Αρχή της µεθόδου: , ή Η 2. Είδη Αέριας Χρωµατογραφίας:

Transcript

1 Αέρια Χρωµατογραφία Gas Chromatography (GC-FID) Αρχή της µεθόδου: Ο διαχωρισµός των συστατικών ενός µίγµατος γίνεται µέσω εκλεκτικών προσροφήσεων ή κατανοµών τους µεταξύ µιας υγρής ή στερεάς στατικής φάσης και µιας αέριας κινούµενης φάσης µέσα στη στήλη της χρωµατογραφίας. Το φέρον αέριο (αδρανές, απαλλαγµένο από προσµίξεις), που είναι συνήθως Ν 2, ή Η 2,ή He ή Ar, οδηγείται από τη φιάλη υψηλής πίεσης µέσα στη στήλη. Η εισαγωγή του δείγµατος γίνεται µε µικροσύριγγα στη βαλβίδα εισαγωγής του δείγµατος στην κορυφή της στήλης. Η παροχή του αερίου ρυθµίζεται µε ειδικές βαλβίδες και ροόµετρα. Είδη Αέριας Χρωµατογραφίας: (α) Στερεά Αέρια Χρωµατογραφία(GSC): Το υλικό πλήρωσης της στήλης είναι µια στερεά φάση µε ενεργή επιφάνεια. Ο διαχωρισµός των συστατικών του µίγµατος οφείλεται στην προσρόφηση αυτών πάνω στην ενεργή επιφάνεια της στερεάς φάσης, π.χ. Silica gel, Αl2Ο3, µοριακά κόσκινα κ.α. (β) Υγρή Αέρια Χρωµατογραφία(GLC ή GC): Η στατική φάση είναι ένα στερεό (κόκκοι) καλυµµένο µε λεπτή στοιβάδα υγρού. Ο διαχωρισµός των συστατικών του µίγµατος οφείλεται στη διαφορά των συντελεστών κατανοµής τους ανάµεσα στην υγρή και στην αέρια φάση. Όσο µεγαλύτερη χηµική συγγένεια υπάρχει ανάµεσα στα συστατικά του αερίου µίγµατος και στην υγρή επικάλυψη της στερεάς φάσης, τόσο ο χρόνος συγκράτησής του στη στήλη είναι µεγαλύτερος.

2 Εισαγωγή δείγµατος στη στήλη (injection) : Υγρά δείγµατα εισάγονται στη στήλη µέσω ενός ελαστικού διαφράγµατος (σε βαλβίδα εισαγωγής injector) που βρίσκεται στην είσοδο του οργάνου και σε όγκους 1µl µε µία µικροσύριγγα. Το φέρον αέριο οδηγεί το δείγµα µέσα στη στήλη και µε σωστά σχεδιασµένες συνθήκες πίεσης, παροχής αερίου και θερµοκρασίας, το δείγµα εξατµίζεται, εξαερώνεται και διαχωρίζεται µέσα στη στήλη. α) Άμεση έγχυση β) Εισαγωγή µε διαμοιρασμό (split) ή χωρίς διαμοιρασμό (splitless) ροής Όταν ο εισαγωγέας βρίσκεται σε λειτουργία split, μέρος του δείγματος εισέρχεται στη στήλη διαχωρισμού ενώ το υπόλοιπο αποβάλλεται στο περιβάλλον από την έξοδο split. Όταν ο εισαγωγέας βρίσκεται σε λειτουργία splitless, όλο το δείγμα που εισάγεται µε την ένεση εισέρχεται στη στήλη διαχωρισμού. 2

3 Αντιπροσωπευτικές συνθήκες εισαγωγής για εισαγωγέα διαμοιρασμού (split), εισαγωγέα μη διαμοιρασμού (splitless) και εισαγωγή στην κορυφή της στήλης (on column) Εισαγωγέας διαµοιρασµού (split injector) Απλός Υψηλή διαχωριστική ικανότητα της στήλης Προστασία της στήλης Απώλεια των µικρού µοριακού βάρους ενώσεων σε σχέση µε αυτές υψηλού µοριακού βάρους Στην ποσοτική ανάλυση µπορεί να υπάρξει περιορισµός της πιστότητας και της ορθότητας ανάλογα µε τη φύση του δείγµατος Εισαγωγέας µη διαµοιρασµού (splitless injector) Διάσπαση σε μικρό ποσοστό (~80 % του δείγµατος εισάγεται στη στήλη ). Ο διαλύτης (με αρχική θερμοκρασία στήλης 40 0 C) συμπυκνώνεται και παγιδεύει τις ουσίες που φθάνουν, σε μια στενή ζώνη στην αρχή της στήλης. Αργή µεταφορά του δείγµατος στη στήλη µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία πεπλατυσµένων κορυφών Προηγείται αραίωση του δείγµατος σε πτητικό διαλύτη Απαιτεί χρόνο : η στήλη πρέπει να διατηρηθεί σε χαµηλή θερµοκρασία 3

4 Εισαγωγή στην κορυφή της στήλης (on column injection) Υψηλή πιστότητα Ενδείκνυται για θερµοσταθερές και θερμοασταθείς ενώσεις Χρησιµοποιείται για πακεταρισµένες και ευρείας διαµέτρου τριχοειδείς στήλες Μικρή διαχωριστική ικανότητα της στήλης Ανιχνευτής ιοντισμού φλόγας (FID) : Η λειτουργία του βασίζεται στην μεταβολή της αγωγιμότητας που προκαλείται από τον ιοντισμό της ουσίας από τη φλόγα του υδρογόνου. Όταν µια οργανική ουσία καίγεται σε µια φλόγα Η 2 και αέρα, παράγονται ιόντα: Οργαν. Ένωση + Η2 + Ο2 CO2 + H2O + (κατιόντα)+ + (ανιόντα) - + e- Σ[(ανιόντων)- + e- ] Ροή ρεύµατος Τα ιόντα συλλέγονται πάνω σε ένα ζεύγος πολωµένων ηλεκτροδίων µέσα στον ανιχνευτή και το ρεύµα που παράγεται ενισχύεται στον ενισχυτή και καταγράφεται. 4

5 Σχήμα ανιχνευτή ιοντισμού φλόγας (FID) συλλέκτης Αέρας Φλόγα Η 2 -αέρα Η 2 Γειωμένο ακροφύσιο Έξοδος στήλης Χαρακτηριστικά του ανιχνευτή FID: Οι περισσότερες οργανικές ενώσεις πυρολύονται σε φλόγα H 2 -αέρα παράγοντας ιόντα και ηλεκτρόνια. Μεταξύ του ακροφυσίου καύσης και του ηλεκτροδίου συλλογής εφαρμόζεται δυναμικό µερικών εκατοντάδων volts. Το προκύπτον ρεύµα είναι ανάλογο του αριθµού ατόµων άνθρακα στη φλόγα. Αποκρίνεται σε µάζα και όχι σε συγκέντρωση. Καταστρεπτικός ανιχνευτής. Ευρείας χρήσης ανιχνευτής. εν παρουσιάζει όµως καλή ευαισθησία σε χαρακτηριστικές οµάδες (π.χ. καρβονυλο- και αλογονο-οµάδες) καθώς επίσης και σε μη καύσιμα αέρια H 2 0, CO 2, SO 2, NO X. Μεγάλη γραμμική περιοχή απόκρισης ~10 7 και χαμηλός θόρυβος. Υψηλή ευαισθησία ~ g/s του αναλύτη/second 5

6 Τριχοειδείς στήλες ( Capillary columns ): Οι τριχοειδείς στήλες είναι σωλήνες πολύ µικρής διαµέτρου (0,1-0,5 mm) και µεγάλου µήκους (10-100m), συνήθως πολυµερούς υλικού, τα εσωτερικά τοιχώµατα των οποίων επικαλύπτονται µε τη στατική φάση. εν υπάρχει υλικό πληρώσεως. Τύποι τριχοειδών στηλών: WCOT (Wall-Coated Open Tubular): Λεπτή επικάλυψη της στατικής φάσης στα εσωτερικά τοιχώµατα της στήλης. SCOT (Support-Coated Open Tubular): Κάλυψη της εσωτερικής επιφάνειας της στήλης µε λεπτό υµένιο 30µm αδρανούς υλικού στήριξης, πάνω στο οποίο κρατιέται η υγρή στατική φάση. Πλεονεκτήματα τριχοειδών στηλών: 1. Μεγάλος αριθµός θεωρητικών πλακών (µέχρι σε σχέση µε τις στήλες πλήρωσης) 2. Μικρότερη ποσότητα δείγµατος (ng) 3. Mικρότερος χρόνος έκλουσης και ανάλυσης γενικότερα 4. Μικρότερες θερµοκρασίες διαχωρισµού 5. Όρια ανίχνευσης περίπου ίδια, αλλά µικρότερη ποσότητα δείγµατος 6. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν για σύζευξη µε ανιχνευτές που επιτυγχάνουν ταυτοποίηση των ενώσεων (π.χ. φασµατογράφος µάζας) 7. Με 3-4 στήλες (που διαφέρουν ως προς την πολικότητα της στατικής φάσης) καλύπτεται όλο το φάσµα των ενώσεων που µπορούν να διαχωριστούν 6

7 Κοινές στατικές φάσεις για χρωματογραφία αερίου υγρού: Αύξηση πολικότητας 7

8 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Χρωματογράφος : GC Focus, Thermo-Finnigan Ανιχνευτής : FID ( flame ionization detector) Αέρια : carrier gas Helium (He) Fuel gas H 2 + air Make-up gas He Εισαγωγέας διαμοιρασμού : split injector Κολώνα : capillary AT-WAX, Alltech Μήκος 30 m Διάμετρος 0,32 mm Πάχος film 0,25μm (polyethylene glycol) Πρόγραμμα : chrom-card, Thermo 8

9 ΠΕΙΡΑΜΑ 1 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΛΚΟΟΛΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ/ΟΡΓΑΝΑ Προσοχή : Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να είναι υψηλής καθαρότητας, κατάλληλα για χρωματογραφία. Διαλύτης : tert-butyl methyl ether (MTBE) Αλκοόλες : methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol Εσωτερικό πρότυπο (Internal standard (is)) : acetonitrile Μικροσύριγγα : 5μl Hamilton Πιπέτες : 1ml, 20 μl, 100μl Gilson 9

10 ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΥ (METHOD ALCOHOLS) Oven Method Initial Temperature (C) : 50 Initial Time (min) : 2.00 Number of Ramps : 1 Rate (deg/min) : 10.0 Final Temperature (C) : 120 Hold Time (min) : 1.00 Maximum Temperature (C) : 350 Prep Run Timeout (min) : Equilibration Time (min) : 0.10 SSL Method (Inlet) Base Temperature: Base Temperature (C): 250 Mode: Split Flow: Split Split Flow Flow (ml/min): 300 Split ratio : 200 Surge Pressure: Off Surge Pressure (kpa): 5.00 Surge Duration (min): 0.02 Constant Purge: Stop Purge At: (min):

11 Carrier Method Mode: Initial Value: Constant Flow Initial Value (ml/min): 1.50 Initial Time: 1.00 Gas Saver: Gas Saver Flow (ml/min): 25 Gas Saver Time: 1.00 Vacuum Compensation: Off FID Method Base Temperature: Base Temperature (C): 250 Flame: Flameout Retry: Off Ignition Threshold (ma): 0.2 H2: Air: Makeup Gas: Signal Method Offset: Off Offset Value: 0 Autozero: Off Range: 99 Gain: 1 11

12 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Για το χειρισμό του οργάνου θα σας δοθούν χωριστά οδηγίες. Γνωστό διάλυμα έγχυσης : 1)Μεταφέρετε με προσοχή λόγω πτητικότητας 50μl από methanol, ethanol, 1-propanol, 1-butanol και εσωτερικό πρότυπο (is) acetonitrile σε ειδικό vial και συμπληρώστε για τελικό όγκο 2ml με διαλύτη tert-butyl methyl ether (MTBE). 2) Από το παραπάνω διάλυμα θα κάνετε τρία τουλάχιστον injections του 1μl. Πριν από κάθε injection θα πρέπει να πλένετε πολύ καλά την σύριγγα με διαλύτη MTBE για την αποφυγή επιμολύνσεων. Άγνωστο διάλυμα έγχυσης : 1) Θα σας δοθεί άγνωστο διάλυμα που θα περιέχει κάποιες από τις παραπάνω αλκοόλες αγνώστου συγκέντρωσης και εσωτερικό πρότυπο (is) acetonitrile ίδιας συγκέντρωσης με το γνωστό διάλυμα. 2) Από το άγνωστο διάλυμα θα κάνετε ένα injection του 1μl, αφού πλυθεί πολύ καλά η σύριγγα με διαλύτη MTBE. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ/ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ουσία Πυκνότητα/ Kg/lt Σ.ζ / ο C methanol 0,79 64,7 ethanol 0,79 78 acetonitrile (is) 0, propanol 0, butanol 0, ΜΤΒΕ 55 12

13 1)Χαρακτηρισμός των κορυφών με βάση το σημείο ζέσεως της κάθε ουσίας και το χρόνο κατακράτησης (retention time) όπως φαίνεται στο παρακάτω χρωματογράφημα. Χρωματογράφημα γνωστού διαλύματος έγχυσης 2) Εύρεση του σχετικού συντελεστή απόκρισης (relative response factor) RRF για κάθε μία αλκοόλη (1). Στο συγκεκριμένο πείραμα θα βρείτε για κάθε αλκοόλη τρία RRF και μετά μέση τιμή και τυπική απόκλιση (sd). Υπολογισμός RRF A ουσίας Α RRF A = RF A = RF is area c A area c is A is = area area A is c c is A (1) Α: ουσία is : εσωτερικό πρότυπο (acetronitrile) c : συγκέντρωση σε μg/μl area : εμβαδόν κορυφής 13

14 3) Στο άγνωστο, αφού χαρακτηρίσετε τις κορυφές όπως φαίνεται στο παρακάτω χρωματογράφημα, θα υπολογίσετε την συγκέντρωση σε (μg/μl) των αλκοολών που εμφανίζονται. (2) Χρωματογράφημα αγνώστου διαλύματος έγχυσης Υπολογισμός συγκέντρωσης ουσίας Α : C A = area area is A c is RRF A (2) 14

15 ΠΕΙΡΑΜΑ 2 ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕΘΑΝΟΛΗΣ ΚΑΙ ΑΙΘΑΝΟΛΗΣ ΣΕ ΑΛΚΟΟΛΟΥΧΑ ΠΟΤΑ ΠΡΟΕΡΧΟΜΕΝΑ ΑΠΟ ΑΠΟΣΤΑΞΗ ΣΤΕΜΦΥΛΩΝ (ΡΑΚΗ) ΜΕΘΑΝΟΛΗ ΚΑΙ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ Η μεθανόλη έχει υψηλή τοξικότητα για τους ανθρώπους. Αν εισαχθεί με ένεση, ποσότητα ίση με 10 ml καθαρής μεθανόλης μπορεί να προκαλέσει τύφλωση με καταστροφή του οπτικού νεύρου, ενώ τα 30 ml είναι ενδυνάμει θανάσιμα. Το ανώτατο επιτρεπτό όριο μεθανόλης στα αλκοολούχα ποτά είναι 1000gr/hl ή 10μg/μl. Σε ότι αφορά τα αλκοολούχα ποτά από απόσταξη στεμφύλων,η μεθανόλη παράγεται με την επίδραση πηκτινολυτικών ενζύμων στις πηκτίνες του σταφυλιού κατά την ζύμωση των στεμφύλων. Έτσι κατά τα τρία στάδια απόσταξης των στεμφύλων κεφαλή, καρδιά και ουρά,το πρώτο και το τελευταίο κλάσμα περιέχουν μεθανόλη και άλλα πτητικά συστατικά τα οποία θα πρέπει να απορρίπτονται ως μη επιθυμητά και επικίνδυνα για την υγεία. Μόνο η καρδιά χρησιμοποιείται για ανθρώπινη κατανάλωση. Το τελικό απόσταγμα περιέχει από 35-50% v/v αιθανόλη ανάλογα αν πρόκειται για σπιτική παραγωγή ή για εμπορική χρήση. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ/ΟΡΓΑΝΑ Αλκοολούχο ποτό προερχόμενο από απόσταξη πχ. ρακή Εσωτερικό πρότυπο (Internal standard (is)) : acetonitrile Μικροσύριγγα : 5μl Hamilton Πιπέτες : 1ml, 20 μl, 100μl Gilson 15

16 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Οι παράμετροι χειρισμού και η όλη πειραματική διαδικασία είναι ίδια με αυτή του πειράματος 1. Αλκοολούχο διάλυμα έγχυσης: 1) Μεταφέρετε 50 μl από το εσωτερικό πρότυπο is (acetonitrile) σε ειδικό vial και συμπληρώστε με ρακή μέχρι τελικού όγκου 2ml. 2) Από το διάλυμα αυτό θα κάνετε ένα injection του 1μl, αφού πλυθεί πολύ καλά η σύριγγα πρώτα με διαλύτη MTBE και μετά με το ίδιο το αλκοολούχο διάλυμα. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ/ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1) Στο αλκοολούχο διάλυμα, αφού χαρακτηρίσετε τις κορυφές όπως φαίνεται στο παρακάτω χρωματογράφημα, θα υπολογίσετε την συγκέντρωση (μg/μl) της methanol (εφόσον ανιχνευτεί) και της ethanol από τη σχέση (2) και τα γνωστά RRF methanol και RRF ethanol του πειραμ. 1. 2) Μετατρέψτε τη c ethanol από μg/μl σε αλκοολικούς βαθμούς % v/v. Χρωματογράφημα ρακής 16

17 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ: 1) «Ποσοτική χημική ανάλυση» Τόμος B Daniel C. Harris,κεφ.23,24 2) «Αρχές της Ενόργανης Ανάλυσης» SKOOG,HOLLER,NIEMAN, κεφ.26,27 17