Πανεπιστήμιο Πατρών. Τμήμα Φαρμακευτικής. Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης. Τίτλος Διατριβής: Ανδρέας Κρητικός

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Τμήμα Φαρμακευτικής Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης Στην κατεύθυνση: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Ουσιών με Φαρμακευτικό Ενδιαφέρον (ΦΜ-Α) Τίτλος Διατριβής: «Αξιολόγηση της χρήσης των βλαστικών κυττάρων της γέλης του Wharton για δοκιμές τοξικότητας» Ανδρέας Κρητικός Βιολόγος ΕΘΝΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΕΡΕΥΝΩΝ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΜΟΝΑΔΑ ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ Αθήνα 2014

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Σωτηροπούλου Γεωργία, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Επιβλέπουσα Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστημίου Πατρών Ζουμπουρλής Βασίλειος, Ερευνητής Α, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Αθήνα Αντιμησιάρη Σοφία, Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστημίου Πατρών [2]

3 Ευχαριστίες Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον Καθηγητή Έρευνας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών, κύριο Βασίλειο Ζουμπουρλή, επιβλέποντα της διπλωματικής εργασίας του μεταπτυχιακού μου, για την καθοδήγηση και τις πλούσιες γνώσεις που μου παρείχε σε όλη τη διάρκεια της διεξαγωγής της στο εργαστήριό που είναι επικεφαλής. Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην υπεύθυνη καθηγήτρια του τμήματος Φαρμακευτικής, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κυρία Γεωργία Σωτηροπούλου για την επίβλεψη, την στήριξη και την βοήθεια που μου προσέφερε κατά την εξέλιξη της μελέτης αυτής. Παράλληλα θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην Καθηγήτρια του τμήματος Φαρμακευτικής, την κυρία Αντιμησιάρη Σοφία, για τις παρατηρήσεις και τις διορθώσεις της, κατά την συγγραφή της παρούσας εργασίας. Επιπρόσθετα, επιθυμώ να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον μεταδιδακτορικό ερευνητή του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών κύριο Ιωάννη Χριστοδούλου για την ερευνητική και τεχνική καθοδήγηση του, την αμέριστη συμπαράσταση και την άψογη συνεργασία. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την εταιρία ΤΑΚ-ΕΙΕ και τον Καθηγητή κύριο Γεώργιο Κολλιάκο για την άριστη συνεργασία στα πλαίσια της μελέτης αυτής. Επιπρόσθετα θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιστημονική συνεργάτιδα του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών κυρία Ευαγγελία Χρυσίνα για την ηθική και ψυχολογική συμπαράσταση που μου προσέφερε, την επιστημονική συνεργάτιδα, κυρία Στυλιανή Λογοθέτη, τον υποψήφιο διδάκτορα κύριο Σωτήριο Γαλτσίδη, και τους μεταπτυχιακούς φοιτητές/τριες Ελένη Σκούρτη, Μαριλένα Ξυπολιτά και Νικόλαο Χούρι για τη βοήθεια και τη συμπαράστασή τους. Τέλος θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην οικογένειά μου, Δημήτριο Κρητικό, Ευαγγελία Παπαϊωάννου και Χριστίνα Κρητικού, που μου συμπαραστέκεται τόσο ηθικά, όσο και οικονομικά και με υποστηρίζει σε κάθε βήμα μου. Αθήνα, 1 Απριλίου 2014 [3]

4 Περίληψη Η σύγχρονη παραγωγή φαρμακευτικών και άλλων χημικών ουσιών και ο αναγκαίος τοξικολογικός τους έλεγχος επιφέρει την χρήση ενός μεγάλου αριθμού πειραματοζώων με αποτέλεσμα την αύξηση του κόστους αλλά και την έγερση ζητημάτων που σχετίζονται με την ασφάλεια και την βιοηθική. Στην βάση αυτού του προβληματισμού η ανάπτυξη νέων in vitro δοκιμασιών κυτταρο-τοξικότητας με δυνατότητα ακριβέστερης πρόβλεψης των αρχικών δόσεων οξείας από του στόματος τοξικότητας, προβάλλει ως αναγκαιότητα στις μέρες. Μέχρι τώρα έχουν χρησιμοποιηθεί σε in vitro δοκιμασίες μετασχηματισμένα, αθανατοποιημένα ή πρωτογενή κύτταρα καθώς και εμβρυικά βλαστικά κύτταρα (hescs). Επίσης πρόσφατα χρησιμοποιήθηκαν μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον μυελό των οστών (BM-hMSCs). Τα κύτταρα αυτά ωστόσο παρουσιάζουν μειονεκτήματα που σχετίζονται με την δυσκολία απομόνωσης τους, την ετερογένεια τους, αλλά και τον πρόωρο φαινότυπο γήρανσης κατά την καλλιέργεια τους. Σε αυτή την μελέτη διερευνάται για πρώτη φορά η χρήση των βλαστικών κυττάρων της γέλης του Wharton (WJSCs) του ομφαλίου λώρου σε in vitro δοκιμασία κυτταροτοξικότητας. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλα μεσενχυματικά κύτταρα καθώς: απομονώνονται εύκολα, καλλιεργούνται εκτεταμένα με διατήρηση των βλαστικών τους ιδιοτήτων, δεν εγείρουν ηθικά ζητήματα για τη χρήσή τους, παρουσιάζουν γενετική και φαινοτυπική σταθερότητα και ήπιο ανοσολογικό προφίλ. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν παράλληλα και συγκριτικά με τα κύτταρα της γέλης του Wharton, οι κυτταρικές σειρές HepG2 (ηπατικού καρκινώματος) και NIH 3T3 (ινοβλάστες ποντικού) αλλά και τα μεσεγχυματικά κύτταρα λίπους AD-hSCs. Όπως προτείνεται από το πρωτόκολλο της ICCVAM δοκιμάστηκαν 12 ουσίες αναφοράς ενώ η μέτρηση της επιβίωσης των κυττάρων έγινε με την δοκιμασία MTS και NRU. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι τα κύτταρα της γέλης του Wharton μπορούν να αποτελέσουν αξιόπιστο και ελπιδοφόρο μοντέλο για δοκιμασίες in vitro τοξικότητας. Το μοντέλο αυτό μπορεί να λειτουργήσει συμπληρωματικά, ή ακόμα και να ξεπεράσει, ήδη επικυρωμένα μοντέλα κυτταροτοξικότητας. [4]

5 Summary The modern production of pharmaceuticals, other chemicals and their required toxicological controls results in the use of a large number of laboratory animals leading in increased costs as well as raising questions considering safety and bioethics. Alternatively, in vitro cytotoxicity assays are highlighted with the ability of a more accurate prediction of the starting dose of oral acute toxicity. Occasionally several cell lines have been used including transformed and immortalized cells or primary cells and embryonic stem cells (hescs). For the same purpose adult mesenchymal stem cells derived from the bone marrow (BM-hMSCs) have been recently used but they exhibit difficulties in their isolation, heterogeneity, and premature senescence phenotype during their sub-cultivation. In this study for the first time we investigated the use of mesenchymal stem cells (WJSCs) isolated from fetal umbilical cord, in particular from the Wharton s Jelly. These cells exhibit the advantage of easily being isolated and cultured in large quantities without ethical issues, genetic and phenotypic stability and subimmunological profile. Two different cell lines HepG2 (liver carcinoma) and NIH 3T3 (mouse fibroblasts) and mesenchymal adipose-derived stem cells AD-hSCs have been used and compared with the WJSCs in parallel. 12 substances have been tested for their cytotoxicity effect on cell survival using the MTS assay as suggested by ICCVAM. Our results indicate that this model is a reliable and promising approach for in vitro cytotoxicity tests on human cells and it can complement or even overpass validated cytotoxicity models. [5]

6 Περιεχόμενα Σελίδα Συντμήσεις 9 Α. Εισαγωγή 11 1.Βλαστικά Κύτταρα Ιστορική αναδρομή Ορισμός Γενικά χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων Ταξινόμηση των βλαστικών κυττάρων με βάση την δυναμική διαφοροποίησης τους Ολοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Totipotent/omnipotent Stem Cells) Πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Pluripotent Stem Cells) Πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (Multipotent stem cells) Ολιγοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Oligopotent stem cells) Μονοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Unipotent stem cells) Εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ESCs) Βλαστικά κύτταρα των ενηλίκων (Adult Stem Cells) Βλαστικά κύτταρα ιστών Επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ipscs) Ηθικά, κοινωνικά και πολιτικά ζητήματα στην χρήση των βλαστικών κυττάρων Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα του ομφαλίου λώρου από την γέλη του Wharton Η ανατομική σχέση των διαφόρων δομών του ομφαλίου λώρου και η γέλη του Wharton (WJ) ως πηγή μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κυττάρων τις γέλης του Wharton Σύγκριση των WJ-MSCs με άλλους τύπους MSCs των Ενηλίκων Σύγκριση των WJ-MSCs με άλλα εμβρυϊκής προέλευσης MSCs Ανοσο-ρυθμιστική ικανότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος Εντοπισμός και κυκλοφορία των MSCs 35 [6]

7 1.7 Κλινικές εφαρμογές των βλαστικών κυττάρων WJ-MSCs Θεραπεία του καρκίνου Θεραπεία ηπατικών ασθενειών Θεραπεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων Διαφοροποίηση των WJ-MSCs προς καρδιακό ιστό Αναγέννηση χόνδρου Αναγέννηση περιφερικών νευρώνων 45 2.Τοξικολογία Αξιολόγηση τοξικολογικού κινδύνου Μέθοδοι για τις δοκιμασίες τοξικότητας Μέθοδοι δοκιμών σε ζώα Κριτική για τη χρήση των μεθόδων που χρησιμοποιούν ζώα Μέθοδοι δοκιμασιών τοξικότητας χωρίς τη χρήση ζώων Το εναλλακτικό κίνημα των 3Rs In vitro τοξικότητα Τελικά σημεία της in vitro τοξικότητας (endpoints) Μηχανισμοί κυτταρικής τοξικότητας Επικύρωση των in vitro δοκιμασιών και κανονιστικές ρυθμίσεις Η μελέτες του ICCVAM Μητρώο κυτταροτοξικότητας (Registry of Cytotoxicity-RC) To ευρωπαϊκό πρόγραμμα REACH Το σύστημα οικουμενικής εναρμόνισης (GHS) Κριτήρια ταξινόμησης Μέθοδοι για δοκιμασίες in vitro κυτταροτοξικότητας Η δοκιμασία MTS Η δοκιμασία NRU 64 [7]

8 2.8 Κυτταρικές καλλιέργειες δύο (2D) και τριών διαστάσεων (3D) στην τοξικολογία Εφαρμογές των βλαστικών κυττάρων στην in vitro τοξικότητα Δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας με χρήση βλαστικών κυττάρων Δοκιμασίες αναπτυξιακής τοξικότητας με χρήση βλαστικών κυττάρων Εφαρμογές των βλαστικών κυττάρων σε λειτουργικές δοκιμασίες τοξικότητας 72 Σκοπός της μελέτης 74 Β. Υλικά και Μέθοδοι Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν Απομόνωση και χαρακτηρισμός των βλαστικών κυττάρων WJ-MSCs και AD-MSCs Καλλιέργειες κυτταρικών σειρών Καλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων Καλλιέργεια κυττάρων σε φλάσκα (ή τρυβλίο Petri) Αλλαγή θρεπτικού υλικού Θρυψινοποίηση κυττάρων Πάγωμα των κυττάρων Ex vivo καλλιέργεια των κυττάρων (3D)- Scaffolds (ικριωμάτων) Προετοιμασία υλικών καλλιέργειας Χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη Δοκιμασία MTS Δοκιμασία NRU Χρώση διπλού φθορισμού με φαλλοϊδίνη (Phalloidin) και DAPI Στατιστική ανάλυση 87 Γ. Αποτελέσματα 89 Δ. Συζήτηση 106 Ε. Μελλοντικές Έρευνες 118 ΣΤ. Βιβλιογραφία 119 [8]

9 Λίστα συντμήσεων ESCs ICM ipscs MSCs MEFCs LIF Εμβρυικά βλαστικά κύτταρα Εσωτερική κυτταρική μάζα βλαστοκύστης Επαγόμενα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα Τροφοδοτικό στρώμα εμβρυϊκών ινοβλαστών Ανασταλτικός παράγοντα της λευχαιμίας Oct 3/4 Μεταγραφικός παράγοντας δεσμευμένος στα οκταμερή 3 και 4 SOX2 Πρωτεΐνη πλαισίου που σχετίζονται με τον SRY -2 KLF4 Ομοιάζον με τον παράγοντα 4 UC UC-MSCs huvecs UCB-MSCs WJ hmscs hucpvcs BM-MSCs AD-SCs IFN-γ VCAM ICAM-1 ALCAM LFA3 IDO DC ΝΚ TGF-β PGE2 PD-1 Homing Ομφάλιος λώρος στον άνθρωπο Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα ομφαλίου λώρου Ενδοθηλιακά κύτταρα από την ομφάλια φλέβα Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από το ομφάλιο αίμα Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα της γέλης του Wharton Περιαγγειακά κύτταρα ομφάλιου λώρου Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα λιπώδους ιστού Ιντερφερόνη-γ Μόριο κυτταρικής προσκόλλησης Ενδοκυτταρικό μόριο προσκόλλησης-1 Ενεργοποιημένο μόριο προσκόλλησης λευκοκυττάρων Λειτουργικό αντιγόνο-3 των λεμφοκυττάρων Ινδολαμίνη 2,3-διοξυγενάση Δενδριτικά κύτταρα Κύτταρα φυσικοί φονείς Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β Προσταγλανδίνη Ε2 Ανασταλτικό μόριο προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου Αυτοκατευθυνόμενη παλιννόστηση [9]

10 ΤΟΡ-β1 Αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β1 bfgf Βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών () PGA PNS QSAR PBTK OECD LD 50 IC 50 ICCVAM GHS RC NRU REACH SDS MTS EST EBs CFU-F FBS NEAA PBS Pen-Str DAPI PFA OD Πολυ-γλυκολικό οξύ Περιφερικό νευρικό σύστημα Μελέτες ποσοτικών σχέσεων δομής-δραστικότητας Μελέτες τοξικο-κινητικής με βάση την φυσιολογία Οργανισμός για την οικονομική συνεργασία και την ανάπτυξη Δόση χημικής ουσίας για θάνατο του 50% των ζώων Δόση χημικής ουσίας για θάνατο του 50% των κυττάρων Διυπηρεσιακή Συντονιστική Επιτροπή για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων Εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης Μητρώο Κυτταροτοξικότητας Δοκιμασία ουδέτερου ερυθρού Καταχώριση, αξιολόγηση, άδεια και περιορισμοί των χημικών Δελτία δεδομένων ασφαλείας Δοκιμασία αλάτων τετραζολίου Δοκιμασία των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων Εμβρυοειδή σωμάτια Δοκιμασία σχηματισμού αποικιών Βόειος εμβρυικός ορός Μη απαραίτητα αμινοξέα Ορός ρυθμισμένος με φωσφορικά Πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη 4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη Παραφορμαλδεΰδη Οπτική πυκνότητα [10]

11 Βλαστικά κύτταρα 1.1 Ιστορική αναδρομή Τα βλαστικά κύτταρα παρουσιάζουν τεράστιο επιστημονικό ενδιαφέρον καθώς θεωρείται πως οι ιδιότητες που διαθέτουν ίσως οδηγήσουν σε πολλές λύσεις και εφαρμογές στο μέλλον, σε ότι αφορά κυρίως ανίατες και γενετικές ασθένειες. Ουσιαστικά, τα βλαστικά κύτταρα μελετώνται συστηματικά τα τελευταία 40 χρόνια. Πρόκειται λοιπόν για μια καινούργια θεραπευτική προσέγγιση, για ένα «νέο» εργαλείο στη διάθεση των επιστημόνων. Οι McCulloch και οι συνεργάτες του, το 1963, ανίχνευσαν την παρουσία κυττάρων που έφεραν ικανότητα αυτoανανέωσης, στον μυελό των οστών των ποντικών. Πέντε χρόνια αργότερα, πραγματοποιήθηκε η πρώτη μεταμόσχευση μυελού των οστών η οποία συνέβαλε στην θεραπεία του συνδρόμου ανοσοανεπάρκειας, ανάμεσα σε δύο αδέρφια. Αρκετά χρόνια αργότερα, το 1992, καλλιεργήθηκαν για πρώτη φορά εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα στο εργαστήριο, με τη μορφή νευρο-σφαιριδίων. Το 1998 οι James Thompson και οι συνεργάτες του δημιούργησαν την πρώτη κυτταρική σειρά βλαστικών κυττάρων του ανθρώπου στο Πανεπιστήμιο του Γουϊσκόνσιν. Μέχρι το 2006, είχε αποδειχθεί πλέον, ότι είναι δυνατόν με τη βοήθεια των βλαστικών κυττάρων να παραχθούν, σε εργαστηριακές συνθήκες, πολλοί διαφορετικοί κυτταρικοί τύποι, ιστοί, ακόμα και ολόκληρα όργανα ή ολόκληροι οργανισμοί (όπως για παράδειγμα ποντίκια). Για το λόγο αυτό πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο σήμερα έχουν στρέψει το ενδιαφέρον τους στη μελέτη και την ανεύρεση εφαρμογών που αφορούν στα βλαστικά κύτταρα. 1.2 Ορισμός Ως «βλαστικό κύτταρο» χαρακτηρίζεται ένα κύτταρο που φέρει ορισμένα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Πρώτον, θα πρέπει να έχει ικανότητα αυτόανανέωσης (self-renewal capacity). Έτσι όταν ένα κύτταρο λαμβάνει σήμα για να διαιρεθεί τότε είτε θα δημιουργήσει δύο ίδια βλαστικά κύτταρα (συμμετρική διαίρεση) είτε θα δημιουργήσει ένα κύτταρο πανομοιότυπο με τον εαυτό του και ένα διαφοροποιημένο (ασύμμετρη διαίρεση), το οποίο θα μεταφερθεί στον ιστό ή στο όργανο που το χρειάζεται [1]. Δεύτερον το κύτταρο θα πρέπει να έχει την ικανότητα [11]

12 να διαφοροποιείται προς διάφορους κυτταρικούς τύπους και να έχει τη δυνατότητα της in vivo ανασύστασης λειτουργικών ιστών. Η δημόσια συζήτηση γύρω από τα βλαστικά κύτταρα έχει λάβει μεγάλες διαστάσεις τόσο για τις εφαρμογές τους στην αναγεννητική ιατρική (regenerative medicine) όσο και τις δυνατότητες που ανοίγει με την χρήση τους στους τομείς της γονιδιακής και κυτταρικής θεραπείας. 1.3 Γενικά Χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων Τα βλαστικά κύτταρα είναι ένας πληθυσμός μη διαφοροποιημένων κυττάρων που χαρακτηρίζονται: α) από την ικανότητα τους να πολλαπλασιάζονται εκτενώς (ικανότητα αυτο-ανανέωσης), β) το γεγονός ότι συνήθως προκύπτουν από ένα μόνο κύτταρο (κλωνική ιδιότητα), και γ) από την ικανότητα τους να διαφοροποιούνται προς διαφορετικούς τύπους κυττάρων και ιστών (δυναμικό διαφοροποίησης). Υπάρχουν αρκετές πηγές βλαστικών κυττάρων με διαφορετικό δυναμικό διαφοροποίησης. Στα πλειοδύναμα κύτταρα ανήκουν τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (embryonic stem cells) που προέρχονται από την εσωτερική κυτταρική μάζα της βλαστοκύστης αλλά και τα επαγόμενα πλειοδύναμα κύτταρα (induced pluripotent stem cells, ips) που σχηματίζονται με χρήση μεθόδων επανα-προγραμματισμού των σωματικών κυττάρων. Τα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε ιστούς και από τις τρείς βλαστικές στιβάδες (του ενδοδέρματος, του μεσοδέρματος και του εξωδέρματος). Αντίθετα τα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, όπως είναι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, μπορούν να διαφοροποιηθούν σε ιστούς που προέρχονται από μία μόνο βλαστική στοιβάδα (διαφοροποίηση προς κύτταρα λιπώδους ιστού, οστού και χόνδρου). Τα βλαστικά κύτταρα των ιστών χαρακτηρίζονται ως ολιγοδύναμα (oligopotent) ή μονοδύναμα (unipotent) δεδομένου ότι μπορούν να σχηματίσουν τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα ενός μόνο ειδικού ιστού. Τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην κυτταρική θεραπεία για την αντικατάσταση κατεστραμμένων κυττάρων ή την αναγέννηση οργάνων (Αναγεννητική Ιατρική Regenerative medicine). Επιπλέον, τα βλαστικά κύτταρα έχουν επεκτείνει την γνώση μας που σχετίζεται με την ανάπτυξη καθώς και την εξέλιξη ορισμένων νόσων [2]. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί ειδικές κυτταρικές σειρές (βλαστοκυττάρων) για συγκεκριμένες ασθένειες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανάπτυξη νέων [12]

13 φαρμάκων. Παρά τις σημαντικές προόδους στην κατανόηση της βιολογίας των βλαστικών κυττάρων, υπάρχουν αρκετά προβλήματα που περιορίζουν την χρήση τους. Τα προβλήματα αυτά σχετίζονται: α) θέματα ηθικής στην χρήση των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων, β) με την ανάπτυξη όγκων σε ποντίκια και γ) με την απόρριψη τους σε περιπτώσεις μεταμοσχεύσεων. 1.4 Ταξινόμηση των Βλαστικών Κυττάρων με βάση την δυναμική διαφοροποίησης τους Ολοδυναμία Πλειοδυναμία Πολυδυναμία Μονοδυναμία Εικόνα 1. Δυναμικό διαφοροποίησης βλαστικών κυττάρων [2]. Όλα τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να κατηγοριοποιηθούν ανάλογα με την δυναμική διαφοροποίησής τους σε 5 ομάδες: τα ολοδύναμα, τα πλειοδύναμα, τα πολυδύναμα, τα ολιγοδύναμα και τα μονοδύναμα βλαστικά κύτταρα Ολοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Totipotent/omnipotent Stem Cells) Τα ολοδύναμα βλαστικά κύτταρα είναι η πλέον αδιαφοροποίητη μορφή κυττάρων που συναντώνται κατά την πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη. Ως ολοδύναμο κύτταρο μπορεί να χαρακτηριστεί ένα γονιμοποιημένο ωοκύτταρο (ζυγωτό) μέχρι το στάδιο των πρώιμων βλαστομεριδίων, έως την δεύτερη κυτταρική διαίρεση, δηλαδή τρεις με τέσσερις (3-4) ημέρες μετά τη γονιμοποίηση. Τα ολοδύναμα κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν τόσο σε εμβρυϊκούς, όσο και σε εξω-εμβρυϊκούς [13]

14 ιστούς, σχηματίζοντας έτσι το έμβρυο και τον πλακούντα. Μπορούν να διαφοροποιηθούν σε περισσότερους από 250 διαφορετικούς τύπους κυττάρων όπως νευρικά κύτταρα (νευρώνες), μυϊκά κύτταρα (μυοκύτταρα), κύτταρα του δέρματος (επιθηλιακά), κύτταρα του αίματος (ερυθροκύτταρα, μονοκύτταρα, λεμφοκύτταρα κτλ), οστίτη ιστό (οστεοκύτταρα) και χόνδρο (χονδροκύτταρα) [3]. Εικόνα 2. Σχέδιο που εμφανίζεται μια σχηματική αναπαράσταση του εμβρύου των θηλαστικών κατά το στάδιο της βλαστοκύστης. ICM: εσωτερική κυτταρική μάζα [3] Πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Pluripotent Stem Cells) Τα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε κυτταρικούς τύπους και από τις τρείς βλαστικές στιβάδες δηλαδή το εξώδερμα, το ενδόδερμα, και το μεσόδερμα. Από τις τρείς βλαστικές στιβάδες προκύπτουν στην συνέχεια όλοι οι τύποι κυττάρων για όλους τους ιστούς και τα όργανα [4]. Το γεγονός αυτό σημαίνει ότι, τα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα εξω-εμβρυϊκών ιστών, όπως ο πλακούντας, με αποτέλεσμα να μην μπορούν από μόνα τους να αναπτύξουν ένα πλήρη οργανισμό, σε αντίθεση με τα ολοδύναμα κύτταρα. Τα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα είναι τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα (Embryonic stem cells, ESCs) που απομονώνονται από την εσωτερική κυτταρική μάζα (ICM) της βλαστοκύστης [5]. Πρόσφατα, οι Takahashi και Yamanaka μαζί με τους συνεργάτες τους [6] δημιούργησαν πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα μέσω επανα-προγραμματισμού των σωματικών κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά που ονομάζονται επαγόμενα πλειοδύναμα βλαστικά [14]

15 κύτταρα (induced pluripotent stem cells, ipscs) έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά και ιδιότητες με τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα (ESCs). Εικόνα 3. Διαφοροποίηση των WJ-MSCs σε νευρώνες [5] Πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (Multipotent stem cells) Τα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα βρίσκονται στους περισσότερους ιστούς του ανθρώπινου σώματος αλλά μπορούν να διαφοροποιηθούν μόνο σε κύτταρα μίας βλαστικής στοιβάδας [7]. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) είναι τα πιο γνωστά πολυδύναμα κύτταρα. Μπορούν να προέλθουν από ένα μεγάλο αριθμό ιστών συμπεριλαμβανομένων του μυελού των οστών, του λιπώδους ιστού, των οστών, της γέλης του Wharton, το αίμα του ομφαλίου λώρου και το περιφερικό αίμα [8]. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) έχουν ικανότητα προσκόλλησης στα τρυβλία και χαρακτηρίζονται από ειδικούς δείκτες στην κυτταρικής τους επιφάνεια. Τα MSC κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν σε ιστούς μεσοδέρματος όπως λιπώδη ιστό, οστά, χόνδρους και μυϊκό ιστό. Πρόσφατα, επιτεύχθηκε η διαφοροποίηση των MSCs σε κύτταρα του νευρικού ιστού που προέρχεται από το εξώδερμα. Το γεγονός αυτό αποτελεί παράδειγμα διαδιαφοροποίησης, δηλαδή της διαδικασίας κατά την οποία ένα κύτταρο μίας συγκεκριμένης βλαστικής στοιβάδας (για παράδειγμα μεσοδέρματος) διαφοροποιείται σε κύτταρο μίας άλλης βλαστικής στοιβάδας, όπως του νευρικού ιστού (εξώδερμα) [9]. [15]

16 1.4.4 Ολιγοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Oligopotent stem cells) Τα ολιγοδύναμα βλαστικά κύτταρα είναι σε θέση να αυτοανανεώνονται και να διαφοροποιούνται σε δύο (2) ή περισσότερες κυτταρικές σειρές που ανήκουν όμως σε ένα συγκεκριμένο είδους ιστού. Έχει αναφερθεί, ότι υπάρχουν ολιγοδύναμα βλαστικά κύτταρα στην επιφάνεια του οφθαλμού του χοίρου (συμπεριλαμβανομένου και του κερατοειδούς χιτώνα) όπου παράγουν μεμονωμένες αποικίες κυττάρων του κερατοειδούς και του επιπεφυκότα [10]. Τα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα αποτελούν ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα ολιγοδύναμων βλαστικών κυττάρων, καθώς μπορούν να διαφοροποιηθούν τόσο σε μυελοειδή, όσο και σε λεμφοειδή κύτταρα. Άλλες μελέτες προτείνουν ότι στον πνεύμονα, τα κύτταρα των διακλαδώσεων του βρογχοκυψελιδικού αγωγού μπορούν να διαφοροποιηθούν και σε βρογχικό επιθήλιο και σε κυψελιδικό επιθήλιο Μονοδύναμα βλαστικά κύτταρα (Unipotent stem cells) Τα μονοδύναμα βλαστικά κύτταρα μπορούν να αυτο-ανανεώνονται και να διαφοροποιούνται σε έναν μόνο συγκεκριμένο τύπο κυττάρων σχηματίζοντας μία μόνο κυτταρική σειρά. Χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι τα βλαστικά κύτταρα των μυών, που σχηματίζουν ώριμα μυϊκά κύτταρα και όχι οποιοδήποτε άλλο κύτταρο [11]. Επίσης στον πνεύμονα, τα πνευμονοκύτταρα των κυψελίδων τύπου II, οδηγούν στον σχηματισμό μόνο πνευμονοκυττάρων τύπου Ι. Ταξινόμηση των βλαστικών κυττάρων με βάση την προέλευση Δυναμικό Διαφοροποίησης Ολοδύναμα Πλειοδύναμα Πολυδύναμα Ολιγοδύναμα Μονοδύναμα Προέλευση ESCs, ipscs Βλαστικά κύτταρα εμβρύου Ενήλικα ή σωματικά βλαστικά κύτταρα Πίνακας 1. Ταξινόμηση των βλαστικών κυττάρων, με βάση το δυναμικό διαφοροποίησής τους και την προέλευση τους [2]. [16]

17 1.4.6 Εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ESCs) Τα ESCs είναι πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα, που προέρχονται από την εσωτερική κυτταρική μάζα (ICM) της βλαστοκύστης (κατά το προ-εμφυτευτικό στάδιο του εμβρύου 5-6 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση). Τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε ιστούς και των τριών πρωτογενών βλαστικών στοιβάδων. Επίσης μπορούν να διατηρούνται σε αδιαφοροποίητη κατάσταση για παρατεταμένο χρονικό διάστημα σε καλλιέργεια in vitro. Η βλαστοκύστη έχει δύο στρώματα κυττάρων, την εσωτερική κυτταρική μάζα, η οποία θα σχηματίσει το έμβρυο, και την εξωτερική κυτταρική μάζα, που ονομάζεται τροφοβλάστη, που θα σχηματίσει στη συνέχεια τον πλακούντα. Κατά την απομόνωση των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων, τα κύτταρα από την εσωτερική κυτταρική στιβάδα διαχωρίζονται από τις τροφοβλάστες και μεταφέρονται σε ένα τρυβλίο καλλιέργειας υπό πολύ ειδικές συνθήκες για την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών των ESCs. Τα ESCs χαρακτηρίζονται από την παρουσία μεταγραφικών παραγόντων όπως οι Nanog και Oct4 [12]. Εμβρυικά Βλαστικά Κύτταρα : Απομόνωση και Χαρακτηριστικά Εικόνα 4. Απομόνωση και καλλιέργεια εμβρυικών βλαστικών κυττάρων [12]. [17]

18 Οι παράγοντες αυτοί διατηρούν τα βλαστικά κύτταρα σε αδιαφοροποίητη κατάσταση, κατά την οποία παραμένουν ικανά για αυτο-ανανέωση. Τα ESCs που έχουν καλλιεργηθεί σε αδιαφοροποίητη κατάσταση, χωρίς γενετικές ανωμαλίες, πολλαπλασιάζονται όπως μία κυτταρική σειρά. Τα κύτταρα αυτά μπορούν να καταψυχθούν και να αποψυχθούν για περαιτέρω καλλιέργεια και πειράματα. Οι συνθήκες καλλιέργειας των ESCs παίζουν σημαντικό ρόλο για τη διατήρηση τους σε αδιαφοροποίητη κατάσταση. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιείται τροφοδοτικό στρώμα εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEFCs) ή καλλιεργητικό μέσο που περιέχει τον παράγοντα που μπλοκάρει την διαφοροποίηση, τον ανασταλτικό παράγοντα της λευχαιμίας LIF. Εάν απομακρυνθεί ο LIF από το καλλιεργητικό μέσο ή απομακρυνθούν τα ESCs από το τροφοδοτικό στρώμα τότε σχηματίζονται «εμβρυοειδή σωμάτια» τα οποία περιλαμβάνουν κύτταρα από το σύνολο των βλαστικών στιβάδων (ενδόδερμα, μεσόδερμα, και εξώδερμα) Βλαστικά κύτταρα ενηλίκων (Adult Stem Cells) Τα βλαστικά κύτταρα των ενηλίκων προέρχονται από ιστούς ενηλίκων. Ορισμένα από αυτά είναι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) καθώς και τα βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από ιστούς όπως ο πλακούντας (για παράδειγμα επιθηλιακά αμνιακά κύτταρα του ανθρώπου που βρίσκονται στο αμνιακό υγρό). Τα κύτταρα αυτά έχουν περιορισμένη ικανότητα διαφοροποίησης (πολυδύναμα ολιγοδύναμα) αν και κατά καιρούς έχουν διαφοροποιηθεί, in vitro, σε ιστούς που αντιπροσωπεύονται από διαφορετικές βλαστικές στοιβάδες [13]. Έχει δειχθεί ότι αυτά τα κύτταρα έχουν αντι-φλεγμονώδη δράση αλλά και ικανότητα επιδιόρθωσης ιστών με επούλωση πληγών σε ζωικά μοντέλα. Το βασικό πλεονέκτημα των βλαστικών κυττάρων των ενηλίκων είναι, ότι είναι αυτόλογα κύτταρα, και έτσι δεν εγείρουν ζητήματα απόρριψης μοσχεύματος ή αντιπαραθέσεις σε ζητήματα ηθικής. Τα βλαστικά κύτταρα θα μπορούσαν να ληφθούν από όλους τους ιστούς και των τριών βλαστικών στιβάδων, καθώς και από τον πλακούντα. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων ενηλίκων, αποκαθιστά κατεστραμμένα όργανα, in vivo, όπως για παράδειγμα η επιδιόρθωση του οστικού ιστού και η επαναγγείωση του καρδιακού ιστού μετά από ισχαιμία μέσω διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων και την παραγωγή νέων εξειδικευμένων κυττάρων [14]. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι τα βλαστικά κύτταρα των ενηλίκων [18]

19 που καλλιεργούνται εκκρίνουν διάφορους μοριακούς μεσολαβητές με αντιαποπτωτικές, ανοσορυθμιστικές, αγγειογόνες και χημειοτακτικές ιδιότητες Βλαστικά κύτταρα Ιστών Στους ενήλικες, η ικανότητα ορισμένων ιστών και οργάνων να ανανεώνονται και να αυτό-διορθώνονται μετά από τραυματισμό εξαρτάται, σε σημαντικό βαθμό, από τα βλαστικά κύτταρα που υπάρχουν σε αυτούς τους ιστούς. Τα βλαστικά κύτταρα παράγουν ιστο-ειδικά, διαφοροποιημένα κύτταρα. Ορισμένες μελέτες δείχνουν ότι αυτά τα κύτταρα δημιουργούνται κατά την οντογένεση και παραμένουν σε αδρανή κατάσταση μέχρι να ενεργοποιηθούν από τοπικά ερεθίσματα και να ξεκινήσουν πάλι τον πολλαπλασιασμό, την διαφοροποίηση και τη μετανάστευση [15]. Τα βλαστικά κύτταρα των ιστών βρίσκονται, στις λεγόμενες, «νησίδες των βλαστικών κυττάρων» όπου το μικροπεριβάλλον ελέγχει την αυτο-ανανέωση και την διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων. Η πλειοψηφία των βλαστικών κυττάρων είναι σε αδρανή κατάσταση-λήθαργο και ενεργοποιούνται από ειδικά σήματα κατά τη διάρκεια του τραυματισμού έτσι ώστε να επιδιορθώσουν τον ιστό. Αυτή η ιδιότητα είναι σημαντική για τη διατήρηση ενός πληθυσμού κυττάρων που δεν εκτελούν άλλες λειτουργίες εκτός από την παραγωγή άλλων ιστο-ειδικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της επιδιόρθωσης. Το περιβάλλον των νησίδων αποτελείται από διάφορα σηματοδοτικά μόρια του εξωκυττάριου υλικού (extracellular matrix) αλλά και διαλυτούς μεσολαβητές που εμπλέκονται στην κυτταρική σηματοδότηση και την γονιδιακή έκφραση[16]. Έτσι ρυθμίζεται ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, η διαφοροποίηση και η απόπτωση των βλαστικών κυττάρων αυτού του τύπου. Επιπλέον, ο ίδιος ο τύπος της κυτταρικής διαίρεσης που υποβάλλεται ένα βλαστικό κύτταρο καθορίζει και τον τύπο των κυττάρων που τελικά θα παραχθούν. Η συμμετρική κυτταρική διαίρεση οδηγεί σε πανομοιότυπα θυγατρικά κύτταρα τα οποία αποδίδονται για την αντικατάσταση των κατεστραμμένων κυττάρων μετά από τραυματισμό. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η ανεξέλεγκτη αύξηση και ο πολλαπλασιασμός των βλαστικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε υπερπλασία των βλαστικών κυττάρων και / ή σε καρκινογένεση, ενώ η μείωση του αριθμού των βλαστικών κυττάρων θα προκαλέσει πρόβλημα στην επιδιόρθωση ιστών και [19]

20 οργάνων. Εν κατακλείδι η εξισορρόπηση της ομοιόστασης των βλαστικών κυττάρων είναι ένα πολύ σημαντικό φαινόμενο [17] Επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ipscs) Εικόνα 5. Διαδικασία παραγωγής των επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων ips [6]. Τα ipscs παράγονται με μία διαδικασία γενετικού επαναπρογραμματισμού των σωματικών κυττάρων των ενηλίκων προς μία κατάσταση που προσομοιάζει στα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα (ESCs) [18]. Τα ipscs ποντικού αναφέρθηκαν για πρώτη φορά από τους Takahashi, Yamanaka και τους συνεργάτες τους το 2006 με την μετατροπή των ινοβλαστών του ποντικού σε ipscs [6]. Χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα διαφορετικά γονίδια τα οποία κωδικοποιούν τους ακόλουθους μεταγραφικούς παράγοντες: τον μεταγραφικό παράγοντα-δεσμευμένο στα οκταμερή 3 και 4 (oct3/4), την πρωτεΐνη πλαισίου υψηλής κινητικότητας που σχετίζονται με το SRY -2 (SOX2), την ογκοπρωτεΐνη c-myc, και τον ομοιάζοντα με τον παράγοντα 4 (KLF4). Ένα χρόνο αργότερα, το 2007, ο Yamanaka και οι συνεργάτες του περιέγραψαν την παραγωγή ipscs από τον άνθρωπο με την χρήση ινοβλαστών δέρματος με τους ίδιους τέσσερις (4) παράγοντες [19]. Επίσης απέδειξαν ότι αυτά τα κύτταρα έχουν παρόμοια χαρακτηριστικά με τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ESCs του ανθρώπου, σε σχέση με την μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό, την έκφραση αντιγόνων επιφανείας, την γονιδιακή έκφραση, την επιγενετική ρύθμιση ειδικών γονιδίων των πολυδύναμων κυττάρων και την ενεργότητα της τελομεράσης. Συγχρώνως απέδειξαν ότι θα [20]

21 μπορούσαν να διαφοροποιηθούν in vitro σε τύπους κυττάρων και από τις τρείς βλαστικές στοιβάδες. Σήμερα, τα ipscs, θεωρούνται χρήσιμα εργαλεία για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων, την μοντελοποίηση ασθενειών, και την αναγεννητική ιατρική. Παρόλα αυτά αν και αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν ορισμένα χαρακτηριστικά των πλειοδύναμων βλαστικών κυττάρων δεν είναι ακόμα σαφές και αποδεδειγμένο εάν τα ipscs και τα ESCs θα διαφέρουν σημαντικά κατά την κλινική πρακτική. Για να εισαχθούν οι παράγοντες επανα-προγραμματισμού στα ενήλικα κύτταρα χρησιμοποιούνται ρετροϊικοί φορείς. Αυτοί σε συνδυασμό με ογκογονίδια όπως το c-myc περιορίζουν την χρήση των ipscs στις κλινικές μελέτες, καθώς θεωρείται πιθανό οι ιικοί φορείς να προκαλέσουν καρκινογένεση. Οι ερευνητές αναζητούν σήμερα νέες μεθόδους για την παραγωγή ασφαλών ipscs χωρίς επέμβαση στο γονιδίωμα των κυττάρων. Έχουν περιγραφεί νέες τεχνικές, όπου για να αποφευχθεί η χρήση των ογκοπρωτεϊνών c-myc και Klf4, χρησιμοποιείται ένας μόνο παράγοντας από αυτούς (oct3/4 ή KLF4) ή οι παράγοντες c-myc και Klf4 έχουν υποκατασταθεί με διάφορους συνδυασμούς άλλων παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης μη-ρετροϊκών φορέων, άλλων χημικών ενώσεων, πλασμιδίων, αδενοϊών και μεταθετών στοιχείων [20]. Παρά τα θέματα ασφάλειας που εγείρονται, αυτή η καινοτόμος ανακάλυψη έχει δημιουργήσει ένα ισχυρό εργαλείο για τον επανα-προγραμματισμό των σωματικών κυττάρων ενηλίκων «στέλνοντάς τα προς τα πίσω» σε προγενέστερα αδιαφοροποίητα στάδια, δημιουργώντας έτσι ένα ιδανικό ταίριασμα με τον δότη των κυττάρων και αποφεύγοντας προβλήματα απόρριψης του μοσχεύματος. [21]

22 1.5 Ηθικά, κοινωνικά και πολιτικά ζητήματα στην χρήση των βλαστικών κυττάρων Η έρευνα στα βλαστικά κύτταρα είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με ηθικά, κοινωνικά και πολιτικά ζητήματα που εγείρονται σε όλο τον κόσμο. Η πιο έντονη συζήτηση αφορά στα ηθικά ζητήματα που εγείρονται με την καταστροφή των εμβρύων του ανθρώπου και την άντληση των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων. Μέσα σε αυτή την συνεχιζόμενη διαμάχη, τα αποτελέσματα πρόσφατων δημοσιεύσεων από διαφορετικές ομάδες επιστημόνων σχετικά με τη δυνατότητα επαναπρογραμματισμού των κυττάρων για την δημιουργία των επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (ipscs), έχουν εξάψει την φαντασία των επιστημόνων και της κοινωνίας. Μερικά δημοφιλή μέσα μαζικής ενημέρωσης προβάλουν ότι τα ηθικά ζητήματα που σχετίζονται με την έρευνα στα βλαστοκύτταρα θα επιλυθούν με την χρήση των ipscs, καθώς η χρήση αυτή δεν απαιτεί την καταστροφή εμβρύων [21]. Εικόνα 6. Ηθικά και κοινωνικά ζητήματα που εγείρονται από την χρήση των βλαστικών κυττάρων. (Δεξιά) Το πρώτο τεχνητό μπιφτέκι που κατασκευάστηκε από βλαστικά κύτταρα αγελάδας [21]. Οι προτάσεις αυτές παίρνουν υπόψη τα επιστημονικά επιχειρήματα για τη συνέχιση της έρευνα στα βλαστοκύτταρα με τη χρήση εμβρύων καθώς αποτελούν το σημαντικότερο εργαλείο για την κατανόηση των βασικών αρχών της αναπτυξιακής διαδικασίας, φυσιολογικής και μη φυσιολογικής, στον άνθρωπο. Πέραν της προέλευσης των κυττάρων υπάρχουν ορισμένα κοινωνικά και ηθικά ζητήματα που αφορούν το σύνολο των τύπων των βλαστικών κυττάρων. Σε αυτά περιλαμβάνονται οι περιορισμοί της πνευματικής ιδιοκτησίας για τη χρήση των υλικών που χρησιμοποιούνται στην έρευνα αλλά και ο βαθμός πρόσβασης στις ιατρικές και [22]

23 θεραπευτικές τεχνολογίες που αναπτύσσονται από τα βλαστικά κύτταρα. Σημαντικό πρόβλημα αποτελεί επίσης η κατανόηση της μελλοντικής χρήσης των προσφερόμενων γαμετών, εμβρύων ή σωματικών κυττάρων από τους δότες αλλά και η προστασία της ιδιωτικής ζωής και του απορρήτου των δοτών. Επίσης τα ιατρικά δεδομένα που προκύπτουν από την έρευνα στα βλαστικά κύτταρα εγείρουν ζητήματα που σχετίζονται με τα προσωπικά δεδομένα [21]. Παράλληλα υπάρχει μεγάλη συζήτηση γύρω από την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα των θεραπειών που βρίσκονται σε εξέλιξη αλλά και την κατανόηση, από την πλευρά των ασθενών, της προέλευσης των υλικών που χρησιμοποιούνται στις θεραπείες. Πιο συγκεκριμένα σε σχέση με τα επιμέρους είδη βλαστικών κυττάρων δημιουργούνται διακριτά ηθικά και κοινωνικά ερωτήματα. Σε ότι αφορά τα βλαστικά κύτταρα που απομονώνονται από τον ομφάλιο λώρο [22] υπάρχουν θέματα που σχετίζονται α) με τον κατάλληλο χρόνο απόσπασης συναίνεσης από τους δότες, για την χρήση των ιατρικών δεδομένων που προκύπτουν και β) θέματα που σχετίζονται με τους όρους κρυο-συντήρησης και φύλαξης των βλαστικών κυττάρων σε ειδικές τράπεζες. Σε ότι αφορά τα μεσεγχυματικά βλαστικά του μυελού των οστών τίθενται θέματα γύρω από τον πόνο και τους κινδύνους που προκαλούνται στον δότη κατα την όλη διαδικασία απομόνωσης των κυττάρων. Η συλλογή των άλλων σωματικών κυττάρων (όπως λιποκύτταρα, ηπατοκύτταρα, και κύτταρα από το δέρμα ενηλίκων) εγείρει κάποια διακριτά αλλά, μέχρι σήμερα διαχειρίσιμα ζητήματα, όπως η περιορισμένη δυσφορία του ασθενούς και ο φυσικός κίνδυνος κατά την διαδικασία απομόνωσης τους. Ορισμένα θέματα πολιτικής και θεσμικής σημασίας σχετίζονται με την προσεκτική εξέταση των δικαιωμάτων πνευματικής ιδιοκτησίας που διέπουν την έρευνα των βλαστοκυττάρων και τις σχετικές ιατρικές θεραπείες. Παράλληλα εγείρονται ζητήματα που σχετίζονται με την πλήρη ενημέρωση και την αληθινή συγκατάθεση των συμμετεχόντων επί του συνόλου της πειραματικής διαδικασίας. Σημαντικό θέμα αποτελεί η επανεξέταση των στόχων της διαδικασίας ενημέρωσης και συναίνεσης που αφορούν τους δότες κυττάρων και ιστών αλλά και η συλλογή και η ανάλυση εμπειρικών δεδομένων, τόσο στο επίπεδο της βασικής έρευνας όσο και σε κλινικές μελέτες θεραπειών με βλαστικά κύτταρα. Ταυτόχρονα αποτελεί μέγιστο ζήτημα η ενθάρρυνση και προώθηση της πολιτικής και κοινωνικής συζήτησης για τα [23]

24 ηθικά ζητήματα και τα ατομικά δικαιώματα στο πλαίσιο της έρευνας των βλαστικών κυττάρων. 1.6 Μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα του ομφαλίου λώρου (γέλη του Wharton) Μία βασική πηγή βλαστικών κυττάρων είναι η γέλη του Wharton (WJ) στον ομφάλιο λώρο[23]. Ένα μοναδικός πληθυσμός κυττάρων που φαίνεται να παρουσιάζει χαρακτηριστικά βλαστικότητας, εντός της γέλης του Wharton, είναι τα μεσεγχυματικά κύτταρα στρώματος ή τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα MSCs. Τα κύτταρα αυτά εμφανίζουν χαρακτηριστικά κυτταρικής προσκόλλησης ενώ παράλληλα εκφράζουν, φαινοτυπικά, ένα καθορισμένο σύνολο δεικτών επιφανείας, συμπεριλαμβανομένων των CD90, CD73 και CD105. Παρά το γεγονός ότι έχουν συλλεχθεί MSCs από πολλούς διαφορετικούς τύπους ιστών, νέες εκτιμήσεις σε σχέση με την ειδικότητα των ιστών υπαγορεύουν ότι η «βλαστικότητα» και οι ανοσολογικές ιδιότητες των MSCs που προέρχονται από εμβρυικούς ιστούς είναι πιο σταθερά εκφραζόμενες σε σχέση με τα MSCs που προέρχονται από ενήλικες, όπως από τον μυελό των οστών ή τον λιπώδη ιστό. Το γεγονός αυτό σχετίζεται με την νεαρή ηλικία των MSCs που συλλέγονται από την, εμβρυϊκής προέλευσης, γέλη του Wharton (WJ). Τα κύτταρα αυτά πολλαπλασιάζονται εύκολα, παρουσιάζουν χαμηλή ανοσογονικότητα και χρησιμοποιούνται σε ευρύ φάσμα θεραπειών. Η γέλη του Wharton αποτελείται από πρωτογενή συνδετικό ιστό στον ομφάλιο λώρο στον άνθρωπο (Umbilical Cord) και περιγράφηκε το 1656 για πρώτη φορά από τον Thomas Wharton. Τα κύτταρα αυτά απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν για πρώτη φορά πριν από μια δεκαετία από τους McElreavey και τους συνεργάτες του [23][24]. Στη συνέχεια, πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν βελτιώσει τα πρωτόκολλα απομόνωσης και διαφοροποίησης αυτών των κυττάρων. [24]

25 1.6.1 Η ανατομική σχέση των διαφόρων δομών του ομφαλίου λώρου και η γέλη του Wharton (WJ) ως πηγή μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, το έμβρυο και ο πλακούντας συνδέονται με ένα ελαστικό ομφάλιο λώρο (UC) που προστατεύει τα υπάρχοντα αγγεία από την συμπίεση, την στρέψη και την κάμψη, παρέχοντας, παράλληλα, μια καλή κυκλοφορία του αίματος. Ανατομικά, ο ομφάλιος λώρος αποτελείται από δύο αρτηρίες και μία φλέβα, ενσωματωμένα μέσα σε μία ειδική βλεννώδη μήτρα πλούσια σε πρωτεογλυκάνες, που είναι γνωστή ως γέλη του Wharton, που καλύπτεται εξωτερικά από αμνιακό επιθήλιο (Εικόνα 7). Η γέλη του Wharton περιέχει ένα πληθυσμό πολυδύναμων, ινοβλαστικής μορφής, μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος (MSCs) που περιγράφονται με τον όρο WJ-hMSCs. Oμφάλιες αρτηρίες Υποάμνιο Εξωτερικός χιτώνας Άμνιο Περιαγγειακή περιοχή Γέλη του Wharton Αίμα Ομφαλίου λώρου Ομφάλια Φλέβα Ενδοθήλιο Εικόνα 7. Γράφημα διατομής του ανθρώπινου ομφάλιου λώρου που δείχνει τα ανατομικά του διαμερίσματα, συμπεριλαμβανομένης της γέλης του Wharton, ως πηγής βλαστικών κυττάρων [25]. Προηγουμένως είχαν χαρακτηριστεί ως «βλαστικά κύτταρα της μήτρας του ομφαλίου λώρου» (UC-MSCs) για να διακριθούν από τα ενδοθηλιακά κύτταρα που [25]

26 απομονώνονται από την ομφάλια φλέβα (huvecs), καθώς και τα MSCs που απομονώνονται από το ομφάλιο αίμα (UCB-MSCs) [25]. Υπάρχουν δύο πιθανές θεωρίες σχετικές με την ύπαρξη των βλαστικών κυττάρων στην γέλη του Wharton (WJ). Σύμφωνα με την πρώτη εκδοχή, υπάρχουν δύο κύματα μετανάστευσης των εμβρυϊκών μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs) κατά τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του ανθρώπου. Μερικά από τα MSCs παγιδεύονται και διαμένουν στην γέλη του Wharton (WJ) του ομφαλίου λώρου (UC) [26]. Κατά την δεύτερη εκδοχή, τα κύτταρα της γέλης του Wharton είναι πραγματικά πρωτογεννή MSCs που προέρχονται από το μεσέγχυμα που ήταν ήδη εκεί, μέσα στην μήτρα του ομφαλίου λώρου. Ο πιθανός ρόλος αυτών των κυττάρων είναι να εκκρίνουν διάφορες γλυκοπρωτεΐνες, βλεννοπολυσακχαρίτες, γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεΐνες του εξωκυττάριου υλικού και σχηματίζεται μία ζελατινώδης ουσία για την αποτροπή της συμπίεσης των φλεβών/αγγείων του ομφαλίου λώρου κατά τη διάρκεια της κύησης [27]. Εικόνα 8. Ανατομία του φυσιολογικού ομφαλίου λώρου του ανθρώπου (μακροσκοπική εικόνα) [27]. [26]

27 Διάφοροι τύποι βλαστικών κύτταρα έχουν απομονωθεί τόσο από το αμνιακό σάκο (από την εξωτερική επιθηλιακή στοιβάδα και την εσωτερική υποαμνιακή μεσεγχυματική στοιβάδα), όσο και από τον χώρο της γέλης του Wharton (WJ), τον περιαγγειακό χώρο που περιβάλλει τα αγγεία, το υγρό και τον εξωτερικό χιτώνα των τοιχωμάτων των αιμοφόρων αγγείων του ομφαλίου λώρου, τον ενδοθηλιακό χώρο (εσωτερικό τοίχωμα των φλεβών) και τον αγγειακό χώρο (το αίμα που βρίσκεται μέσα στα αιμοφόρα αγγεία του ομφαλίου λώρου) [27]. Όλα τα τμήματα αυτά έχουν περιγραφεί ως διακριτές περιοχές ενώ η ονοματολογία δεν έχει τυποποιηθεί. Κατά καιρούς έχουν χρησιμοποιηθεί όροι όπως «υποαμνιακά», «ενδοαγγειακά», «περιαγγειακά» και "huvec". Επίσης, μέχρι στιγμής δεν έχουν τυποποιηθεί απόλυτα οι μέθοδοι απομόνωσης και η περιοχή ενδιαφέροντος για τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα της γέλης του Wharton (από εδώ και πέρα θα χρησιμοποιείται ο όρος WJ hmscs). Πράγματι, δεν είναι γνωστό εάν οι διαφορετικοί πληθυσμοί των βλαστικών κυττάρων μεταξύ των διαφόρων διαμερισμάτων είναι ίδιοι, καθώς δεν υπάρχει σαφής ιστολογικός διαχωρισμός μεταξύ των διαμερισμάτων αυτών. Εικόνα 9. Τυπική ινοβλαστική μορφολογία ς των WJ-hMSCs σε in vitro καλλιέργεια [27]. Ταυτόχρονα υπαρχουν διαφορετικά πρωτόκολλα απομόνωσης γεγονός αυτό συμβάλει σε μεγαλύτερη ετερογένεια μεταξύ των διαφορετικών πληθυσμών βλαστικών κυττάρων των διαμερισμάτων. Τα WJ-MSCs μπορούν να απομονωθούν [27]

28 από δύο περιοχές, την ενδοαγγειακή περιοχή και το υπο-άμνιο, ενώ διάφοροι έχουν απομονώσει WJ-MSCs από τρεις διαφορετικές περιοχές, δηλαδή, την περιαγγειακή ζώνη, την ενδο-αγγειακή ζώνη, και το υπο-άμνιο[28]. Δομικές, ανοσοϊστοχημικές και λειτουργικές in vitro αναλύσεις, που πραγματοποιήθηκαν, έδειξαν σημαντικές διαφορές στον αριθμό και την φύση των κυττάρων μεταξύ των τριών αυτών περιοχών και το γεγονός ότι έχουν διαφορετικές ιδιότητες. Αυτά τα ευρήματα οδήγησαν στην υπόθεση ότι οι περιοχές αυτές μπορεί να προέρχονται από διαφορετικές προϋπάρχουσες δομές [29]. Επίσης ο πληθυσμός βλαστικών κυττάρων που έχει απομονωθεί από τα γύρω τμήματα των ομφάλιων αγγείων, ονομάζεται «περιαγγειακά κύτταρα ομφάλιου λώρου ανθρώπου» (hucpvcs), ενώ παράλληλα κύτταρα που oμοιάζουν σε βλαστικά κύτταρα έχουν απομονωθεί και από το υποάμνιο. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα WJ-hMSCs που βρίσκονται κοντά στην αμνιακή επιφάνεια, εμφανίζουν ενισχυμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού, ενώ τα WJ-hMSCs που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση με τα ομφάλια αγγεία εμφανίζουν μεγαλύτερη ικανότητα διαφοροποίησης [30] Φαινοτυπικός χαρακτηρισμός των κυττάρων της γέλης του Wharton. Η ειδική επιτροπή μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων και ιστών,της Διεθνούς Κοινότητας για την κυτταρική θεραπεία (International Society for Cellular Therapy) έχει προτείνει τρία καθοριστικά κριτήρια έτσι ώστε ένας πληθυσμός κυττάρων να χαρακτηριστεί ως πληθυσμός μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ή μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος (MSCs). Τα MSCs πρέπει να (α) εμφανίζουν ιδιότητες κυτταρικής προσκόλλησης και πλαστικότητας (β) να μην εκφράζουν ή να εκφράζουν ορισμένους ειδικούς δείκτες επιφανείας (να είναι αρνητικά για τους CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a,CD19 και τα δεύτερης τάξης αντιγόνα λευκοκυττάρων στον άνθρωπο [HLA] και θετικά για τους CD73, CD29, CD105, [28]

29 CD90 και (γ) να έχουν την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και να διαφοροποιούνται in vitro σε οστεοκύτταρα, χονδροκύτταρα και σε κύτταρα του λιπώδους ιστού. Εικόνα 10. Γραφική απεικόνιση του ομφαλίου λώρου ανθρώπου. Στο αριστερό τμήμα φαίνονται οι ομφάλιες αρτηρίες και φλέβες καθώς και η περιοχή της γέλης του Wharton. Στο δεξιό τμήμα φαίνονται οι διάφοροι κυτταρικοί τύποι σε in vitro καλλιέργεια που μπορούν να απομονωθούν από τα αντίστοιχα τμήματα του ομφαλίου λώρου (μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα και βλαστικά κύτταρα ομφαλίου αίματος)[30]. [29]

30 Πίνακας 1 Θετική επιλογή Αρνητική επιλογή Πίνακας 2. Δείκτες για την απομόνωση των μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος [31]. Το 2010 o Kita και οι συνεργάτες του [31] έθεσαν τις βάσεις σχετικά με το χαρακτηρισμό των κυττάρων της γέλης του Wharton του ομφαλίου λώρου, παρέχοντας μια συνολική εικόνα των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των κυττάρων που προέρχονται από διάφορα μέρη του ομφαλίου λώρου στον άνθρωπο. Η υψηλή ετερογένεια κατά την απομόνωση, την καλλιέργεια, και των διαδικασιών ανάλυσης εμποδίζουν τη δυνατότητα να προσδιοριστούν με ακρίβεια τα χαρακτηριστικά των κυττάρων αυτών. Συνολικά, τα κύτταρα από την γέλη του Wharton εμφανίζουν τα απαραίτητα κριτήρια για να χαρακτηριστούν ως μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (ή κύτταρα στρώματος)- MSCs. Τα WJ-hMSCs διαθέτουν ικανότητα προσκόλλησης, μπορούν να διαφοροποιηθούν προς κύτταρα χόνδρου, λίπους και οστών και παρουσιάζουν έκφραση των δεικτών επιφανείας CD105+ (ενδογλίνης, SH2), CD73+ (SH3), CD90+ (Thy-1), HLA-A,B,C+ (MHC τάξης I), CD34, CD45-, HLA-DR- (MHC τάξης II) [29]. Είναι ενδιαφέρον, ότι τα WJ-hMSCs δεν έχουν μόνο ιδιότητες μεσεγχυματικών κυττάρων, αλλά παρουσιάζουν παρόμοιες ιδιότητες με εκείνες των [30]

31 εμβρυικών βλαστικών κυττάρων (ESCs). Συγκεκριμένα, τα WJ-hMSCs εκφράζουν τους δείκτες Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA-1 (στάδιο-ειδικό εμβρυϊκό αντιγόνο-1), SSEA-4, αλκαλική φωσφατάση ενώ ακόμα σχηματίσζουν in vitro εμβρυοειδή σωμάτια. Επιπλέον, εκφράζουν τους δείκτες πλειοδυναμίας Oct-4, Sox-2 και Nanog αν και σε σχετικά χαμηλότερα επίπεδα από ό, τι τα ESCs. Δεδομένα ανάλυσης μικρο-συστοιχιών και ποσοτικής qrt-pcr έχουν επιβεβαιώσει την μικρότερη έκφραση, σε σχέση με τα ESCs, των δεικτών πλειοδυναμίας [32]. Αν και αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι τα WJ-MSCs δεν είναι ολοδύναμα, ωστόσο δείχνουν ότι είναι ιδιαίτερα πολυδύναμα. Οι μελέτες μικρο-συστοιχιών επιβεβαιώνουν επίσης ότι τα WJ-hMSCs εκφράζουν δείκτες και των τριών αρχέγονων βλαστικών στοιβάδων [32]. Δεν προκαλεί έκπληξη ότι οι δείκτες Oct-4, Sox-2 και Nanog δεν εκφράζονται στα ενήλικα βλαστικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs) που λαμβάνονται από τον μυελό των οστών [33] Σύγκριση των WJ-MSCs με άλλους τύπους MSCs Ενηλίκων. Οι ομοιότητες των WJ-MSCs και των υπολοίπων MSCs μπορούν να συνοψιστούν ως εξής: τα WJ-MSCs έχουν τα ίδια βασικά χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται για να χαρακτηριστούν τα MSCs των ενηλίκων. Επιπλέον τα WJ- MSCs εκφράζουν την συνθάση GD2, που αποτελούν μοναδικό δείκτη για τον προσδιορισμό των MSCs που απομονώνονται από τον μυελό των οστών[34]. Επίσης τα WJ-hMSCs έχουν ταχύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού και μεγαλύτερες δυνατότητες καλλιέργειας ex vivo σε σχέση με τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα του μυελού των οστών (BM-MSCs). Αυτό μπορεί να οφείλεται στην έκφραση της τελομεράσης από τα WJ-MSCs. Τα MSCs χρησιμοποιούνται συνήθως για όχι παραπάνω από έξι (6) ανακαλλιέργειες (περάσματα). Σε μία μελέτη έχει αναφερθεί ότι τα WJ-MSCs καλλιεργήθηκαν 300 φορές πάνω από τις επτά ανακαλλιέργειες [30]. Σε αντίθεση με τα MSCs ενηλίκων, τα WJ-hMSCs έχουν ένα σημαντικά υψηλότερο ρυθμό σχηματισμού αποικιών (CFU-F). Επίσης οι πληθυσμοί των WJ- MSCs εκφράζουν την νεστίνη, έναν ειδικό δείκτη των νευρικών αλλά και άλλων βλαστικών κυττάρων. Σε άλλες μελέτες αναφέρεται ότι τα WJ-hMSCs είναι ανώτερα από τα MSCs των ενηλίκων τόσο για την χρήση τους στην αποκατάσταση των φωτοϋποδοχέων, όσο και γενικότερα για την χρήση τους στην μηχανική των ιστών [35]. Τα WJ-hMSCs φαίνεται να μοιάζουν τόσο με τα μεσεγχυματικά κύτταρα του [31]

32 στρώματος του μυελού των οστών όσο και με αλλά MSCs των ενηλίκων. Αυτό συμπεραίνεται από το γεγονός ότι εκτός από τους τρεις δείκτες επιφάνειας που αναφέρθηκαν ανωτέρω, όλα εκφράζουν τους δείκτες CD10, CD13, CD29, και CD44. Όπως και τα BM-ΜSCs, τα WJ-MSCs εκφράζουν το γονίδιο του παράγοντα των βλαστικών κυττάρων [36]. Ωστόσο, ορισμένοι από αυτούς τους δείκτες εμφανίζονται να μειώνονται όσο ο αριθμός των ανα-καλλιεργειών αυξάνεται [37]. Ο Karahuseyinoglu και οι συνεργάτες του [30] διαίρεσαν τα WJ-hMSCs σε δύο ομάδες (α) στα κύτταρα τύπου Ι, τα οποία είχαν περισσότερο ατρακτοειδή μορφολογία, και εξέφραζαν επίσης κυτοκερατίνες και άλλους δείκτες διαφοροποίησης και (β) τα κύτταρα τύπου II, τα οποία ήταν πιο επίμηκη σε μορφολογία αλλά ήταν πιο αποτελεσματικά στην επαγωγή της διαφοροποίησης προς νευρικά κύτταρα. Στην συνέχεια ανέφεραν ότι τα WJ-hMSCs, όταν αναπτύχθηκαν σε καλλιεργητικό μέσο ειδικό για χονδρογέννεση, ήταν έντονα θετικά έναντι του κολλαγόνου τύπου II, ενώ τα BM-ΜSCs στο ίδιο καλλιεργητικό μέσο έδειξαν μόνο ασθενές θετικό ανοσοφθορισμό για το κολλαγόνο τύπου IΙ Σύγκριση των WJ-MSCs με άλλα εμβρυϊκής προέλευσης MSCs. Σε αντίθεση με ό, τι έχει παρατηρηθεί για τα MSCs ενηλίκων, τα WJ-MSCs έχουν αρκετές κοινές ιδιότητες που είναι μοναδικές για τα MSCs που λαμβάνονται από τον εμβρυικό ιστό. Πρώτον, έχουν μεγαλύτερες δυνατότητες καλλιέργειας in vitro σε σχέση με τα MSCs ενηλίκων όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Δεύτερον, τα WJ-MSCs εκφράζουν τον δείκτη HLA τάξης I, ενώ δεν εκφράζουν τον δείκτη HLA τάξης II στην επιφάνεια τους. Σε αντίθεση με ό, τι έχει δημοσιευθεί για τα εμβρυϊκής προέλευσης MSCs, τα WJ-MSCs έχουν ανοσοκατασταλτική δράση σε μικτές δοκιμασίες λεμφοκυττάρων και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων. Τα WJ-MSCs εμφανίζουν αντοχή μετά από αλλογενή μεταμόσχευση ενώ διεγείρουν την ανοσο-απόκριση μετά από πολλαπλές ενέσεις ή μετά από ένεση με WJ-MSCs που έχουν προηγουμένως εκτεθεί σε ιντερφερόνη[28]. [32]

33 1.6.5 Ανοσο-ρυθμιστική ικανότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος Αν και παραδοσιακά το ενδιαφέρον για τα MSCs προσέλκυε η αναγεννητική τους ικανότητα, μέσω της πλαστικότητάς που παρουσιάζουν, πλέον το μεγαλύτερο ενδιαφέρον στρέφεται στον ρόλο που παίζουν στην ρύθμιση των ανοσολογικών αποκρίσεων. Πολυάριθμες μελέτες έχουν αποδείξει τον ρόλο των MSCs στην ρύθμιση της λειτουργίας των Τ λεμφοκυττάρων (Τ-κύτταρα) που είναι κεντρικοί παράγοντες της ανοσολογικής απόκρισης. Είναι γνωστό ότι τα MSCs δεν εκφράζουν τον παράγοντα MHC τάξης II και το μεγαλύτερο μέρος των κλασσικών συνδιεγερτικών μορίων όπως τους CD80, CD86, ή CD40 [38]. Ωστόσο ο Le Blanc και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι τα MSCs μπορούν να εκφράσουν τα αντιγόνα MHC τάξης II μετά από επαγωγή με ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) [39]. Το γεγονός αυτό είναι σημαντικό, διότι, εντός του μικροπεριβάλλοντος της φλεγμονής, επάγεται η έκφραση της IFN-γ και με τη σειρά της μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της έκφρασης του MHC τάξης II. Επιπλέον, η έλλειψη έκφρασης των συνδιεγερτικών μορίων των Τ κυττάρων υποδηλώνει ότι η δραστηριότητα των Τ-κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε έλλειψη ανοσολογικής απόκρισης, γεγονός που μπορεί να συμβάλει στην παρατηρούμενη ανοσολογική ανοχή. Η άποψη που προτάθηκε αρχικά, ότι τα MSCs απλώς αποφεύγουν την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή είναι αρκετά απλοποιημένη. Τα MSCs εκφράζουν υποδοχείς που τους επιτρέπουν να αλληλεπιδρούν με τα Τ-κύτταρα. Τα μόρια MHC τάξης Ι και αρκετά άλλα μόρια προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένου του μορίου κυτταρικής προσκόλλησης (VCAM), του ενδοκυτταρικού μορίου προσκόλλησης-1 (ICAM-1), του ενεργοποιημένου μορίου κυτταρικής προσκόλλησης λευκοκυττάρων (ALCAM), του λειτουργικού αντιγόνου-3 των λεμφοκυττάρων (LFA3), και μερικών ιντεγκρινών μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τους αντίστοιχους προσδέτες τους πάνω στα Τ-κύτταρα. Τα MSCs εκφράζουν την λειτουργικά ενεργή ινδολοαμίνη 2,3-διοξυγενάση (IDO) μετά από διέγερση με IFN-γ η οποία καταλύει την μετατροπή τρυπτοφάνης προς κυνουρενίνη [40] η οποία έχει αναγνωριστεί ως ανασταλτικό μονοπάτι των Τ-κυττάρων [41]. [33]

34 Εικόνα 11. Ανοσορυθμιστικοί μηχανισμοί των μεσεγχυματικών βλασστικών κυττάρων [42]. Ένας ακόμη δυνητικός μηχανισμός με τον οποίο τα MSCs αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ-κυττάρων είναι η παραγωγή οξειδίου του αζώτου (ΝΟ)[42]. Τα MSCs φαίνεται επίσης, ότι μειώνουν την ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων μέσω έμμεσων μηχανισμών όπως η αναστολή της ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων, (DC) από τα μονοκύτταρα. Τα δενδριτικά κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην διαδικασία παρουσίασης του αντιγόνου στα ανώριμα Τ-κύτταρα αμέσως μετά την ωρίμανση τους, η οποία μπορεί να επάγεται από φλεγμονώδεις κυτοκίνες. Παράλληλα τα MSCs μειώνουν το προφλεγμονώδες δυναμικό των δενδριτικών κυττάρων αναστέλλοντας την έκκριση των TNF-α, IFN-γ, και της ιντερλευκίνης (IL) -12, και αντιστρόφως αυξάνοντας τα επίπεδα της IL-10, με αποτέλεσμα να επάγεται ένας περισσότερο αντιφλεγμονώδης φαινότυπος τους [43]. Επιπρόσθετα η αλληλεπίδραση μεταξύ των MSCs και των κυττάρων φυσικοί φονείς (ΝΚ) μπορεί να συμβάλλει στα ανοσορρυθμιστικά αποτελέσματα των MSC. Η Sotiropolou και οι συνεργάτες της πρότειναν μια συνδυαστική επίδραση στην καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΝΚ [44]. Αρχικά αυτό επιτυγχάνεται μέσω της επαφής κυττάρου-κυττάρου μεταξύ των κυττάρων MSCs και των ΝΚ, και στην [34]

35 συνέχεια την έκκριση διαλυτών παραγόντων από τα MSCs που περιλαμβάνουν τον αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού-β (TGF-β) και την προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2). Το ανασταλτικό μόριο του προγραμματισμένου θανάτου (PD-1) μέσω της σύνδεσης του με τους προσδέτες του, PD-L 1 και PD-L2, μπορεί επίσης να ευθύνεται για την αναστολή του πολλαπλασιασμού των Τ-κυττάρων, μέσω επαφής κυττάρουκυττάρου των MSCs, οδηγώντας τόσο στην ρύθμιση της έκφρασης των υποδοχέων κυτταροκίνης, όσο και την ενεργοποίηση μορίων για την σηματοδότηση των κυτταροκινών [45]. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα MSCs ασκούν τη λειτουργία τους στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι πλειοτροπικοί και είναι σαφές ότι βρισκόμαστε μακριά από την πλήρη κατανόηση τους. Η εικόνα 11 συνοψίζει μερικούς πιθανούς μηχανισμούς Εντοπισμός και κυκλοφορία των MSCs Τα MSCs βρίσκονται σε εξειδικευμένες θέσεις εντός διαφόρων ιστών και, έχει αποδειχθεί ότι, ο μυελός των οστών, τα οστά, και η σπλήνα αποτελούν θέσεις εγκατάστασής τους [46]. Πρόσφατα αναφέρθηκε επίσης ότι ένας πολύ μικρός αριθμός MSCs κυκλοφορούν συνεχώς στο περιφερικό αίμα και ότι η κυκλοφορία τους αυξάνεται σημαντικά υπό συνθήκες υποξίας [47]. Η χρήση των MSCs σε θεραπευτικές εφαρμογές, έχει αναγνωριστεί ιδιαιτέρως λόγω της εγγενούς τους ικανότητας να μεταναστεύουν-εγκαθίστανται σε θέσεις φλεγμονής μετά από κάποιον τραυματισμό των ιστών, όταν αυτά χορηγούνται με ενδοφλέβια ένεση. Η αυτοκατευθυνόμενη μετανάστευση και εγκατάσταση των MSCs ονομάζεται homing (παλιννόστηση) και είναι ουσιαστικά η διαδικασία με την οποία τα κύτταρα μεταναστεύουν και ενσωματόνωνται στους ιστούς στους οποίους θα ασκήσουν στην συνέχεια λειτουργικές και προστατευτικές επιδράσεις. Αν και οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους τα MSCs είναι σε θέση να μεταναστεύουν και να εγκαθίστανται στις περιοχές του τραυματισμού δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί, έχει προταθεί, ως υπόδειγμα, η σύνθετη και πολυσταδιακή διαδικασία με την οποία τα λευκοκύτταρα μεταναστεύουν σε περιφερικές θέσεις φλεγμονής. [35]

36 Εικόνα 12. Προτεινόμενος μηχανισμός για την αυτοκατευθυνόμενη παλιννόστηση (homing) και κυκλοφορία των μεσεγχυματικών κυττάρων στρώματος σε περιοχές τραυματισμού του ιστού [42]. Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει μια πληθώρα επιπρόσθετων μονοπατιών και διαδικασιών που συμμετέχουν στη μετανάστευση, την κυκλοφορία και την εγκατάσταση των MSC. Κατά τη διάρκεια της φλεγμονής, η στρατολόγηση των κυττάρων που εμπλέκονται στην φλεγμονή απαιτεί μια συντονισμένη διαδικασία πολλών σταδίωνγεγονότων προσκόλλησης και σηματοδότησης. Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται αρχικά η κύλιση που μεσολαβείτε από την σελεκτίνη και η ενεργοποίηση των κυττάρων με χημειοκίνες και κυτοκίνες. Στην συνέχεια γίνεται η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών και η σταθερή προσκόλληση στο ενδοθήλιο με την μεσολάβηση των ιντεγκρινών. Ακολούθως λαμβάνει χώρα η ενδοθηλιακή μετανάστευση και τέλος η εισβολή στον εξωκυττάριο χώρο που περιλαμβάνει αλληλεπιδράσεις, που εξαρτώνται από τις [36]

37 ιντεγκρίνες, αλλά και την αποδόμηση του εξω-κυττάριου υλικού από ορισμένες πρωτεάσες. Είναι γνωστό ότι η κατεύθυνση μετανάστευσης ακολουθεί την βαθμίδωση της πυκνότητας των χημειοκινών. Η αύξηση της συγκέντρωσης τους στην περιοχή της φλεγμονής είναι ο κύριος μεσολαβητής της κίνησης των MSC προς την θέση της βλάβης. Τα MSC εκφράζουν διάφορους υποδοχείς για τις χημειοκίνες [48]. Ο παράγοντας SDF-1/CXCL12 είναι μέλος της οικογένειας των χημειοκινών και εκφράζεται από τα MSCs του μυελού των οστών και από άλλα προγονικά κύτταρα ενώ επίσης τα MSCs εκφράζουν τον ειδικό υποδοχέα SDF-1 της χημειοκίνης CXCR4[49]. Επιπλέον, τα MSCs εκφράζουν επίσης αρκετά μόρια προσκόλλησης που ανταποκρίνονται στον SDF-1, καθώς και τις χημειοκίνες CX3CL1, CXCL16, CCL3, CCL19, και CCL21. Πρόσφατα ο Sasaki και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι η χορήγηση των MSCs συμβάλλει σημαντικά στην επούλωση μίας πληγής, μέσω συσσώρευσης των MSCs στην περιοχή του τραύματος [50]. Στο δέρμα τα κερατινοκύτταρα στην περιοχή του τραύματος, αποδείχθηκε ότι εκφράζουν τον παράγοντα CCL21 ενώ τα MSCs αποδείχθηκε αντίστοιχα ότι εκφράζουν τον ειδικό υποδοχέα του CCR7. Ο Ip και οι συνεργάτες του προσδιόρισαν, την σηματοδότηση μέσω της ιντεγκρίνης-β1, ως ένα ξεχωριστό μονοπάτι για την κίνηση και την εμφύτευση των MSCs στο μυοκάρδιο που υπέστη ισχαιμία [51]. Η αποτελεσματικότητα της αυτοκατευθυνόμενης εγκατάστασης των MSCs, έχει αναφερθεί, ότι επηρεάζεται σημαντικά από τις διαφορές μεταξύ των πρωτοκόλλων που χρησιμοποιούνται σήμερα για την απομόνωση και την καλλιέργεια των πληθυσμών που απαιτούνται για την χρήση σε in vivo πειράματα. Μια σαφέστερη κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους τα MSCs εγκαθίστανται στις θέσεις της φλεγμονής, είναι πιθανόν να αποκαλύψει τις δυνατότητες που υπάρχουν για την βελτίωση των κλινικών βελτιώσεων, που παρατηρούνται, μετά από μεταμόσχευση των MSCs. Εν κατακλείδι, παρά το γεγονός ότι πολλές προκλινικές και κλινικές μελέτες έχουν δείξει την ασφάλεια και την αποφυγή της τοξικότητα της μεταμόσχευσης των MSC, άλλες εκθέσεις δείχνουν ότι υπάρχει σαφής ομοιότητα μεταξύ των βλαστικών κυττάρων και του καρκινικών βλαστικών κυττάρων [52]. Έχει αναφερθεί ότι τα [37]

38 MSCs του ανθρώπου, που καλλιεργούνται ex νίνο για μεγάλο χρονικό διάστημα, μπορούν να υποστούν αυθόρμητο μετασχηματισμό προς καρκινικά κύτταρα. 1.7 Κλινικές εφαρμογές των βλαστικών κυττάρων WJ-MSCs Θεραπεία του καρκίνου Η θεραπείες με βάση την χρήση των βλαστικών κυττάρων παρουσιάζουν σημαντικές προοπτικές για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων των πρωτογενών και μεταστατικών καρκίνων. Ο Tamura και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι τα WJ-MSCs του ανθρώπου και του αρουραίου αναστέλλουν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό πολλών καρκινικών κυτταρικών σειρών τόσο in vivo όσο και in vitro μέσω πολλαπλών μηχανισμών [53]. Παρότι δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως ακόμη ο μηχανισμός της αναστολής του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων, ωστόσο, έχουν προταθεί δύο πιθανοί μηχανισμοί. Ο πρώτος μηχανισμός αναφέρεται στην παραγωγή πολλαπλών εκκρινόμενων πρωτεΐνων που επάγουν τον κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι τα WJ-MSCs προωθούν την δραστηριότητα των κασπασών και διακόπτουν τον κυτταρικό κύκλο, ακόμη και χωρίς την άμεση επαφή με τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, η ανάλυση μικροσυστοιχιών των WJ-MSCs αρουραίου αποκάλυψε την υπερέκφραση πολλαπλών ογκοκατασταλτικών γονίδίων [53]. Ο δεύτερος πιθανός μηχανισμός είναι η διέγερση της ανοσολογικής απόκρισης έναντι των καρκινικών κυττάρων. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι η πλειοψηφία των διηθητικών λεμφοκυττάρων σε όγκους αρουραίου που έχουν εναθεί WJ-MSCs, ήταν Τ κύτταρα. Αν και αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με την χαμηλή ανοσογονικότητα των WJ-MSCs, είναι πιθανό η τελευταία να εξαρτάται από το μικροπεριβάλλον των WJ-MSCs αλλά και των κυττάρων του όγκου. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα γενικά και τα WJ-MSCs έχουν μια ικανότητα παλινόστησης (homing) στους χώρους που βρίσκονται τα καρκινικά κύτταρα. Η ικανότητα αυτή φαίνεται να οφείλεται στην αλληλεπίδραση κυτοκινών / αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους. Τα κύτταρα των όγκων εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες διαφόρων κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων. Επειδή τα WJ- [38]

39 MSCs και άλλα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) εκφράζουν στην επιφάνεια τους διάφορους υποδοχείς κυτοκινών και αυξητικών παραγόντων, είναι πιθανό να μεταναστεύσουν προς τις μονάδες παραγωγής κυτοκινών/αυξητικών παραγόντων ανιχνεύοντας τις σταδιακές διαβαθμίσεις τους. Λόγω της υπερ-έκφραση του υποδοχέα της IL-8 και CXCR, τα WJ-MSCs έχουν μεγαλύτερη ικανότητα να μεταναστεύουν προς τους όγκους σε σχέση με τα BM-MSCs. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι αυτά τα κύτταρα μπορούν να τροποποιηθούν έτσι ώστε να εκφράζουν κυτταροτοξικές κυτοκινές ή να προ-εγκατασταθούν σε αυτά φορτία νανο-σωματιδίων τα οποία θα εξασθενήσουν τους όγκους μετά την εγκατάσταση τους σε αυτούς. Παράλληλα έχουν τροποποιηθεί γενετικά WJ-hMSCs ώστε να εκφράζουν INF-β σε επαρκείς ποσότητες ώστε να επάγoυν το θάνατο κυττάρων αδενοκαρκινώματος μαστού και βρογχο-κυψελιδικού καρκινώματος από τον άνθρωπο, τόσο in vitro όσο και in νiνο [54]. Αυτά τα δεδομένα προβάλλονται σήμερα ως νέες προσέγγισεις για την κυτταρική θεραπεία του καρκίνου. Μεταξύ των πολλών τύπων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων, τα WJ-hMSCs μπορεί να είναι κατάλληλα για αλλογενή μεταμόσχευση (ως θεραπευτικό εργαλείο) λόγω της αφθονίας τους, της χαμηλής ανοσογονικότητας τους, της μη έκφρασης των CD34 και CD45, και της ευκολίας των μεθόδων συγκομιδής και καλλιέργειας in vitro Θεραπεία ηπατικών ασθενειών Η κυτταρική θεραπεία έχει επίσης αναδειχθεί ως μια ελκυστική εναλλακτική λύση για την θεραπεία της ηπατικής νόσου και προσεγγίσεων αναγεννητικής ιατρικής μέσω ορθοτοπικής μεταμόσχευσης ήπατος. Τα WJ-MSCs έχουν επιδείξει την δυνατότητα να διαφοροποιούνται σε κύτταρα ενδοδέρματος συμπεριλαμβανομένων των ηπατοκυττάρων. Τα WJ-MSCs αντιπροσωπεύουν μία πολύ ελκυστική πηγή κυττάρων για τη θεραπεία της νόσου του ήπατος καθώς εκφράζουν διάφορους ηπατικούς δείκτες χαρακτηριστικούς για τα διαδοχικά βήματα της ανάπτυξης του ήπατος. Επιπλέον, in vivo πειράματα έδειξαν ότι μετά από μεταμόσχευση αδιαφοροποίητων WJ-MSCs στo ήπαρ αθυμικών ποντικών (SCID) με μερική ηπατεκτομή, τα μεταμοσχευμένα κύτταρα εξέφρασαν ηπατικούς δείκτες χαρακτηριστικούς για τον άνθρωπο όπως η λευκωματίνη και ο AFP [55]. [39]

40 Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης και μια άλλη μελέτη που προτείνει ένα υποστηρικτικό ρόλο, των αδιαφοροποίητων WJ-MSCs, στη διάσωση ηπατικών λειτουργιών μετά από τραύμα αλλά και την μείωση της ίνωσης in vivo. Αυτή η μελέτη υποστηρίζει ότι, ακόμη και σε απουσία μιας πραγματικής διαδικασίας διαδιαφοροποίησης, τα WJ-MSCs μπορούν να έχουν υποστηρικτική δράση αυξάνοντας τη λειτουργική ανάκτηση του παραλήπτη ήπατος, μέσω της διέγερση της διαφοροποίησης ενδογενών κυττάρων παρεγχύματος και την προώθηση της αποδόμησης του ινώδους πλέγματος [55]. Επιπλέον η ικανότητα διαφοροποίησης των WJ-MSC προς την ηπατική γενεαλογία μπορεί να ενισχυθεί τόσο in vivo όσο και in vitro με την προσθήκη στην καλλιέργεια ηπατογόνων παραγόντων. Κατά την θεραπεία της κίρρωσης του ήπατος, τα WJ-MSCs παρουσιάζουν αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες και δράση έναντι της ίνωσης μέσω ενδογενών παραγόντων που εκκρίνουν όπως οι μεταλλο-πρωτεϊνάσες. Η ικανότητα των WJ-MSCs να διαφοροποιούνται σε ηπατικά κύτταρα ορίζει την ανάγκη για περαιτέρω έρευνα με σκοπό την καλύτερη κατανόηση του τρόπου που τα παραπάνω κύτταρα μπορούν να αναπληρώσουν εκ νέου ή να διασώσουν την ηπατική λειτουργία Θεραπεία Καρδιαγγειακών Νοσημάτων Παράλληλα έχει προταθεί η χρήση των WJ-MSCs και οι θεραπευτικές δυνατότητες τους στον τομέα της καρδιαγγειακής μηχανικής ιστών. Η χειρουργική θεραπεία με την χρήση μη-αυτόλογων βαλβίδων ή σωλήνων έχει συγκεκριμένα μειονεκτήματα. Σε αυτά περιλαμβάνονται οι αποφρακτικές προσεκβολές του ιστού και η ασβεστοποίηση του εμφυτεύματος. Έτσι ο τομέας της καρδιαγγειακής μηχανικής ιστών επικεντρώνεται στην in vitro παραγωγή αυτόλογων, ζωντανών ιστών με τη δυνατότητα για αναγέννηση του καρδιακού μυός. Η γενική ιδέα της χρήσης των WJ-MSCs στον τομέα αυτό έχει επικυρωθεί σε μεγάλες μελέτες σε πειραματικά μοντέλα [56]. Εν συντομία, με την χρήση των WJ-MSCs από άνθρωπο, παρήχθησαν πλήρως αυτόλογες, βιώσιμες, τρίφυλλες καρδιακές βαλβίδες οι οποίες εμφυτεύτηκαν με επιτυχία σε μοντέλα αναπτυσσόμενων προβάτων για έως και 20 εβδομάδες. Αυτές οι βαλβίδες έδειξαν καλή λειτουργική απόδοση, καθώς και δομικά και βιο-μηχανικά [40]

41 χαρακτηριστικά που μοιάζουν έντονα με εκείνα των φυσικών βαλβίδων της καρδιάς [56]. Σε συγκριτικές μελέτες, μεταξύ διαφόρων κυτταρικών πηγών για την καρδιαγγειακή μηχανική ιστών, τα κύτταρα WJ-hMSCs προβάλουν ως μια ελκυστική, άμεσα διαθέσιμη πηγή αυτόλογων κυττάρων, που προσφέρουν πρόσθετα πλεονεκτήματα από την αξιοποίηση των νεανικών κυττάρων και την αποφυγή της επεμβατικής συγκομιδής των άθικτων αγγειακών δομών. Πρόσφατα παρουσιάστηκε μια κατασκευή, τριών διαστάσεων ευθυγραμμισμένων μικροϊνών, ιστού μυοκαρδίου καλλιεργημένου υπό συνθήκες παροδικής αιμάτωσης [57]. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη ενός ενθέματος μυοκαρδιακού ιστού για την χρήση του σε εμφράγματα του μυοκαρδίου ή την επιβράδυνση των βλαβών του ιστού και την βελτίωση της μακροπρόθεσμης λειτουργίας της καρδιάς. Το μικροϊνώδες στρώμα φιλοξένησε τα WJ-MSCs ευθυγραμμισμένα παράλληλα μεταξύ τους με παρόμοιο τρόπο με αυτόν της κυτταρικής οργάνωσης στο φυσικό μυοκάρδιο. Τα πειραματικά αποτελέσματα κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας έχουν δείξει ότι τα WJ-MSCs έχουν μεγάλες δυνατότητες στον τομέα της μηχανικής των ιστών, στον οποίο μία από τις πιο ελπιδοφόρες κατευθύνσεις είναι η καρδιαγγειακή μηχανική των ιστών. Παρά τις γνώσεις που υπάρχουν σήμερα για τα προηγμένα χαρακτηριστικά των WJ-MSCs και τις πρώτες εκθέσεις επιτυχών προκλινικών και κλινικών εφαρμογών τους, απαιτείται περαιτέρω μελέτη για να καθοριστούν τα όρια των κλινικών εφαρμογών αλλά και για να καθοριστούν ρεαλιστικά κλινικά πρωτόκολλα. Για παράδειγμα, οι αντικαταστάσεις που εφαρμόζονται σήμερα με βάση την μηχανική των ιστών σε ικρίωματα ως επί το πλείστον βασίζονται σε ξένα προς τον οργανισμό υλικά, όπως φυσικά, συνθετικά ή υβριδικά πολυμερή. Αυτό οδηγεί σε ελλιπή ανάπτυξη και αναδιαμόρφωση και φέρει τον κίνδυνο θρομβο-εμβολικών επιπλοκών και λοιμώξεων. Επίσης συχνά προβλήματα που ανακύπτουν, σχετικά με αυτά τα συστήματα, είναι η συστημική τοξικότητα, ο περιορισμός του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της λειτουργίας των κυττάρων αλλά και δυσκολίες ενσωμάτωσης των κυττάρων και των ιστών. Έτσι είναι απαραίτητη η ανάπτυξη συμβατών βιοϋλικών που δεν θα περιορίζουν τις αναγεννητικές και ανοσορυθμιστικές δυνατοτήτες των WJ-hMSCs. [41]

42 1.7.4 Διαφοροποίηση των WJ-MSCs προς Καρδιακό ιστό. Τα αδιαφοροποίητα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSC) τείνουν να διαφοροποιούνται αυθόρμητα προς πολλαπλές κατευθύνσεις όταν μεταμοσχεύονται in vivo. H αναπτυξιακή μοίρα των μεταμοσχευμένων μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων μυελού των οστών (ΒΜ-MSCs), μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου, δεν καθορίζεται από τον περιβάλλοντα ιστό. Είναι πιθανό λοιπόν, ότι μια ομάδα μη δεσμευμένων αναπτυξιακά βλαστικών κυττάρων, να υφίστανται λανθασμένη διαφοροποίηση εντός της περιοχής εμφράγματος του μυοκάρδιο με δυνητικά απειλητικές συνέπειες για τη ζωή του ασθενούς. Ως εκ τούτου, έχει υποτεθεί ότι απαιτείται μια ορισμένη καρδιακή διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων πριν την μεταμόσχευση η οποία θα οδηγήσει σε ενισχυμένη αναγέννηση του μυοκαρδίου και ανάκτηση της καρδιακής λειτουργίας [58]. Εικόνα 13. Μορφολογική ανάλυση βλαστικών κυττάρων του ομφαλίου λώρου (WJ-MSCs). (Α) μη διαφοροποιημένων και (Β) διαφοροποιημένων βλαστικών κυττάρων προς καρδιακά κύτταρα (cwj- MSCs) με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Τα WJ-MSCs εμφανίζουν την χαρακτηριστική τους μορφολογία των ινοβλαστών [58]. Σε αυτό το πλαίσιο, η εκκίνηση της διαφοροποίησης, των βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα μυοκαρδίου, επιτυγχάνεται με την καλλιέργεια τους υπό καθορισμένες συνθήκες. Τα WJ-MSCs μπορούν να διαφοροποιηθούν προς κύτταρα μυοκαρδίου με χορήγηση 5-αζακυτιδίνης, για 3 εβδομάδες, οπότε και εκφράζουν χαρακτηριστικούς δείκτες κυττάρων μυοκαρδίου όπως η καρδιακή τροπονίνη I, η συνδετίνη 43 και η δεσμίνη, ενώ παράλληλα παρουσιάζουν οκυτταρική μορφολογία μυοκαρδίου [35]. Επιπλέον για την επαγωγή της διαφοροποίηση διαφόρων τύπων [42]

43 βλαστικών κυττάρων προς μυοκύτταρα χρησιμοποιούνται παράγοντες όπως η οξυτοκίνη, τα εμβρυοειδή συσσωματώματα και διάφοροι αυξητικοί παράγοντες, όπως ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β1(τορ-β1), ο PDGF και ο βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (bfgf). Μια τέτοια μελέτη έδειξε ότι η καρδιακή διαφοροποίηση των WJ-MSCs πραγματοποιήθηκε με κατεργασία των κυττάρων με 5-αζακυτιδίνη, οξυτοκίνη, καθώς επίσης και με σχηματισμό «εμβρυοειδών σωματίων" [59]. Οι ανοσοκυτταροχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι ο πιο αποτελεσματικός τρόπος διαφοροποίησης των WJ-MSCs σε μυοκαρδιοκύτταρα, είναι η κατεργασία τους με οξυτοκίνη. Σε μια πολύ πρόσφατη μελέτη πραγματοποιήθηκε σύγκριση των μακροπρόθεσμων θεραπευτικών αποτελεσμάτων της χορήγησης MSC από δύο διαφορετικές πηγές (μυελού των οστών ενηλίκων ή γέλης του Wharton ομφαλίου λώρου) μετά την πρόκληση εμφράγματος του μυοκαρδίου σε ένα μοντέλο αρουραίων [59]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα MSCs έχουν μια σημαντική και ισχυρή ευεργετική επίδραση, που διαρκεί περισσότερο από 25 εβδομάδες, όταν χορηγηθούν ώρες μετά την πρόκληση εμφράγματος Αναγέννηση χόνδρου Ο χόνδρος είναι ένας εξειδικευμένος συνδετικός ιστός που έχει χαμηλή ικανότητα in vivo αναγέννησης και αυτοεπιδιόρθωσης. Οι κύριες αιτίες βλάβης ή εκφυλισμού του χόνδρου είναι κάποιος τραυματισμός ή αυτοάνοσες διεργασίες. Νέες ελπίδες για την αντιμετώπιση τους έρχονται από τον τομέα της μηχανικής των ιστών με τη χρήση των βλαστικών κυττάρων που έχουν υποστεί διαφοροποίηση προς κύτταρα χόνδρου. Για το σκοπό αυτό υπάρχουν τόσο in vitro όσο και in vivo δεδομένα σχετικά με τη χρήση των περιγεννητικών βλαστικών κυττάρων, ιδίως των WJ-MSCs, για την χρήση τους στην αναγεννητική ιατρική και την αποκατάσταση του χόνδρου [60]. Τα WJ-MSCs είναι σε θέση να διαφοροποιηθούν σε χονδροκύτταρα εάν καλλιεργειθούν σε ειδικό καλλιεργητικό μέσο. Η ανάλυση του δυναμικού διαφοροποίησης των WJ-MSCs προς χόνδρο, έδειξε ότι έχουν το δυναμικό πολυδύναμων κυττάρων και η ικανότητά τους αυτή θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για μελλοντική ανάπτυξη κυτταρικής θεραπείας για αρθρικές νόσους. Ο Wang και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι η πυκνότητα επίστρωσης των WJ-MSCs σε ικριώματα πολυ-γλυκολικού οξέος (PGA), υπό την παρουσία χονδρο-γεννητικού [43]

44 καλλιεργητικού μέσου, παρουσίασε σημαντική επιδράση στο δυναμικό διαφοροποίησης τους προς ιστό χόνδρου [60]. Υψηλότερες πυκνότητες επίστρωσης προωθούν καλύτερα την βιοσύνθεση και την μηχανική ακεραιότητα. Έτσι συνιστάται μια πυκνότητα επίστρωσης τουλάχιστον είκοσι πέντε (25*10 3 ) εκατομμυρίων κυττάρων / ml για την μηχανική ιστών και την διαφοροποίηση σε ιστό χόνδρου με χρήση των κυττάρων WJ-MSCs. Επίσης η διαφοροποίηση προς χόνδρο των WJ- MSCs μπορεί να επιτευχθεί με καλλιέργεια επάνω σε νανοινώδη υποστρώματα και σε περιβάλλον δύο διαφορετικών καλλιεργητικών μέσων. Με την μέθοδο αυτή, τα WJ-MSCs μπορούν να αυξήσουν την παραγωγή υαλουρονικού οξέος και GAGs, καθώς και την έκφραση βασικών γονιδίων όπως το SOX9, το COMP, το κολλαγόνο τύπου II και το FMOD. Είναι γεγονός ότι φυσιολογικά ο ιστός αποτελείται και από κύτταρα χόνδρου και κύτταρα οστών με αποτέλεσμα να είναι κρίσιμη η επιλογή κυτταρικών πηγών αλλά και η διασύνδεση των περιοχών του ιστού μεταξύ χόνδρου και οστού, ώστε να είναι επιτυχής η αναγέννηση του ιστού με οστεοχονδρική σύνθεση. Πρόσφατα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα WJ-MSCs μπορούν να αποτελέσουν μια κατάλληλη πηγή κυττάρων για την αναγέννηση οστεοχονδρικού ιστού ιδιαίτερα με την χρήση στρατηγικών εγκλωβισμού των κυττάρων μεταξύ δύο στρωμάτων από ικριώματα τα οποία διευκολύνουν την ενσωμάτωση και διασύνδεση των ιστών [60]. Εν κατακλείδι τόσο το δυναμικό διαφοροποίησης τους όσο και οι ανοσοτροποποιητικές τους ιδιότητες, αλλά και το γεγονός ότι έχει αποδειχθεί η επιτυχής διαφοροποίηση τους σε κύτταρα που μοιάζουν με ώριμα χονδροκύτταρα, κάνουν τα WJ-MSCs μια ελκυστική πηγή κυττάρων για τη χρήση τους σε προσπάθειες αντιμετώπισης της οστεοαρθρίτιδας, της ρευματοειδούς αρθρίτιδας και άλλων νόσων. [44]

45 1.7.6 Αναγέννηση περιφερικών νευρώνων Κατά καιρούς έχουν ακολουθηθεί πολλές θεραπευτικές προσεγγίσεις στην προσπάθεια αποκατάστασης της νευρικής λειτουργίας μετά από τραυματισμό του περιφερικού νευρικού συστήματος (PNS). Οι πρόσφατες μελέτες μηχανικής ιστών έχουν επικεντρωθεί στην ανάπτυξη βιο-τεχνητών νευρικών αγωγών για την καθοδήγηση της αναγέννησης των νευραξόνων. Σε αυτό το σύστημα, ο βιοτεχνητός αγωγός νεύρου τοποθετείται μεταξύ των άκρων του νεύρου ώστε να περικλείει το παρεμβαλλόμενο κενό, επιτρέποντας έτσι στους άξονες να αναγεννηθούν μέσα στο απομακρυσμένο τμήμα του νεύρου. Εικόνα 14. Κύτταρα Schwann μπορούν να προκύψουν μέσω διαφοροποίησης από μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα από τον μυελό των οστών, τον ομφάλιο λώρο και τον λιπώδη ιστό [61]. Ωστόσο, οι τεχνητοί αυτοί αγωγοί έχουν περιορισμένες δυνατότητες όταν το κενό είναι μεγάλο. Τα κύτταρα Schwann, που είναι τα πιο σημαντικά συστατικά της περιφερικής γλοίας που σχηματίζει την μυελίνη, αποτελούν ένα ευνοϊκό μικροπεριβάλλον για την επισκευή των κατεστραμμένων νευρικών ινών στο περιφερικό νευρικό σύστημα (PNS). Επειδή η απομόνωση και η καλλιέργεια των κυττάρων Schwann από άλλες πηγές περιφερικών νευρώνων έχουν περιορισμούς, πολλοί ερευνητές έχουν επικεντρωθεί στα MSCs από διάφορους τύπους ιστών. Οι [45]

46 Dezawa και οι συνεργάτες του ανέφεραν το 2001 ένα σύστημα επαγωγής της διαφοροποίησης κυττάρων ΒΜ-MSCs προς κύτταρα Schwann [61]. Πρόσφατα, δείχθηκε ότι και τα WJ-MSCs διαφοροποιούνται σε κύτταρα Schwann που μπορούν να υποστηρίξουν την νευρική αναγέννηση και την κατασκευή της μυελίνης [62]. Μετά από μεταμόσχευση κυττάρων Schwan από WJ-MSCs, σε αρουραίο που είχε αφαιρεθεί το ισχιακό νεύρο δείχθηκε ότι αυτά διατηρούν τον διαφοροποιημένο φαινότυπο τους in vivo και συμβάλουν στην αναγέννηση και την λειτουργική αποκατάσταση των νευραξόνων. Μία άλλη ομάδα απέδειξε ότι τα κύτταρα Schwann από WJ-MSCs παράγουν νευροτροφικούς παράγοντες όπως ο NGF και ο BDNF[63]. Όπως φαίνεται (Εικόνα 14), τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι τα τα κύτταρα Schwann από WJ-MSCs αποτελούν μια εναλλακτική λύση που μπορεί να εφαρμοστεί σε πρωτοκολλά κυτταρικής θεραπείας για την αντιμετώπιση βλαβών των νεύρων. [46]

47 2.Τοξικολογία 2.1 Αξιολόγηση Τοξικολογικού Κινδύνου Η διαδικασία της τοξικολογικής εκτίμησης κινδύνου είναι η μεθοδολογία εκείνη με την οποία οι χημικές ουσίες, αξιολογούνται ως προς τις πιθανές επιπτώσεις τους στην υγεία του ανθρώπου [64]. Αποτελείται από πολλά και σαφώς καθορισμένα στάδια που περιλαμβάνουν: τον προσδιορισμό του επιπέδου επικινδυνότητας μιας ουσίας, την εκτίμηση της έκθεσης σε αυτήν αλλά και τον χαρακτηρισμό του κινδύνου μετά την έκθεση [65-67]. Μέχρι σήμερα η βασική μεθοδολογία, για την εκτίμηση των κινδύνων από υφιστάμενες και νέες χημικές ουσίες και την τοξικολογική αξιολόγηση, βασίζεται σε πειράματα στα ζώα. Η χρήση των ζώων ήδη εδώ και αρκετά χρόνια αλλά και σήμερα υφίσταται κριτική, τόσο για ηθικούς, όσο και για επιστημονικούς λόγους. Τα σημαντικότερα επιμέρους στοιχεία της διαδικασίας αξιολόγησης του κίνδυνου για την χρήση μιας χημικής ουσίας είναι: 1) η ταυτοποίηση της επικινδυνότητας κατά την οποία γίνεται ο προσδιορισμός της εγγενούς ικανότητας μιας χημικής ουσίας να προκαλέσει δυσμενείς επιπτώσεις, και η ποσοτική περιγραφή της φύσης αυτών των επιπτώσεων. Η διαδικασία ταυτοποίησης της επικινδυνότητας περιλαμβάνει δοκιμές τοξικότητας και αυστηρή συγκέντρωση των διαθέσιμων αποτελεσμάτων τόσο επιδημιολογικών και τοξικολογικών, όσο και μελετών δομής και δραστικότητας. Επίσης σε αυτό το στάδιο γίνεται και χρήση ζωικών μοντέλων. 2) η εκτίμηση της δόσο-απόκρισης ή σε γενικές γραμμές ο χαρακτηρισμός του κινδύνου όπου είναι η ημιποσοτική αξιολόγηση της φύσης των δυσμενών επιπτώσεων μετά από έκθεση σε μία χημική ουσία, και όπου είναι δυνατόν να γίνει η εκτίμηση της δόσο-απόκρισης, 3) η εκτίμηση της έκθεσης όπου είναι η ημιποσοτική αξιολόγηση της πιθανότητας έκθεσης του ανθρώπου, ή άλλου οργανισμού, ή συστήματος ή υποπληθυσμού σε μια χημική ουσία [64] και 4) ο χαρακτηρισμός του κινδύνου όπου είναι η ημι-ποσοτική εκτίμηση των πιθανοτήτων για την εμφάνιση δυσμενών επιπτώσεων αλλά και την σοβαρότητα και την διάρκεια τους σε ένα δεδομένο πληθυσμό, υπό προκαθορισμένες συνθήκες έκθεσης. [47]

48 2.2 Μέθοδοι για τις Δοκιμασίες Τοξικότητας Ο έλεγχος τοξικότητας είναι το ένα από τα δύο βασικά συστατικά στοιχεία της διαδικασίας αξιολόγησης του κινδύνου με τα οποία ελέγχονται οι νέες ουσίες για τις πιθανές επιπτώσεις τους στην υγεία του ανθρώπου. Το δεύτερο συστατικό είναι η εκτίμηση της έκθεσης στην ουσία. Οι δοκιμασίες τοξικότητας είναι απαραίτητες για τις νέες χημικές ουσίες που εισάγονται στην αγορά, για τις παλαιότερες χημικές ουσίες αλλά και για τα νέα και παλαιότερα μείγματα τους. Η δοκιμασία για την εύρεση του LD 50 είναι ένα κλασικό παράδειγμα μιας δοκιμής έκθεσης και αντίδρασης. Είναι ένα μέτρο για τον προσδιορισμό της οξείας θνησιμότητας. Τα δεδομένα για την τοξικότητα είναι δυνατό να ληφθούν από διάφορες πηγές, συμπεριλαμβανομένων των τοξικολογικών μελετών, των επιδημιολογικών μελετών, των μελετών ποσοτικών σχέσεων δομής-δραστικότητας (QSAR) και των μελετών τοξικο-κινητικής με βάση την φυσιολογία (PBTK). Οι βασικοί στόχοι των δοκιμών τοξικότητας είναι: 1) ο προσδιορισμός των πιθανών ανεπιθύμητων ενεργειών μιας συγκεκριμένης χημικής ουσίας και 2) η παροχή ικανοποιητικών δεδομένων για την εκτίμηση της ποσοτικής σχέσης έκθεσης και απόκρισης στο ζωικό μοντέλο που εξετάζεται [64]. Κατά το παρελθόν αυτοί οι στόχοι γίνονταν εφικτοί μέσω της χρήσης μελετών σε ζώα καθώς όταν ξεκίνησαν οι δοκιμές τοξικότητας κατά το 1920 και 1930, η χρήση ολόκληρων ζώων ήταν η πιο λογική επιλογή. Οι διαθέσιμες εναλλακτικές λύσεις, όπως οι δοκιμές σε εθελοντές ανθρώπους, θεωρείτο και συνεχίζει να θεωρείται μη ηθική. 2.3 Μέθοδοι δοκιμών σε ζώα Ο σχεδιασμός, η διεξαγωγή και η πληρότητα των εκθέσεων των αποτελεσμάτων για πειράματα τοξικολογικών μελετών σε είδη θηλαστικών παίζουν κρίσιμο ρόλο για την εγκυρότητα και την συνάφεια των αποτελεσμάτων. Ως πειραματικά ζωικά μοντέλα χρησιμοποιούνται συχνά, ορισμένα είδη θηλαστικών και κυρίως τα τρωκτικά [68]. Οι μελέτες σε ζώα έχουν τρεις κύριους στόχους: Τον προσδιορισμό των βασικών τοξικών επιπτώσεων των εν λόγω ουσιών με την εξέταση ενός αριθμού πιθανών ιστών στόχων. Τον προσδιορισμό των τοξικών δόσεων είτε με μία (1) είτε με επανειλημμένες εκθέσεις. [48]

49 Τον καθορισμό των επιπέδων πρόσληψης που δεν οδηγούν σε δυσμενείς επιπτώσεις (NOAEL). Εικόνα 15. Δοκιμασίες τοξικότητας σε ζώα [68]. Οι μελέτες σε ζώα οδηγούν και σε παρατηρήσεις των κλινικών, των ιστοπαθολογικών ή / και των λειτουργικών αλλαγών που προκαλούνται στα ζώα από την δεδομένη δόση της υπό μελέτη χημικής ουσίας. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων τεσσάρων δεκαετιών έχουν διατυπωθεί από διάφορους διεθνείς οργανισμούς, όπως για παράδειγμα ο ΟΟΣΑ (οργανισμός για την οικονομική συνεργασία και την ανάπτυξη), αυστηρές κατευθυντήριες γραμμές για τις δοκιμές σε ζώα και την αξιολόγηση των τοξικολογικών κινδύνων που έχουν οδηγήσει σε μια σειρά καλά καθορισμένων, σταθερών και τυπικών διαδικασιών [69]. Τα κυριότερα τελικά σημεία για την τοξικολογία είναι: η οξεία τοξικότητα, ο ερεθισμός του δέρματος, ο ερεθισμός των ματιών, η διάβρωση, η ευαισθητοποίηση του δέρματος, η ευαισθητοποίηση του αναπνευστικού συστήματος, η χρόνια τοξικότητα, η μεταλλαξιγένεση, η τερατογένεση, η εμβρυοτοξικότητα και η καρκινογένεση. Για πολλές δεκαετίες, η χημική ταξινόμηση της οξείας τοξικότητας, έκανε χρήση της πολύ αμφιλεγόμενη δοκιμή του LD 50 [70]. Η δοκιμασία βασίζεται στην χορήγηση δόσεων σε διάφορες συγκεντρώσεις, της υπό έλεγχο χημικής ουσίας σε ομάδες ζώων. Οι δόσεις αναμένεται να προκαλέσουν το θάνατο σε τουλάχιστον ένα κλάσμα των ζώων στα οποία χορηγήθηκε. Συνήθως χρησιμοποιούνται, τουλάχιστον 5 [49]

50 διαφορετικά ζώα για τη δοκιμασία. Το αποτελέσματα της δοκιμασίας αυτής, επιτρέπει τον υπολογισμό της τιμής LD 50 η οποία αντικατοπτρίζει την δόση η οποία θα σκοτώσει το 50% των ζώων εντός 14 ημερών μετά από μία μόνο έκθεση. Το 2002, η μέθοδος LD 50 για έλεγχο της από του στόματος τοξικότητας καταργήθηκε από τις οδηγίες που δίνει ο ΟΟΣΑ και αντικαταστάθηκε από πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν πολύ λιγότερα ζώα όπως οι οδηγίες TG 420, TG 423, και TG 425[69]. 2.4 Κριτική για τη χρήση των μεθόδων που χρησιμοποιούν τα ζώα Για αρκετά χρόνια έως τώρα, υποστηρίζεται ότι η συλλογή δεδομένων από δοκιμασίες σε ζώα πρέπει να σταματήσει. Η επιχειρηματολογία περιλαμβάνει αιτιάσεις για τον πόνο που προκαλείται στα ζώα κατά την διάρκεια των δοκιμασιών, την αναξιοπιστία των δεδομένων που λαμβάνονται με τις δοκιμασίες σε ζώα σε σχέση με την αναγωγή τους σε δεδομένα για τον άνθρωπο, τον τρόπο που τα δεδομένα αυτά μπορούν να εμποδίσουν την λήψη ρυθμιστικών αποφάσεων και το κόστος και τις καθυστερήσεις που προκαλούνται από την αναζήτηση στοιχείων για τα ζώα. Έχει υπολογιστεί ότι τουλάχιστον 12,8 εκατομμύρια ζώα θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο ουσιών[71]. Ο αριθμός ανέρχεται σε πάνω από 50 εκατομμύρια, όταν παράγονται απόγονοι τους, κατά τη διάρκεια των αναπαραγωγικών μελετών. Συνοπτικά, οι κύριοι λόγοι για τις ανακριβείς προβλέψεις των μελετών τοξικότητας σε ζώα είναι: 1. Διαφορές μεταξύ των ειδών ζώων. Παρατηρούνται παραλλαγές στην ευαισθησία έναντι τοξικών χημικών ουσιών, στο βαθμό και τις οδούς απορρόφησης κατανομής και αποβολής από τον κάθε οργανισμό. 2. Τοποθεσία έκθεσης στην τοξική χημική ουσία (αυτί, δέρμα, ραχιαία έκθεση) και τρόπος χορήγησης των ενώσεων. 3. Δοσολογία: Παρουσιάζονται προβλήματα με τη χρήση μικρών ζώων και μεγάλων δόσεων καθώς οι περισσότερες δοκιμασίες πραγματοποιούνται σε τρωκτικά τα οποία είναι μικρόσωμα και βραχύβια ενώ τα αποτελέσματα θα εφαρμοστούν σε μεγαλόσωμα και μακρόβια ζώα (όπως ο άνθρωπος). 4. Ανεπάρκεια να εξετάσουν το ενδεχόμενο απουσίας προϋπάρχουσας παθολογικής κατάστασης. Τα πειραματόζωα, τα οποία είναι συνήθως [50]

51 καθαρά, χωρίς παθογόνους μικροοργανισμούς και γενετικά ομοιογενή δεν αντιπροσωπεύουν τα κανονικά ζώα του είδους τους ή τους ανθρώπινους πληθυσμούς. 5. Προβολή των in vivo αποτελεσμάτων στον άνθρωπο. 6. Χαμηλή επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων. 7. Πιο δαπανηρή και χρονοβόρα: Η νέα πολιτική της ΕΕ (REACH) για τον έλεγχο των χημικών, προβλέπει ότι θα απαιτηθούν από 5 έως 10 δισεκατομμύρια τα επόμενα χρόνια για τον έλεγχο ουσιών ενώ θα χρειαστούν πάνω από 5 χρόνια για τον έλεγχο μόνο της καρκινογονικότητας των ουσιών αυτών[71]. 8. Δεοντολογικά ζητήματα: οι περισσότερες δοκιμές τοξικότητας προκαλούν τον θάνατο, το στρες αλλά και σοβαρές ασθένειες σε πολλά ζώα. 9. Δυσκολία αξιολόγησης των επιπτώσεων έκθεσης σε μείγματα χημικών ουσιών. 10. Προβλήματα με τα καθορισμένα τοξικολογικά τελικά σημεία (endpoints). 11. Προβλήματα με τις πολλαπλές χημικές μορφές στις οποίες υπάρχουν πολλές χημικές ουσίες (π.χ. αμίαντος). Οι συνήθεις δοκιμές σε ζώα διεξάγονται με μία μόνο μορφή της χημικής ουσίας και τα αποτελέσματα είναι συχνά εξαιρετικά δύσκολο να αναχθούν και να ερμηνευτούν. Οι εξελίξεις στις βιοϊατρικές επιστήμες και η πρόοδος στην καλλιέργεια κυττάρων και ιστών αλλά και της μοριακής βιολογίας δίνει τεράστιες δυνατότητες για την ανάπτυξη μιας μεγάλης ποικιλίας νέων τεχνικών. [51]

52 2.5 Μέθοδοι δοκιμασιών τοξικότητας χωρίς τη χρήση ζώων Το εναλλακτικό κίνημα των 3Rs Η εμφάνιση του εναλλακτικού κινήματος θεωρείται ότι ξεκίνησε το 1959 με το έργο δύο Βρετανών ερευνητών, των W.M.S. Russell και R.L. Burch οι οποίοι εισήγαγαν την έννοια των τριών R (Reduction, Refinement and Replacement ή Μείωση, Βελτίωση και Αντικατάσταση) στο κλασικό τους έργο, «Οι Αρχές της πειραματικής τεχνικής του ανθρώπου» [72]. Εικόνα 16. Το εναλλακτικό κίνημα των 3Rs [72]. Οι ηθικές αρχές των τριών R και η εφαρμογή τους στις τοξικολογικές έρευνες συνεχίζει να επηρεάζει την έρευνα και την ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών και στρατηγικών. Οι εξελίξεις αυτές μπορούν να συνοψιστούν ως την ανάπτυξη δοκιμασιών που 1) μειώνουν τον αριθμό των ζώων που απαιτούνται για ένα πείραμα, 2) βελτιώνουν τις υπάρχουσες δοκιμασίες με την ελαχιστοποίηση του πόνου και του στρες των ζώων με 3) απώτερο στόχο την πλήρη αντικατάσταση των υφιστάμενων ζωικών μοντέλων με μη ζωικές εναλλακτικές μεθόδους [72] In vitro τοξικότητα Η ανάπτυξη και επέκταση μη-γενοτοξικών, in vitro, μελετών τοξικότητας ξεκίνησε και πάλι από τα μέσα της δεκαετίας του Σε γενικές γραμμές, η in vitro τοξικότητα είναι η χρήση δοκιμασιών που δεν χρησιμοποιούν σπονδυλωτά ως συστήματα μοντελοποίησης. Η in vitro τοξικότητα αποτελεί την μελέτη των τοξικών επιδράσεων, όπως παρατηρούνται σε ένα σύστημα που βρίσκεται έξω από το σώμα [52]

53 ενός ολόκληρου οργανισμού. Οι δοκιμασίες αυτές θα μπορούσαν να περιλαμβάνουν οποιονδήποτε από τους κατώτερους οργανισμούς (έλμυνθες και βακτήρια) έως καλλιεργημένα κύτταρα και υπολογιστικά μοντέλα. Ο όρος in vitro αναφέρεται κυρίως στο χειρισμό των κυττάρων και των ιστών έξω από το σώμα και κάτω από συνθήκες που να υποστηρίζουν την ανάπτυξή, τη διαφοροποίηση και τη σταθερότητα τους[73]. Η in vitro κυτταρο-τοξικολογία ή κυτταροτοξικότητα αναφέρεται στη χρήση τεχνικών κυτταρικής καλλιέργειας στις έρευνες τοξικολογίας. Τα μοντέλα κυττάρων μπορεί να είναι είτε καλλιέργειες πρωτογενών κυττάρων ή αθανατοποιημένων και μετασχηματισμένων κυτταρικών σειρών ή βλαστικών κυττάρων. Είναι απαραίτητο να υπάρχουν βασικές γνώσεις για την τοξικολογία των χημικών ουσιών που μελετούνται όπως η απορρόφηση, η κατανομή, ο μεταβολισμός και η απέκκριση τους. Τα πλεονεκτήματα από τη χρήση των in vitro μελέτών είναι: Η δυνατότητα χρήσης κυττάρων και ιστών του ανθρώπου, αποφεύγοντας έτσι τις διαφορές ανάμεσα στα είδη. Η μεγαλύτερη απλότητα σε σχέση με τα ζωικά μοντέλα γεγονός που καθιστά ευκολότερη την λήψη αποτελεσμάτων. Η μεγαλύτερη ευκολία στην εφαρμογή σύγχρονων, βιοχημικών, κυτταρικών και μοριακών τεχνικών σε μηχανιστικές μελέτες. Η δυνατότητα μελέτης των συστατικών των πιθανών οργάνων-στόχων αλλά στοχευόμενων συστημάτων είτε ξεχωριστά είτε σε συνδυασμό. Η δυνατότητα εκπόνησης μελετών για μείγματα χημικών ουσιών. Οι εφαρμογές των in vitro μεθόδων τοξικολογίας αντιμετωπίζουν και ορισμένες δυσκολίες-μειονεκτήματα όπως: Η κυτταρική καλλιέργεια είναι ένα απλοποιημένο σύστημα και δεν μπορεί να αντικατοπτρίσει την πολυπλοκότητα της λειτουργίας ενός ολόκληρου οργανισμού. Τα in vitro συστήματα δεν διαθέτουν κρίσιμες λειτουργίες του οργανισμού (π.χ. ορμόνες, ανοσοποιητικό σύστημα, νευρικό σύστημα) με αποτέλεσμα να μην μπορούν να αναπαράγουν τη βιοδυναμική ολόκληρου του ανθρώπου. Δυσκολία στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων, καθώς και στην προβολή των αποτελεσμάτων σε πιθανές επιδράσεις στον άνθρωπο η οποία απαιτεί [53]

54 γνώση της φαρμακοκινητικής της εκάστοτε χημικής ένωσης. Οι περισσότερες in vitro δοκιμασίες, μέχρι σήμερα, περιορίζονται σε δοκιμές οξείας τοξικότητας και όχι στα βραχυπρόθεσμα ή μακροπρόθεσμα αποτελέσματα της τοξικότητας με επαναλαμβανόμενες δόσεις. Πολλά τεχνικά προβλήματα που περιλαμβάνουν: o Το είδος των κυττάρων που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της in vitro κυτταροτοξικότητας. o Τη διαλυτότητα των χημικών ουσιών που μελετούνται. o Την περίοδο έκθεσης, που μπορεί να μην είναι πάντα επαρκής Τελικά σημεία της in vitro τοξικότητας (endpoints) Η in vitro κυτταροτοξικότητα εξαρτάται από τις παραμέτρους και τις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για να καθοριστεί, σε ένα δεδομένο σύστημα δοκιμασίας. Τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά τελικά σημεία έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της κυτταροτοξικότητας που μετρούν διαφορετικές βιολογικές παραμέτρους. Αυτά περιλαμβάνουν: 1. Τον κυτταρικό θάνατο: Αυτό είναι ένα μη-ειδικό τελικό σημείο που δεν δίνει την δυνατότητα για την διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών ή την αντιστρεψιμότητα του κυτταρικού θανάτου. Οι διάφορες χημικές ουσίες σκοτώνουν τα κύτταρα είτε με άμεση βλάβη των δομικών συστατικών του κυττάρου ή με έμμεση παρεμβολή στην κανονική φυσιολογία και το μεταβολισμό του κυττάρου. 2. Την κυτταρική βιωσιμότητα: Αυτό είναι ένα τελικό σημείο μέτρησης των ζωντανών κυττάρων. 3. Την διαρροή της μεμβράνης: Αυτό είναι ένα τελικό σημείο μέτρηση της κυτταρικής βλάβης μέσω της απελευθέρωσης κυτταρικών συστατικών ή προϊόντων. 4. Την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων: Παραδείγματα είναι ο προσδιορισμός της αποτελεσματικότητας κλωνοποίησης και η μέτρηση της μείωσης της σύνθεσης του DNA. 5. Η μορφολογία των κυττάρων: Οι μορφολογικές αλλαγές όπως οι αλλαγές στο μέγεθος, το σχήμα ή την ακεραιότητα της κυτταρικής [54]

55 μεμβράνης και άλλων κυτταρικών συστατικών, συνδέονται με την τοξικότητα [74]. 6. Η κυτταρική λειτουργία: Αυτό είναι ένα τελικό σημείο που χρησιμοποιείται για την μέτρηση της θερμοδυναμικής και μεταβολικής λειτουργίας. Η τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της κυτταροτοξικότητας διότι είναι η κύρια πηγή ενέργειας σε κυτταρικό επίπεδο [74] όπως και η αναστολή των μεταβολικών διεργασιών, η εξάντληση ορισμένων συν-παραγόντων (π.χ. ΑΤΡ) και η μείωση της μιτοχονδριακής λειτουργίας (π.χ. ΜΤΤ, MTS και ΧΤΤ που αποτελούν δοκιμασίες άλατος τετραζολίου). 7. Η κυτταρική προσκόλληση: Η προσκόλληση στην επιφάνεια της καλλιέργειας, η αποκόλληση από την επιφάνεια καλλιέργειας, και η προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου Μηχανισμοί κυτταρικής τοξικότητας Υπάρχουν τρεις τύποι μηχανισμών τοξικότητας η βασική κυτταροτοξικότητα, η οργανοειδική κυτταροτοξικότητα και η τοξικότητα των οργανιδίων [74]. Βασική κυτταροτοξικότητα Εάν μια ένωση έχει οξεία τοξικότητα αναμένεται ότι, στις περισσότερες περιπτώσεις, αυτό θα εμφανιστεί μέσω των δυσλειτουργιών που θα προκαλέσει στις εγγενείς λειτουργίες των κυττάρων. Ο όρος «Βασική κυτταροτοξικότητα» εισήχθη από τον Ekwal και τους συνεργάτες του [75]. Η βασική κυτταροτοξικότητα βασίζεται στην παραδοχή ότι η τοξική δράση των χημικών ουσιών θα προκαλέσουν βλάβες στις βασικές λειτουργίες των κυττάρων, η οποίες με τη σειρά τους θα επηρεάσουν και πιο εξειδικευμένες λειτουργίες του. Η βασική κυτταρική τοξικότητα ορίζεται ως «οι δυσμενείς επιπτώσεις στα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των κυττάρων που είναι απαραίτητα για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό τους. Η βασική κυτταρική τοξικότητα μπορεί να διερευνηθεί μόνο με την χρήση αδιαφοροποίητων κυττάρων ενώ οι επιδράσεις της περιλαμβάνουν την ακεραιότητα των μεμβρανών και του κυτταροσκελετού, τον κυτταρικό μεταβολισμό (π.χ. ως συνάρτηση της μιτοχονδριακής δραστηριότητας), την σύνθεση του DNA και των [55]

56 πρωτεϊνών, την σύνθεση, την αποικοδόμηση ή την απελευθέρωση κυτταρικών συστατικών ή προϊόντων, την ρύθμιση των ιόντων, την κυτταρική διαίρεση αλλά και άλλες κυτταρικές διεργασίες όπως αυτές των ριβοσωμάτων και των λυσοσωμάτων. Με βάση τα παραπάνω, οι in vitro δοκιμές μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μέθοδοι για την σάρωση πολλών ουσιών και ως πιθανή μέθοδος για την αντικατάσταση των in vivo δοκιμών τοξικότητας, και συγκεκριμένα της οξείας θανατηφόρου τοξικότητας (acute lethal toxicity) [67]. H in vitro τοξικότητα δεν είναι αποτελεσματική για τις χημικές ουσίες οι οποίες απαιτούν βιομετατροπή[6]. Για να ξεπεραστεί το εμπόδιο αυτό χρησιμοποιούνται καλλιέργειες πρωτογενών κυττάρων των οργάνων ενδιαφέροντος, τα οποία διατηρούν ένα υψηλό επίπεδο ενζυμικής δραστηριότητας, ή γίνεται χρήση του μοντέλου PBPK σε συνδυασμό με πληροφορίες σχετικά με την βιο-κινητική των χημικών ουσιών. Από την άλλη πλευρά η οργανοειδική τοξικότητα είναι επί της ουσίας βασική κυτταροτοξικότητα που κατανέμεται στα όργανα στόχους. Η μελέτη της οργανοειδικής κυτταροτοξικότητας απαιτεί καλλιέργειες πρωτογενών, καλά διαφοροποιημένων κυττάρων από διαφορετικά όργανα. Τέλος η τοξικότητα των οργανιδίων θα μπορούσε να μελετηθεί έμμεσα σε κυτταρικές καλλιέργειες με εξέταση των προϊόντων του μεταβολισμού των κυττάρων. 2.6 Επικύρωση των in vitro δοκιμασιών και κανονιστικές ρυθμίσεις. Για την επικύρωση των νέων in vitro δοκιμασιών είναι απαραίτητο να αποδεικνύεται η συνάφεια, η αξιοπιστία και η ικανότητα πρόβλεψης της νέας μεθοδολογίας, προτού κερδίσει την αποδοχή και αντικαταστήσει τις παραδοσιακές in vivo μεθόδους σε [76]. Προκειμένου να εκτιμηθεί με ακρίβεια η ειδικότητα και η ευαισθησία μιας νέας δοκιμασίας, είναι απαραίτητο να εξεταστεί ένας μεγάλος αριθμός ενώσεων με διαφορετικούς μηχανισμούς μέσω αρκετών διαφορετικών in vitro δοκιμών με διαφορετικά τελικά σημεία. Τα δύο βασικά σημεία που πρέπει να εξεταστούν σε μια διαδικασία επικύρωσης είναι η επαναληψημότητα και η ικανότητα πρόβλεψης της μεθόδου [76]. Αρκετοί οργανισμοί σε όλο τον κόσμο έχουν αρχίσει την μορφοποίηση και την επικύρωση in vitro συστημάτων τοξικότητας και διανέμονται σε τρεις ηπείρους: [56]

57 ΗΠΑ: CAAT: Ίδρυμα John Hopkins για Εναλλακτικές έναντι των δοκιμών σε ζώα (Altweb: ICCVAM: η κυβέρνηση των ΗΠΑ δημιούργησε την Διυπηρεσιακή Συντονιστική Επιτροπή για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων, 1994 [77]. NICEATM: Το Εθνικό Διυπηρεσιακό Πρόγραμμα Τοξικολογίας για την Αξιολόγηση Εναλλακτικών τοξικολογικών Μεθόδων ιδρύθηκε το 1998, για να παρέχει στήριξη στο ICCVAM. Ευρώπη: FRAME: Το ταμείο για την αντικατάσταση των ζώων σε ιατρικά πειράματα ιδρύθηκε το MEIC: Κέντρο για την Αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητα in vitro που οργάνωσε η Σκανδιναβική Κοινότητα Κυτταρικής Τοξικολογίας το ECVAM: Ευρωπαϊκό Κέντρο για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων, ΖΕΒΕΤ: Κέντρο για την τεκμηρίωση και την αξιολόγηση εναλλακτικών μεθόδων στα πειράματα σε ζώα ιδρύθηκε στη Γερμανία, το Ασία: JSAAE: Ιαπωνική κοινότητα για την εύρεση εναλλακτικών λύσεων στα πειράματα σε ζώα που ιδρύθηκε το Αυστραλία: ANZCCART: Συμβούλιο της Αυστραλίας και της Νέας Ζηλανδίας για τη φροντίδα των ζώων στην Έρευνα και την Διδασκαλία. Το συμβούλιο ιδρύθηκε το 1987[77]. [57]

58 2.6.1 Η μελέτες του ICCVAM Η ICCVAM (Διυπηρεσιακή Συντονιστική Επιτροπή για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων) έχει αναπτύξει μια αυστηρή, αντικειμενική και έγκριτη μεθοδολογία για τον διερεύνηση της καταλληλότητας νέων δοκιμασιών τοξικότητας ως εναλλακτικές λύσεις για τις ήδη υπάρχουσες. Η διαδικασία επισκόπησης γίνεται μέσω της υπηρεσίας NICEATM. Ο ICCVAM σε συνεργασία με τον NICETAM έχουν ήδη επικυρώσει την Δοκιμασία λεμφαδένων σε ποντικούς (Murine Lymph Node Assay-LLNA) που χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της αλλεργικής δερματίτιδας που προκαλείται μετά από επαφή με χημικές ουσίες. Η μέθοδος αυτή έγινε αργότερα αποδεκτή ως πλήρως επικυρωμένη μέθοδος από τις χώρες μέλη του ΟΟΣΑ (Οδηγία αξιολόγησης ) [78]. Επίσης μία ακόμη in vitro μέθοδος, CORROSITEX που αφορά στην εκτίμηση της ικανότητας χημικών ουσιών για διάβρωση του δέρματος έγινε αποδεκτή από τους ρυθμιστικούς οργανισμούς τον Μάρτιο του Εικόνα 17. Διυπηρεσιακή Συντονιστική Επιτροπή για την Επικύρωση Εναλλακτικών Μεθόδων (ICCVAM). Το 2006 ο ICCVAM επικύρωσε την χρήση δύο κυτταρικών σειρών ως πρότυπα μοντέλα για την πρόβλεψη της οξείας κυτταροτοξικότητας in vitro, τους ινοβλάστες ποντικού (BALB/c) 3T3 κύτταρα και τα φυσιολογικά κερατινοκύτταρα του ανθρώπου (Normal Human Keratinocytes-NHK) [79]. Για την επικύρωση των παραπάνω κυτταρικών σειρών, που σήμερα θεωρούνται πρότυπες, ακολουθήθηκε ολόκληρη η διαδικασία για την επικύρωση νέων κυτταρικών σειρών όπως περιγράφεται στην Έκθεση Αξιολόγησης Μεθόδων για δοκιμασίες τοξικότητας της [58]

59 ICCVAM (ICCVAM Test Methods Evaluation Report). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, για να εγκριθεί ένας τύπος κυττάρου ως κατάλληλός για τον προσδιορισμό της in vitro κυτταροτοξικότητας θα πρέπει να δοκιμαστούν τουλάχιστον 12 χημικές ουσίες οι οποίες θα καλύπτουν τις 5 κατηγορίες κατάταξης ως προς την επικινδυνότητα, όπως αυτές περιγράφονται από το Παγκοσμίως εναρμονισμένο Σύστημα Ταξινόμησης (Globally Harmonized System of Classification) GHS [80]. Πραγματοποιήθηκε γραμμική συσχέτιση των τιμών IC 50 με τις τιμές LD 50 με γραμμική παλινδρόμηση. Οι τιμές LD 50 ήχθησαν από το Μητρώο Κυτταροτοξικότητας (Registry of Cytotoxicity-RC). Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν δύο νέες εξισώσεις, η RC rat-only millimole και η RC rat-only weight, για την πρόβλεψη των αρχικών δόσεων για πρόκληση θανάτου που οφείλεται σε οξεία από του στόματος τοξικότητας. Για τον προσδιορισμό του ποσοστού επιβίωσης των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Neutral Red Uptake (NRU). Παρόλα αυτά και οι δύο αυτές κυτταρικές σειρές (3T3, NHK) δεν παρουσίασαν ικανοποιητικά αποτελέσματα για την ορθή πρόβλεψη της τοξικότητας. Δημιουργείτε έτσι ή ανάγκη ανάδειξης νέων κυτταρικών τύπων τα αποτελέσματα των όποιων θα πρέπει να είναι τουλάχιστον συγκρίσιμα ή και καλύτερα στο επίπεδο της ακρίβειας και της αξιοπιστίας Μητρώο Κυτταροτοξικότητας (Registry of Cytotoxicity-RC) Το 1985 o Willi Halle ανέπτυξε ένα μοντέλο παλινδρόμησης για την σχέση μεταξύ των in vitro και in vivo δεδομένων τοξικότητας ποντικού και αρουραίου χρησιμοποιώντας τις τιμές IC 50 και LD 50. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του Halle [81], η θετική συσχέτιση των in vivo και in vitro δεδομένων επιτρέπει την πρόβλεψη των τοξικών ιδιοτήτων των ξενοβιοτικών και την ταξινόμηση της τοξικότητας των χημικών ουσιών. Με βάση τα ευρήματά του, ο Halle ίδρυσε την RC, όπου είναι μία βάση δεδομένων για την τοξικότητα και παράλληλα εφαρμόζει και το παραπάνω μοντέλο παλινδρόμησης για την πρόβλεψη. [59]

60 2.6.3 To ευρωπαϊκό πρόγραμμα REACH Το 2001 η Ευρωπαϊκή Επιτροπή ενέκρινε την «Λευκή Βίβλο σε σχέση με τη στρατηγική και την μελλοντική πολιτική για τα χημικά», η οποία πρότεινε να συμπεριληφθούν τα εναρμονισμένα κριτήρια ταξινόμησης και αξιολόγησης κινδύνου στην κοινοτική νομοθεσία τόσο για τις νέες, όσο και για τις υφιστάμενες χημικές ουσίες[69]. Έτσι το Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο ενέκρινε ψήφισμα για το πρόγραμμα «REACH» που σημαίνει καταχώριση, αξιολόγηση, αδειοδότηση και περιορισμοί στη χρήση των χημικών προϊόντων. Το ψήφισμα αυτό τέθηκε σε ισχύ την 1η Ιουνίου του Ο κανονισμός REACH προωθεί σαφώς την χρήση των εναλλακτικών δοκιμών για την αξιολόγηση της ασφάλειας των χημικών ουσιών. Στα πλαίσια του προγράμματος REACH πρέπει να αξιολογηθούν για την ασφάλεια τους περίπου χημικές ουσίες [70] Το σύστημα οικουμενικής εναρμόνισης (Globally Harmonised System-GHS) Η παρουσία πολλών μεθοδολογιών διαχείρισης και συστημάτων ταξινόμησης του κινδύνου των χημικών ουσιών, τόσο σε εθνικό, όσο και σε διεθνές επίπεδο, δημιουργεί μια συγκεχυμένη εικόνα και καθιστά δύσκολη την εφαρμογή κατάλληλης διαχείρισης ελέγχου των χημικών ουσιών. Αυτές οι διαφορές στην ταξινόμηση έχουν ισχυρό αντίκτυπο στην προστασία της υγείας του ανθρώπου, του περιβάλλοντος, και του εμπορίου. Η ζήτηση για ένα οικουμενικά εναρμονισμένο σύστημα ταξινόμησης των χημικών κινδύνων άρχισε ήδη από την δεκαετία του Το GHS παρέχει την υποδομή για μία οικουμενική και συνεκτική προσέγγιση για την ταξινόμηση των [60]

61 χημικών ουσιών και μία συνεκτική και συνεπή προσέγγιση για τον καθορισμό και την ταξινόμηση των χημικών κινδύνων αλλά και την κοινοποίηση των πληροφοριών στις ετικέτες και τα δελτία δεδομένων ασφαλείας (safety data sheets-sds)[82]. Το GHS καλύπτει όλες τις επικίνδυνες χημικές ουσίες, συμπεριλαμβανομένων των αραιωμένων διαλυμάτων και μειγμάτων, αλλά δεν καλύπτει φαρμακευτικά προϊόντα, καλλυντικά, πρόσθετα τροφίμων και κατάλοιπα φυτοφαρμάκων στα τρόφιμα, εκτός από τον τομέα των μεταφορών ή εάν εργαζόμενοι εκτίθενται σε αυτά Κριτήρια ταξινόμησης Η δήλωση της επικινδυνότητας στο GHS, βασίζεται στην παροχή συγκεκριμένων σηματοδοσιών-φράσεων και εικονογραμμάτων, τα οποία συνδέονται με τον ειδικό κίνδυνο που φέρει μια ουσία ή το μείγμα ενδιαφέροντος. Σε ότι αφορά τους κινδύνους για την υγεία από την τοξικότητα και ειδικότερα την τοξικότητα μίας μόνο δόσης (οξεία από του στόματος τοξικότητα) η κατηγοριοποίηση εμφανίζεται στον πίνακα και καλύπτει ένα ευρύ φάσμα τελικών σημείων τοξικότητας μέσω διαφορετικών οδών έκθεσης. Συνολικά οι χημικές ουσίες χωρίζονται σε πέντε κατηγορίες με βάση τις τιμές LD 50 που έχουν, με αυξανόμενη σειρά από τις λιγότερο τοξικές προς αυτές που παρουσιάζουν εντονότερη τοξικότητα. Το σύμβολο με το κρανίο και τα οστά χαρακτηρίζει την οξεία από του στόματος τοξικότητα και αντιπροσωπεύει την προειδοποιητική λέξη "κίνδυνος". Το θαυμαστικό αντιπροσωπεύει την λέξη "Προειδοποίηση". Δεν υπάρχουν σύμβολα για την κατηγορία 5 εκτός από την λέξη "Προειδοποίηση"[82]. Πίνακας 3. Τα κριτήρια του GHS για την τοξικότητα μιας δόσης. Οι τιμές κάθε κατηγορίας αναφέρονται σε τιμές LD 50 [82]. [61]

62 2.7 Μέθοδοι για δοκιμασίες in vitro κυτταροτοξικότητας Μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί πολλά in vitro μοντέλα τα οποία βασίζονται είτε σε αντιδράσεις βιοφωταύγειας είτε χρωματομετρίας. Οι δοκιμασίες που είναι σήμερα διαθέσιμες μπορούν να προσδιορίσουν μία ποικιλία διαφορετικών δεικτών και αφορούν τον αριθμό των νεκρών κυττάρων (δοκιμασία κυτταροτοξικότητας), τον αριθμό των ζώντων κυττάρων (δοκιμασία βιωσιμότητας), τον συνολικό αριθμό των κυττάρων ή τον μηχανισμό του κυτταρικού θανάτου (π.χ. απόπτωση). Εικόνα 18. Δοκιμασίες προσδιορισμού της in vitro κυτταροτοξικότητας που έχουν διαφορετικό επίπεδο δράσης [83] Η δοκιμασία MTS Η δοκιμασία MTS (3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-5-(3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2-(4 -σουλφοφαινυλ)-2η-τετραζολίου) προσδιορίζει την μεταβολική δραστικότητα των μιτοχονδριακών αφυδρογονασών, οι οποίες παράγονται από τα ζωντανά κύτταρα. Οι δοκιμασίες με άλατα τετραζολίου έχουν χρησιμοποιηθεί για πολλά χρόνια, για την διάκριση των ζωντανών κυττάρων από τα νεκρά. Τα άλατα τετραζολίου μετατρέπονται σε φορμαζάνη από το σύστημα του κυτοχρώματος των ζωντανών κυττάρων, και το χρώμα που παράγεται είναι ανάλογο των κυττάρων που έχουν επιβιώσει στην καλλιέργεια [83]. Η αναγωγή του άλατος τετραζολίου MTS σε φορμαζάνη είναι αποτέλεσμα της δράσης των αφυδρογονασών που παράγουν αναγωγικά ισοδύναμα, όπως το NADH ή NADPH. Στην συνέχεια το NADH [62]

63 μεταφέρει τα ηλεκτρόνια του σε ένα αντιδραστήριο μεταφοράς ηλεκτρονίων όπως η μεθοθειική φαιναζίνη (PMS) με αποτέλεσμα την αναγωγή αυτών των ενώσεων. Οι αναχθείσες ETRs, με την σειρά τους, αλληλεπιδρούν άμεσα και ανάγουν την ένωση τετραζολίου MTS με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός έντονα χρωματισμένου διαλυτού υδατικού προϊόντος φορμαζάνης το οποίο μπορεί να μετρηθεί χρωματομετρικά όπως φαίνεται στο εικόνα 14. Εικόνα 19. Σχηματική αναπαράσταση της δράσης του κυτταρικού μεταβολισμού για την μετατροπή του MTS σε φορμαζάνη [83]. Εν συντομία τα πλεονεκτήματα της δοκιμασία MTS είναι: Η διαλυτότητά του σε καλλιεργητικό μέσο σε αντίθεση με τον πρόγονό του, την δοκιμασία ΜΤΤ. Μη-ραδιενεργό: δεν απαιτεί κοκτέιλ σπινθηρισμών ή την απομάκρυνση ραδιενεργών αποβλήτων. Ταχύτητα: εκτέλεση της ανάλυσης σε τρυβλία 96 φρεατίων χωρίς πλύσεις ή κυτταρική συγκομιδή. Ασφάλεια: δεν απαιτεί πτητικό οργανικό διαλύτη για τη διάλυση του προϊόντος φορμαζάνης. Βολικό: παρέχεται έτοιμο προς χρήση με την μορφή σταθερού, παγωμένου, στείρου διαλύματος. [63]

64 Ευέλικτο: σε αντίθεση με το ΜΤΤ μπορεί να διαβαστεί (σε φωτόμετρο) και στην συνέχεια να επιστραφεί στον επωαστή για περαιτέρω ανάπτυξη του χρώματος. Η αποτελεσματικότητα του MTS έχει αποδειχθεί από διάφορους ερευνητές[83-85] Η δοκιμασία NRU H δοκιμασία προσδιορισμού της κυτταροτοξικότητας με χρήση του ουδέτερου ερυθρού (NR) αναφέρεται σε μία μέθοδο μέτρησης της χημειοευαισθησίας και της επιβίωσης των κυττάρων. H μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα των ζωντανών κυττάρων να ενσωματώνουν και να δεσμεύουν ουδέτερο ερυθρό, μία έντονη χρωστική (κόκκινο του τολουολίου) [86]. Η NR διαπερνά εύκολα τις κυτταρικές μεμβράνες των ζωντανών κυττάρων με μη-ιοντική διάχυση, και συσσωρεύεται ενδοκυτταρικά στα λυσοσώματα. Οι μεταβολές, λόγω της δράσης χημικών ουσιών στην επιφάνεια των κυττάρων ή στις ευαίσθητες μεμβράνες των λυσοσωμάτων, οδηγούν σε μειωμένη πρόσληψη και δέσμευση του NR. Εικόνα 20. Δοκιμασία πρόσληψης ουδέτερου ερυθρού (NRU). Παρατηρήσεις στο μικροσκόπιο που παρουσιάζουν την πρόσληψη του ουδέτερου ερυθρού (NR) από τα κύτταρα σε μια σειρά από διαφορετικές τοξικές επιδράσεις [86]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι χημικές ουσίες οι οποίες έχουν άμεση επίδραση στα λυσοσώματα (π.χ. θειικό χλώριο) μπορεί να εμφανίζουν μεγαλύτερη τοξικότητα μέσω της δοκιμασίας NRU. Ο προσδιορισμός της πρόσληψης ουδέτερου ερυθρού γίνεται με εξαγωγή του από τα κύτταρα και ακολούθως [64]

65 φασματοφωτομετρική μέτρηση της απορρόφησης. Η δοκιμασία αυτή έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα ως μία αξιόπιστη, με επαναληψιμότητα και ανέξοδη in vitro δοκιμασία για τον προσδιορισμό της κυτταρικής επιβίωσης [87]. Σήμερα έχουν επικυρωθεί δύο in vitro δοκιμασίες που κάνουν χρήση του NRU, η δοκιμασία με την χρήση των ινοβλαστών ποντικού (BALB/c) 3Τ3 και η δοκιμασία με την χρήση των φυσιολογικών κερατινοκυττάρων ανθρώπου (NHK). 2.8 Κυτταρικές καλλιέργειες δύο (2D) και τριών διαστάσεων (3D) στην τοξικολογία Οι in vitro δοκιμασίες τοξικότητας έχουν προχωρήσει, από το στάδιο της μελέτης κυττάρων σε καλλιέργεια, στην μελέτη με την χρήση κατασκευών που προσομοιάζουν τους ιστούς, σε μία προσπάθεια να προσομοιαστεί το πραγματικό in vivo περιβάλλον. Τα κύτταρα, είτε είναι πρωτογεννή είτε μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές, είτε βλαστικά κύτταρα συνήθως καλλιεργούνται σε τρυβλία μονής στοιβάδας (δύο διαστάσεις-2d). Ο τρόπος αυτός όμως αντιπροσωπεύει ένα απλοποιημένο και τεχνητό μοντέλο της πραγματικής κατάστασης in vivo. Εικόνα 21. Αναπαράσταση την δομής των μικροινών από τις οποίες κατασκευάζονται τα ικριώματα (scaffolds) που χρησιμοποιούνται σε καλλιέργειες τριών διαστάσεων (3D) [88]. Για τον λόγο αυτό η ανάπτυξη και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εντός τρισδιάστατων (3D) δομών γίνεται όλο και πιο δημοφιλής[88]. Η τρίτη διάσταση γίνεται εφικτή με την ανάπτυξη των κυττάρων σε εναιωρήματα των καλλιεργητικών μέσων, σε τεχνητά υποστρώματα (π.χ. ικριώματα-scaffolds), ή σε συνθήκες πλέγματος (matrix) (π.χ., άγαρ και πηκτώματα). Αρκετές συγκριτικές μελέτες μεταξύ καλλιεργειών 3D και καλλιεργειών δύο διαστάσεων έχουν δείξει μεγάλη βελτίωση [65]

66 τόσο σε επίπεδο λειτουργιών και συμπεριφοράς των κυττάρων όσο και στο επίπεδο αλληλεπιδράσης κυττάρου-κυττάρου, τη μεταγωγή σήματος, και την έκφραση των γονιδίων[89, 90]. Για παράδειγμα, ορισμένες 3D καλλιέργειες πρωτογενών ηπατικών κυττάρων έδειξαν αυξημένη λειτουργικότητα σε σχέση με τις καλλιέργειες δύο διαστάσεων αλλά και παρατεταμένο χρόνο επιβίωσης έως και αρκετές εβδομάδες.[91, 92]. Λόγω του ότι τα 3D μοντέλα αναπαράγουν και διατηρούν ορισμένες ειδικές λειτουργίες των οργάνων και των ιστών, έχει αυξηθεί κατά τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον για την εφαρμογή τους ειδικά για τις δοκιμές τοξικότητας [90]. Ωστόσο, η τρίτη διάσταση φέρνει επίσης και μια σειρά από νέες προκλήσεις στον τομέα της κυτταρικής καλλιέργειας. Τα πολλαπλά στρώματα κυττάρων εγείρουν ανησυχίες σχετικά με την επαρκή παροχή οξυγόνου και θρεπτικών ουσιών στον πυρήνα των κυτταρικών καλλιεργειών. Επιπλέον, υπάρχει πιθανότητα συσσώρευσης τοξικών μεταβολιτών, γεγονός που θα μπορούσε να οδηγήσει σε νέκρωση των κυττάρων στο κέντρο της καλλιέργειας[93]. Ως εκ τούτου, τα κυτταρικά μοντέλα που θα χρησιμοποιηθούν στο μέλλον, θα πρέπει να είναι επαρκώς χαρακτηρισμένα και να μπορούν να διατηρούν, στον καλύτερο βαθμό, σταθερές συνθήκες καλλιέργειας. Παρά το γεγονός ότι τα 3D μοντέλα χρησιμοποιούνται όλο και περισσότερο, οι πλειοψηφία των εμπορικά διαθέσιμων δοκιμασιών τοξικότητας εξακολουθούν να εφαρμόζονται σε καλλιέργειες με τρυβλία πολλαπλών φρεατίων μονής στοιβάδας (2D). Έτσι, για να αξιοποιηθεί πλήρως η τρίτη διάσταση κατά την κυτταρική καλλιέργεια, πρέπει να αναπτυχθούν πιο κατάλληλα τελικά σημεία (κατώφλια) π.χ., οι βιοχημικές δοκιμασίες ή απεικονιστικές τεχνολογίες. [66]

67 3. Εφαρμογές των βλαστικών κυττάρων στην in vitro τοξικότητα Ένα μόνιμο ζήτημα που απασχολεί τον κλάδο της τοξικολογίας είναι το ποια συγκεκριμένα κύτταρα ή κυτταρικές σειρές είναι κατάλληλά για αυτές τις δοκιμασίες. Η καλύτερη επιλογή, για τις in vitro δοκιμασίες, θεωρείται η χρήση κυττάρων από τον άνθρωπο καθώς τα τελευταία αντιπροσωπεύουν καλύτερα τις in vivo αποκρίσεις των ιστών του ανθρώπου. Ένα άλλο σημαντικό πλεονέκτημα, είναι ότι με την χρήση κυττάρων του ανθρώπου είναι δυνατόν να διερευνηθεί και η ευαισθησία του ανθρώπινου σώματος σε σχέση με ορισμένους παράγοντες που συνδέονται με ασθένειες ή τοξικότητα [94]. Αντίθετα οι καλλιέργειες πρωτογενών κυττάρων από τον άνθρωπο, ενώ φέρουν αρκετά από τα λειτουργικά χαρακτηριστικά των κυττάρων των ιστών, παρουσιάζουν δυσκολίες στην καλλιέργεια τους in vitro, δεν έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής in vitro, ενώ οι ποσότητες που μπορούν να απομονωθούν και να χρησιμοποιηθούν σε πειράματα είναι ελάχιστες. Οι μετασχηματισμένες και αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές ενώ έχουν χαμηλό κόστος χρήσης και μεγάλη προσαρμοστικότητα, παράλληλα παρουσιάζουν ανευπλοειδία και μικρή αντιπροσωπευτικότητα της βιολογίας του ανθρώπου. Παράλληλα τα βλαστικά κύτταρα εμφανίζονται ως υποψήφιος τύπος κυττάρων για δοκιμασίες in vitro τοξικότητας. Σήμερα οι πιο πολλά υποσχόμενες πηγές κυττάρων του ανθρώπου, για τον έλεγχο της τοξικότητας είναι τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (hescs), τα βλαστικά κύτταρα ενηλίκου (κυρίως τα μεσεγχυματικά-mscs), και τα επαγόμενα βλαστικά κύτταρα (ipscs). Αυτή η τεχνολογία επιτρέπει τη δημιουργία κυττάρων με ευρύ γενετικό υπόβαθρο δίνοντας την δυνατότητα για τον έλεγχο της ευαισθησίας έναντι ενός μεγάλου αριθμού χημικών ουσιών, εντός ενός πληθυσμού [95]. [67]

68 Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Προϋποθέσεις Βελτίωσης Δυνατότητα άμεσης πρόβλεψης των επιπτώσεων στον άνθρωπο Ικανότητα αυτόανανέωσης και συνεπώς -> ανεξάντλητη πηγή πανομοιότυπων κυττάρων Διαφοροποίηση προς διάφορους λειτουργικούς τύπους ανθρώπινων κυττάρων Μελέτη της επίδρασης γενετικών παραγόντων σε ανθρώπινους πληθυσμούς Επιτρέπουν τη μελέτη των πρώιμων αναπτυξιακών διαδικασιών στον άνθρωπο Τα ips και τα πολυδύναμα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα ξεπερνούν τα ηθικά ζητήματα που τίθεντο για τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα Ηθικά και θρησκευτικά ζητήματα Ασαφείς μακροπρόθεσμη λειτουργική και γενετική σταθερότητα Δυσκολία λήψης ομοιογενών πληθυσμών Πληθυσμοί σε διάφορα στάδια διαφοροποίησης Ελλιπής γνώση αλληλεπιδράσεων in vivo, κυττάρουκυττάρου και μονοπατιών σηματοδότησης Ελλιπής γνώση μεταβολισμού Ανάγκη για παρουσία τροφοδοτικών κυττάρων Ελλιπής χαρακτηρισμός ips Βελτιστοποίηση και τυποποίηση των πρωτοκόλλων διατήρησης και διαφοροποίησης Βελτίωση της μακροχρόνιας σταθερότητας Καλύτερος χαρακτηρισμός της λειτουργίας, των μονοπατιών σηματοδότησης και του μεταβολισμού. Πραγματοποίηση μελετών επικύρωσης των μοντέλων βλαστικών κυττάρων για τον καθορισμό της προγνωστικής τους ικανότητας και της αξιοπιστίας τους ως προς την χρήση τους σε δοκιμασίες τοξικότητας Πίνακας 4. Πλεονεκτήματα, μειονεκτήματα και μελλοντικές βελτιώσεις για την χρήση των βλαστικών κυττάρων στην τοξικολογία [95]. Οι τοξικολογικές δοκιμασίες με βάση τα βλαστικά κύτταρα ταξινομούνται σε τρείς κατηγορίες. Πρώτον στις δοκιμασίες που αξιολογούν την οξεία τοξικότητα μέσω του προσδιορισμού/ καταμέτρησης του αριθμού των κυττάρων που επιβίωσαν και ως εκ τούτου του ποσοστού επιβίωσης των κυττάρων (δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας). Δεύτερον τις δοκιμασίες που αξιολογούν την ανασταλτική δράση χημικών ουσιών στην διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων σε άλλους [68]

69 τύπους κυττάρων (δοκιμασίες αναπτυξιακής τοξικότητας). Τρίτον υπάρχουν οι δοκιμασίες που καθορίζουν τις ανασταλτικές ή διεγερτικές επιδράσεις χημικών ουσιών στη λειτουργία ώριμων διαφοροποιημένων κυττάρων που έχουν ληφθεί μέσω διαφοροποίησης από βλαστικά κύτταρα (δοκιμασίες κυτταρικής λειτουργίας). 3.1 Δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας με τη χρήση των βλαστικών κυττάρων. Τα σωματικά βλαστικά κύτταρα έχουν χρησιμοποιηθεί τόσο για δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας όσο και για δοκιμασίες εμβρυικής τοξικότητας. Συγκεκριμένα έχει διερευνηθεί η τοξικότητα ορισμένων μετάλλων, που χρησιμοποιούνται ως βιουλικά σε ιατρικές συσκευές, με τη χρήση μεσεγχυματικών και νευρικών βλαστικών κυττάρων[96-99]. Η Scanu και οι συνεργάτες της εξέτασαν την οξεία από του στόματος τοξικότητα 12 χημικών ουσιών διαβαθμισμένης τοξικότητας, με χρήση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον μυελό των οστών [100]. Στην συνέχεια συνέκριναν στατιστικά τα αποτελέσματα τους με τα in vivo και in vitro αποτελέσματα της μελέτης επικύρωσης του, μοναδικού από το 2006 έως τώρα, επικυρωμένου μοντέλου οξείας από του στόματος τοξικότητας του οργανισμού ICCVAM (ICCVAM 2006). Η μελέτη απέδειξε μια ικανοποιητική συσχέτιση των τιμών IC 50 και LD 50 αλλά και βελτιωμένα ποσοστά πρόβλεψης των τιμών LD 50. Επίσης ο Chang και οι συνεργάτες του εξέτασαν τις επιδράσεις αντιφλεγμονωδών φαρμάκων στον πολλαπλασιασμό, την κυτταροτοξικότητα και την οστεογένεση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από το μυελό των οστών [97]. Παράλληλα ο Hackenberg και οι συνεργάτες του εξέτασαν την επίδραση νανοσωματιδίων από ασήμι στην κυτταροτοξικότητα μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων λίπους, ενώ ο Kermani και οι συνεργάτες του εξέτασαν την επίδραση του μολύβδου στον πολλαπλασιασμό και τη νευρική διαφοροποίηση μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων μυελού των οστών από ποντικό[98] [99]. Το 2012 ο May και οι συνεργάτες του περιέγραψαν την ανάπτυξη ενός νέου in vitro μοντέλου, το οποίο θα μπορούσε να προσαρμοστεί για οποιοδήποτε δοκιμασία τοξικολογίας [101]. Το μοντέλο χρησιμοποιεί τα ηπατικά κύτταρα HepG2 ως πηγή μεταβολικών ενζύμων εφαρμόζοντας παράλληλα ένα μοντέλο συν-καλλιέργειας με μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών. Έτσι μπορεί να αξιολογηθεί η επίδραση, οποιασδήποτε ουσίας μεταβολίζεται, στον δεύτερο τύπο κυττάρων. Στόχος [69]

70 τους ήταν να αξιολογήσουν την επίδραση των χημικοθεραπευτικών φαρμάκων στην επιβίωση των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων (MSCs). Επίσης για δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας και αναπτυξιακής τοξικότητας, έχουν χρησιμοποιηθεί και τα νευρικά βλαστικά κύτταρα[101, 102]. Είναι γνωστό πώς τα νευρικά βλαστικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται στην μορφή συμπλεγμάτων νευροσφαιριδίων. Ως εκ τούτου, εκτός από τα ποσοστά επιβίωσης των κύτταρων ως κριτήριο αξιολόγησης θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ο αριθμός και τα μεγέθη των νευροσφαιριδίων. Πριν από περίπου 10 χρόνια επικυρώθηκε, από τον φορέα ECVAM, η γνωστή δοκιμασία τοξικότητας εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού (δοκιμασία EST)[103]. Η μέθοδος κάνει χρήση διαφόρων δοκιμασιών κυτταροτοξικότητας αλλά και δοκιμασιών αξιολόγησης της επίδρασης τοξικών ενώσεων στην διαφοροποίηση με στόχο τον υπολογισμό του τοξικολογικού κινδύνου μέσω συγκεκριμένου μαθηματικού τύπου. Κατά τα επόμενα χρόνια πολλές άλλες μελέτες σχετικά με τις δοκιμασίες τοξικότητας χρησιμοποίησαν τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα με βάση την παραπάνω μέθοδο. Η δοκιμασία EST είναι η μόνη δοκιμασία αναπτυξιακής τοξικότητας που δεν απαιτεί ζώα που κυοφορούν αλλά βασίζεται σε ένα σύστημα θηλαστικών[104]. Οι De Jong και οι συνεργάτες του (2009) αξιολόγησαν την ευαισθησία της δοκιμασίας EST έναντι μεταβολιτών γλυκολαιθέρα και η σύγκριση των αποτελεσμάτων τους με in vivo αποτελέσματα αναπτυξιακής τοξικότητας έδειξε ότι η δραστικότητα των χημικών ενώσεων ήταν παρόμοια [105]. Επίπρόσθετα, ο Stummann και οι συνεργάτες του [106] διερεύνησαν την τοξική δράση του μεθυλυδραργύρου (MeHg) και διαπίστωσαν ότι οι πρόδρομοι νευρώνες είναι πιο ευαίσθητοι στα μη κυτταροτοξικά επίπεδα του MeHg σε σύγκριση με τους ώριμους διαφοροποιημένους νευρώνες. 3.2 Δοκιμασίες αναπτυξιακής τοξικότητας με τη χρήση των βλαστικών κυττάρων Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, η μη ωμαλή διαφοροποίηση των ανώριμων βλαστικών κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε αναπτυξιακές ανωμαλίες και καρκινογένεση. Οι δοκιμασίες αναπτυξιακής τοξικότητας χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των κινδύνων της μη ομαλής διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων [70]

71 με έκθεση τους σε ορισμένες χημικές ουσίες. Στην συνέχεια ακολουθεί ο προσδιορισμός και η αξιολόγηση ως τελικό σημείο, της αναλογίας των ειδικών τύπων κυττάρων που έχουν προέλθει μετά την διαφοροποίηση. Τα βλαστικά κύτταρα παρουσιάζουν μεγάλες δυνατότητες για την ανάπτυξη εφαρμογών αναπτυξιακής τοξικότητας καθώς φυσιολογικά παίζουν σημαντικό ρόλο σε ένα μεγάλο αριθμό αναπτυξιακών διαδικασιών [107, 108]. Στην πραγματικότητα, μόνο μία δοκιμασία αναπτυξιακής τοξικότητας έχει επικυρωθεί επίσημα για τον έλεγχο της εμβρυοτοξικότητας και αυτή είναι η δοκιμασία EST, η δοκιμασία των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων ποντικού [109]. Η δοκιμασία βασίζεται στην ανάλυση των τιμών IC 50 τριών παραμέτρων: 1) της αξιολόγησης της διαφοροπίησης των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε μυοκαρδιοκύτταρα, 2) στη εκτίμηση των κυτταροτοξικών επιδράσεων σε αδιαφοροποίητα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και 3) στη εκτίμηση των κυτταροτοξικών επιδράσεων σε διαφοροποιημένους ινοβλάστες 3Τ3 [110]. Εικόνα 22. Τα αναπτυξιακά στάδια των βλαστοκυττάρων σε συνδυασμό με τις εφαρμογές τους σε τοξικολογικές αναλύσεις. Τόσο τα ανώριμα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα όσο και τα σωματικά βλαστικά κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμασίες κυτοτοξικότητας για να αξιολογηθεί η καταστροφική επίδραση των τοξικών ουσιών στην επιβίωση αλλά και οι επιδράσεις στην κυτταρική διαφοροποίηση [109]. [71]

72 Ωστόσο, η δοκιμασία των EST περιορίζεται μόνο στην διαφοροποίηση σε κύτταρα του μυοκαρδίου, ενώ μετράται μόνο η αναλογία διαφοροποίησης μετράται στο πρωτόκολλο του EST. Παράλληλα τόσο εμβρυϊκά, όσο και βλαστικά κύτταρα ενηλίκων έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολόγηση των δυσμενών επιπτώσεων χημικών ουσιών στις νευροαναπτυξιακές διαδικασίες [111, 112]. Σε μια πρόσφατη μελέτη προσδιορίστηκε η βιωσιμότητα, ο πολλαπλασιασμός, η κυτταρική μετανάστευση και η διαφοροποίηση νευρικών προγονικών κυττάρων δείχνοντας ελπιδοφόρα αποτελέσματα στην πρόβλεψη της in vivo αναπτυξιακής νευροτοξικότητας [96]. 3.3 Εφαρμογές των βλαστικών κυττάρων σε λειτουργικές δοκιμασίες τοξικότητας και ελέγχου φαρμάκων Με την χρήση πολυδύναμων και σωματικών βλαστικών κυττάρων που μπορούν να διαφοροποιηθούν προς συγκεκριμένους τύπους σωματικών κυττάρων είναι δυνατόν να αποφευχθούν ηθικά ζητήματα που σχετίζονται με την συλλογή πρωτογενών κυττάρων από ιστούς του ανθρώπου. Μέχρι σήμερα για τον έλεγχο των κυτταρικών λειτουργιών γινόταν χρήση κυτταρικών σειρών και πρωτογενών κυττάρων που συλλέγονταν από ζώα. Εικόνα 23. Σχηματική αναπαράσταση της λειτουργικής δοκιμασίας διαφοροποίησης ES σε κύτταρα του μυοκαρδίου. Αρχικά, οι αποικίες ES καλλιεργούνται σε τροφοδοτικό στρώμα MEF (αριστερά) και για την επαγωγή της διαφοροποίησης μεταφέρονται σε εναιώρημα (κέντρο). Στις 10 ημέρες τα EBs (εμβρυοειδών σωματίων) επιστρώνονται σε τρυβλία επικαλυμμένα με ζελατίνη, όπου παρατηρούνται για την εμφάνιση αυθόρμητων συσπάσεων (δεξιά) [113]. [72]

73 Πρόσφατα μετρήθηκαν και προσδιορίστηκαν οι ηλεκτροφυσιολογικές και μεταβολικές λειτουργίες σωματικών κυττάρων που προήλθαν από διαφοροποίηση είτε από εμβρυικά βλαστικά κύτταρα (ES), είτε από επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ips)[113, 114]. Δύο κατηγορίες κυττάρων που είναι κατάλληλα για δοκιμασίες προσδιορισμού της κυτταρικής λειτουργίας με ηλεκτροφυσιολογικές μετρήσεις είναι οι νευρώνες και τα κύτταρα του μυοκαρδίου. Στην δοκιμασία αυτή αρχικά παρασκευάζονται εμβρυοειδή σωμάτια (EBs) μέσω διαφοροποίησης από εμβρυικά βλαστικά κύτταρα. Στην συνέχεια παράγονται μυοκαρδιοκύτταρα μέσω των εμβρυοειδών σωματίων και καλλιεργούνται στην επιφάνεια ενός συστήματος μέτρησης πολλαπλών ηλεκτροδίων για την παρακολούθηση της δραστηριότητας [113]. Οι νευρώνες μπορούν να διαφοροποιηθούν είτε από τα εμβρυοειδή σωμάτια (EBs) ή τα νευροσφαιρίδια των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Σε άλλες δημοσιευμένες μελέτες, οι νευρώνες καλλιεργούνται σε επιφάνεια ενός συστήματος μέτρησης πολλαπλών ηλεκτροδίων για την παρακολούθηση του αυθόρμητου σχηματισμού ενός δικτύου νευρώνων[115, 116]. Στην συνέχεια γίνεται προσθήκη διαφόρων χημικών ουσιών στο καλλιεργητικό μέσο, με αποτέλεσμα να τροποποιούνται τα μοτίβα της νευρωνικής δραστηριότητας (η συχνότητα και ο συγχρονισμός μεταξύ διαφορετικών νευρώνων) και να γίνεται εφικτή η αξιολόγηση της τοξικότητας των ουσιών. Τα ηπατικά κύτταρα είναι σημαντικά κύτταρα για τις τοξικολογικές δοκιμασίες και τα πρωτόκολλα ελέγχου φαρμάκων λόγω των μεταβολικών δραστηριοτήτων τους. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν την παραγωγή, μεταβολικά λειτουργικών, ηπατικών κυττάρων τόσο από εμβρυικά βλαστικά κύτταρα ανθρώπου (ES) όσο από επαγώμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ips)[114]. Στις μελέτες αυτές, τα ηπατικά κύτταρα προήλθαν μέσω διαφοροποίησης ES ή ips κυττάρων και χαρακτηρίστηκαν μέσω της έκκριση αλβουμίνης, την αποθήκευση γλυκογόνου και την δραστηριότητα του κυτοχρώματος p450 (CYP) καθώς και από την ικανότητα μεταβολισμού φαρμάκων. Μόνο στους τύπους των κυττάρων, που εμφανίζουν έντονες τις παραπάνω λειτουργίες, εφαρμόζονται συγκεκριμένες λειτουργικές δοκιμασίες τόσο ηλεκτροφυσιολογικές, όσο και μεταβολικές λειτουργικές δοκιμασίες. [73]

74 Σκοπός της παρούσας μελέτης Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης στοχεύσαμε στην διερεύνηση, για πρώτη φορά, της χρήσης των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του ομφαλίου λώρου (γέλης του Wharton) από τον άνθρωπό σε δοκιμασίες in vitro κυτταροτοξικότητας. Στην παρούσα μελέτη, στόχος ήταν να εξεταστούν παράλληλα και συγκριτικά τα παρακάτω είδη κυττάρων/κυτταρικών σειρών: In vitro και ex vivo, καλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων του ομφαλίου λώρου (γέλης του Wharton- WJ-hMSCs) από τον άνθρωπό, σε ικριώματα τριών διαστάσεων (3D). In vitro, καλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ενηλίκου λιπώδους ιστού (AD-SCs). In vitro, καλλιέργειες των κυτταρικών σειρών HepG2 (ηπατικού καρκινώματος) και NIH 3T3 (ινοβλάστες ποντικού), ως επικυρωμένα μοντέλα ελέγχου της in vitro κυτταροτοξικότητας. In silico δεδομένα για τις τιμές IC 50 (δόση χημικής ουσίας που προκαλεί το θάνατο του 50% των υπό εξέταση κυττάρων) των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον μυελό των οστών, ανθρώπου (BM-hMSCs). In silico δεδομένα για τα φυσιολογικά πρωτογενή κερατινοκύτταρα (ΝΗΚ) ανθρώπου και την κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού (BALB/c) 3T3, που αποτελούν τους δύο επικυρωμένους, από τον ICCVAM, τύπους κυττάρων για μελέτες in vitro κυτταροτοξικότητας. In silico δεδομένα για τις τιμές LD 50 (δόση χημικής ουσίας που προκαλεί το θάνατο του 50% των υπό εξέταση ποντικών) Όπως προτείνεται από το πρωτόκολλο της ICCVAM δοκιμάστηκαν 12 ουσίες αναφοράς ενώ η μέτρηση της επιβίωσης των κυττάρων έγινε με την δοκιμασία MTS. Αρχικός στόχος ήταν ο προσδιορισμός της in vitro οξείας τοξικότητας δώδεκα (12) επιλεγμένων χημικών ουσιών που καλύπτουν όλες τις κατηγορίες κινδύνου (GHS) έναντι των παραπάνω κυττάρων και κυτταρικών σειρών με μέτρηση του ποσοστού επιβίωσης των κυττάρων. Ο προσδιορισμός της κυτταρικής βιωσιμότητας έγινε μέσω των δοκιμασιών ενδοκυττάριας μετατροπής άλατος τετραζολίου (MTS assay) και συσσώρευσης Ουδέτερου Ερυθρού (NRU assay) σε τρυβλία πολλαπλών [74]

75 φρεάτιων, είτε απευθείας πάνω στην καλλιεργητική επιφάνειά τους, είτε μέσα σε ενθέματα τριών διαστάσεων. Επόμενος στόχος ήταν η σύγκριση της ευαισθησίας των κυττάρων ή των κυτταρικών σειρών και των in silico δεδομένων ως προς: 1. Η ακρίβεια του in vitro/ex vivo ποσοτικού προσδιορισμό της τοξικότητας μια ουσίας (προσδιορισμός τιμών IC 50 ) 2. Η συσχέτιση των τιμών IC 50 με την αρχική δόση θνησιμότητας (LD 50 ) σε πρότυπα ζωικά μοντέλα τοξικότητας. 3. Το ποσοστό ορθής πρόβλεψης της τοξικότητας μιας άγνωστης ή γνωστής ουσίας που προορίζεται για ανθρώπινη χρήση ή κατανάλωση. 1 o hmsc Cell Lines Human ADSC 5 chemicals NIH 3T3 (murine fibroblasts) HepG2 (human hepatocytes) 12 chemicals 1 o hmsc Validated Cell Lines * Human BM-MSC 12 chemicals NHK (human keratinocytes) 3T3/BALB-c (murine fibroblasts) 12 chemicals IN VITRO IN SILICO WJSC (MTS-NRU assay/mtp plates) EX VIVO Variation 3D culture (PS inert inserts) 6 chemicals Intra-assay Mean %CV of conc. range of each of 12 chemicals Inter-assay Mean %CV of IC 50 values of 12 chemicals Inter-culture N = 3 5 chemicals Differences in regression slopes & intercepts Εικόνα 24. Σχηματική αναπαράσταση του συνόλου των πειραματικών διαδικασιών και στατιστικών αναλύσεων και συγκρίσεων που πραγματοποιήθηκαν στην μελέτη αυτή. [75]

76 Πειραματικό Μέρος [76]

77 Υλικά και Μέθοδοι 1. Τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν Για τις in vitro δοκιμασίες που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο μας, χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις διαφορετικοί τύποι κυττάρων: Η κυτταρική σειρά ηπατοκαρκινώματος HepG2, που υπήρχε σε απόθεμα κρυοφιαλιδίων στο εργαστήριο μας, κατεψυγμένα σε υγρό άζωτο στους -200 ο C. H κυτταρική σειρά ινοβλαστών ποντικού ΝΙΗ 3Τ3, που υπήρχε σε απόθεμα κρυοφιαλιδίων στο εργαστήριο μας, κατεψυγμένα σε υγρό άζωτο στους -200 ο C. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα ομφαλίου λώρου (γέλης του Wharton-WJ-hMSCs) ανθρώπου τα οποία μας παραχωρήθηκαν για ερευνητικούς σκοπούς από την εταιρία ΤΑΚ-ΕΙΕ (Τράπεζα Αρχεγόνων Κυττάρων- Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών), που δημιουργήθηκε σε μία συνεργασία του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας του ΕΙΕ και της εταιρίας βιοτεχνολογίας Biohellenika S.A. Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα λίπους ανθρώπου (AD-hMSCs) τα οποία μας παραχωρήθηκαν για ερευνητικούς σκοπούς από την εταιρία ΤΑΚ-ΕΙΕ (Τράπεζα Αρχεγόνων Κυττάρων- Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών), που δημιουργήθηκε σε μία συνεργασία του Ινστιτούτου Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας του ΕΙΕ και της εταιρίας βιοτεχνολογίας Biohellenika S.A. 1.1 Απομόνωση και Χαρακτηρισμός των βλαστικών κυττάρων WJ-MSCs και AD-MSCs Τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα του ομφαλίου λώρου (γέλης του Wharton-WJ-hMSCs) είχαν ήδη απομονωθεί και χαρακτηριστεί από τους Christodoulou και τους συνεργάτες του[117], νωρίτερα στο εργαστήριο μας [118]. Στην μελέτη αυτή έγινε η απομόνωση των κυττάρων σύμφωνα με το ήδη εγκεκριμένο πρωτόκολλο των Seshareddy και των συνεργατών του[119] μετά από έγκριση της [77]

78 επιτροπής βιοηθικής δεοντολογίας. Τα AD-SCs απομονώθηκαν με αναρροφήσεις κοιλιακού λίπους ασθενών που υποβλήθηκαν σε εθελοντική χειρουργική επέμβαση λιποαναρρόφησης. Τα κύτταρα ελέχθησαν για την έκφραση των δεικτών επιφανείας βλαστικών κυττάρων και ήταν θετικά για τους δείκτες CD29, CD44, CD73, CD90 και CD105 ενώ ήταν αρνητικά για τους δείκτες CD14, CD34, και CD45. Παράλληλα, στην ίδια μελέτη, για τον χαρακτηρισμό των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν δοκιμές σχηματισμού αποικών (CFU-F-Colony formation assay) για τον έλεγχο της ικανότητας αυτο-ανανέωσης, αλλά και δοκιμές διαφοροποίησης προς κύτταρα οστού. Τα WJ-hMSCs παρουσίασαν σταθερό φαινότυπο μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ενώ ο μέσος χρόνος διπλασιασμού ενός πληθυσμού προσδιορίστηκε κοντά στις 32 ώρες [117]. 2. Καλλιέργειες κυτταρικών σειρών Για την καλλιέργεια των κυτταρικών σειρών NIH 3T3 και HepG2 οι οποίες μελετώνται, χρησιμοποιείται θρεπτικό υλικό DMEM (Dulbecco s Modified Eagle Medium) που περιέχει 10% ορό (FBS, fetus bovine serum) και 1% αντιβιοτικά ευρέως φάσματος (Pen-Str, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη). 2.1 Καλλιέργειες μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων Για την καλλιέργεια των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων ομφαλίου λώρου (από την γέλη του Wharton-WJ-hMSCs) και των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων λίπους ανθρώπου (AD-hMSCs) τα οποία μελετώνται χρησιμοποιείται θρεπτικό υλικό DMEM/F12 (Dulbecco s Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12) που περιέχει 10% ορό (FBS, fetus bovine serum) και 1% αντιβιοτικά ευρέως φάσματος (Pen-Str, πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη), 5% μη απαραίτητα αμινοξέα (Non- Essential Amino Acid -NEAA), 7,5 ml HEPES (για την διατήρηση του ph) και 2ml Fungizone (αντιμυκητιασικό σκεύασμα αμφοτερικίνης Β). 2.2 Καλλιέργεια κυττάρων σε φλάσκα (ή τρυβλίο Petri) Τα κύτταρα στα κρυοφιαλίδια (αμπούλες) που καλλιεργήθηκαν αφαιρούνται από το υγρό άζωτο και τοποθετούνται σε ένα στατό το οποίο στη συνέχεια τοποθετείται μέσα στο υδατόλουτρο στους 37 ο C μέχρις ότου οι αμπούλες ξεπαγώσουν. Ετοιμάζεται μία φλάσκα (ή ένα τρυβλίο) για κάθε κυτταρική σειρά [78]

79 γράφοντας επάνω της το όνομα της εκάστοτε κυτταρικής σειράς και ημερομηνία. Πραγματοποιείται καθαρισμός του απαγωγού με χαρτί εμποτισμένο με εργαστηριακή αιθανόλη. Προηγουμένως, έχει αφεθεί για περίπου 1 ώρα η λάμπα υπεριώδους ώστε να αποστειρωθεί ο χώρος και να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα κάποιας μόλυνσης. Στην συνέχεια προστίθεται σε κάθε φλάσκα 15-20ml θρεπτικό υλικό (αν πρόκειται για φλάσκα των 75ml - μεγάλη) ή 5-8ml αν πρόκειται για φλάσκα των 25ml - μικρή). Αν υπάρχουν τρυβλία για την καλλιέργεια, προστίθεται περίπου 7-10ml θρεπτικού υλικού σε κάθε τρυβλίο των 60mm. Αφού αναδευτεί το περιεχόμενο κάθε αμπούλας με πιπέτα τύπου Gilson, μεταφέρεται στο εσωτερικό της φλάσκας. Τα κύτταρα μεταφέρονται τελικά σε κλίβανο των 37 ο C. 2.3 Αλλαγή θρεπτικού υλικού Επιλέγεται η φλάσκα/τρυβλίο με τα κύτταρα στα οποία θα γίνει αλλαγή θρεπτικού υλικού. Πραγματοποιείται μηχανική αναρρόφηση του θρεπτικού υλικού (μέσω αρνητικής πίεσης) με μία πιπέτα Pasteur, από τη φλάσκα (ή το τρυβλίο). Προστίθενται 10ml PBS (Phosphate buffered saline) για το ξέπλυμα των κυττάρων. Τέλος γίνεται αναρρόφηση του PBS και προστίθεται φρέσκο θρεπτικό υλικό. 2.4 Θρυψινοποίηση κυττάρων Με μία πιπέτα Pasteur αναρροφάτε το θρεπτικό υλικό από τη φλάσκα. Γίνεται ξέπλυμα με PBS, προσθέτωντας με μία πιπέτα των 8-10ml. Στην συνέχεια γίνεται αναρρόφηση του PBS. Προστίθενται 2-3ml θρυψίνης και αφού γίνει ανάδευση και η φλάσκα τοποθετείται σε κλίβανο 37 ο C για 5-10 ώστε να δράσει η θρυψίνη. Η θρυψινοποίηση υποβοηθείτε με ελαφρό χτύπημα στα τοιχώματα της φλάσκας. Όταν ολοκληρωθεί η θρυψινοποίηση, γεγονός που ελέγχεται με παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, προστίθενται μερικά ml θρεπτικού υλικού (5-10). Το θρεπτικό υλικό έχει ορό (FBS) ο οποίος περιλαμβάνει αναστολέα της θρυψίνης και εμποδίζει την περαιτέρω δράση της θρυψίνης. Διαφορετικά, αν το ένζυμο αφεθεί να δράσει κι άλλο θα σκοτώσει τα κύτταρα. Τα κύτταρα μεταφέρονται σε σωλήνα universal και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 5 στις 1800rpm. Μόλις τελειώσει η φυγοκέντρηση, αναρροφάτε το υπερκείμενο και το ίζημα των κυττάρων αραιώνεται [79]

80 ξανά σε 1ml θρεπτικού υλικού. Στο σημείο αυτό γίνεται να χωριστεί το 1ml κυττάρων σε δύο νέες φλάσκες. 2.5 Πάγωμα των κυττάρων Αρχικά πραγματοποιείται θρυψινοποίηση όπως περιγράφηκε πιο πάνω. Γίνεται προετοιμασία υγρού κατάψυξης. Το υγρό κατάψυξης αποτελείται από 50% FBS, 10% DMSO και 40% θρεπτικό υλικό (DMEM) για τις κυτταρικές σειρές HepG2 και ΝΙΗ 3Τ3. Έτσι, για ένα aliquot του 1ml χρειάζονται 500μl FBS, 100μl DMSO και 400μl θρεπτικό υλικό. Για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs και AD-hMSCs το υγρό κατάψυξης αποτελείται από 50% FBS, και μείγμα 10% DMSO και 40% FBS. Έτσι, για ένα aliquot του 1ml χρειάζονται 900μl FBS και 100μl DMSO. Σημειώνεται στο κρυοφιαλίδιο (αμπούλα) το όνομα της κυτταρικής σειράς και η ημερομηνία. Μόλις τελειώσει η φυγοκέντρηση, τα κύτταρα αραιώνονται και πάλι στο υγρό κατάψυξης και τα μεταφέρονται στο κρυοφιαλίδιο (αμπούλα). Το κρυοφιαλίδιο (αμπούλα) τοποθετείται σε ειδικό δοχείο με ισοπροπανόλη και μεταφέρεται στους -80 ο C. Έπειτα από 2-3 ημέρες μεταφέρεται στο υγρό άζωτο (-200 ο C). 2.6 Ex vivo καλλιέργεια των κυττάρων σε συνθήκες τριών διαστάσεων (3D)- Scaffolds H ex vivo καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων WJ-hMSCs σε συνθήκες τριών διαστάσεων γίνεται με την χρήση των ικριωμάτων μικρο-ινών της Biotek, τα 3D Insert TM -PS scaffolds. Τα ένθετα ικριώματα 3D InsertTM-PS scaffolds είναι τοποθετημένα εντός των φρεατίων, σε τρυβλία 96 φρεατίων. Μετά την θρυψινοποίηση και την εκ νέου αραίωση των κυττάρων σε DMEM/F12, προστέθηκαν 15μl καλλιεργητικού μέσου σε κάθε ένθετο ικρίωμα. Στην συνέχεια το τρυβλίο τοποθετείται στους 37 ο C σε κλίβανο για τρείς ώρες. Τέλος προστίθενται επιπλέον 185 μl καλλιεργητικού μέσου. [80]

81 Εικόνα 25. Τα 3D Insert TM -PS scaffolds σε τρυβλία πολλαπλών φρεατίων. 2.7 Προετοιμασία υλικών καλλιέργειας DMEM: Σε ένα αποστειρωμένο δοχείο προστίθενται 50ml FBS, 5ml Pen-Str και συμπληρώνεται μέχρι τα 500ml με DMEM. Το DMEM περιέχει γλουταμίνη και γλυκόζη, επομένως δε χρειάζεται να προστεθούν ανεξάρτητα. Στην έξω πλευρά του δοχείου σημειώνεται 1x DMEM + 1% Pen-Str + 10% FBS, η ημερομηνία. Tο καπάκι κλείνει και προστίθεται εξωτερικά parafilm. Αποθηκεύεται στο ψυγείο. DMEM/F12: Σε ένα αποστειρωμένο δοχείο προστίθενται 50ml FBS, 5ml Pen-Str, 5ml HEPES, 7,5ml NEAA, 2ml Fungizone και συμπληρώνεται μέχρι τα 500ml με DMEM. Το DMEM περιέχει γλουταμίνη και γλυκόζη, επομένως δε χρειάζεται να προστεθούν ανεξάρτητα. Στην έξω πλευρά του δοχείου σημειώνεται 1x DMEM/F12 + 1% Pen-Str + 10% FBS+ 1% HEPES+ 1,5 % NEAA +2ml Fungizone, η ημερομηνία. Tο καπάκι κλείνει και προστίθεται εξωτερικά parafilm. Αποθηκεύεται στο ψυγείο. PBS: Σε ένα αποστειρωμένο δοχείο προστίθενται 50ml PBS 10Χ και συμπληρώνεται μέχρι τα 500ml με dh2o. Στην έξω πλευρά του δοχείου σημειώνεται 1Χ PBS και η [81]

82 ημερομηνία. κλείνει το καπάκι και προστίθεται εξωτερικά parafilm. Αποθηκεύεται στο ψυγείο. Η σύσταση του PBS (phosphate buffered saline) φαίνεται στον επόμενο πίνακα: 3. Χημικές Ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη Ελέγχθηκε ένα σύνολο δώδεκα (12) τοξικών ουσιών με γνωστά in vivo δεδομένα τοξικότητας και με κλιμακούμενη τοξικότητα σύμφωνα με τις κατηγορίες κινδύνου GHS. Οι ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας είναι οι: χλωριούχος υδράργυρος II (HgCl 2 ), κυκλοεξιμίδιο (C 15 H 23 NO 4 ) (κατηγορία 1), αρσενικώδες νάτριο (NaAsO 2 ), διένυδρο διχρωμικό νάτριο (Na 2 Cr 2 O 7 2 H 2 O) (κατηγορία 2), χλωριούχο κάδμιο II (CdCl 2 ), φθοριούχο νάτριο(naf) (κατηγορία 3), προπρανολόλη HCl( C 16 O 21 NO 2 ), μονοϋδρική θειική ατροπίνη (C 17 H 23 NO 3 )2 H 2 SO 4 H 2 O) (κατηγορία 4), χλωριούχο κάλιο ( KCl), τριχλωροξεικό οξύ (C l3 CCOOH ) (κατηγορία 5), υποχλωριώδες νάτριο (NaClO), γλυκερόλη (C 3 H 8 O 3 ) (μη ταξινομημένες ουσίες). Ως θετικός μάρτυρας ελέγχου χρησιμοποιήθηκε το SDS (NaC 12 H 25 SO 4 ). [82]

83 Πίνακας 5. Οι 12 από τις 30 προτεινόμενες από τον φορέα ICCVAM. Οι χημικές ουσίες που επιλέχθηκαν για τη μελέτη, είναι χωρισμένες με βάση τις κατηγορίες κινδύνου GHS, μαζί με τα αντίστοιχα μοριακά τους βάρη και τους αριθμούς CAS. Όλες οι χημικές ουσίες είναι διαλυτές στο νερό. Τα αρχικά διαλύματα έγινα σε απεσταγμένο - απιονισμένο νερό (ddh 2 0) ακολούθησε φιλτράρισμα σε φίλτρα σύριγγας έτσι ώστε να αποφευχθούν οι μολύνσεις. Τα τελικά διαλύματα πραγματοποιήθηκαν απευθείας σε καλλιεργητικό μέσο είτε DMEM ή DMEM/F12. [83]

84 4. Δοκιμασία MTS H δοκιμασία MTS, αλάτων τετραζολίου, πραγματοποιείτε με το προϊόν CellTiter 96 AQueous Assay (Promega). Τα κύτταρα, μετά την θρυψινοποίηση, επιστρώνονται σε τρυβλία 96 φρεατίων με πυκνότητα επίστρωσης 3,2-3,5 x 10 3 κύτταρα/100 μl/φρεάτιο σε μέσο καλλιέργειας και τοποθετούνται σε κλίβανο. Μετά από 48 ώρες επώαση (37 ο C / 5% CO 2 ), τα κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με οκτώ επίπεδα συγκεντρώσεων για κάθε μία από τις χημικές ουσίες δοκιμής, διαλυμένες σε 100 μl μέσου καλλιέργειας. Όλα τα χημικά αραιώνονται στο αντίστοιχο για το κύτταρο μέσο καλλιέργειας χωρίς οποιονδήποτε διαλύτη. Το δείγμα αρνητικού ελέγχου επωάζεται με προσθήκη μόνο καλλιεργητικού μέσου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται (37 ο C / 5% CO 2 ) για 48 ακόμα ώρες. Μετά την περίοδο επώασης, αφαιρούνται τα χημικά διαλύματα από όλα τα τρυβλία και τα κύτταρα ξεπλένονται με 150 μl / φρεάτιο προθερμασμένου PBS. Στην συνέχεια προστίθενται 100μl/φρεάτιο καλλιεργητικού μέσου, χωρίς ερυθρό φαινόλης, έτσι ώστε να μην επηρεαστεί η μέτρηση από το θρεπτικό μέσο. Προστίθενται επίσης 20 μl από το διάλυμα CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent (Promega) ανά φρεάτιο. Στα κενά φρεάτια ροστίθενται 150μl PBS. Τα κύτταρα επωάζονται για 4 ώρες ακόμα. Ακολούθως γίνεται ανίχνευση της απορρόφησης στα 490 nm (και στα 650 παράλληλα για την απαλοιφή του θορύβου) σε μία συσκευή φωτομέτρηση (μονοχρωμάτορα) Monochromator Microplate Reader safire 2 TECAN AUSTRIA G.M.B.H./ Measurement parameter Editor Magellan (version 6). 5. Δοκιμασία NRU Η δοκιμασία NRU (Neutral Red Uptake), απορρόφησης ουδέτερου ερυθρού, διεξάγεται σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο των Borenfreund και Puerner και των συνεργατών τους [87] σε συμφωνία με τις τροποποιήσεις του φορέα ICCVAM. Τα κύτταρα, μετά την θρυψινοποίηση, επιστρώνονται σε τρυβλία 96 φρεατίων με πυκνότητα επίστρωσης 3,2-3,5 x 10 3 κύτταρα/100 μl/φρεάτιο σε μέσο καλλιέργειας και τοποθετούνται σε κλίβανο. Μετά από 48 ώρες επώαση (37 ο C / 5% CO 2 ), τα [84]

85 κύτταρα επεξεργάζονται σε οκτώ διαφορετικές συγκεντρώσεις για κάθε μία από τις χημικές ουσίες δοκιμής, διαλυμένες σε 100 μl μέσου καλλιέργειας. Όλα τα χημικά αραιώνονται, στο αντίστοιχο για το κύτταρο, μέσο καλλιέργειας χωρίς οποιονδήποτε άλλον διαλύτη. Το δείγμα αρνητικού ελέγχου επωάζεται με προσθήκη μόνο καλλιεργητικού μέσου. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάζονται (37 ο C / 5% CO 2 ) για 48 ακόμα ώρες σε κλίβανο. Μετά την περίοδο επώασης, αφαιρούνται τα χημικά διαλύματα από όλες τις πλάκες και τα κύτταρα πλύθηκαν με 150 μl / φρεάτιο προθερμασμένου PBS. Στην συνέχεια προετοιμάζεται το διάλυμα NR (NR Stock Solution), το οποίο περιέχει 0,4 g χρωστικής NR αραιωμένη σε 100 ml milliq Η 2 Ο. Ακολούθως, 1 ml από το διάλυμα NR Stock Solution, αραιώνεται σε 79ml καλλιεργητικού μέσου, έτσι ώστε να σχηματιστεί το διάλυμα NR-θρεπτικού υλικού. Αφού αφαιρεθεί το PBS, προστίθενται 250μl/ φρεάτιο διαλύματος NR-θρεπτικού υλικού. Ακολουθεί επώαση στον κλίβανο (37 ο C / 5% CO 2 ) για τρείς ακόμα ώρες. Τα κύτταρα παρατηρούνται τακτικά κατά την διάρκεια της επώασης, κυρίως μεταξύ των 2 και 3 ωρών, προκειμένου να ελεγχθεί ο σχηματισμός κρυστάλλων NR. Μετά την περίοδο επώασης, αφαιρείται το NR-θρεπτικού υλικού από όλες τις πλάκες και τα κύτταρα ξεπλένονται, δύο φορές, με 250 μl / φρεάτιο προθερμασμένου PBS. Στην συνέχεια απομακρύνεται το PBS και προστίθενται, για την απελευθέρωση της χρωστικής, 100μl /φρεάτιο σταθεροποιητή εκρόφησης (NR desorbing fixative) που περιέχει 1% οξικό οξύ, 50% αιθανόλη και 49% Η 2 Ο. Τα τρυβλία ανακινούνται για λεπτά για την διαμόρφωση ενός ομοιογενούς διαλύματος. Ακολούθως γίνεται ανίχνευση της απορρόφησης στα 540 nm σε μία συσκευή φωτομέτρηση (μονοχρωμάτορα) Monochromator Microplate Reader safire2 TECAN AUSTRIA G.M.B.H./ Measurement parameter Editor Magellan (version 6). [85]

86 6. Χρώση διπλού φθορισμού με φαλλοϊδίνη (Phalloidin) και DAPI Η φαλλοϊδίνη (Phalloidin) είναι μία τοξίνη-δικυκλικό πεπτίδιο που σχετίζεται με τα θανατηφόρα μανιτάρια Amanita phalloides. Η φαλλοϊδίνη δεσμεύεται ειδικά με τα πολυμερή ακτίνης του κυτταρικού σκελετού. Η χαρακτηριστική ομάδα Alexa Fluor που είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένη στην Φαλλοϊδίνη επιτρέπει την οπτικοποίηση του φθορισμού. Το DAPI (4,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη) είναι μία φθορίζουσα χρωστική που συνδέεται ισχυρά με τις περιοχές του DNA που είναι πλούσιες σε αδενίνη (Α) και θυμίνη (Τα). Ως εκ τούτου, η χρώστική είναι ειδική για τις πυρηνικές περιοχές του κυττάρου, και σε μικρότερο βαθμό για την χρώση του μιτοχονδριακού DNA. Για την διπλή χρώση των κυττάρων, που καλλιεργούνται στα ικριώματα (καλλιέργεια τριών διαστάσεων) ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Ξέπλυμα με 200μl PBS/φρεάτιο 1. Αφαίρεση του PBS 2. Προσθήκη 100μl/φρεάτιο διαλύματος 4% PFA (παραφορμαλδεΰδη διαλυμένη σε PBS) για 10 λεπτά, για την μονιμοποίηση των κυττάρων. 3. Αφαίρεση του PFA 4. Ξέπλυμα για δύο φορές με 200μl PBS/φρεάτιο 5. Αφαίρεση του PBS 6. Προσθήκη 50μl/φρεάτιο διαλύματος 0.1% Triton X-100 (Triton X-100 αραιωμένο σε PBS) για να γίνουν διαπερατά τα κύτταρα. 7. Προσθήκη 50μl/φρεάτιο διαλύματος Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 αραιωμένο σε PBS) για την χρώση της F-ακτίνης του κυτταρικού σκελετού. 8. Ξέπλυμα με 200μl PBS/φρεάτιο 9. Αφαίρεση του PBS 10. Προσθήκη 50μl/φρεάτιο διαλύματος DAPI ( διάλυμα 14.3mM σε PBS με 0.1% Triton X-100) για 10 λεπτά για την χρώση του πυρήνα 11. Ξέπλυμα με 200μl PBS/φρεάτιο 12. Εξέταση με συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal) [86]

87 7. Στατιστική Ανάλυση Οι τιμές οπτικής πυκνότητας (OD values) της απορρόφησης, για τις δοκιμασίες NRU και MTS, μεταφέρθηκαν σε υπολογιστικά φύλλα του προγράμματος Microsoft Office Excel Το ποσοστό της επιβίωσης των κυττάρων εκφράστηκε θέτοντας ως μέγιστη την επιβίωση των δειγμάτων αρνητικού ελέγχου. Στην συνέχεια προσδιορίστηκαν οι τιμές IC 50 για κάθε μία από τις δώδεκα (12) χημικές ουσίες και για όλες τις διαφορετικές συνθήκες υπό τις οποίες εξετάστηκαν (κύτταρα, κυτταρικές σειρές, τρόπος καλλιέργειας και δικιμασίες). Οι τιμές IC 50 υπολογίστηκαν με χρήση της αναδιαταχθείσας συνάρτησης: Η συνάρτηση αυτή αποτελεί μία εξίσωση-μαθηματικό μοντέλο τεσσάρων παραμέτρων και προτείνετε από τον φορέα ICCVAM. Ο υπολογισμός και όλη η περεταίρω στατιστική επεξεργασία έγινε με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος GraphPad Prism 5. Τα δεδομένα IC 50 χρησιμοποιήθηκαν για να πραγματοποιηθεί μια ανάλυση συσχέτισης γραμμικής παλινδρόμησης χρησιμοποιώντας τις αντίστοιχες τιμές LD 50 που παρέχονται από την αναφορά αξιολόγησης του φορέα ICCVAM. Στην συνέχεια έγιναν σύγκρίσης των γραμμικών παλινδρομήσεων τόσο μεταξύ των κυττάρων και των διαφορετικών συνθηκών καλλιέργειας/δοκιμασιών που ελέχθησαν στο εργαστήριο μας in vitro/ex vivo, όσο και με τις γραμμικές παλινδρομήσεις των δύο ήδη εγκεκριμένων και καθιερωμένων κυτταρικών σειρών ινοβλαστών NIH 3T3 και φυσιολογικών κερατινοκυττάρων NHK. Τα δεδομένα για αυτές τις σειρές προήλθαν από την αναφορά αξιολόγησης του φορέα ICCVAM. Για την ποσοτική αξιολόγηση της ανάλυσης γραμμικής παλινδρόμησης που πραγματοποιήθηκε, χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής r 2. Οι προκύπτουσες παλινδρομήσεις συγκρίθηκαν μεταξύ τους με την στατιστική δοκιμή F-test για τις κλίσεις (slopes) των ευθειών και τις τομές (intercepts) του άξονα των y. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε πρόβλεψη των τιμών LD 50 με βάση της τιμές IC 50 με χρήση των εξισώσεων: [87]

88 RC rat-only millimole (log LD50 (mmol/kg) = log IC50 (mm) ) για χημικές ουσίες γνωστού μοριακού βάρους. RC-rat only weight (log LD50 (mg/kg) = log IC50 (lg/ml) ) για χημικές ουσίες άγνωστου μοριακού βάρους. Τέλος πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση του εύρους διασποράς των τιμών μεταξύ: 1) των διαφορετικών κυττάρων ή κυτταρικών σειρών και 2) των διαφορετικών χημικών ουσιών και των διαφορετικών μεθόδων προσδιορισμού της κυτταρικής βιωσιμότητας. Η ετερογένεια και η ακρίβεια, των δοκιμασιών in vitro αξιολόγησης της τοξικότητας προσδιορίστηκε με τις μεθόδους: α) Διακύμανση εντός της δοκιμασίας (%CV εντός κάθε τρυβλίου/για κάθε χημική ουσία) -intra assay variation β) Διακύμανση των τιμών μεταξύ των διαφορετικών πειραμάτων (%CV μεταξύ διαφορετικών τρυβλίων/ τιμών IC 50 που αντιστοιχούν σε διαφορετικές χημικές ουσίες)-inter assay variation γ) Διακύμανση τιμών μεταξύ των διαφορετικών μεθόδων καλλιέργειας των κυττάρων- inter culture variation [88]

89 Αποτελέσματα [89]

90 In vitro κυτταροτοξικότητα Αρχικά σχεδιάστηκαν, με την βοήθεια του στατιστικού προγράμματος GraphPad Prism 5 οι καμπύλες βιωσιμότητας (εικόνα 26) για τις 12 χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στις δοκιμασίες in vitro κυτταροτοξικότητας. Σχεδιάστηκαν καμπύλες βιωσιμότητας και για τις 12 χημικές ουσίες για τα κύτταρα WJ-hMSCs με την δοκιμασία MTS και την δοκιμασία NRU.Επίσης σχεδιάστηκαν καμπύλες βιωσιμότητας και για τις 12 χημικές ουσίες για τα κύτταρα HepG2 και NIH 3T3 με την δοκιμασία MTS. Σε ότι αφορά τα κύτταρα AD-hSCs σχεδιάστηκαν 7 καμπύλες βιωσιμότητας για τις αντίστοιχες 7 χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν (χλωριούχος υδράργυρος II, αρσενικώδες νάτριο, διένυδρο διχρωμικό νάτριο, φθοριούχο νάτριο, μονοϋδρική θειική ατροπίνη, χλωριούχο κάλιο και υποχλωριώδες νάτριο) με την δοκιμασία MTS. Ομοίως και για την δοκιμασία σε καλλιέργεια τριών διαστάσεων (3D) σχεδιάστηκαν 7 καμπύλες βιωσιμότητας. Χρησιμοποιήθηκαν 8 διαφορετικές συγκεντρώσεις για κάθε χημική ουσία, συμπεριλαμβανομένης και της μηδενικής συγκέντρωσης. Στην συνέχεια προσδιορίστηκαν οι τιμές IC 50 με την χρήση της συνάρτησης Hillslope. Οι τιμές συγκεντρώθηκαν στον πίνακα 5. Επίσης στον πίνακα 1 τοποθετήθηκαν και οι τιμές IC 50 για τις ίδιες χημικές ουσίες, δεδομένα από την μελέτη της Scanu και των συνεργατών της [100]. Επίσης τοποθετήθηκαν οι τιμές in vivo τοξικότητας LD 50, από την βάση δεδομένων RC. [90]

91 % Viability % Viability % Viability % Viability C7 C5 C3 C1 Καμπύλες Επιβίωσης Χλωριούχος υδράργυρος II Χλωριούχο MTS in UC-MSC K.Cl Concentration (log g/ml) Κάλιο Concentration (log g/ml) S.Hypochloride Υποχλωριώδες 160 Νάτριο Concentration (log g/ml) Αρσενικώδες νάτριο S.A.S Concentration (log g/ml) Εικόνα 26. Κυτταροτοξικότητα των κυττάρων hwj-scs μετά από 48 ώρες έκθεση σε διάφορες συγκεντρώσεις (C7 έως C1) των χημικών ουσιών. Στο αριστερό πλαίσιο φαίνονται οι μικρογραφίες (25x) των κυττάρων hwj-scs μετά από 48 ώρες έκθεση σε τέσσερις αντιπροσωπευτικές, των τεσσάρων κατηγοριών κινδύνου χημικές ουσίες. Στον δεξιό πίνακα απεικονίζονται οι αντίστοιχες καμπύλες επιβίωσης (y =% βιωσιμότητα, x = συγκέντρωση σε logμg / ml) για κάθε χημική ουσία και οι τιμές IC 50 (μg / ml -επάνω δεξιά γωνία των διαγραμμάτων). Οι αιχμές των βελών στις καμπύλες επιβίωσης απεικονίζουν τις τέσσερις αντίστοιχες συγκεντρώσεις που παρουσιάζονται στις μικροφωτογραφίες στα αριστερά. [91]

92 Συγκεντρωτικά Αποτελέσματα IC 50 Χημικές ουσίες LD 50 mmol/kg BM-MSCs mm In Silico δεδομένα IC 50 3T3 Balb/c mm NHK mm Mercury II Cloride 0,0037 0,16 0,0152 0,0213 Cycloeximide 0,0071 0,006 0,0007 0,0003 Sodium arsenite Solution 0,3156 0,01 0,0058 0,0037 Sodium dichromate dihydrate 0,1908 0,004 0,002 0,0024 Cadmium II chloride 0,4801 0,002 0,0028 0,0098 Sodium Fluoride 4,29 1,56 1,858 1,164 Propanolol HCL 1,589 0,08 0,0477 0,1224 Atropine Sulfate monohydrate 0,9204 0,64 0,1094 0,1178 Potassium cloride 34,9 75,01 47,68 30,01 Trichloroacetic Acid 30,59 8,62 5,519 2,529 Sodium Hypochloride 138,7 21,51 13,97 20,18 Glycerol 137,8 742,66 264,4 268,5 Χημικές ουσίες WJ-MTS mm WJ-NRU mm In Vitro δεδομένα NIH 3T3 mm IC 50 HepG2 mm WJscaffolds ADhMSCs Mercury II Cloride 0,0655 0,0308 0,0390 0,0166 0,0620 0,0514 Cycloeximide 0,0002 0,0000 0,0000 0,0034 Sodium arsenite Solution 0,0160 0,0124 0,0074 0,0039 0,0162 0,0359 Sodium dichromate dihydrate 0,0012 0,0001 0,0072 0,0029 0,0015 0,0018 Cadmium II chloride 0,0193 0,1431 0,0155 0,0693 Sodium Fluoride 0,9680 0,7394 2,3597 2,5755 0,6454 1,5271 Propanolol HCL 0,2070 0,2203 0,1042 0,1432 0,3214 Atropine Sulfate monohydrate 2,1141 1,4195 0,2450 0,1556 0,2938 Potassium cloride 105, , , , , ,5885 Trichloroacetic Acid 9,6778 5, , ,8614 Sodium Hypochloride 8,0385 4,8549 5, ,5389 7,4847 2,9186 Glycerol 671, , , ,9898 Πίνακας 6. Συγκεντρωτικά αποτελέσματα για τις τιμές IC 50 από τις δοκιμασίες in vitro κυτταροτοξικότητας. Στον πρώτο πίνακα Α παραθέτονται τα in silico δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ στον πίνακα Β παρουσιάζονται συγκεντρωμένα τα in vitro δεδομένα. Τα παραπάνω δεδομένα και τιμές χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις αναλύσεις αυτής της μελέτης. [92]

93 logld50 mm Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων WJ-hMSCs με 3Τ3 (BALB / c) και NHK Έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs και των ήδη επικυρωμένων κυττάρων 3Τ3 (BALB / c) και NHK. Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs είναι (r 2 =0,695) έναντι των ήδη επικυρωμένων κυττάρων 3Τ3 (BALB / c) και NHK (r 2 =0,774 και r 2 =0,795 αντίστοιχα). Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 3 3T3 (BALB/c) 2 NHK WJSC log IC50 mm Είδος Κυττάρου Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P (slope) P (intercept) WJSC 3Τ3 (BALB/c) log LD 50 = 0,5776 log IC , log LD 50 = 0,7052 log IC ,6644 0,774 NHK log LD 50 = 0,7291 log IC ,677 0,795 Εικόνα 27. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs, 3Τ3 (BALB / c) και NHK. Η γραμμή παλινδρόμησης των κυττάρων WJ-hMSCs αντιπροσωπεύεται από τη διακεκομμένη γραμμή και τα σημεία δεδομένων επισημαίνονται ως σύμβολα "x", και των κυττάρων 3Τ3 (BALB / c) (συνεχής γραμμή, ανοικτά τετράγωνα) και NHK (διακεκομμένη γραμμή, κλειστά τρίγωνα) για τις 12 επιλεγμένες χημικές ουσίες. Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης. Τα δεδομένα για τα κύτταρα hwj-scs ελήφθησαν με την μέθοδο NRU (μετατροπής ουδέτερου ερυθρού) στο εργαστήριο μας, ενώ τα στοιχεία για 3Τ3 (BALB / c) και NHK, και οι τιμές LD 50 προήλθαν από την μελέτη επικύρωσης της ICCVAM. [93]

94 logld50 mm/kg Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων WJ-hMSCs με HepG2 και NIH 3T3 Στην συνέχεια έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs και των HepG2 και ΝΙΗ 3Τ3. Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs είναι (r 2 =0,715) έναντι των ήδη καθιερωμένων κυτταρικών σειρών HepG2 και ΝΙΗ 3Τ3 (r 2 =0,758 και r 2 =0,788 αντίστοιχα). Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά NIH 3T3 HepG2 WJSC log IC50 mm Είδος Κυττάρου Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P (slope) P (intercept) WJSC log LD 50 = 0,6543 log IC ,715 ΝΙΗ 3Τ3 log LD 50 = 0,6461 log IC ,5399 0, HepG log LD 50 = 0,7092 log IC ,4005 0,788 Εικόνα 28. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs, HepG2 και NΙΗ 3Τ3. Η γραμμή παλινδρόμησης των κυττάρων WJ-hMSCs αντιπροσωπεύεται από τη διακεκομμένη γραμμή και τα σημεία δεδομένων επισημαίνονται ως σύμβολα "x"), και των κυττάρων HepG2 (διακεκομμένη γραμμή, κλειστά τρίγωνα) και NΙΗ 3Τ3 (συνεχής γραμμή,κλειστά τρίγωνα) για τις 12 επιλεγμένες χημικές ουσίες. Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης. [94]

95 logld50 mm Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων WJ-hMSCs με AD-hMSCs Στην συνέχεια έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs και μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων λίπους. Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs (0.518) και AD-hMScs (0.538) δεν διαφέρει σημαντικά. Στα κύτταρα AD-hMSCs δοκιμάστηκαν μόνο 7 χημικές ουσίες, καθώς ο μεγάλος χρόνος διπλασιασμού τους (>150 ώρες) δεν επέτρεπε την συγκέντρωση ικανών αριθμών αυτού του τύπου κυττάρου για την δοκιμασία. Έτσι η σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων έγινε για τις 7 μόνο χημικές ουσίες. Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 3 2 WJSC ADSC log IC50 mm Είδος Κυττάρου Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P P WJSC log LD 50 = log IC ADSC log LD 50 = log IC Εικόνα 29. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs και των κυττάρων AD-hMScs. Η γραμμή παλινδρόμησης των κυττάρων WJ-hMSCs αντιπροσωπεύεται από τη διακεκομμένη γραμμή και τα σημεία δεδομένων επισημαίνονται ως σύμβολα "x"), και των κυττάρων AD-hMScs (ευθεία γραμμή, ανοιχτοί κύκλοι) για τις 7 επιλεγμένες χημικές ουσίες: χλωριούχος υδράργυρος II, αρσενικώδες νάτριο, διένυδρο διχρωμικό νάτριο, φθοριούχο νάτριο, μονοϋδρική θειική ατροπίνη, χλωριούχο κάλιο και υποχλωριώδες νάτριο. Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης [95]

96 logld50 mm Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων για τα WJ-hMSCs μεταξύ των δοκιμασιών NRU και MTS. Έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs μεταξύ των δοκιμασιών NRU και MTS. Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs μεταξύ των δοκιμασιών NRU (0.695) και MTS (0.715) δείχνει μια μικρή υπεροχή της δοκιμασίας MTS έναντι της NRU συνολικά. Για τις δύο διαφορετικές δοκιμασίες προσδιορισμού της κυτταρικής επιβίωσης δοκιμάστηκαν και οι 12 χημικές ουσίες. Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. 3 WJSC (MTS) 2 WJSC (NRU) log IC50 mm Είδος Κυττάρου Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P P a) WJSC (MTS) logld 50 = 0,6543 log IC WJSC - - (NRU) log LD 50 = log IC Εικόνα 30. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs μεταξύ των δοκιμασιών NRU και MTS. Η γραμμή παλινδρόμησης της δοκιμασίας NRU αντιπροσωπεύεται από την ευθεία γραμμή, κλειστά τρίγωνα και της δοκιμασίας MTS από τη διακεκομμένη γραμμή και τα σημεία δεδομένων επισημαίνονται ως σύμβολα "x". Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης. [96]

97 logld50 mm Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων WJ-hMSCs με ΒΜ-hMSCs Στην συνέχεια έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs και των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον μυελό των οστών BM-hMSCs. Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs (0,695) και των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον μυελό των οστών BM-hMSCs (0.628) δείχνει υπεροχή της συσχέτισης WJ-hMSCs έναντι των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον μυελό των οστών BM-hMSCs. Για τις δύο διαφορετικές δοκιμασίες προσδιορισμού της κυτταρικής επιβίωσης δοκιμάστηκαν και οι 12 χημικές ουσίες. Τα δεδομένα για τα BM-hMSCs προήλθαν από το άρθρο των Scanu και των συνεργατών της [100]. Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά WJSC ΒΜSC log IC50 mm Είδος Κυττάρου Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P P WJSC (NRU) log LD 50 = 0,5776 log IC ,695 0, BMSC log LD 50 = 0,6566 log IC ,3954 Εικόνα 31. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs και των BMhMSCs. Η γραμμή παλινδρόμησης των κυττάρων WJ-hMSCs αντιπροσωπεύεται από τη διακεκομμένη γραμμή και τα σημεία δεδομένων επισημαίνονται ως σύμβολα "x" και των μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από τον μυελό των οστών BM-hMSCs από την ευθεία γραμμή, κλειστά τρίγωνα. Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης. [97]

98 logld50 mm Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων για τα WJ-hMSCs μεταξύ των καλλιεργειών των κυττάρων σε δύο (2D) και τρείς διαστάσεις (3D). Ακολούθως, έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs μεταξύ των καλλιεργειών των κυττάρων σε δύο (2D) και τρείς διαστάσεις (3D). Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs μεταξύ των καλλιεργειών των κυττάρων σε δύο (2D) (0,545) και τρείς διαστάσεις (3D) (0,590) δείχνει μια μικρή υπεροχή της καλλιέργειας των κυττάρων σε τρείς διαστάσεις (3D) έναντι των καλλιεργειών των κυττάρων σε δύο (2D) διαστάσεις, συνολικά. Για τις δύο διαφορετικές δοκιμασίες προσδιορισμού της κυτταρικής επιβίωσης δοκιμάστηκαν και 7 χημικές ουσίες. Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά D 3D log IC50 mm Είδος Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P P In vitro (2D) Ex vivo (3D) log LD 50 = 0,6768 log IC , log LD 50 = 0,7858 log IC ,590 jhbjhbn mnlkn0,5018 Εικόνα 32. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs μεταξύ των καλλιεργειών των κυττάρων σε δύο (2D) (η γραμμή παλινδρόμησης αντιπροσωπεύεται από τη διακεκομμένη γραμμή και τα σημεία δεδομένων επισημαίνονται ως σύμβολα "x") και τρείς διαστάσεις (3D) (ευθεία γραμμή, κλειστά τρίγωνα). Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης. [98]

99 logld50 mm/kg Σύγκριση γραμμικών παλινδρόμησεων για τα WJ-hMSCs μεταξύ των καλλιεργειών των κυττάρων από τρείς διαφορετικούς δότες. Ακολούθως, έγινε σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs μεταξύ δειγμάτων από τρείς διαφορετικούς δότες (W1,W2,W3). Από τις τιμές r 2 συμπεραίνουμε πώς οι συσχέτιση των τιμών LD 50 και IC 50 για τα βλαστικά κύτταρα WJ-hMSCs μεταξύ των δειγμάτων από τρείς διαφορετικούς δότες (W1,W2,W3) είναι (0,624, 0,687 και 0,753 αντίστοιχα). Φαίνεται ότι δεν υπάρχουν μεγάλες διαφορές μεταξύ δειγμάτων από τρείς διαφορετικούς δότες, συνολικά. Για τις δύο διαφορετικές δοκιμασίες προσδιορισμού της κυτταρικής επιβίωσης δοκιμάστηκαν και 5 χημικές ουσίες. Το F-test που πραγματοποιήθηκε μεταξύ των κλίσεων και των τομών των παραγόμενων ευθειών δεν έδειξε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά WJ1 WJ2 WJ log IC50 mm Είδος Κυττάρου Εξίσωση παλινδρόμησης r 2 P P (intercept) WJ logld 50 = 0,9275 log IC ,2887 0,624 (slope) WJ2 log LD 50 = 0,6461 log IC ,5399 0, WJ log LD 50 = 0,7092 log IC ,4005 0,753 Εικόνα 33. Σύγκριση των γραμμικών παλινδρομήσεων των κυττάρων WJ-hMSCs μεταξύ μεταξύ δειγμάτων από τρείς διαφορετικούς δότες (W1,W2,W3). Επιλέχθηκαν 5 χημικές ουσίες: χλωριούχος υδράργυρος II, αρσενικώδες νάτριο, φθοριούχο νάτριο, χλωριούχο κάλιο και υποχλωριώδες νάτριο. Οι παράμετροι της παλινδρόμησης παρουσιάζονται σε πίνακα κάτω από τα διαγράμματα παλινδρόμησης. [99]

100 Χρώση με DAPI και φαλοϊδίνη σε καλλιέργειες τριών διαστάσεων (3D) και φωτογραφίες σε συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal microscopy) Στην συνέχεια με χρήση των χρωστικών DAPI και Phalloidin πραγματοποιήθηκε χρώση των πυρήνων και των πολυμερών ακτίνης του κυτταρικού σκελετού (αντίστοιχα) των WJ-hMSCs σε καλλιέργειες τριών διαστάσεων, που καλλιεργούνται σε ικριώματα τριών διαστάσεων. Στόχος ήταν καταρχήν η αποτύπωση την ανάπτυξη των WJ-hMSCs πάνω στα ικριώματα και δεύτερον η αποτύπωση σε εικόνα της επίδρασης της χημικής ένωσης φθοριούχο νάτριο στις καλλιέργειες των WJ-hMSCs στο μοντέλο των ικριωμάτων. Επιβεβαιώθηκε ότι τα WJ-hMSCs προσκολλώνται, αναπτύσσονται και πολλαπλασιάζονται πάνω στις μικρο-ίνες των ικριωμάτων. Επίσης, όπως φαίνεται στην εικόνα, όταν προστίθεται φθοριούχο νάτριο μειώνεται ο αριθμός των κυττάρων και αναδιατάσσεται ο κυτταρικός σκελετός. Εικόνα 34. Ex vivo έλεγχος της κυτταροτοξικότητας σε 3D ικριώματα με χρήση της δοκιμασίας MTS. Αριστερά, φυσιολογική ανάπτυξη και μορφολογία των WJSC στο 3D μικροπεριβάλλον του ικριώματος αδρανούς πολυστυρολίου (PS). Δεξιά, συγκέντρωση NaF κοντά στο IC 50. Κάθε σύνθετη εικόνα προήλθε από τη συγχώνευση 10 συνεστιακών μικρογραφιών. Μπλε = DAPI, πυρηνική χρώση. Πράσινο = φαλλοϊδίνη, χρώση κυτταροσκελετού. Πρόβλεψη των in vivo τιμών LD 50 από τις in vitro τιμές IC 50 Πραγματοποιήθηκε πρόβλεψη των in vivo τιμών LD 50 από τις in vitro τιμές IC 50 μέσω δύο διαφορετικών εξισώσεων των RC rat-only millimole και RC-rat only weight με χρήση του προγράμματος GraphPad Prism 5. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα (πίνακας 6 και 7) το μεγαλύτερο ποσοστό πρόβλεψης παρουσιάζουν [100]

101 τα κύτταρα WJ-MSCs με την δοκιμασία MTS (50% και για τις δύο εξισώσεις). Όταν αφαιρέθηκε ο ορός από την καλλιέργεια των WJ-MSCs το ποσοστό ανήλθε στο 58% για την RC-rat only weight και 50% για την RC rat-only millimole. Για τον ίδιο τύπο, με χρήση της δοκιμασία NRU το ποσοστό ορθής πρόβλεψής ανήλθε στο 41,7% και για τις δύο εξισώσεις. Για τις καθιερωμένες κυτταρικές σειρές, NHK και BALB/c3T3 τα ποσοστά ορθής πρόβλεψής των τιμών LD 50 είναι 25% και 33,3% για τις δύο εξισώσεις. Σε ότι αφορά το κατώτερο τμήμα του πίνακα 1, δηλαδή για τις δοκιμασίες που ελέχθησαν μόνο επτά από τις δώδεκα χημικές ουσίες αναφοράς, το ποσοστό ορθής πρόβλεψης για τα WJ-MSCs καλλιεργημένα σε συνθήκες τριών διαστάσεων με την μέθοδο MTS, δεν είναι υψηλό (28,6% και 42,9%). Τα βλαστικά κύτταρα λίπους AD-hMSCs παρουσιάζουν ακόμη πιο χαμηλό ποσοστό ορθής πρόβλεψης του LD 50 (42,9% και 14,3%). Οι ορθές προβλέψεις για τις κυτταρικές σειρές HepG2 (41,7% και 67%) και NIH 3T3 (41,7% και 33.3%) είναι χαμηλότερες από τα WJ-MSCs. 12 chemicals (in vitro/in silico data) 7 chemicals (in vitro/ex vivo data) LogIC 50 mm - LogLD 50 mmol/kg Γραμμική παλινδρόμηση Ποσοστό ορθής πρόβλεψης τοξικότητας (%) r 2 p RC rat only Weight RC rat only Millimole WJSC/WJSC* 0.737/0.775 < / /50 WJSC-NRU < HEPG < NIH -3T < NHK < BALBc-3T < BMSC < WJSC/WJSC* 0.581/0.611 <0.05/< WJSC-3D < WJSC-NRU NS ADSC NS HEPG < NIH -3T < Πίνακας 7. Σύνοψη όλων των αποτελεσμάτων για την σύγκριση των συσχετίσεων μέσω γραμμικής παλινδρόμησης και πρόβλεψης των τιμών LD 50 μεταξύ όλων των κυττάρων και των κυτταρικών σειρών αλλά και όλων των διαφορετικών συνθηκών που χρησιμοποιήθηκαν. Ο πίνακας είναι χωρισμένος σε δύο τμήματα. Στο πάνω τμήμα παρατίθενται οι τιμές για τις 12 χημικές ουσίες. Στο κάτω τμήμα παρατίθενται οι τιμές μόνο για 7 ουσίες καθώς σε ορισμένες περιπτώσεις (ικριώματα, ADhMSCs) δεν ήταν δυνατός ο έλεγχος και των 12 χημικών ουσιών. p = επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας, NS = μη σημαντικό στατιστικά αποτέλεσμα (p>0.5), * χωρίς την προσθήκη ορού. [101]

102 RC Rat-only weight regression WJSC (mg/kg GHS) RC Rat-only millimole regression WJSC (mg/kg GHS) Chemicals (GHS) RC rodent (mg/kg) MTS NRU MTS NRU Mer.Chl. (1) U 233 U 343 U 246 U Cyclohex. (1) 2 38 U 15 U 29 U 10 U Sod.Ars. (2) U 126 U 88,4 U 78 S.D.D. (2) O Cad.Chl. (3) U U Sod.Fluor U Prop.HCl A.S.M U 1373 U 4033 U 2416 U Pot.Chl T.A.A O 1344 O 1849 O 1466 O Sod.Hypo O 945 O 777 O 622 O Glycerol Correct prediction score (%) 5/12 (41.7) 5/12 (41.7)* 6/12 (50) 5/12 (41.7)* Πίνακας 8. Αποτελέσματα πρόβλεψης της τοξικότητας πρόβλεψη, με τις δοκιμασίες MTS και NRU για τα κύτταρα WJ-hMScs. Το σύμβολο U αφορά την υποεκτίμηση της τοξικότητας ενώ το O την υπερεκτίμηση της τοξικότητας. Ο αστερίσκος * για τα ποσοστά πρόβλεψης των κυττάρων Balb/C-3T3 και NHK (Μελέτη επικύρωσης ICCVAM). Χρησιμοποιείται πλάγια έντονη γραφή για ορθή πρόβλεψη και με τις δύο εξισώσεις. [102]

103 Στατιστική ανάλυση της διακύμανσης- ακρίβειας της δοκιμασίας Υπολογίστηκαν οι διακυμάνσεις των τιμών εντός κάθε ξεχωριστής δοκιμασίας και για κάθε χημική ουσία. Ωστόσο δεν παρουσιάστηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά, γεγονός που φαίνεται να ισχύει όλους τους τύπους κυττάρων αφού ο μέσος όρος των τιμών CV% + / - SD ήταν 18.3 ± 3.9, 12.9 ± 4.2 και 6.3 ± 15,για τα WJhMSCs, τα ΝΙΗ 3Τ3 και τα HepG2 κύτταρα, αντίστοιχα (Εικόνα 35). Ωστόσο, η διασπορά των τιμών ήταν γενικά χαμηλότερη για τα WJ-hMSCs σε σχέση με τους υπόλοιπους τύπους κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι η χημική ένωση προπανολόλη παρουσίασε τις υψηλότερες τιμές διακύμανσης και διασποράς των τιμών σε όλες τις κυτταρικές σειρές που ελέχθησαν (Εικόνα 35). Σε ότι αφορά τις δοκιμασίες βιωσιμότητας που χρησιμοποιήθηκαν, την χαμηλότερη διακύμανση παρουσίασε η δοκιμασία NRU για όλες τις χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν με εξαίρεση την προπανολόλη και το χλωριούχο κάλιο. Σε ότι αφορά την διακύμανση των τιμών, μεταξύ των διαφορετικών δοκιμασιών, κυμαινόταν μεταξύ 13 και 20 % και δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ομάδων (Σχήμα 11). Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι όταν προσδιορίστηκε η τοξικότητα σε συνθήκες χωρίς ορό ( για 2 επιλεγμένες χημικές ουσίες) η διακύμανση WJ-hMSCs μειώθηκε σημαντικά ( p < 0,001) κατά σχεδόν 3 φορές. [103]

104 % CV % CV % cv % CV WJSC (MTS) WJSC (NRU) T3-NIH HepG Εικόνα 35. Οι διακυμάνσεις των τιμών εντός των δοκιμασιών (% CV για κάθε τρυβλίο πολλαπλών φρατίων/ για κάθε χημική ουσία) για τα κύτταρα WJSC, NIH, και HepG2. Οι χημικές ουσίες εμφανίζονται στον άξονα x κατά φθίνουσα σειρά κυτταροτοξικότητας. Οι διακυμάνσεις των τιμών εντός των δοκιμασιών που υπολογίστηκαν για κάθε χημική ουσία δεν διέφεραν σημαντικά για όλους τους 3 τύπους κυττάρων και με τις δύο διαφορετικές δοκιμασίες προσδιορισμού της κυτταροτοξικότητας (MTS και NRU). [104]

105 Εικόνα 36. Αποτέλεσμα του FBS στην διακύμανση των τιμών εντός της δοκιμασίας WJSC-MTS. (p <0,001) Εικόνα 37. Διακυμάνσεις των τιμών ανάμεσα στα διαφορετικά κύτταρα/κυτταρικές σειρές και τρόπων καλλιέργειας (2D και 3D) που χρησιμοποιηθήκαν. [105]