Monolisa HBe Ag-Ab PLUS

Transcript

1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS 2 Πλακέτες HBe Ag - 96 HBe Ab ΚΙΤ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΙΑ HBe Ag ΚΑΙ HBe Ab ΜΕΣΩ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ /01

2 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 2. ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ 3. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 4. ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ KIT 5. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ 6. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 7. ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ 8. ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 9. ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ - ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ 10. ΔΕΙΓΜΑΤΑ 11. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 12. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 13. ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ 14. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 15. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 2 [GR]

3 1 - ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το κιτ Monolisa HBe Ag-Ab PLUS προορίζεται για τον ποιοτικό προσδιορισµό του αντιγόνου της ηπατίτιδας Β (HBe Ag) ή του αντισώµατος έναντι του αντιγόνου της ηπατίτιδας Β (Anti-HBe) µε ανοσοενζυµική ανάλυση σε ανθρώπινο ορό ή πλάσµα. 2 - ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Η παρουσία του HBe Ag εκφράζει γενικά ενεργό πολλαπλασιασµό του ιού και υποδεικνύει τη µολυσµατική κατάσταση ενός δείγµατος ορού. Το HBe Ag εµφανίζεται στα πρώτα στάδια της µόλυνσης από τον ιό της ηπατίτιδας Β και η παραµονή του (περισσότερο από ένα µήνα) αποτελεί ένδειξη κινδύνου αυξηµένης ηπατικής παθολογίας λόγω του πολλαπλασιασµού του ιού. Η εµφάνιση του αντισώµατος έναντι του HBe Ag υποδεικνύει µειωµένο πολλαπλασιασµό του ιού και αποτελεί γενικά καλή κλινική πρόγνωση. 3 - ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ α) Προσδιορισµός του αντιγόνου HBe Η ανίχνευση του αντιγόνου HBe Ag βασίζεται σε µια ανοσοενζυµική ανάλυση 2 βηµάτων τύπου «sandwich» µε τη χρήση ενός ανθρώπινου αντισώµατος anti HBe και ενός ζεύγους µονόκλωνων αντισωµάτων ποντικού anti HBe επισηµασµένων µε υπεροξειδάση (mab 1 και mab 2) έναντι διαφορετικών επιτόπων. Η στερεά φάση αποτελείται από την επικάλυψη των βυθισµάτων πολυστυρενίου 8 ταινιών µε ανθρώπινο αντίσωµα anti HBe. Η ανάλυση περιλαµβάνει τα παρακάτω βήµατα: 1. Επώαση δειγµάτων ορού ελέγχου και άγνωστων δειγµάτων µε το αντίσωµα anti- HBe που χρησιµοποιήθηκε για την επικάλυψη κατά τη στερεά φάση. 2. Πλύση, επώαση ακινητοποιηµένων συµπλόκων µε τα επισηµασµένα µε υπεροξειδάση µονόκλωνα αντισώµατα. 3. Αποµάκρυνση του ελεύθερου συζεύκτη µε πλύση και, στη συνέχεια, ανάπτυξη της ενζυµικής δραστηριότητας που δεσµεύεται στη στερεά φάση µε την προσθήκη υποστρώµατος. 4. Διακοπή της αντίδρασης ανάπτυξης χρώµατος, µέτρηση απορρόφησης στα 450/620 nm και ερµηνεία αποτελεσµάτων. β) Προσδιορισµός αντισωµάτων anti-hbe Για την ανίχνευση του anti HBe χρησιµοποιείται η ίδια στερεά φάση όπως και για το HBe Ag. Η εξέταση βασίζεται στον ανταγωνισµό µεταξύ των ακινητοποιηµένων αντισωµάτων και των αντισωµάτων που υπάρχουν στο δείγµα έναντι µιας περιορισµένης ποσότητας HBe Ag που χρησιµοποιείται ως αντιδραστήριο εξουδετέρωσης. Στη συνέχεια, η ανίχνευση επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια ενός άλλου µίγµατος µονόκλωνων αντισωµάτων επισηµασµένων µε υπεροξειδάση (mab 1 και mab 2). Η ανάλυση περιλαµβάνει τα παρακάτω βήµατα: 1. Επώαση δειγµάτων ορού ελέγχου και άγνωστων δειγµάτων µε το αντίσωµα anti HBe που χρησιµοποιήθηκε για επικάλυψη κατά τη στερεά φάση και το αντιδραστήριο εξουδετέρωσης. 2. Πλύση, επώαση ακινητοποιηµένων συµπλόκων µε τα επισηµασµένα µε υπεροξειδάση µονόκλωνα αντισώµατα. 3 [GR]

4 3. Αποµάκρυνση του ελεύθερου συζεύκτη µε πλύση και, στη συνέχεια, ανάπτυξη της ενζυµικής δραστηριότητας που δεσµεύεται στη στερεά φάση µε την προσθήκη υποστρώµατος. 4. Διακοπή της αντίδρασης ανάπτυξης χρώµατος, µέτρηση απορρόφησης στα 450/620 nm και ερµηνεία αποτελεσµάτων. 4 - ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται αποκλειστικά για in vitro διαγνωστική χρήση. Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για 2 x 96 προσδιορισµούς σε 1 έως και 12 ανεξάρτητες αναλύσεις και σύµφωνα µε τους παρακάτω συνδυασµούς: 96 προσδιορισµοί HBe Ag και 96 προσδιορισµοί anti-hbe ή 2 x 48 προσδιορισµοί HBe Ag και 2 x 48 προσδιορισµοί anti HBe ταυτόχρονα. Ετικετα Συσταση Αντιδραστηριων Μορφη R1 Microplate Μικροπλακα 2 πλάκες 12 x 8 ταινίες βυθισµάτων µε ανθρώπινα αντισώµατα anti-hbe από θετικό πλάσµα για HBs Ag, αδρανοποιηµένο. R2 Concentrated washing solution (20X) Συµπυκνωµενο Διαλυµα Πλυσησ (20X) Ρυθµιστικό διάλυµα Tris NaCI, ph 7,4 Συντηρητικό: ProClin 300 (0,04 %) 1 φιαλίδιο 235 ml R3 R4 R5 R6 Negative control HBe Ab positive control HBe Ag positive control Neutralizing HBe Ag Αρνητικοσ Οροσ Ελεγχου κοινός για την εξέταση HBe Ag και anti HBe Ανθρώπινος ορός, αρνητικός για αντισώµατα HBs Ag, anti-hiv1, anti-hiv2 και anti-hcv Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου < 0,1 % Θετικοσ Οροσ Ελεγχου HBe Ab Απινιδωµένο θετικό ανθρώπινο πλάσµα anti HBe, εν δυνάµει θετικό για αντισώµατα HBs Ag, και αρνητικό για αντισώµατα anti-hiv1, anti-hiv2 και anti- HCV, αδρανοποιηµένο Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου < 0,1 % Θετικοσ Οροσ Ελεγχου HBe Ag Απινιδωµένο θετικό ανθρώπινο πλάσµα HBe Ag και HBs Ag, αρνητικό για αντισώµατα anti-hiv1, anti-hiv2 και anti- HCV, αδρανοποιηµένο Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου < 0,1 % Αντιγονο Εξουδετερωσησ HBe Απινιδωµένο ανθρώπινο πλάσµα θετικό για HBe Ag και Bs Ag, αρνητικό για αντισώµατα anti-hiv1, anti-hiv2 και anti- HCV, αδρανοποιηµένο Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου < 0,1 % 1 φιαλίδιο 8 ml 1 φιαλίδιο 1,5 ml 1 φιαλίδιο 1,5 ml 1 φιαλίδιο 8 ml 4 [GR]

5 R7a Concentrated anti HBe conjugate R7b Concentrated Ag HBe conjugate R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Συµπυκνωµενοσ Συζευκτησ Εξετασησ Anti HBe (5Χ) Ένα ζεύγος µονόκλωνων αντισωµάτων anti-hbe (mab1 και mab2)* επισηµασµένων µε υπεροξειδάση Συντηρητικό: ProClin 300 (0,5 %) Συµπυκνωµενοσ Συζευκτησ Ag HBe (5Χ) Ένα ζεύγος µονόκλωνων αντισωµάτων anti-hbe (mab1 και mab2)* επισηµασµένων µε υπεροξειδάση Συντηρητικό: ProClin 300 (0,5 %) Ρυθµιστικο Διαλυµα Υποστρωµατοσ Υπεροξειδασησ Διάλυµα κιτρικού οξέος και οξικού νατρίου ph 4,0 που περιέχει H 2 O 2 (0,015 %) και DMSO (4%) Χρωµογονο Διάλυµα που περιέχει τετραµεθυλβενζιδίνη (ΤΜΒ) Αντιδραστηριο Αναστολησ 1 N Θειικό οξύ Κενο φιαλιδιο για αραιωµενο R2 1 φιαλίδιο 3 ml 1 φιαλίδιο 3 ml 1 φιαλίδιο 60 ml 1 φιαλίδιο 5 ml 1 φιαλίδιο 28 ml 1 φιαλίδιο 25 ml * Ο λόγος mab 1/mab 2 είναι διαφορετικός για τους συζεύκτες R7a και R7b. Μην ανταλλάσσετε τους 2 συζεύκτες. 5 - ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Aποσταγµένο ή πλήρως απιονισµένο νερό. Υποχλωριώδες νάτριο (οικιακό λευκαντικό) και διττανθρακικό νάτριο. Απορροφητικό χαρτί. Γάντια µίας χρήσης. Σωληνάρια πολυστυρενίου µίας χρήσης (12 x 75 mm). Χειροκίνητες ή ηµιαυτόµατες, ρυθµιζόµενες ή προρυθµισµένες πιπέτες, µε δυνατότητα µέτρησης και µεταφοράς 50 µl, 100 µl, 200 µl και 1 ml. Βαθµονοµηµένοι κύλινδροι: 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml. Αναδευτήρας τύπου Vortex. Δοχεία βιολογικά επικίνδυνων αποβλήτων Χειροκίνητη, ηµιαυτόµατη ή αυτόµατη συσκευή πλύσης µικροπλάκας*. Υδατόλουτρο µε θερµοστατική ρύθµιση στους 40 ± 1 C ή αντίστοιχο επωαστήρα για τη θέρµανση πλακών*. Συσκευή ανάγνωσης µικροπλάκας µε φίλτρα 450 και 620 nm*. (*) Για λεπτοµέρειες σχετικά µε το συνιστώµενο εξοπλισµό, επικοινωνήστε µε το τµήµα τεχνικής υποστήριξης. 5 [GR]

6 6 - ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τη σωστή εφαρµογή της ακόλουθης ορθής εργαστηριακής πρακτικής: Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες σε µία συγκεκριµένη εξέταση. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Για το διάλυµα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20X, πράσινο χρώµα), το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος υπεροξειδάσης (R8, στοιχεία ετικέτας: ρυθµιστικό διάλυµα TMB, µπλε χρώµα), το χρωµογόνο (R9, στοιχεία ετικέτας: TMB 11X, µοβ χρώµα) και το διάλυµα αναστολής (R10, στοιχεία ετικέτας: 1N, κόκκινο χρώµα) µπορείτε να χρησιµοποιήσετε άλλες παρτίδες από αυτές που περιλαµβάνονται στο κιτ, µε την προϋπόθεση ότι σε µία συγκεκριµένη εξέταση θα χρησιµοποιηθεί η ίδια παρτίδα. Τα αντιδραστήρια αυτά µπορούν να χρησιµοποιηθούν και µε ορισµένα άλλα προϊόντα της Bio-Rad. Επιπλέον, το διάλυµα πλύσης (R2, στοιχεία ετικέτας: 20X, πράσινο χρώµα) µπορεί να αναµιχθεί µε τα υπόλοιπα 2 διαλύµατα πλύσης που συµπεριλαµβάνονται σε διάφορα κιτ αντιδραστηρίων της Bio-Rad (R2, στοιχεία ετικέτας: 10X, µπλε χρώµα ή 10X, πορτοκαλί χρώµα), µετά από κατάλληλη ανασύσταση και µε την προϋπόθεση ότι θα χρησιµοποιηθεί µόνο ένα µίγµα σε µια συγκεκριµένη εξέταση. Για περισσότερες πληροφορίες επικοινωνήστε µε την τεχνική υπηρεσία. Η ονοµασία της εξέτασης καθώς και ο ειδικός αριθµός αναγνώρισης της εξέτασης αναγράφονται στο πλαίσιο κάθε πλάκας µικροτιτλοδότησης. Αυτός ο ειδικός αριθµός αναγνώρισης αναγράφεται, επίσης, και σε κάθε ταινία. Monolisa HBe Ag-Ab PLUS: Ειδικός αριθµός αναγνώρισης = 56. Επαληθεύετε τον ειδικό αριθµό αναγνώρισης πριν από κάθε χρήση. Αν δεν υπάρχει αριθµός αναγνώρισης ή ο αριθµός αναγνώρισης είναι διαφορετικός από αυτόν που αναφέρεται παραπάνω, δεν πρέπει να χρησιµοποιήσετε την ταινία. Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια που έχουν λήξει. Πριν από τη χρήση πρέπει να περιµένετε 30 λεπτά, ώστε τα αντιδραστήρια να σταθεροποιηθούν σε θερµοκρασία δωµατίου και µία ώρα για το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα R2. Εκτελέστε προσεκτικά ανασύσταση των αντιδραστηρίων αποφεύγοντας τυχόν µόλυνση. Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης που θα µπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυµική δραστηριότητα των συζευκτών. Χρησιµοποιείτε υλικά από γυαλί, που έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά µε απιονισµένο νερό, ή κατά προτίµηση, υλικά µίας χρήσης. Μην αφήνετε τη µικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστηµα από το τέλος της πλύσης και µέχρι την κατανοµή των αντιδραστηρίων. Για κάθε δείγµα χρησιµοποιείτε νέο ακροφύσιο κατανοµής. Η πλύση των βυθισµάτων αποτελεί ιδιαίτερα σηµαντικό βήµα σε αυτήν τη διαδικασία: Τηρείτε το συνιστώµενο αριθµό κύκλων πλύσης και βεβαιώνεστε ότι όλα τα βυθίσµατα είναι πλήρως γεµάτα και, στη συνέχεια, άδεια. Η εσφαλµένη πλύση ενδέχεται να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσµατα. Μη χρησιµοποιείτε ποτέ το ίδιο δοχείο για την κατανοµή του συζεύκτη και του διαλύµατος ανάπτυξης. Ελέγχετε αν οι πιπέτες και ο υπόλοιπος εξοπλισµός λειτουργεί σωστά και µε ακρίβεια. Μην αλλάζετε τη διαδικασία της ανάλυσης. 6 [GR]

7 Το διάλυµα ανάπτυξης (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος + χρωµογόνο) πρέπει να έχει ροζ χρώµα. Η µεταβολή του ροζ χρώµατος εντός µερικών λεπτών µετά την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί και πρέπει να αντικατασταθεί. Η προετοιµασία του διαλύµατος ανάπτυξης µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε καθαρό πλαστικό δίσκο µίας χρήσης ή σε γυάλινο δοχείο που έχει προηγουµένως πλυθεί µε HCl 1N, ξεπλυθεί σχολαστικά µε αποσταγµένο νερό και στεγνώσει. Το αντιδραστήριο αυτό πρέπει να αποθηκεύεται σε σκοτεινό µέρος. 7 - ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Όλα τα αντιδραστήρια που περιέχει το κιτ προορίζονται «για in vitro διαγνωστική χρήση». Κατά το χειρισµό αντιδραστηρίων και δειγµάτων πρέπει να φοράτε γάντια µίας χρήσης και να πλένετε σχολαστικά τα χέρια σας µετά το χειρισµό τους. Μην αναρροφάτε µε πιπέτα από το στόµα. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιήθηκε στην προετοιµασία του αντιδραστηρίου R3 (αρνητικός ορός ελέγχου) εξετάστηκε και βρέθηκε µη αντιδρών για αντιγόνο επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag) και αντισώµατα έναντι των ιών ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (anti-hiv-1 και anti HIV-2). Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιήθηκε στην προετοιµασία του αντιδραστηρίου R1 (µικροπλάκα) εξετάστηκε και βρέθηκε µη αντιδρών για αντισώµατα έναντι των ιών ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (anti-hiv-1 και anti HIV- 2) και αντισώµατα έναντι του ιού της ηπατίτιδας C (HCV). Το υλικό αυτό είναι αντιδρών για αντιγόνο επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag). Αδρανοποιήθηκε µε φωτοχηµική µέθοδο. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιµοποιήθηκε στην προετοιµασία των αντιδραστηρίων R4 (θετικός ορός ελέγχου Anti-HBe), R5 (θετικός ορός ελέγχου HBe Ag) και R6 (Αντιγόνο εξουδετέρωσης Hbe) εξετάστηκε και βρέθηκε µη αντιδρών για αντισώµατα έναντι των ιών ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (anti-hiv- 1 και anti HIV-2) και αντισώµατα έναντι του ιού της ηπατίτιδας C (HCV). Τα αντιδραστήρια R5 και R6 βρέθηκαν αντιδρώντα για αντιγόνο επιφανείας της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), ενώ το R4 εν δυνάµει αντιδρών για HBs Ag. Αδρανοποιήθηκε µε φωτοχηµική µέθοδο. Καθώς καµία γνωστή µέθοδος εξέτασης δεν µπορεί να διασφαλίσει πλήρως την απουσία µολυσµατικών παραγόντων, πρέπει να χειρίζεστε τα αντιδραστήρια και τα δείγµατα ασθενών ως εν δυνάµει µολυσµατικά. Ο εξοπλισµός που έρχεται σε άµεση επαφή µε δείγµατα και αντιδραστήρια καθώς και µε διαλύµατα πλύσης, θα πρέπει να θεωρείται µολυσµένος και ο χειρισµός του πρέπει να είναι ανάλογος. Απαιτείται προσοχή ώστε να µη χυθούν δείγµατα ή διαλύµατα που περιέχουν δείγµατα Τα σηµεία όπου έχει χυθεί υγρό πρέπει να καθαρίζονται µε λευκαντικό αραιωµένο στο 10%. Αν το µολυσµένο υγρό είναι οξύ, τα σηµεία όπου έχει χυθεί πρέπει αρχικά να εξουδετερωθούν µε διττανθρακικό νάτριο και, στη συνέχεια, να σκουπιστούν µε απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιµοποιήθηκε για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για µολυσµένα απορρίµµατα Τα δείγµατα, τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και τα µολυσµένα υλικά και τα προϊόντα πρέπει να απορρίπτονται µετά την απολύµανση: - είτε µε εµβάπτιση σε λευκαντικό µε τελική συγκέντρωση υποχλωριώδους νατρίου 5% (1 όγκος λευκαντικού ανά 10 όγκους µολυσµένου υγρού ή νερού) για 30 λεπτά 7 [GR]

8 - είτε µε αποστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 C για τουλάχιστον 2 ώρες. Η αποστείρωση σε αυτόκαυστο είναι η βέλτιστη µέθοδος αδρανοποίησης των ιών HIV και HBV. ΜΗΝ ΤΟΠΟΘΕΤΕIΤΕ ΣΤΟ ΑΥΤΟΚΑΥΣΤΟ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΥΠΟΧΛΩΡΙΩΔΕΣ ΝΑΤΡΙΟ Μην παραλείπετε την εξουδετέρωση και/ή αποστείρωση σε αυτόκαυστο των διαλυµάτων ή των αποβλήτων πλύσης ή άλλων υγρών που περιέχουν βιολογικά δείγµατα, πριν από την απόρριψή τους στο νεροχύτη. Το δελτίο δεδοµένων ασφάλειας διατίθεται κατόπιν αίτησης. Ο χειρισµός και η απόρριψη χηµικών ουσιών θα πρέπει να εκτελείται σύµφωνα µε την ορθή εργαστηριακή πρακτική. Αποφεύγετε τυχόν επαφή του δέρµατος και του βλεννογόνου µε το ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος, το χρωµογόνο και το διάλυµα αναστολής (κίνδυνος τοξικότητας, ερεθισµού ή εγκαύµατος). Για συστάσεις αναφορικά µε τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται µε κάποια χηµικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήµατα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδοµένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Πριν από τη χρήση, αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). Μικροπλάκα (R1) Κάθε πλαίσιο που περιέχει 12 ταινίες είναι συσκευασµένο σε σφραγισµένη σακούλα αλουµινίου. Κόψτε τη σακούλα µε ψαλίδι ή νυστέρι 0,5 1 cm πάνω από τη σφράγιση. Ανοίξτε τη σακούλα και αφαιρέστε το πλαίσιο. Τοποθετήστε ξανά στη σακούλα τις µη χρησιµοποιηµένες ταινίες. Κλείστε προσεκτικά τη σακούλα και αποθηκεύστε την ξανά στους +2-8 C. Συµπυκνωµένο διάλυµα πλύσης (20X): R2 Αραιώστε σε αναλογία 1:20 σε αποσταγµένο νερό, για να παρασκευάσετε το έτοιµο για χρήση διάλυµα πλύσης. Αναµίξτε. Για µία ταινία απαιτούνται 75 ml διαλύµατος πλύσης έτοιµου για χρήση. Συµπυκνωµένος συζεύκτης Anti HBe (R7a) Αραιώστε το αντιδραστήριο R7a µε παρασκευασµένο διάλυµα R2 σε αναλογία 1:5, σύµφωνα µε τον αριθµό των ταινιών που πρόκειται να χρησιµοποιηθούν: Αριθµός ταινιών που θα χρησιµοποιηθούν Όγκος του R7a (ml) 1 0, , , , , , ,6 8 Πλήρωση µε παρασκευασµένο R2 έως (ml) 8 [GR]

9 9 1, , ,4 12 Αναµίξτε. Ο συζεύκτης R7a µπορεί να χρησιµοποιηθεί χωρίς προαραίωση ακολουθώντας την παρακάτω συνιστώµενη διαδικασία: προσθέστε 80 µl αραιωµένου διαλύµατος πλύσης (R2) σε 20 µl συζεύκτη Anti-Hbe R7a. Αναµίξτε. Συµπυκνωµένος συζεύκτης εξέτασης Ag HBe (R7b) Χρησιµοποιήστε το ίδιο πρωτόκολλο όπως και για το συζεύκτη R7a. Διάλυµα ανάπτυξης χρώµατος (R8 + R9) Αραιώστε το αντιδραστήριο (R9) χρησιµοποιώντας το αντιδραστήριο R8 σε αναλογία 1:11 (παράδειγµα: 1 ml αντιδραστηρίου R9 µε 10 ml αντιδραστηρίου R8). Οµογενοποιήστε. Για 1 έως 10 ταινίες απαιτούνται και επαρκούν 10 ml. 9 - ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑ- ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Το κιτ πρέπει να αποθηκεύεται σε θερµοκρασία +2-8 C. Όταν αποθηκεύεται σε αυτήν τη θερµοκρασία, κάθε αντιδραστήριο που περιέχεται στο κιτ µπορεί να χρησιµοποιηθεί µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στη συσκευασία (εκτός από τις περιπτώσεις στις οποίες ισχύουν ειδικές οδηγίες). R1: Μετά το άνοιγµα της σφραγισµένης υπό κενό σακούλας, οι ταινίες µικροβυθισµάτων που αποθηκεύονται στους +2-8 C µπορούν να χρησιµοποιηθούν για 1 µήνα, εφόσον έχετε σφραγίσει ξανά προσεκτικά τη σακούλα. R2: Το αραιωµένο διάλυµα πλύσης µπορεί να αποθηκευτεί στους C για 2 εβδοµάδες. Το συµπυκνωµένο διάλυµα πλύσης (R2) µπορεί να αποθηκευτεί στους C. R7a: Ο αραιωµένος συζεύκτης για την εξέταση anti-hbe µπορεί να αποθηκευτεί για 8 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). Ο αραιωµένος συζεύκτης πρέπει να προστατεύεται από την ηλιακή ακτινοβολία κατά την αποθήκευση σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). R7b: Ο αραιωµένος συζεύκτης για την εξέταση HBe Ag µπορεί να αποθηκευτεί για 8 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). Ο αραιωµένος συζεύκτης πρέπει να προστατεύεται από την ηλιακή ακτινοβολία κατά την αποθήκευση σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C). R8 + R9: Μετά την ανασύσταση, το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευµένο σε σκοτεινό χώρο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για 6 ώρες, σε θερµοκρασία δωµατίου (18-30 C) ΔΕΙΓΜΑΤΑ Συλλέξτε ένα δείγµα αίµατος σύµφωνα µε τη συνήθη πρακτική. Η εξέταση θα πρέπει να εκτελείται σε µη αραιωµένο ορό ή πλάσµα (που έχει συλλεχθεί σε αντιπηκτικά µε βάση EDTA, κιτρικό οξύ, ACD). Εκτελέστε εκχύλιση όσο το δυνατό συντοµότερα για την αποφυγή αιµόλυσης. Πριν από την εξέταση, τα δείγµατα που περιέχουν συσσωµατώµατα πρέπει να υποβάλλονται σε φυγοκέντρηση, για επαναφορά της διαύγειας. Τα εναιωρήµατα 9 [GR]

10 συσσωµατωµάτων ινώδους ή σωµατιδίων ενδέχεται να προκαλέσουν ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Τα δείγµατα θα πρέπει να αποθηκεύονται στους +2-8 C, εφόσον η ανίχνευση πρόκειται να εκτελεστεί εντός 7 ηµερών ή να καταψύχονται στους -20 C. Μην θερµαίνετε το δείγµα. Αποφύγετε την επανειληµµένη ψύξη/απόψυξη. Σε περίπτωση µεταφοράς των δειγµάτων, συσκευάστε τα δείγµατα σύµφωνα µε τους κανονισµούς σχετικά µε τη µεταφορά αιτιολογικών παραγόντων, κατά προτίµηση κατεψυγµένα. ΜΗ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΕ ΜΟΛΥΣΜΕΝΟΥΣ, ΥΠΕΡΛΙΠΑΙΜΙΚΟΥΣ Ή ΥΠΕΡΒΟΛΙΚΑ ΑΙΜΟΛΥΜΕΝΟΥΣ ΟΡΟΥΣ. ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ: Τα δείγµατα που περιέχουν έως και 100 mg/l χολερυθρίνης, τα λιπαιµικά δείγµατα που περιέχουν έως και 36 g/l τριολεΐνης και τα αιµολυµένα δείγµατα που περιέχουν έως και 2,5 mg/ml αιµοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. Παρατηρήθηκε µείωση της αναλογίας για αρνητικά δείγµατα στα οποία προστέθηκαν εξωγενώς 45 mg/ml λευκωµατίνης ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Αν οι διαδικασίες εξέτασης anti-hbe και HBe Ag εκτελούνται ταυτόχρονα στην ίδια πλάκα, ακολουθήστε την εξής συνιστώµενη διάταξη: Εξέταση Anti HBe: σειρές 1 έως 6 Εξέταση HBe Ag: σειρές 7 έως 12 α) Διαδικασία εξέτασης Anti-HBe 1. Προετοιµάστε το διάλυµα πλύσης. 2. Αφαιρέστε µία ή περισσότερες ταινίες και το δίσκο από την προστατευτική συσκευασία. Τοποθετήστε τις ταινίες που δεν χρησιµοποιήθηκαν στη συσκευασία και επανασφραγίστε την. 3. Διοχετεύστε τους παρακάτω όγκους σε κάθε βύθισµα ως εξής: A1, B1, C1: 100 µl αρνητικού ορού ελέγχου (R3) D1: 100 µl θετικού ορού ελέγχου (R4) E1, F1, G1: 100 µl δείγµατος Ανάλογα µε το σύστηµα που χρησιµοποιείται, είναι δυνατή η τροποποίηση της θέσης των ορών ελέγχου ή της σειράς κατανοµής. Σηµείωση: Υπάρχει σαφής διαφορά στο χρώµα των κενών βυθισµάτων και των βυθισµάτων που περιέχουν το δείγµα (κίτρινο). Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία δείγµατος στα βυθίσµατα µέσω φασµατοφωτοµετρικής µέτρησης στα 490 nm (ένα µήκος κύµατος). Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 4. Προσθέστε αµέσως 50 µl αντιγόνου εξουδετέρωσης HBe R6 σε κάθε βύθισµα. Οµογενοποιήστε. Καλύψτε µε αυτοκόλλητη µεµβράνη και υποβάλλετε σε επώαση για 3 ώρες ± 10 λεπτά στους 37 C ± 1 C. Σηµείωση: Η κατανοµή του αντιγόνου εξουδετέρωσης HBe (R6), το οποίο έχει ροζ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία αντιγόνου εξουδετέρωσης HBe στα βυθίσµατα µέσω φασµατοφωτοµετρικής µέτρησης στα 490 nm (ένα µήκος κύµατος). 10 [GR]

11 Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 5. Προετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα συζεύκτη R7a πριν από το τέλος του βήµατος Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη. Αναρροφήστε το περιεχόµενο κάθε βυθίσµατος στο δοχείο για τα βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήστε πλύση τέσσερις φορές. 7. Διοχετεύστε αµέσως 100 µl αραιωµένου διαλύµατος συζεύκτη R7a (ανατρέξτε στην ενότητα 8: ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ) σε κάθε βύθισµα ή χρησιµοποιήστε το συζεύκτη R7a όπως είναι, ακολουθώντας την παρακάτω συνιστώµενη διαδικασία: διοχετεύστε αρχικά 80 µl αραιωµένου διαλύµατος πλύσης (R2) σε κάθε βύθισµα και, στη συνέχεια, 20 µl συζεύκτη Anti-HBe R7a (5X). Οµογενοποιήστε. Καλύψτε µε αυτοκόλλητη µεµβράνη και υποβάλλετε σε επώαση για 30 λεπτά στους 37 C ± 1 C (από 25 λεπτά το ελάχιστο έως και 40 λεπτά το µέγιστο). Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη, αναρροφήστε το περιεχόµενο κάθε βυθίσµατος στο δοχείο για τα βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα και, στη συνέχεια, πραγµατοποιήστε πλύση πέντε φορές. Σηµείωση: Η κατανοµή του αραιωµένου διαλύµατος συζεύκτη R7a, το οποίο έχει µοβ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία αραιωµένου διαλύµατος συζεύκτη R7a στα βυθίσµατα µέσω φασµατοφωτοµετρικής µέτρησης στα 620 nm (ένα µήκος κύµατος). Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 8. Αµέσως πριν από τη χρήση, προετοιµάστε το διάλυµα ανάπτυξης χρώµατος (R8 + R9). Ανατρέξτε στην ενότητα 8: ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ. 9. Διοχετεύστε αµέσως 80 µl διαλύµατος ανάπτυξης χρώµατος σε κάθε βύθισµα. Τοποθετήστε την πλάκα σε σκοτεινό µέρος και σε θερµοκρασία δωµατίου ( C) για 30 λεπτά ± 5 λεπτά. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης, το οποίο έχει ροζ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας: Υπάρχει σαφής διαφορά στο χρώµα των κενών βυθισµάτων και των βυθισµάτων που περιέχουν το ροζ διάλυµα. Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 10. Διοχετεύστε αµέσως 100 µl διαλύµατος αναστολής (R 10) σε κάθε βύθισµα. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος αναστολής, το οποίο είναι άχρωµο, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής, το υπόστρωµα ροζ χρώµατος γίνεται άχρωµο για τα αρνητικά δείγµατα και το υπόστρωµα µπλε χρώµατος γίνεται κίτρινο για τα θετικά δείγµατα. 11. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος της πλάκας. Ελέγξτε την οπτική πυκνότητα στα 450/620 nm χρησιµοποιώντας µια συσκευή ανάγνωσης πλάκας τουλάχιστον 4 λεπτά µετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής και εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. 11 [GR]

12 β) Διαδικασία εξέτασης HBe Ag 1. Προετοιµάστε το διάλυµα πλύσης. 2. Αφαιρέστε µία ή περισσότερες ταινίες και το δίσκο από την προστατευτική συσκευασία. Τοποθετήστε τις ταινίες που δεν χρησιµοποιήθηκαν στη συσκευασία και επανασφραγίστε την. 3. Διοχετεύστε τους παρακάτω όγκους σε κάθε βύθισµα ως εξής: A1, B1, C1: 100 µl αρνητικού ορού ελέγχου (R3) D 1: 100 µl θετικού ορού ελέγχου (R5) E1, F1, G1: 100 µl δείγµατος Ανάλογα µε το σύστηµα που χρησιµοποιείται, είναι δυνατή η τροποποίηση της θέσης των ορών ελέγχου ή της σειράς κατανοµής. Σηµείωση: Υπάρχει σαφής διαφορά στο χρώµα των κενών βυθισµάτων και των βυθισµάτων που περιέχουν το δείγµα (κίτρινο). Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία δείγµατος στα βυθίσµατα µέσω φασµατοφωτοµετρικής µέτρησης στα 490 nm (ένα µήκος κύµατος). Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 4. Καλύψτε µε αυτοκόλλητη µεµβράνη και υποβάλλετε σε επώαση για 3 ώρες ± 10 λεπτά στους 37 C ± 1 C. 5. Προετοιµάστε το διάλυµα συζεύκτη R7b πριν από το τέλος του βήµατος Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη. Αναρροφήστε το περιεχόµενο κάθε βυθίσµατος στο δοχείο για τα βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήστε πλύση τέσσερις φορές. 7. Διοχετεύστε αµέσως 100 µl αραιωµένου διαλύµατος συζεύκτη (R7b) σε κάθε βύθισµα ή χρησιµοποιήστε το συζεύκτη R7b όπως είναι, ακολουθώντας την παρακάτω συνιστώµενη διαδικασία: διοχετεύστε αρχικά 80 µl αραιωµένου διαλύµατος πλύσης (R2) σε κάθε βύθισµα και, στη συνέχεια, 20 µl συζεύκτη Anti- HBe R7b (5X). Οµογενοποιήστε. Καλύψτε µε αυτοκόλλητη µεµβράνη και υποβάλλετε σε επώαση για 30 λεπτά στους 37 C ± 1 C (από 25 λεπτά το ελάχιστο έως και 40 λεπτά το µέγιστο). Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη µεµβράνη, αναρροφήστε το περιεχόµενο κάθε βυθίσµατος στο δοχείο για τα βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα και, στη συνέχεια, πραγµατοποιήστε πλύση πέντε φορές. Σηµείωση: Η κατανοµή του αραιωµένου διαλύµατος συζεύκτη R7b, το οποίο έχει κυανό χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μπορείτε να επαληθεύσετε την παρουσία αραιωµένου διαλύµατος συζεύκτη R7a στα βυθίσµατα µέσω φασµατοφωτοµετρικής µέτρησης στα 620 nm (ένα µήκος κύµατος). Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 8. Αµέσως πριν από τη χρήση, προετοιµάστε το διάλυµα ανάπτυξης χρώµατος (R8 + R9). 9. Διοχετεύστε αµέσως 80 µl διαλύµατος ανάπτυξης χρώµατος (R8 + R9) σε κάθε βύθισµα. Τοποθετήστε την πλάκα σε σκοτεινό µέρος και σε θερµοκρασία δωµατίου ( C) για 30 λεπτά ± 5. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος ανάπτυξης, το οποίο έχει ροζ χρώµα, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας: Υπάρχει σαφής διαφορά στο χρώµα των κενών βυθισµάτων και των βυθισµάτων που περιέχουν το ροζ διάλυµα. Ανατρέξτε στην ενότητα 13: ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ 12 [GR]

13 ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ. 10. Προσθέστε αµέσως 100 µl διαλύµατος αναστολής (R10) σε κάθε βύθισµα. Σηµείωση: Η κατανοµή του διαλύµατος αναστολής, το οποίο είναι άχρωµο, µπορεί να ελεγχθεί οπτικά σε αυτό το βήµα της διαδικασίας. Μετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής, το υπόστρωµα ροζ χρώµατος γίνεται άχρωµο για τα αρνητικά δείγµατα και το υπόστρωµα µπλε χρώµατος γίνεται κίτρινο για τα θετικά δείγµατα. 11. Σκουπίστε προσεκτικά το κάτω µέρος της πλάκας. Ελέγξτε την οπτική πυκνότητα στα 450/620 nm χρησιµοποιώντας µια συσκευή ανάγνωσης πλάκας τουλάχιστον 4 λεπτά µετά την προσθήκη του διαλύµατος αναστολής και εντός 30 λεπτών από τη διακοπή της αντίδρασης. γ) Ταυτόχρονες διαδικασίες εξέτασης anti-hbe και HBe Ag (στην ίδια πλάκα) Τα βήµατα της διαδικασίας είναι τα ίδια µε αυτά που περιγράφηκαν παραπάνω. Η διάταξη για την κατανοµή του δείγµατος διαφέρει ως εξής: Εξέταση Anti HBe: σειρές 1 έως 6 Εξέταση HBe Ag: σειρές 7 έως ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ α) Eξέταση Anti-HBe 1. Υπολογίστε τη µέση απορρόφηση ( = Οπτική Πυκνότητα, O.D.) στα αντίγραφα του αρνητικού ορού ελέγχου: Μέση τιµή (OD R3) Παράδειγµα: Αρνητικός ορός OD ελέγχου R3 1 1, , ,552 Συνολικό OD = 4,569 Μέση τιµή (OD R3) = Συνολικό OD / 3 = 4,569 / 3 = 1,523 Μόνο µία τιµή απορρόφησης R3 µπορεί να µη συµπεριληφθεί στον υπολογισµό, όταν παρουσιάζει απόκλιση από τη µέση τιµή άνω του 25 %. Στη συνέχεια, επαναλάβετε τον υπολογισµό της µέσης απορρόφησης µε τις δύο άλλες τιµές. 2. Υπολογισµός τιµής αναφοράς Η τιµή αναφοράς υπολογίζεται για κάθε πλάκα σύµφωνα µε τον τύπο: Τιµή αναφοράς = Μέση τιµή (OD R3) x 0,4 Παράδειγµα: Μέση τιµή (OD R3) = 1,523 Τιµή αναφοράς = 1,523 x 0,4 = 0, Εγκυρότητα ανάλυσης για την εξέταση anti-hbe Μέση τιµή (OD R3) > 0,900 OD R4 < 0, [GR]

14 4. Υπολογισµός λόγου Ο λόγος υπολογίζεται για κάθε δείγµα σύµφωνα µε τον τύπο: Λόγος = δείγµα OD / τιµή αναφοράς 5. Ερµηνεία αποτελεσµάτων Τα δείγµατα θα θεωρηθούν: θετικά αν η τιµή του λόγου είναι µικρότερη ή ίση µε 0,9 (λόγος 0,9) αρνητικά αν η τιµή του λόγου είναι µεγαλύτερη από 1,1 (λόγος > 1,1) Ωστόσο, όταν το αποτέλεσµα είναι µεταξύ 0,9 και 1,1, συνιστάται η επανάληψη της ανίχνευσης του anti-hbe σε επόµενη δειγµατοληψία. Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των αρχικά θετικών δειγµάτων εις διπλούν. Μετά την επανεξέταση, αν είναι θετική τουλάχιστον µία τιµή, το δείγµα θεωρείται θετικό. β) Εξέταση HBe Ag 1. Υπολογίστε τη µέση απορρόφηση ( = Οπτική Πυκνότητα, O.D.) στα αντίγραφα του αρνητικού ορού ελέγχου: Μέση τιµή (OD R3) Παράδειγµα: Αρνητικός ορός OD ελέγχου R3 1 0, , ,026 Συνολικό OD = 0,071 Μέση τιµή (OD R3) = Συνολικό OD / 3 = 0,071 / 3 = 0,024 Μόνο µία τιµή απορρόφησης R3 µπορεί να µη συµπεριληφθεί στον υπολογισµό, όταν παρουσιάζει απόκλιση από τη µέση τιµή άνω του 25%. Στη συνέχεια, επαναλάβετε τον υπολογισµό της µέσης απορρόφησης µε τις δύο άλλες τιµές. 2. Υπολογισµός τιµής αναφοράς Η τιµή αναφοράς υπολογίζεται για κάθε πλάκα σύµφωνα µε τον τύπο: Τιµή αναφοράς = Μέση τιµή (OD R3) + 0,025 Παράδειγµα: Μέση τιµή (OD R3) = 0,024 Τιµή αναφοράς= 0, ,025 = 0, Εγκυρότητα ανάλυσης για την εξέταση Ag HBe Μέση τιµή (OD R3) < 0,060 OD R5 > 0, Υπολογισµός λόγου Ο λόγος υπολογίζεται για κάθε δείγµα σύµφωνα µε τον τύπο: Λόγος = δείγµα OD / τιµή αναφοράς 5. Ερµηνεία αποτελεσµάτων Τα δείγµατα θα θεωρηθούν: θετικά αν η τιµή του λόγου είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 1 (λόγος 1) αρνητικά αν η τιµή του λόγου είναι µικρότερη από 1 (λόγος < 1) 14 [GR]

15 Συνιστάται η επανάληψη της εξέτασης των αρχικά θετικών δειγµάτων εις διπλούν. Μετά την επανεξέταση, αν είναι θετική τουλάχιστον µία τιµή, το δείγµα θεωρείται θετικό ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΕΠΑΛΗΘΕΥΣΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΠΙΠΕΤΑ 1 - Εξεταση Anti-HBe Παρουσία δείγµατος και ορού ελέγχου Η παρουσία δείγµατος και ορού ελέγχου στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 490 nm. Η τιµή OD σε κάθε βύθισµα που περιέχει δείγµα και ορό ελέγχου πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,050. Παρουσία αντιγόνου εξουδετέρωσης HBe (R6) Η παρουσία αντιγόνου εξουδετέρωσης HBe στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 490 nm και υπολογισµό της τιµής δέλτα OD. Τιµή δέλτα OD = (OD 490 δείγµα (ή ορός ελέγχου) µε R6) - (µόνο OD 490 δείγµα (ή ορός ελέγχου)) Η τιµή δέλτα OD πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,150. Παρουσία συµπυκνωµένου συζεύκτη εξέτασης Anti-HBe (R7a) Η παρουσία αραιωµένου συζεύκτη R7a στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 620 nm. Η τιµή OD κάθε βυθίσµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερη ή ίση µε 0,070 και µικρότερη ή ίση µε 0,200. Παρουσία διαλύµατος ανάπτυξης (R8 + R9) Η παρουσία διαλύµατος ανάπτυξης στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 490 nm. Η τιµή OD κάθε βυθίσµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0, Εξεταση HBe Ag Παρουσία δείγµατος και ορού ελέγχου Η παρουσία δείγµατος και ορού ελέγχου στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 490 nm. Η τιµή OD σε κάθε βύθισµα που περιέχει δείγµα και ορό ελέγχου πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,050. Παρουσία συµπυκνωµένου συζεύκτη Ag HBe (R7b) Η παρουσία αραιωµένου συζεύκτη R7b στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 620 nm. Η τιµή OD κάθε βυθίσµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0,210. Παρουσία διαλύµατος ανάπτυξης (R8 + R9) Η παρουσία διαλύµατος ανάπτυξης στα βυθίσµατα µπορεί να επαληθευτεί µε αυτόµατη µέτρηση στα 490 nm. Η τιµή OD κάθε βυθίσµατος πρέπει να είναι µεγαλύτερη από 0, [GR]

16 14 - ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΗΣ ΕΞΕΤΑΣΗΣ Τα χαρακτηριστικά απόδοσης της εξέτασης Monolisa HBe Ag-Ab PLUS, που συνοψίζονται παρακάτω, αξιολογήθηκαν σε 2 τοποθεσίες χρησιµοποιώντας δείγµατα από αιµοδότες, ασθενείς και πίνακες οροµετατροπής. 1 - Εξέταση HBe Ag Ειδικότητα Η ειδικότητα σε ένα σύνολο 200 τυχαίων δειγµάτων δοτών αίµατος υπολογίστηκε στο 100% [98, %], (IC95). Επίσης, η ειδικότητα αξιολογήθηκε σε δείγµατα ασθενών και υπολογίστηκε στο 100% [99, %], (IC95, 416/416 δείγµατα). Η ανάλυση δειγµάτων 195 ασθενών µε διαφορετικές παθολογίες ή καταστάσεις που δεν συνδέονται µε την ηπατίτιδα Β (έγκυες γυναίκες, ρευµατοειδής παράγοντας, αντιπυρηνικά αντισώµατα, αντισώµατα Ig αντι-ποντικού ή άλλες ιικές και βακτηριδιακές λοιµώξεις) κατέδειξε ειδικότητα 99,49% [97,18-99,99%] (IC 95, 194/195 δείγµατα που βρέθηκαν αρνητικά). Αναλυτική ευαισθησία Το όριο ευαισθησίας της εξέτασης εκτιµήθηκε στα 0,64 IU/ml [0,49-0,84] (IC 95) κατά τη διάρκεια της αξιολόγησης µε το πρότυπο PEI. Ευαισθησία Η ευαισθησία εξετάστηκε σε 203 θετικά δείγµατα από ασθενείς που παρακολουθούνταν λόγω χρόνιας µόλυνσης από τον ιό HBV, καθώς και από πίνακες οροµετατροπής του εµπορίου. Η ευαισθησία σε αυτά τα δείγµατα υπολογίστηκε στο 99,51% [97,29-99,99%] (IC 95, 202/203 δείγµατα). Αναπαραγωγιµότητα ανάλυσης Η αναπαραγωγιµότητα της εξέτασης Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (HBe Ag) καθορίστηκε µε την ανάλυση 4 δειγµάτων: 1 αρνητικό δείγµα, 1 θετικό δείγµα HBe Ag χαµηλής συγκέντρωσης, 1 θετικό δείγµα HBe Ag υψηλής συγκέντρωσης και 1 θετικό δείγµα HBe Ag µεσαίας συγκέντρωσης. Η αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας αυτά τα 4 δείγµατα 30 φορές στην ίδια ανάλυση, ενώ η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε εξετάζοντας αυτά τα 4 δείγµατα εις διπλούν εντός 20 ηµερών εκτελώντας 2 αναλύσεις την ηµέρα. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες: Πίνακας 1: Αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης n = 30 δείγµα 1 δείγµα 2 δείγµα 3 δείγµα 4 µέση τιµή 3,56 5,29 27,24 45,56 λόγων τυπική 0,05 0,35 0,63 2,88 απόκλιση (SD) CV (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 16 [GR]

17 Πίνακας 2: Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων n = 80 δείγµα 1 δείγµα 2 δείγµα 3 δείγµα 4 µέση τιµή 0,51 8,19 27,33 46,35 λόγων τυπική 0,12 1,17 3,26 4,98 απόκλιση (SD) CV (%) 23,86 14,27 11,92 10, Εξέταση HBe Ag Ειδικότητα Η ειδικότητα σε ένα σύνολο 200 τυχαίων δειγµάτων δοτών αίµατος υπολογίστηκε στο 100% [98, %], (IC95). Επίσης, η ειδικότητα αξιολογήθηκε σε 206 δείγµατα ασθενών και υπολογίστηκε στο 98,54% [95,80-99,70 %], IC95 (203/206). Εξετάστηκαν δείγµατα 198 ασθενών µε διαφορετικές παθολογίες ή καταστάσεις που δεν συνδέονται µε την ηπατίτιδα Β (έγκυες γυναίκες, ρευµατοειδής παράγοντας, αντιπυρηνικά αντισώµατα, αντισώµατα Ig αντι-ποντικού ή άλλες ιικές και βακτηριδιακές λοιµώξεις). 3 δείγµατα βρέθηκαν θετικά (2 δείγµατα HCV και 1 δείγµα ρευµατοειδούς παράγοντα). Η ειδικότητα αυτών των δειγµάτων υπολογίστηκε στο 98,48% [95,64-99,69%] (IC 95, 195/198 δείγµατα που βρέθηκαν αρνητικά). Τα δείγµατα αυτά επανεξετάστηκαν. Το δείγµα ρευµατοειδούς παράγοντα βρέθηκε κατ' επανάληψη αντιδρών. Τα δύο δείγµατα HCV βρέθηκαν αρνητικά ή αµφίβολα. Ευαισθησία Διεξήχθησαν µελέτες ευαισθησίας σε 220 θετικά δείγµατα από ασθενείς που παρακολουθούνταν λόγω χρόνιας µόλυνσης από τον ιό HBV, καθώς και από πίνακες του εµπορίου. Η ευαισθησία υπολογίστηκε στο 98,64% [96,07 99,72%] (IC 95, 217/220 δείγµατα). Αναπαραγωγιµότητα ανάλυσης Η αναπαραγωγιµότητα της εξέτασης Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (anti-hbe Ab) καθορίστηκε µε την ανάλυση 4 δειγµάτων: 1 αρνητικό δείγµα, 1 θετικό δείγµα HBe Ab χαµηλής συγκέντρωσης, 1 θετικό δείγµα HBe Ab υψηλής συγκέντρωσης και 1 θετικό δείγµα HBe Ab µεσαίας συγκέντρωσης. Η αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης αξιολογήθηκε εξετάζοντας αυτά τα 4 δείγµατα 30 φορές στην ίδια ανάλυση, ενώ η αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων αξιολογήθηκε εξετάζοντας αυτά τα 4 δείγµατα εις διπλούν εντός 20 ηµερών εκτελώντας 2 αναλύσεις την ηµέρα. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες: Πίνακας 1: Αναπαραγωγιµότητα εντός της ανάλυσης n = 30 δείγµα 1 δείγµα 2 δείγµα 3 δείγµα 4 µέση τιµή 3,15 0,69 0,42 0,03 λόγων τυπική 0,05 0,04 0,04 0,00 απόκλιση (SD) CV (%) 1,7 5,7 10,5 6,6 17 [GR]

18 Πίνακας 2: Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ των αναλύσεων n = 80 δείγµα 1 δείγµα 2 δείγµα 3 δείγµα 4 µέση τιµή 2,39 0,81 0,59 0,3 λόγων τυπική 0,23 0,077 0,09 0,01 απόκλιση (SD) CV (%) 9,6 9,5 14,5 39, ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1 - MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l'hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L'ADN du virus de l'hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l'antigène HBe et l'anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l'hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); [GR]

19 19 [GR]

20 20 [GR]

21 21 [GR]

22 22 [GR]

23 23 [GR]