επαλήθευση ή επανάληψη των αντιδράσεων συχνά οφείλεται σε: Ανεπαρκή πλύση της μικροπλάκας. Μόλυνση αρνητικών δειγμάτων από ορό ή πλάσμα με υψηλό τίτλο αντισωμάτων. Μόλυνση του διαλύματος ανάπτυξης από χημικούς οξειδωτικούς παράγοντες (λευκαντικό, μεταλλικά ιόντα...). Μόλυνση του διαλύματος αναστολής. 7

8 9 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Tα χαρακτηριστικά απόδοσης της εξέτασης Platelia Toxo IgM έχουν αξιολογηθεί σε 2 τοποθεσίες, χρησιμοποιώντας συνολικά 863 δείγματα από έγκυες γυναίκες και δότες αίματος. Επιπλέον, οι επιδόσεις του Platelia Toxo IgM εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας 47 δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου. 9.1 Συχνότητα εμφάνισης Ο προσδιορισμός της συχνότητας εμφάνισης των αντισωμάτων IgM anti-toxo με χρήση της εξέτασης Platelia Toxo IgM διεξήχθη χρησιμοποιώντας έναν πίνακα 500 δειγμάτων από έγκυες γυναίκες. 15 δείγματα ήταν θετικά για αντισώματα IgM anti-toxo. Με την ανάλυση Platelia Toxo IgM η συχνότητα εμφάνισης καθορίστηκε στο 3% (15/500). 9.2 Ειδικότητα Ο προσδιορισμός της ειδικότητας διεξήχθη χρησιμοποιώντας έναν πίνακα 737 δειγμάτων από 2 τοποθεσίες στη Γαλλία, τα οποία βρέθηκαν αρνητικά με την εξέταση Platelia Toxo IgM TMB (72751) και κατανέμονται ως εξής: 154 οροί από δότες αίματος 583 οροί από έγκυες γυναίκες Πληθυσμός υπό εξέταση / τοποθεσία Τοποθεσία 1 Τοποθεσία 2 Έγκυες γυναίκες Δότες αίματος Έγκυες γυναίκες Αριθμός ορών Αρνητικό Διφορούμενο * Θετικό Ειδικότητα I alt * Τα διφορούμενα αποτελέσματα θεωρήθηκαν θετικά για τον υπολογισμό της ειδικότητας. [IC 95%] = διάστημα εμπιστοσύνης 95%. 100,0 % (102/102) [97,1%-100%] 100,0 % (154/154) [98,1%-100%] 99,8 % (480/481) [99,8%-99,9%] 99,9 % (736/737) [99,25%-100%] 9.3 Ευαισθησία Ο προσδιορισμός της ευαισθησίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας έναν πίνακα 69 δειγμάτων από 2 τοποθεσίες στη Γαλλία, τα οποία βρέθηκαν θετικά με την εξέταση Platelia Toxo IgM TMB (72751) και κατανέμονται ως εξής: 4 οροί από δότες αίματος 65 οροί από έγκυες γυναίκες Platelia Toxo IgM (72841) Platelia Toxo IgM TMB (72751) Διφορούμενο * Θετικό Σύνολο Αρνητικό Διφορούμενο * Θετικό Σύνολο Σχετική ευαισθησία* 69/69 100,0% [CI 95% = 94,8% - 100,0%] Τα διφορούμενα αποτελέσματα θεωρήθηκαν θετικά για τον υπολογισμό της ευαισθησίας. [IC95%] = διάστημα εμπιστοσύνης 95%. 8

9 Το δείγμα που βρέθηκε θετικό και με ανακόλουθα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας την εξέταση Platelia Toxo IgM επιβεβαιώθηκε ως θετικό με μια μέθοδο ανοσοπροσροφητικής ανάλυσης συγκόλλησης (ISAGA). Επιπλέον, εξετάστηκαν 57 δείγματα από έναν πίνακα 19 ορομετατροπών. Από αυτές τις 19 ορομετατροπές, 18 ανιχνεύτηκαν συγκριτικά, ενώ σε μια ορομετατροπή παρουσιάστηκε μεταβολή ενός δείγματος υπέρ της μεθόδου αναφοράς. 9.4 Επιδόσεις σε δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου 47 δείγματα αίματος ομφάλιου λώρου εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που έχει αναφερθεί στην ενότητα 7.4 (αραίωση δείγματος 1:21): 22 δείγματα επιβεβαιωμένων εκ γενετής τοξοπλάσμωσης 18 δείγματα προγενέστερης λοίμωξης μητρικής τοξοπλάσμωσης 7 δείγματα χωρίς λοίμωξη 20 δείγματα εκ γενετής τοξοπλάσμωσης βρέθηκαν είτε θετικά (18) είτε αμφίβολα (2) με το αντιδραστήριο Platelia Toxo IgM (72841). Παρόλα αυτά, όλα τα αρνητικά και προγενέστερης λοίμωξης δείγματα βρέθηκαν αρνητικά. Platelia Toxo IgM (72841) Platelia Toxo IgG (72840) Θετικό Αμφίβολο Αρνητικό Θετικό Αμφίβολο Αρνητικό Εκ γενετής τοξοπλάσμωση (n=22) Προγενέστερης λοίμωξης μητρική τοξοπλάσμωση (n=18) Αρνητικά (n=7) Διασταυρούμενη αντιδραστικότητα Ένας πίνακας 205 δειγμάτων, στα οποία περιλαμβάνονταν 167 θετικά δείγματα για CMV, ερυθρά, EBV, HSV, VZV, παρωτίτιδα, ιλαρά και HIV και 38 θετικά δείγματα για ρευματοειδή παράγοντα, αυτοαντισώματα και ετερόφιλα αντισώματα μαζί με δείγματα θετικά για μυέλωμα, υποβλήθηκε σε εξέταση με την ανάλυση Platelia Toxo IgM και μια ανοσοενζυμική ανάλυση (ΕΙΑ) του εμπορίου για το διαγνωστικό έλεγχο των αντισωμάτων IgM anti-t. gondii. Από τα δείγματα αυτά, 2 βρέθηκαν θετικά και επαληθεύτηκαν με το κιτ ανοσοενζυμικής ανάλυσης (EIA) που χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση: 1 δείγμα θετικό για αντισώματα anti-ebv και 1 δείγμα θετικό για αντισώματα IgG anti-hsv Ακρίβεια Ακρίβεια εντός της ανάλυσης (επαναληψιμότητα): Για να αξιολογηθεί η επαναληψιμότητα εντός της ανάλυσης, εξετάστηκαν ένα αρνητικό και τρία θετικά δείγματα 32 φορές κατά τη διάρκεια της ίδιας ανάλυσης. Ο λόγος (OD δείγματος/co) καθορίστηκε για κάθε δείγμα. Η μέση τιμή λόγου, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%CV) για κάθε δείγμα αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα: Ακρίβεια εντός της ανάλυσης (επαναληψιμότητα) N=32 Αρνητικό δείγμα Θετικό δείγμα χαμηλής συγκέντρωσης Θετικό δείγμα Θετικό δείγμα υψηλής συγκέντρωσης Λόγος (OD δείγματος/co) Μέση τιμή 0,05 1,92 3,23 4,49 SD 0 0,04 0,07 0,10 %CV 5,0% 2,1% 2,3% 2,3% 9

10 Ακρίβεια μεταξύ των αναλύσεων (αναπαραγωγιμότητα): Για να αξιολογηθεί η αναπαραγωγιμότητα μεταξύ των αναλύσεων, τα τέσσερα δείγματα (ένα αρνητικό και τρία θετικά) εξετάστηκαν εις διπλούν σε δύο αναλύσεις την ημέρα για περίοδο 20 ημερών. Ο λόγος (OD δείγματος/co) καθορίστηκε για κάθε δείγμα. Η μέση τιμή λόγου, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής μεταβλητότητας (%CV) για κάθε δείγμα αναφέρονται στον παρακάτω πίνακα: Ακρίβεια μεταξύ των αναλύσεων (αναπαραγωγιμότητα) Θετικό δείγμα Αρνητικό N=80 χαμηλής δείγμα συγκέντρωσης Θετικό δείγμα Θετικό δείγμα υψηλής συγκέντρωσης Λόγος (OD δείγματος/co) Μέση τιμή 0,04 2,05 3,28 4,64 SD 0,01 0,06 0,10 0,14 %CV 21,0% 2,8% 3,1% 3,0% 10 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η διάγνωση της λοίμωξης από το παράσιτο T. gondii θα πρέπει να βασίζεται αποκλειστικά σε ένα συνδυασμό κλινικών και βιολογικών στοιχείων. Το αποτέλεσμα μίας μόνο εξέτασης τιτλοποίησης αντισωμάτων IgM anti-t. gondii δεν αποτελεί επαρκή απόδειξη για τη διάγνωση πρόσφατης λοίμωξης. Η διάγνωση πρόσφατης λοίμωξης μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο βάσει ολοκληρωμένων πληροφοριών ασθενή, συμπεριλαμβανομένων κλινικών και βιολογικών στοιχείων (σημαντική αύξηση αντισωμάτων IgG anti-t. gondii σε 2 δείγματα ορού ασθενή που έχουν συλλεχθεί σε διάστημα 3 εβδομάδων και έχουν εξεταστεί στην ίδια ανάλυση, παρουσία αντισωμάτων IgM anti-t. gondii σε σημαντικά επίπεδα, εμφάνιση χαμηλής ισχύος σύνδεσης αντιγόνου-αντισώματος IgG). Η παρουσία αντισωμάτων IgM anti-t. gondii δεν αποτελεί επαρκή απόδειξη για την επιβεβαίωση πρόσφατης λοίμωξης, καθώς τα αντισώματα IgM ενδέχεται να παραμείνουν αρκετούς μήνες ή και χρόνια μετά τη λοίμωξη. Σε περίπτωση ανίχνευσης αντισωμάτων IgM, θα πρέπει να εκτελείται ποσοτικός προσδιορισμός των αντισωμάτων IgG anti-t. gondii, καθώς και συμπληρωματική εξέταση της εξέλιξης των αντισωμάτων anti-t. gondii τουλάχιστον σε ένα δεύτερο δείγμα ορού που θα συλλεχθεί τρεις εβδομάδες αργότερα. Εάν η εξέταση του δείγματος πραγματοποιηθεί υπερβολικά νωρίς κατά τη διάρκεια πρόσφατης πρωτογενούς λοίμωξης, ενδέχεται να μην υπάρχουν ακόμη αντισώματα IgM anti-t. gondii. Εάν υπάρχει υποψία αντισωμάτων, θα πρέπει να ληφθεί ένα δεύτερο δείγμα 3 εβδομάδες περίπου μετά την πρώτη ανάλυση και να επαναληφθεί η εξέταση για αντισώματα IgM. 11 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα παρασκευασμένα αντιδραστήρια προετοιμάζονται σύμφωνα με το σύστημα ποιότητας που διαθέτουμε, από την παραλαβή των πρώτων υλών έως την εμπορευματοποίηση του τελικού προϊόντος. Κάθε παρτίδα υποβάλλεται σε αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου και διατίθεται στην αγορά μόνο εφόσον διασφαλιστεί ότι συμμορφώνεται με τα προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία που σχετίζονται με την παραγωγή και τους ελέγχους κάθε μεμονωμένης παρτίδας φυλάσσονται εντός των εγκαταστάσεων της Bio-Rad. 12 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36,

11 4. JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol.Infect. Dis. 1993; 3, WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. Antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

12 12

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)