ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΑΣ ΤΥΠΟΥ «SANDWICH» ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΑΝΝΑΝΗΣ CANDIDA

Transcript

1 PLATELIA CANDIDA Ag 96 ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ: Η PLATELIA CANDIDA Ag ΕΙΝΑΙ ΜΙΑ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΑΣ ΤΥΠΟΥ «SANDWICH» ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΜΑΝΝΑΝΗΣ CANDIDA ΣΕ ΟΡΟ. 1 ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Η Platelia Candida Ag είναι μια ανοσοενζυμική ανάλυση μικροπλάκας τύπου «sandwich» για την ανίχνευση κυκλοφορούντος αντιγόνου μαννάνης Candida σε δείγματα ορού. 2 ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΧΡΗΣΗΣ Η εξέταση Platelia Candida Ag (αρ. κατ ) είναι μια εξέταση, η οποία αν χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με την εξέταση Platelia Candida Ab/Ac/Ak (αρ. κατ ) επιτρέπει την πρώιμη διάγνωση της διηθητικής μονιλίασης, με βελτιωμένη παράλληλα ευαισθησία, στο πλαίσιο μιας ολοκληρωμένης διαγνωστικής προσέγγισης που περιλαμβάνει κλινικά και μυκητολογικά δεδομένα καθώς και εκτίμηση των ενδογενών και ιατρογενών παραγόντων κινδύνου 12. Ο συνδυασμός αυτός αποτελεί, επίσης, αναπόσπαστο μέρος ενός κλινικού και εργαστηριακού συστήματος παρακολούθησης ασθενών και χρησιμοποιείται ως βοήθεια στη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Οι λοιμώξεις από Candida αποτελούν τη συχνότερη μορφή νοσοκομειακών μυκητιασικών λοιμώξεων 2. Οι διηθητικές μορφές λοιμώξεων αποτελούν τις πιο σοβαρές λοιμώξεις με επίπεδα θνησιμότητας από 30 έως 70% σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς 10. Η διάγνωση των διηθητικών λοιμώξεων Candida δεν μπορεί να καθοριστεί εύκολα λόγω της χαμηλής ειδικότητας των κλινικών συμπτωμάτων και της χαμηλής ευαισθησίας των καλλιεργειών, παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει πραγματοποιηθεί πρόσφατα στο πεδίο αυτό. Η διάγνωση της διηθητικής μονιλίασης που οδηγεί στην έναρξη κατάλληλης θεραπείας, βασίζεται συνήθως σε ένα συνδυασμό κλινικών και μυκητολογικών παραγόντων καθώς και παραγόντων κινδύνου 7. Στο πλαίσιο αυτό, η διάγνωση της συστημικής μονιλίασης πρέπει να περιλαμβάνει πάντα ορολογικές τεχνικές καθώς και άμεσες μυκητολογικές μεθόδους. Η διάγνωση της λοίμωξης Candida φαίνεται να βελτιώνεται με την ανίχνευση κυκλοφορούντων αντιγόνων στον ορό, ειδικά σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς. Η μαννάνη, ένα από τα αντιγόνα Candida, είναι ένας πολυσακχαρίτης που δεσμεύεται μη ομοιοπολικά στα κυτταρικά τοιχώματα του ζυμομύκητα και αντιπροσωπεύει πάνω από 7% του ξηρού βάρους του C. albicans 3. Το αντιγόνο αυτό φαίνεται να είναι ένας από τους κύριους δείκτες της διηθητικής μονιλίασης 6. 4 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η Platelia Candida Ag είναι μια ανοσοενζυμική ανάλυση μικροπλάκας τύπου «sandwich» ενός σταδίου, με την οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί ποσοτική ή ποιοτική ανίχνευση του κυκλοφορούντος αντιγόνου μαννάνης στον ανθρώπινο ορό. Στην ανάλυση χρησιμοποιείται το μονόκλωνο αντίσωμα αρουραίου EBCA-1 που κατευθύνεται κατά του Candida α 1-5 oligomannosides και έχει χαρακτηριστεί σε προηγούμενες μελέτες 1, 5, 11. Το μονόκλωνο αντίσωμα χρησιμοποιείται για τους εξής σκοπούς: επικάλυψη των μικροβυθισμάτων της μικροπλάκας και δέσμευση του αντιγόνου μαννάνης ανίχνευση του αντιγόνου που έχει δεσμευτεί στην ευαισθητοποιημένη μικροπλάκα (αντιδραστήριο συζεύκτη: μονόκλωνο αντίσωμα που συνδέεται με υπεροξειδάση). Τα δείγματα του ορού υποβάλλονται σε θερμική επεξεργασία με EDTA για να διαχωριστούν ανοσοσυμπλέγματα και να καθιζάνουν οι πρωτεΐνες του ορού που θα μπορούσαν να παρεμβληθούν στην εξέταση. 1

2 Τα επεξεργασμένα δείγματα ορού και συζεύκτη προστίθενται στα μικροβυθίσματα που επικαλύπτονται με μονόκλωνο αντίσωμα και επωάζονται. Ένα σύμπλεγμα μονόκλωνου αντισώματος - μαννάνης μονόκλωνου αντισώματος / υπεροξειδάσης σχηματίζεται παρουσία του αντιγόνου μαννάνης. Οι λωρίδες πλένονται για να απομακρυνθεί κάθε αδέσμευτο υλικό. Στη συνέχεια, προστίθεται το διάλυμα υποστρώματος, το οποίο θα αντιδράσει με τα σύμπλοκα που έχουν δεσμευτεί στο μικροβύθισμα σχηματίζοντας μία αντίδραση μπλε χρώματος. Η ενζυμική αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη οξέος, το οποίο αλλάζει το μπλε χρώμα σε κίτρινο. Η απορρόφηση (οπτική πυκνότητα) των δειγμάτων, των ορών ελέγχου και των σημείων εύρους προσδιορίζεται με φασματοφωτόμετρο ρυθμισμένο σε μήκος κύματος 450 και 620 nm. Η εξέταση μπορεί να εκτελεστεί σύμφωνα με δύο τρόπους λειτουργίας: Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας: με καθορισμό καμπύλης βαθμονόμησης από 4 σημεία εύρους: 2,0, 1,0, 0,5 και 0,25 ng/ml. Τα αποτελέσματα των δειγμάτων εξέτασης εκφράζονται σε ng μαννάνης ανά ml ορού. Ποιοτικός τρόπος λειτουργίας: χρησιμοποιούνται μόνο τα σημεία εύρους 0,25 ng/ml και 0,5 ng/ml. Με τη σύγκριση των τιμών OD των δειγμάτων εξέτασης και των τιμών OD των 2 σημείων εύρους, τα αποτελέσματα μπορούν να παρουσιαστούν ως αρνητικοί, ενδιάμεσοι ή θετικοί οροί. 5 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Platelia Candida Ag: αρ. προϊόντος (96 Εξετάσεις) Αποθηκεύστε το κιτ στους +2-8 C. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου ( C) πριν από τη χρήση. Επαναφέρατε όλα τα αντιδραστήρια στους +2-8 C αμέσως μετά τη χρήση. Τοποθετήστε ξανά τις λωρίδες/πλάκες που δεν χρησιμοποιήθηκαν στο σακουλάκι τους και επανασφραγίστε. Μην αφαιρείτε το αποξηραντικό υλικό. Οι λωρίδες πρέπει να χρησιμοποιηθούν εντός 5 εβδομάδων αφότου ανοιχθεί και επανασφραγιστεί το σακουλάκι. Μετά την αραίωση, το διάλυμα πλύσης εργασίας μπορεί να διατηρηθεί για 14 ημέρες στους +2-8 C. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης μετά το άνοιγμα. Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για την εκτέλεση 96 εξετάσεων το ανώτερο σε 6 παρτίδες. Συστατικό Περιεχόμενα Ποσότητα - 96 μικροβυθίσματα (12 λωρίδες των 8 1 Πλάκα / μικροβυθισμάτων η καθεμία) επικαλυμμένα με 12 x 8 μονόκλωνο αντίσωμα κατά της μαννάνης EBCA-1 Μικροβυθίσματα R1 Πλάκα λωρίδων μικροβυθίσματος R2 Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (10Χ) R3 Αρνητικός ορός ελέγχου R4 Βαθμονομητής ορού - Ρυθμιστικό διάλυμα Tris NaCI (ph 7,4) - 1% Tween 20 - Συντηρητικό: 0,01% thimerosal - Ανθρώπινος ορός ελέγχου αρνητικός στη μαννάνη, ο οποίος χρησιμοποιείται ως αρνητικός ορός ελέγχου και αραιωτικό για τον τυπικό ορό κατά την προετοιμασία των σημείων εύρους 1,0, 0,5 και 0,25 ng/ml στην ποσοτική εξέταση καθώς και για την προετοιμασία του βαθμονομητή ορού στην ποιοτική εξέταση (βλ. «10. Διαδικασία») - -Αρνητικός για αντισώματα anti-hiv1, anti-hiv2, anti- HCV και αντιγόνο HBs - Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου 0,1% - Ανθρώπινος ορός που περιέχει 2,0 ng/ml μαννάνης και χρησιμοποιείται για την προετοιμασία των σημείων εύρους 1,0, 0,5 και 0,25 ng/ml στην ποσοτική εξέταση καθώς και για την προετοιμασία του βαθμονομητή ορού στην ποιοτική εξέταση (βλ. «10. Διαδικασία») - -Αρνητικός για αντισώματα anti-hiv1, anti-hiv2, anti- HCV και αντιγόνο HBs - Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου 0,1% 1 x 100 ml 1 x 10 ml 2 x 2 ml 2

3 R5 Θετικός ορός ελέγχου R6 Συζεύκτης (έτοιμος για χρήση): - Ανθρώπινος ορός που περιέχει μεταξύ 0,5 και 1,5 ng μαννάνης - -Αρνητικός για αντισώματα anti-hiv1, anti-hiv2, anti- HCV και αντιγόνο HBs - Συντηρητικό: Αζίδιο του νατρίου 0,1% - Με επισήμανση από μονόκλωνο αντίσωμα κατά της μαννάνης/υπεροξειδάση - Συντηρητικό: 0,01% thimerosal 1 x 2 ml 1 x 8 ml R7 Διάλυμα επεξεργασίας ορού (έτοιμος για χρήση): R8 Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος ΤΜΒ (έτοιμος για χρήση): R9 Χρωμογόνο: Διάλυμα ΤΜΒ (συμπυκνωμένο) -διάλυμα οξέος EDTA, χωρίς συντηρητικό - Διάλυμα κιτρικού οξέος και οξικού νατρίου ph 5,2-0,009% υπεροξείδιο υδρογόνου - 4% Διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) - 90% διάλυμα διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO) που περιέχει 0,6% τετραμεθυλοβενζιδίνη (TMB)* 1 x 10,5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml R10 Διάλυμα - 1,5 N Θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) 1 x 12 ml αναστολής (έτοιμο για χρήση): Σφραγιστικά πλάκας - Αυτοκόλλητα φύλλα για μικροπλάκες 1 x 4 φύλλα *Σημείωση: Η TMB (Τετραμεθυλοβενζιδίνη) είναι μη καρκινογόνο και μη μεταλλαξιγόνο χρωμογόνο για υπεροξειδάση. 6 ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. Για διαγνωστική χρήση in vitro. 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Δεν συνιστάται η χρήση του παρόντος κιτ εξέτασης με άλλα δείγματα εκτός από ανθρώπινο ορό. 4. Το υλικό ανθρώπινης προέλευσης που χρησιμοποιείται στην προετοιμασία των αντιδραστηρίων έχει εξεταστεί και έχει βρεθεί αρνητικό για αντισώματα anti-hiv-1, anti-hiv-2 και anti-hcv καθώς και για αντιγόνο HBs. Ωστόσο, καθώς καμία μέθοδος δεν μπορεί να εγγυηθεί απολύτως την απουσία μολυσματικών παραγόντων, όλα τα αντιδραστήρια και όλα τα δείγματα ασθενών θα πρέπει να αντιμετωπίζονται ως εν δυνάμει μολυσματικά. Όλες οι εξετάσεις θα πρέπει να διεξάγονται σύμφωνα με τις προτεινόμενες προφυλάξεις για παθογόνα που μεταδίδονται με το αίμα. 5. Φοράτε προστατευτική ενδυμασία και γάντια μίας χρήσης κατά το χειρισμό των αντιδραστηρίων του κιτ και των δειγμάτων ασθενών. Πλένετε σχολαστικά τα χέρια σας μετά την ολοκλήρωση της εξέτασης. 6. Μην αναρροφάτε με πιπέτα από το στόμα. 7. Μην καπνίζετε και μην καταναλώνετε ροφήματα ή τρόφιμα σε περιοχές όπου εκτελείται επεξεργασία δειγμάτων ή αντιδραστηρίων του κιτ. 8. Αποφεύγετε τη διαρροή δειγμάτων ή διαλυμάτων αυτών. 9. Κηλίδες βιολογικού υλικού που δεν περιέχουν οξύ πρέπει να σκουπίζονται επιμελώς με ένα δραστικό απολυμαντικό. Τα απολυμαντικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν περιλαμβάνουν, ενδεικτικά, ένα διάλυμα 10% λευκαντικού (0,5% διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου), 70% αιθανόλης ή 0,5% Wescodyne. Οι κηλίδες που περιέχουν οξύ πρέπει να σκουπίζονται ή να εξουδετερώνονται με διττανθρακικό νάτριο και έπειτα να ακολουθεί καθαρισμός με ένα από τα 3

4 χημικά απολυμαντικά. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται για το σκούπισμα των κηλίδων πρέπει να απορρίπτονται ως βιολογικά επικίνδυνα απόβλητα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Μην τοποθετείτε διαλύματα που περιέχουν λευκαντικά στο αυτόκαυστο. 10. Απορρίψτε όλα τα δείγματα και τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για την εκτέλεση της εξέτασης ως μολυσματικά. Η απόρριψη πρέπει να τηρεί όλες τις ισχύουσες προϋποθέσεις απόρριψης αποβλήτων. 11. Ορισμένα αντιδραστήρια περιέχουν αζίδιο του νατρίου ως συντηρητικό. Το αζίδιο του νατρίου μπορεί να οδηγήσει στο σχηματισμό αζιδίων μολύβδου ή χαλκού στις εργαστηριακές σωληνώσεις. Τα αζίδια αυτά είναι εκρηκτικά. Για να αποφευχθεί τυχόν συσσώρευση αζιδίων, ξεπλένετε τη σωλήνωση με άφθονο νερό σε περίπτωση απόρριψης στο νεροχύτη διαλυμάτων που περιέχουν αζίδια μετά την εξουδετέρωσή τους. 12. ΠΡΟΣΟΧΗ: Θειικό οξύ (H 2 SO 4 ) 1,5 N και DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο) 90% R36/38: Ερεθιστικό για τα μάτια και το δέρμα. S: : Διατηρείτε το προϊόν μακριά από παιδιά. Σε περίπτωση επαφής με τα μάτια, πλύνετε αμέσως με άφθονο νερό και ζητήστε ιατρική συμβουλή. Ποτέ μην προσθέτετε νερό σε αυτό το προϊόν. 13. Αποφεύγετε την επαφή του ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος TMB, του χρωμογόνου: διαλύματος TMB και του διαλύματος αναστολής με τα μάτια, το δέρμα και τους βλεννογόνους (κίνδυνος τοξικότητας, ερεθισμού και εγκαυμάτων). 14. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφάλειας (MSDS) διατίθεται κατόπιν αίτησης. 7 ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. ΚΑΤΕΨΥΓΜΕΝΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΡΟΥ ΠΟΥ ΑΠΟΘΗΚΕΥΤΗΚΑΝ ΥΠΟ ΑΓΝΩΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΕΝΔΕΧΕΤΑΙ ΝΑ ΔΩΣΟΥΝ ΨΕΥΔΗ ΘΕΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΛΟΓΩ ΤΗΣ ΜΟΛΥΝΣΗΣ ΑΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ ΚΑΙ/Ή ΒΑΚΤΗΡΙΑ. 2. Μην χρησιμοποιείτε το κιτ ή αντιδραστήρια του κιτ μετά το πέρας της αναγραφόμενης ημερομηνίας λήξης. 3. Εκτός από το Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης (R2) και το Διάλυμα Αναστολής (R10), μην αναμιγνύετε αντιδραστήρια από άλλα κιτ με διαφορετικούς αριθμούς παρτίδας. 4. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. 5. Αναμίξτε καλά κατά την ανασύσταση των αντιδραστηρίων, με ιδιαίτερη προσοχή ώστε να αποφευχθεί τυχόν μικροβιακή μόλυνση. 6. Μην εκτελείτε την εξέταση παρουσία δραστικών αερίων (οξέων, αλκαλίων, αλδεϋδών) ή σκόνης, που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ενζυμική δραστηριότητα του συζεύκτη. 7. Χρησιμοποιείτε καθαρά, πλαστικά δοχεία πολυπροπυλενίου μίας χρήσης για να ετοιμάσετε το διάλυμα αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου. Εάν πρέπει να χρησιμοποιηθούν υλικά από γυαλί, θα πρέπει πρώτα να πλυθούν σε υδροχλωρικό οξύ 1Ν, να ξεπλυθούν με αποσταγμένο νερό και να στεγνώσουν. 8. Για χειροκίνητη μεταφορά με πιπέτα των ορών ελέγχου και των δειγμάτων, χρησιμοποιείτε ξεχωριστά ακροφύσια πιπέτας, για να αποφεύγετε την επιμόλυνση των δειγμάτων. 9. Για να διασφαλίσετε επαρκές πλύσιμο των μικροβυθισμάτων, τηρήστε το συνιστώμενο αριθμό κύκλων πλύσης και βεβαιωθείτε ότι όλα τα μικροβυθίσματα είναι πλήρως γεμάτα και, στη συνέχεια, άδεια. Το πλύσιμο δεν πρέπει να εκτελείται χειροκίνητα με συμπιεζόμενη φιάλη. 10. Μην αφήνετε τη μικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστημα από το τέλος του κύκλου πλύσης και μέχρι την προσθήκη των αντιδραστηρίων. 11. Μη χρησιμοποιείτε το ίδιο δοχείο για τα διαλύματα συζεύκτη και υποστρώματος. 12. Μην αφήνετε τα διαλύματα συζεύκτη ή αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου να έλθουν σε επαφή με μέταλλο ή μεταλλικά ιόντα. 13. Αποφεύγετε την έκθεση του χρωμογόνου: διαλύματος ΤΜΒ ή του διαλύματος αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου σε δυνατό φωτισμό κατά την αποθήκευση ή την επώαση. Μην αφήνετε τα διαλύματα χρωμογόνου να έλθουν σε επαφή με οξειδωτικό παράγοντα. 14. Αποφεύγετε την επαφή του Διαλύματος Αναστολής με οποιονδήποτε οξειδωτικό παράγοντα. Μην αφήνετε το Διάλυμα Αναστολής να έλθει σε επαφή με μέταλλο ή μεταλλικά ιόντα. 15. Περιορίστε την έκθεση των διαλυμάτων (ορός, διάλυμα επεξεργασίας ορού, συζεύκτης) ή ανοικτών δοχείων (πλάκες, σωλήνες, πιπέτες) στον αέρα. 4

5 16. Μη διοχετεύετε τυχόν ποσότητες συζεύκτη που δεν χρησιμοποιήθηκαν στο αρχικό δοχείο. 17. Το Διάλυμα Αντίδρασης Υποστρώματος-Χρωμογόνου πρέπει να είναι άχρωμο. Η εμφάνιση ενός μπλε χρώματος μετά την αραίωση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο είναι μολυσμένο και δεν πρέπει να χρησιμοποιηθεί. Απορρίψτε το και ετοιμάστε νέο αντιδραστήριο. 8 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟΥ Πλάκα λωρίδων μικροβυθίσματος (R1) Αφού ανοιχθεί το σακουλάκι της πλάκας, οι λωρίδες μικροβυθίσματος είναι σταθερές για 5 εβδομάδες στους +2-8 C στην αρχική τους σακούλα, εάν είναι προσεκτικά κλεισμένη και περιέχει αποξηραντικό. Διάλυμα πλύσης (R2) Προετοιμάστε το διάλυμα πλύσης εργασίας, όπως απαιτείται, προσθέτοντας ένα μέρος συμπυκνωμένου διαλύματος πλύσης σε 9 μέρη αποστειρωμένου απιονισμένου ή αποσταγμένου νερού. Προετοιμάστε επαρκή ποσότητα διαλύματος πλύσης εργασίας για να ολοκληρώσετε την ανάλυση (80 ml για μία λωρίδα: 8 ml R ml αποσταγμένο νερό). Το διάλυμα πλύσης εργασίας μπορεί να αποθηκευτεί για 14 ημέρες στους +2-8 C. Μετά το άνοιγμα, το συμπυκνωμένο διάλυμα πλύσης αποθηκεύεται στους C, όπου αν δεν υπάρξει μόλυνση, είναι σταθερό μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Διάλυμα αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου (R8 + R9) Προετοιμάστε το διάλυμα αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου προσθέτοντας ένα μέρος συμπυκνωμένο διάλυμα χρωμογόνου: ΤΜΒ, R9, σε 50 μέρη ρυθμιστικού διαλύματος υποστρώματος ΤΜΒ, R8. Ετοιμάστε 2 ml διαλύματος αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου για κάθε λωρίδα: 40 µl του R9 + 2 ml του R8. Το διάλυμα είναι σταθερό για 6 ώρες όταν αποθηκευτεί σε σκοτεινό μέρος και σε θερμοκρασία δωματίου ( C). Μετά από το άνοιγμα, τα αντιδραστήρια R8 και R9 αποθηκεύονται στους +2-8 C, όπου εάν δεν υπάρξει μόλυνση, είναι σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα. Αρνητικός ορός ελέγχου (R3), βαθμονομητής ορού (R4), θετικός ορός ελέγχου (R5), συζεύκτης (R6), διάλυμα επεξεργασίας ορού (R7) και διάλυμα αναστολής (R10) Μετά το άνοιγμα και εάν δεν παρατηρηθεί μόλυνση, τα αντιδραστήρια R3, R4, R5, R6, R7 και R10 που είναι αποθηκευμένα στους +2-8 C παραμένουν σταθερά μέχρι την ημερομηνία λήξης που υποδεικνύεται στην ετικέτα. 9 ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Συλλέξτε δείγματα αίματος σύμφωνα με τις τυπικές εργαστηριακές διαδικασίες. Η εξέταση εκτελείται σε ορό. Τα δείγματα ορού πρέπει να μην είναι μολυσμένα από μυκητιασικούς σπόρους και/ή βακτήρια. Μεταφέρετε και αποθηκεύετε τα δείγματα σε σφραγισμένα σωληνάρια που δεν εκτίθενται στον αέρα. Τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στους +2-8 C για 24 ώρες πριν από την εξέταση. Για μακρόχρονη αποθήκευση, αποθηκεύστε τον ορό τους -70 C. Τα δείγματα ορού μπορούν να υποβληθούν το ανώτερο σε 3 κύκλους ψύξης / απόψυξης. Πρόσφατα κατεψυγμένα δείγματα πρέπει να αναμιγνύονται καλά μετά από την απόψυξή τους πριν από την εξέταση. Τα αποτελέσματα δεν επηρεάζονται από δείγματα που περιέχουν 90 g/l βόειου ορού, 200 mg/l χολερυθρίνης, λιπαιμικά δείγματα που περιέχουν 360 g/l τριελαΐνης (τριγλυκερίδιο) ή από αιμολυμένα δείγματα που περιέχουν 200 g/l αιμοσφαιρίνης. Μην αποσυνθέτετε τον ορό. 10 ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Παρεχόμενα υλικά Βλ. ενότητα ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ. Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται 1. Αποστειρωμένο αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό, για αραίωση του συμπυκνωμένου διαλύματος πλύσης. 2. Απορροφητικό χαρτί. 3. Γάντια μίας χρήσης. 5

6 4. Προστατευτικά γυαλιά. 5. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διττανθρακικό νάτριο. 6. Πιπέτες ή πολλαπλές πιπέτες ρυθμιζόμενες ή σταθερές, για να μετρούν και να διοχετεύουν 50 µl, 100 µl, 300 µl, και 1000 µl. 7. Σωληνάρια πολυπροπυλενίου μικροφυγόκεντρου 1,5 ml με αεροστεγή πώματα, που έχουν την ιδιότητα να αντέχουν σε θερμοκρασία 120 C (θερμαντική συσκευή) ή 100 C (βραστό υδατόλουτρο): Σωληνάρια με βιδωτά καπάκια: Κωνικά σωληνάρια 1,5 ml, Bio-Rad αρ. κατ ή αντίστοιχα. Ή Σωληνάρια με κουμπωτά καπάκια: Μικροσωληνάρια Εξέτασης EZ, 1,5 ml, Bio-Rad Αρ. Κατ ή αντίστοιχα. Ασφάλειες καπακιών μικροσωληναρίων: VWR αρ. κατ ή αντίστοιχα. Με τις ασφάλειες αυτές, τα σωληνάρια με κουμπωτά καπάκια σφραγίζουν καλά και δεν ανοίγουν κατά τις μεταβολές θερμοκρασίας και πίεσης, ενώ επίσης μπορούν να ανασηκωθούν εύκολα από τη θερμαντική συσκευή ή το βραστό υδατόλουτρο. 8. Επιτραπέζια φυγόκεντρος εργαστηρίου για σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml με χωρητικότητα g. 9. Εάν χρησιμοποιείται θερμαντική συσκευή για την επεξεργασία του ορού: Θερμαντική συσκευή. Συστήνονται τα παρακάτω μοντέλα θερμαντικής συσκευής: - μοντέλο συσκευής 1 μονάδας: Grant Αρ. Κατ. QBD1 (VWR Αρ. Κατ. # ) - μοντέλο συσκευής 2 μονάδων: Grant Αρ. Κατ. QBD2 (VWR Αρ. Κατ. # ) Μονάδα για θερμαντική συσκευή: και οι δύο θερμαντικές συσκευές (QBD1 και QBD2) πρέπει να χρησιμοποιούνται με τη μονάδα Grant αρ. κατ. QB-E1 (VWR αρ. κατ ) Εάν χρησιμοποιείται βραστό υδατόλουτρο για την επεξεργασία του ορού: Στρογγυλή, αφαιρούμενη υποδοχή μικροφυγοκέντρου για ποτήρι ζέσης 1L. Βραστό υδατόλουτρο στους 100 C 10. Αναδευτήρας τύπου Vortex. 11. Επωαστής μικροπλάκας στους 37 ± 1 C. 12. Ημιαυτόματη ή αυτόματη συσκευή πλύσης μικροπλάκας. 13. Συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με φίλτρα 450 και 620 nm. 14. Δοχείο για μολυσμένα απορρίμματα. Παρατηρήσεις διαδικασίας Σε κάθε ανάλυση πρέπει να εξετάζονται οι αρνητικοί και θετικοί οροί ελέγχου καθώς και τα σημεία εύρους, ώστε να διασφαλίζεται η εγκυρότητα των αποτελεσμάτων της εξέτασης. Προετοιμασία των σημείων εύρους Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας: R3 Αρνητικός ορός ελέγχου Για 1 σειρά Για 6 σειρές (*) R4 R3 2 ng/ml Αρνητικός ορός Βαθμονομητής ορού ελέγχου R4 2 ng/ml Βαθμονομητής ορού Σημείο 2 ng/ml µl µl Σημείο 1 ng/ml 150 µl 150 µl 1000 µl 1000 µl Σημείο 0,5 ng/ml 225 µl 75 µl 1500 µl 500 µl Σημείο 0,25 ng/ml 262,5 µl 37,5 µl 1750 µl 250 µl (*) μπορείτε να προετοιμάσετε εκ των προτέρων έναν όγκο αντιδραστηρίων που αντιστοιχεί σε 6 σειρές: για κάθε σημείο εύρους, διαιρείτε σε κλάσματα 300 μl και αποθηκεύετε στους -20 C. Αφήστε τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου (18-25 C) πριν από τη χρήση. Ποιοτικός τρόπος λειτουργίας: Προετοιμάστε τα σημεία εύρους 0,5 ng/ml (βαθμονομητής ορού) και 0,25 ng/ml, όπως υποδεικνύεται στον προηγούμενο πίνακα. 6

7 Επεξεργασία των ορών Όλοι οι οροί ελέγχου: αρνητικοί (R3), θετικοί (R5) καθώς και τα σημεία εύρους 2,0, 1,0, 0,5 και 0,25 ng/ml πρέπει να υποβάλλονται σε επεξεργασία ταυτόχρονα με τα δείγματα εξέτασης: 1. Διοχετεύστε με πιπέτα 300 µl από κάθε ορό εξέτασης, ορό ελέγχου και σημείο εύρους σε χωριστά σωληνάρια πολυπροπυλενίου 1,5 ml. 2. Προσθέστε 100 µl Διαλύματος Επεξεργασίας Ορού (R7) σε κάθε σωληνάριο. 3. Αναμίξτε τα σωληνάρια σχολαστικά με έντονη ανάμιξη ή στροβιλισμό για να αναμιχθούν καλά. Κλείστε σφιχτά το σωληνάρια για να αποφευχθεί το άνοιγμα κατά τη θέρμανση. Μην τρυπάτε το πώμα. 4. Επιλογή θερμαντικής συσκευής: Θερμάνετε τα σωληνάρια για 6 λεπτά στη θερμαντική συσκευή στους 120 o C. Τα σωληνάρια πρέπει να τοποθετηθούν μέσα στη συσκευή μόνο όταν επιτευχθεί η καθορισμένη θερμοκρασία. (*) Ή Επιλογή υδατόλουτρου: Εάν χρησιμοποιείτε βραστό υδατόλουτρο: θερμάνετε τα σωληνάρια για 3 λεπτά στους 100 o C. Τα σωληνάρια πρέπει να τοποθετηθούν στο υδατόλουτρο μόνο όταν επιτευχθεί η καθορισμένη θερμοκρασία. (*) 5. Απομακρύνετε προσεκτικά τα καυτά σωληνάρια από τη θερμαντική συσκευή ή το βραστό υδατόλουτρο και τοποθετήστε τα σε φυγόκεντρο. Φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια στα x g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο υγρό χρησιμοποιείται για ανίχνευση του αντιγόνου μαννάνης. 6. Ελέγξτε τα υπερκείμενα υγρά ακολουθώντας την παρακάτω διαδικασία. Μετά την επεξεργασία του ορού, η εξέταση πρέπει να εκτελείται το συντομότερο δυνατό. Εάν η ανάλυση των αποτελεσμάτων υποδεικνύει ότι απαιτείται επανεξέταση, πρέπει να υποβληθεί σε επεξεργασία άλλο κλάσμα ορού. (*) Η αυστηρή τήρηση της συνιστώμενης θερμοκρασίας και του συνιστώμενου χρόνου εξαγωγής αποτελεσμάτων καθώς και η χρήση του συνιστώμενου υλικού αποτελούν βασικές προϋποθέσεις για την επιτυχία της εξέτασης. Μην εμπιστεύεστε τη θερμοκρασία που εμφανίζεται στη συσκευή, αλλά ελέγχετε αν η θερμοκρασία συμφωνεί με τις προδιαγραφές χρησιμοποιώντας βαθμονομημένο θερμόμετρο το οποίο τοποθετείται σε σωληνάριο που περιέχει ορυκτέλαιο: Στο εσωτερικό του σωληναρίου πρέπει να επιτευχθεί θερμοκρασία 120 C όταν χρησιμοποιείται θερμαντική συσκευή και 100 C όταν χρησιμοποιείται βραστό υδατόλουτρο. Σημείωση: - Για την εκτέλεση της εξέτασης Platelia Aspergillus EIA μπορείτε να χρησιμοποιήσετε όλα τα δείγματα ορού που υποβάλλονται στην επεξεργασία αυτή, καθώς οι διαδικασίες επεξεργασίας ορού είναι όμοιες για τις δύο εξετάσεις. - Μην αποθηκεύετε ποσότητες ορού (ορούς ελέγχου, σημεία εύρους και δείγματα εξέτασης) μετά την επεξεργασία. Διαδικασία ανοσοενζυμικής ανάλυσης (ΕΙΑ) Τηρείτε αυστηρά το προτεινόμενο πρωτόκολλο. Τηρείτε την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική. 1. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να αποκτήσουν θερμοκρασία δωματίου (18-25 C) για 15 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. 2. Προετοιμάστε το διάλυμα πλύσης εργασίας, το διάλυμα αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου, τους αρνητικούς και θετικούς ορούς και τα σημεία εύρους. 3. Προετοιμάστε έναν πίνακα για την ταυτοποίηση των ορών εξέτασης, των ορών ελέγχου και των σημείων εύρους στη μικροπλάκα. Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας: Οι οροί ελέγχου και τα σημεία εύρους (0,25, 0,50, 1,0 και 2,0 ng/ml) μπορούν να τοποθετηθούν σύμφωνα με το παρακάτω διάγραμμα: - A1: Αρνητικός ορός ελέγχου (R3) - B1: σημείο εύρους 0,25 ng/ml - C1: σημείο εύρους 0,50 ng/ml - D1 : σημείο εύρους 1,0 ng/ml - E1: σημείο εύρους 2,0 ng/ml (R4) - F1: Θετικός ορός ελέγχου (R5) - G1: Θετικός ορός ελέγχου (R5) 7

8 Ποιοτικός τρόπος λειτουργίας: Μπορείτε να τοποθετήσετε τους ορούς ελέγχου και τα σημεία εύρους 0,5 ng/ml και 0,25 ng/ml σύμφωνα με το παρακάτω διάγραμμα: - A1: Αρνητικός ορός ελέγχου (R3) - B1: σημείο εύρους 0,25 ng/ml - C1: σημείο εύρους 0,5 ng/ml (Βαθμονομητής ορού) - D1 : σημείο εύρους 0,5 ng/ml (Βαθμονομητής ορού) - E1: Θετικός ορός ελέγχου (R5) 4. Αφαιρέστε τη βάση της πλάκας και τις λωρίδες μικροβυθίσματος (R1) από το σακουλάκι της πλάκας. Επανατοποθετήστε τις λωρίδες που δεν θα χρησιμοποιηθούν στο σακουλάκι, με το αποξηραντικό και επανασφραγίστε το σακουλάκι. 5. Αναμίξτε τα περιεχόμενα της φιάλης Συζεύκτη (R6) αναστρέφοντας πριν από τη χρήση. Προσθέστε 50 µl συζεύκτη σε κάθε μικροβύθισμα. Στη συνέχεια, προσθέστε 50 µl υπερκείμενου υγρού επεξεργασμένου ορού σε κάθε μικροβύθισμα, όπως καθορίστηκε παραπάνω. Μην προσθέτετε δείγματα ορού στα μικροβυθίσματα πριν από το συζεύκτη. 6. Καλύψτε την πλάκα με σφραγιστικό ή άλλα μέσα για να εμποδίσετε την εξάτμιση, διασφαλίζοντας ότι ολόκληρη η επιφάνεια είναι καλυμμένη και υδατοστεγής. 7. Επωάστε τη μικροπλάκα σε ξηρό επωαστή μικροπλάκας για 90 ± 5 λεπτά στους 37 C (± 1 C). 8. Αφαιρέστε το σφραγιστικό πλάκας. Αναρροφήστε τα περιεχόμενα όλων των μικροβυθισμάτων σε ένα δοχείο αποβλήτων (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε την πλάκα 5 φορές, χρησιμοποιώντας τουλάχιστον 370 µl διαλύματος πλύσης εργασίας. Μετά από την τελευταία πλύση, αναστρέψτε τη μικροπλάκα και σκουπίστε απαλά με απορροφητικό χαρτί για να αφαιρεθεί το υγρό που απέμεινε. 9. Προσθέστε γρήγορα 200 µl διαλύματος αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου (R8 + R9) σε κάθε μικροβύθισμα, αποφεύγοντας την έκθεση σε δυνατό φως. 10. Αφήστε τη μικροπλάκα να επωαστεί σε σκοτεινό μέρος σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 25 C) για 30 ± 5 λεπτά. Μη χρησιμοποιείτε αυτοκόλλητη μεμβράνη κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης. 11. Προσθέστε 100 µl διαλύματος αναστολής (R10) σε κάθε μικροβύθισμα, χρησιμοποιώντας την ίδια σειρά για την προσθήκη διαλύματος αντίδρασης υποστρώματος-χρωμογόνου. Αναμίξτε καλά. 12. Σκουπίστε καλά το κάτω μέρος κάθε πλάκας. 13. Διαβάστε την ένδειξη οπτικής πυκνότητας κάθε μικροβυθίσματος στα 450 nm (φίλτρο αναφοράς 620/630 nm). Πρέπει να διαβάσετε τις μικροπλάκες πρέπει εντός 30 λεπτών από την προσθήκη του διαλύματος αναστολής. 11 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑΣ) Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας Χρησιμοποιείτε ορούς ελέγχου και σημεία εύρους σε κάθε μικροπλάκα για κάθε εξέταση. Για να διασφαλιστεί η εγκυρότητα της διαδικασίας εξέτασης, θα πρέπει να πληρούνται τα παρακάτω κριτήρια: Τιμή οπτικής πυκνότητας: 0,300 < OD σημείου εύρους 0,5 ng/ml < 1,100 Λόγοι: OD (σημείο εύρους 2,0 ng/ml) / OD (σημείο εύρους 0,5 ng/ml) > 2,1 OD (σημείο εύρους 1,0 ng/ml) / OD (σημείο εύρους 0,5 ng/ml) > 1,25 OD (σημείο εύρους 0,25 ng/ml) / OD (σημείο εύρους 0,5 ng/ml) < 0,85 OD (R3) / OD (σημείο εύρους 0,25 ng/ml) 0,80 Συγκέντρωση μαννάνης: Η συγκέντρωση R5 είναι ίση με τη συγκέντρωση που υποδεικνύεται στο φιαλίδιο ± 20%. Ποιοτικός τρόπος λειτουργίας Υπολογισμός τιμής αναφοράς (CO) Προσθέστε τις τιμές OD που έχετε λάβει για κάθε μικροβύθισμα που περιέχει το σημείο εύρους 0,5 ng/ml και διαιρέστε με το 2. 8

9 Κριτήρια εγκυρότητας 0,300 < CO < 1,100 OD R5 > CO OD R3 < 0,7 CO OD σημείου εύρους 0,25 ng/ml < 0,85 CO 12 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας Καθορισμός της πρότυπης καμπύλης Η πρότυπη καμπύλη σχεδιάζεται με 4 σημεία εύρους, 2,0, 1,0, 0,5 και 0,25 ng/ml, τα οποία προετοιμάζονται από το βαθμονομητή ορού R4. Στην καμπύλη δεν συμπεριλαμβάνονται οι θετικοί (R5) και οι αρνητικοί (R3) οροί ελέγχου. Για μέγιστη ακρίβεια, σχεδιάστε μια σιγμοειδή καμπύλη κατά προσέγγιση σημειώνοντας τη συγκέντρωση μαννάνης σε ng/ml στον άξονα Χ (λογαριθμική κλίμακα) και την οπτική πυκνότητα στον άξονα Υ (γραμμική κλίμακα). Εάν δεν μπορείτε να χρησιμοποιήσετε αυτόν τον τύπο αναπαράστασης στη συσκευή ανάγνωσης πλάκας, σχεδιάστε μια καμπύλη συνδέοντας τα διάφορα σημεία εύρους. Καθορισμός της συγκέντρωσης μαννάνης στους ορούς εξέτασης Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε την καμπύλη βαθμονόμησης για να καθορίσετε τη συγκέντρωση αντιγόνου μαννάνης, σε ng/ml, για κάθε δείγμα εξέτασης. Ερμηνεία αποτελεσμάτων Οι οροί με συγκέντρωση μαννάνης εμφανώς χαμηλότερη από 0,25 ng/ml (C < 0,25) θεωρούνται «αρνητικοί» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης. Οι οροί με συγκέντρωση μαννάνης μεταξύ 0,25 και 0,5 ng/ml (0,25 C < 0,5) θεωρούνται «ενδιάμεσοι» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης. Οι οροί με συγκέντρωση μαννάνης υψηλότερη ή ίση με 0,5 ng/ml (C 0,5) θεωρούνται «θετικοί» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης. Δεν είναι δυνατός ο ακριβής καθορισμός συγκεντρώσεων πάνω από 2,5 ng/ml με τα σημεία εύρους που χρησιμοποιούνται για τη σχεδίαση της καμπύλης βαθμονόμησης. Η εξέταση θα πρέπει να επαναλαμβάνεται μετά την αραίωση του ορού σε αναλογία 1/5 σε αρνητικό ορό (R3), ώστε να επιτυγχάνεται ακριβέστερος καθορισμός της συγκέντρωσης των εμφανώς θετικών ορών. Σημείωση: Η Platelia Candida Ag προορίζεται για χρήση ως βοήθεια στη διάγνωση της διηθητικής μονιλίασης. Τα θετικά αποτελέσματα που λαμβάνονται με την Platelia Candida Ag πρέπει να εξετάζονται σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες, όπως μικροβιολογική καλλιέργεια, ιστολογική εξέταση δειγμάτων βιοψίας και διερεύνηση ακτινογραφικών ενδείξεων. Για την αύξηση της ευαισθησίας και της πρώιμης θετικότητας της εξέτασης, συνιστάται ο τακτικός διαγνωστικός έλεγχος των ασθενών υψηλού κινδύνου. Ποιοτικός τρόπος λειτουργίας Ερμηνεία αποτελεσμάτων OD δείγματος < OD σημείου εύρους 0,25 ng/ml: οι οροί θεωρούνται «αρνητικοί» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης. OD σημείου εύρους 0,25 ng/ml OD δείγματος < CO: οι οροί θεωρούνται «ενδιάμεσοι» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης. OD δείγματος CO: οι οροί θεωρούνται «θετικοί» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης. Σημείωση: η Platelia Candida Ag προορίζεται για χρήση ως βοήθεια στη διάγνωση της διηθητικής μονιλίασης. Τα θετικά αποτελέσματα που λαμβάνονται με την Platelia Candida Ag πρέπει να εξετάζονται σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες, όπως μικροβιολογική καλλιέργεια, ιστολογική εξέταση δειγμάτων βιοψίας και διερεύνηση ακτινογραφικών ενδείξεων. Για την αύξηση της ευαισθησίας και της πρώιμης θετικότητας της εξέτασης, συνιστάται ο τακτικός διαγνωστικός έλεγχος των ασθενών υψηλού κινδύνου. Σημείωση: για τον καθορισμό της έντασης των θετικών αποτελεσμάτων, μπορεί να υπολογιστεί ένας δείκτης (I): 9

10 I= OD θετικού ορού / CO Με το δείκτη αυτό, είναι δυνατή η έκβαση των αποτελεσμάτων σε ημιποσοτικό τρόπο λειτουργίας. 13 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Μια αρνητική εξέταση δεν μπορεί να αποκλείσει τη διάγνωση διηθητικής μονιλίασης, λόγω της ιδιαίτερα χαμηλής συγκέντρωσης και της ταχείας καταστροφής της μαννάνης κατά τη διάρκεια της λοίμωξης. 2. Επίσης, μια αρνητική εξέταση για αντιγόνο μαννάνης θα πρέπει να ερμηνεύεται σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα των εξετάσεων για αντισώματα κατά της μαννάνης: ακόμη και στην περίπτωση της διηθητικής μονιλίασης, είναι πιο δύσκολο να ανιχνευτεί το αντιγόνο σε ασθενείς με θετική διάγνωση για αντισώματα κατά της μαννάνης (ανατρέξτε στο κεφάλαιο 14, Ειδικά χαρακτηριστικά απόδοσης). 3. Η απόδοση της ανίχνευσης του αντιγόνου μαννάνης στον ορό σχετίζεται με τη συχνότητα των εξετάσεων που πραγματοποιούνται στον ασθενή 4. Για την αύξηση της ευαισθησίας και της πρώιμης θετικότητας της εξέτασης, συνιστάται η τακτική παρακολούθηση των ασθενών υψηλού κινδύνου και ο διαγνωστικός έλεγχος για αντισώματα κατά της μαννάνης. 4. Κατά την εξέταση των δειγμάτων για την παρουσία αντιγόνου μαννάνης πρέπει να τηρείται η διαδικασία της ανάλυσης Platelia Candida Ag και η ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Σε κάθε χρήστη αυτού του κιτ συνιστάται η προσεκτική ανάγνωση του ένθετου συσκευασίας πριν από την εκτέλεση της εξέτασης. Συγκεκριμένα, η διαδικασία εξέτασης πρέπει να τηρείται προσεκτικά για τη μεταφορά δειγμάτων και αντιδραστηρίων με πιπέτα, για την πλύση πλάκας και για το χρονισμό των βημάτων επώασης. 5. Η αποτυχία προσθήκης των δειγμάτων ή των αντιδραστηρίων σύμφωνα με τις οδηγίες που περιγράφονται στη διαδικασία ενδέχεται να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Όταν υπάρχει κλινική υποψία διηθητικής μονιλίασης ή σφάλματος διαδικασίας, θα πρέπει να εξετάζεται το ενδεχόμενο επαναληπτικής εξέτασης πρόσθετων δειγμάτων. 6. Η μόλυνση μικροβυθισμάτων αρνητικού δείγματος ασθενή με θετικό ορό ελέγχου/μικροβυθίσματα δείγματος ασθενή είναι πιθανή, αν τα περιεχόμενα ενός μικροβυθίσματος διαρρεύσουν σε άλλο μικροβύθισμα λόγω αμελούς χειρισμού της μικροπλάκας ή κακής τεχνικής μεταφοράς με πιπέτα κατά την προσθήκη αντιδραστηρίων. 7. Έχουν αναφερθεί περιπτώσεις διασταυρούμενης αντίδρασης σε ασθενείς που έλαβαν έγχυμα με ορισμένες παρτίδες διαστολέων πλάσματος με υδροξυαιθυλάμυλο (όπως Hesteril 6%), οι οποίες χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση της κυκλοφορικής ανεπάρκειας: υπογκαιμία, αιμορραγικό σοκ, σηπτικό σοκ. 14 ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 14.1 Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας A Μελέτες Αναπαραγωγιμότητας Διαφοροποίηση εντός της ανάλυσης: Εξετάστηκαν τέσσερις οροί (ένας αρνητικός, ένας ενδιάμεσος στα 0,48 ng/ml και δύο θετικοί οροί με συγκεντρώσεις 0,69 ng/ml και 1,39 ng/ml) σε τριάντα αντίγραφα. Οι συντελεστές μεταβλητότητας ήταν 3,1%, 6,9%, 9,1% και 7,0%, αντίστοιχα. Διαφοροποίηση μεταξύ των αναλύσεων: Εξετάστηκαν οκτώ αρνητικοί και τέσσερις θετικοί οροί σε πέντε σειρές, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν σε διάστημα πέντε εβδομάδων. Οι συντελεστές μεταβλητότητας ήταν < 20% για τις συγκεντρώσεις των θετικών ορών και < 13% για την τιμή OD των αρνητικών ορών. B Κλινική Εξέταση ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Τα αποτελέσματα ειδικότητας συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα: Κατηγορία ασθενών Χωρίς νοσοκομειακή περίθαλψη Υπό νοσοκομειακή περίθαλψη, μη αποικισμένοι, Αριθμός ασθενών (αρ. ορών) Συγκέντρωση (ng/ml) C < 0,25 0,25 C < 0,5 C 0,5 184 (184) 183 (99,5%) 1 (0,5%) 151 (200) 140 (92,8%) 7 (4,6%) 4 (2,6%) 10

11 με : - Νόσος του Crohn 52 (52) 49 (98,1%) 3 (1,9%) - Ελκώδης κολίτιδα 43 (43) 41 (95,4%) 1 (2,3%) 1 (2,3%) - Ασπεργίλλωση 26 (35) 23 (88,5%) 1 (3,8%) 2 (7,7%) - Πνευμονοκύστωση 4 (4) 4 (100%) - Κρυπτοκοκκίαση 13 (13) 12 (92,3%) 1 (7,7%) Υπό νοσοκομειακή περίθαλψη, αποικισμένοι με Candida: 41 (160) 35 (85,3%) 4 (9,8%) 2 (4,9%) ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Πραγματοποιήθηκε κλινική εξέταση για την αξιολόγηση της ευαισθησίας της ανάλυσης Platelia Candida Ag σε τρία πανεπιστημιακά νοσοκομεία στη Γαλλία. Η μελέτη διεξήχθη αναδρομικά χρησιμοποιώντας συνολικά 366 δείγματα ορού που συλλέχθηκαν από 106 ασθενείς από διαφορετικά τμήματα νοσοκομείων: χειρουργικό, αιματολογικό, μονάδα εντατικής θεραπείας, μονάδα εγκαυμάτων... Οι ζυμομύκητες Candida απομονώθηκαν από καλλιέργειες αίματος ή δείγματα μεγάλου βάθους των ασθενών αυτών 8, 9. Στο συγκεκριμένο πληθυσμό ασθενών, η γενική ευαισθησία της ανάλυσης Platelia Candida Ag ήταν 51,5% (εκτός των ορών με συγκέντρωση αντιγόνου μαννάνης μεταξύ 0,25 και 0,50 ng/ml, οι οποίοι θεωρούνται «ενδιάμεσοι» στην παρουσία αντιγόνου μαννάνης: 6,6% των ασθενών). Η ευαισθησία ποικίλλει, ανάλογα με το είδος Candida που έχει απομονωθεί, όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα: Είδος Candida Αριθμός Ευαισθησία που έχει ασθενών απομονωθεί (αρ. ορών) C 0,5 C 0,5 και 0,25 C < 0.5 C. tropicalis 10 (72) 70,0 % 70,0 % C. glabrata 12 (31) 58,3 % 58,3 % C. albicans 64 (208) 52,5 % 60,3 % C. kefyr 2 (5) 50,0 % 50,0 % C. parapsilosis 10 (29) 37,5 % 57,5 % C. krusei 8 (21) 20,0 % 20,0 % Η ευαισθησία εξαρτάται από τον αριθμό και τη συχνότητα των δειγμάτων 13. Οι κλινικές αυτές μελέτες καταδεικνύουν, επίσης, την αξία του συνδυασμού της ανίχνευσης αντιγόνου μαννάνης με Platelia Candida Ag και αντισωμάτων κατά της μαννάνης με Platelia Candida Ab/Ac/Ak. Οι ασθενείς μπορούν να ταξινομηθούν σε 2 σημαντικά διαφορετικούς πληθυσμούς (έλεγχος του x 2, p < 0,0005), όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα που παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα: Ασθενείς με αρνητική διάγνωση σε αντισώματα κατά της μαννάνης: η ευαισθησία της ανάλυσης Platelia Candida Ag είναι 78,8% παρουσία λοιμώξεων C. albicans και 66,6% για συνδυασμένα είδη Candida. Ασθενείς με θετική διάγνωση σε αντισώματα κατά της μαννάνης: είναι πιο δύσκολο να ανιχνευτεί το αντιγόνο μαννάνης. Είδος που προκάλεσε τη λοίμωξη (+αρ. ασθενών) Συνδυασμένα είδη Candida (106) C. albicans (64) Ευαισθησία Platelia Candida Ag Ασθενείς με αρνητική διάγνωση σε αντισώματα κατά της μαννάνης Ασθενείς με θετική διάγνωση σε αντισώματα κατά της μαννάνης Όλοι οι ασθενείς 66,6 % 17,5 % 51,5 % 78,8 % 16,1 % 52,5 % Για το λόγο αυτό, η ερμηνεία της εξέτασης Platelia Candida Ag θα πρέπει να περιλαμβάνει πληροφορίες σχετικά με την ανοσολογική κατάσταση του ασθενή στη μαννάνη Candida. 11

12 Με τη συνδυασμένη ορολογική ανίχνευση του αντιγόνου μαννάνης και των αντισωμάτων κατά της μαννάνης καταδεικνύεται ευαισθησία 84,8% (εκτός από το 6,6% των ασθενών με ενδιάμεση συγκέντρωση αντιγόνου μαννάνης). Ωστόσο, σε ορισμένους ασθενείς εμφανίζεται θετική απόκριση προς τους δύο δείκτες σε διάφορα χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια του ίδιου επεισοδίου λοίμωξης. Η πρόγνωση της λοίμωξης ενδέχεται να συνδέεται με την ισορροπία μεταξύ της αντιγοναιμίας μαννάνης και της απόκρισης των αντισωμάτων μαννάνης Ποιοτικός τρόπος λειτουργίας A Μελέτες Αναπαραγωγιμότητας Διαφοροποίηση εντός της ανάλυσης: Εξετάστηκαν τέσσερις οροί (ένας αρνητικός, ένας ενδιάμεσος στα I = 0.95 και δύο θετικοί οροί με I = 1.24 και 2.00) σε τριάντα αντίγραφα. Οι ποσοστιαίοι συντελεστές μεταβλητότητας (%CV) ήταν 3,1%, 7,2%, 5,9% και 5,9%. Διαφοροποίηση μεταξύ των αναλύσεων: Εξετάστηκαν δέκα θετικοί και τέσσερις ενδιάμεσοι οροί σε έξι σειρές. Οι ποσοστιαίοι συντελεστές μεταβλητότητας (%CV) ήταν < 15% για τις συγκεντρώσεις θετικών και ενδιάμεσων ορών. B Κλινική Εξέταση ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ - ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Εάν ληφθεί υπόψη ότι οι συγκεντρώσεις 0.5ng/mL ή < 0.25 ng/ml που λήφθηκαν σε ορούς σε ποσοτικό τρόπο λειτουργίας, αντιστοιχούν στους θετικούς και αρνητικούς, αντίστοιχα, ορούς σε ποιοτικό τρόπο λειτουργίας, τα χαρακτηριστικά απόδοσης της εξέτασης σε ποιοτικό τρόπο λειτουργίας είναι ισοδύναμα με τα χαρακτηριστικά που περιγράφονται στο κεφάλαιο «Ποσοτικός τρόπος λειτουργίας». 15 ποιοτικος ελεγχοσ του ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα παρασκευασμένα αντιδραστήρια προετοιμάζονται σύμφωνα με το Σύστημα Ποιότητας που διαθέτουμε, ξεκινώντας από την παραλαβή των πρώτων υλών μέχρι την τελική εμπορευματοποίηση του προϊόντος. Κάθε παρτίδα υποβάλλεται σε αξιολόγηση ποιοτικού ελέγχου και διατίθεται στην αγορά μόνο αφού διασφαλιστεί ότι συμμορφώνεται με προκαθορισμένα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία που σχετίζονται με την παραγωγή και τον έλεγχο κάθε μεμονωμένης παρτίδας φυλάσσονται εντός των εγκαταστάσεων της Bio-Rad. 16 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI, and D. POULAIN Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: p FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p FUKAZAWA, Y Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER, and D. POULAIN Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: p PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS Non-Culture-Based Diagnostics, p In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 12

13 7. RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI Deep Candida infections in the neutropenic and nonneutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ, and D. POULAIN Mapping of Candida albicans oligomannosidic epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: p VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: p YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p

14

15

16 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette Frankrike Tlf.: +33 (0) /2008 Faks: +33 (0)