Δθανιμβέξ ηδξ ηεπκζηήξ HPTLC ζηδκ πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ιεθέηδ εηποθζζιάηςκ θφθθςκ εθζάξ ηαζ ημο είδμοξ Genista halacsyi

Transcript

1 ΔΘΝΗΚΟ ΚΑΗ ΚΑΠΟΓΟΣΡΗΑΚΟ ΠΑΝΔΠΗΣΖΜΗΟ ΑΘΖΝΩΝ ΣΜΖΜΑ ΦΑΡΜΑΚΔΤΣΗΚΖ ΣΟΜΔΑ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΗΑ ΚΑΗ ΥΖΜΔΗΑ ΦΤΗΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΣΩΝ Δθανιμβέξ ηδξ ηεπκζηήξ HPTLC ζηδκ πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ιεθέηδ εηποθζζιάηςκ θφθθςκ εθζάξ ηαζ ημο είδμοξ Genista halacsyi Βαζζθζηή Ηςάκκα Μπυηα Υδιζηυξ Αεήκα, 2011

2

3 Δοπανζζηίεξ Θα ήεεθα κα εοπανζζηήζς ζδζαίηενα : Σα ιέθδ ηδξ ηνζιεθμφξ επζηνμπήξ, ημκ Πνυεδνμ ημο Φανιαηεοηζημφ Σιήιαημξ ηαζ Γζεοεοκηή ημο ημιέα Φανιαημβκςζίαξ ηαεδβδηή η. Αθέλζμ- Λέακδνμ ηαθηζμφκδ, ημκ ηαεδβδηή η. Βαζίθεζμ Ρμφζζδ ηαζ ημκ Δπίημονμ ηαεδβδηή η. Νεηηάνζμ Αθδβζάκκδ. Σμκ ηαεδβδηή η. Αθέλζμ-Λέακδνμ ηαθηζμφκδ, βζα ηζξ ζοιαμοθέξ ημο ηαζ ημ ζοκεπέξ εκδζαθένμκ. Σμκ επζαθέπμκηα ηδξ πανμφζαξ ιεηαπηοπζαηήξ ενβαζίαξ Δπίημονμ ηαεδβδηή η. Νεηηάνζμ Αθδβζάκκδ βζα ηδ ζοκεπή ηαεμδήβδζδ ηαε υθδ ηδ δζάνηεζα ηδξ πνμζπάεεζαξ αοηήξ, ηζξ πμθφηζιεξ ζοιαμοθέξ ημο, ηδκ εονεία πανμπή βκχζεςκ, ηδκ δεζηή οπμζηήνζλδ ηαζ οπμιμκή ημο, πμο ζοκηέθεζακ ζηδκ άνζζηδ ζοκενβαζία ιαξ. Σδ ιεηαδζδάηημνα Αζηαηενίκδ Ανβονμπμφθμο βζα ηδ αμήεεζά ηδξ, ηδ ζοκεπή ηαεμδήβδζή ηδξ, ηδκ δεζηή οπμζηήνζλή ηδξ, ηδκ οπμιμκή ηδξ ηαζ ηδκ άνζζηδ ζοκενβαζία ιαξ. Σμκ δζδάηημνα η. Δθεοεένζμ Καθπμοηγάηδ βζα ηδ ζοθθμβή ηαζ αμηακζηή ηαοημπμίδζδ ηςκ θοηζηχκ δνμβχκ, ηδκ παναπχνδζδ θςημβναθζημφ οθζημφ απυ ημ πνμζςπζηυ ημο ανπείμ ηαζ ημ εκδζαθένμκ ημο. Σμκ Λέηημνα η. Δοάββεθμ Γηίηα βζα ηδκ αμήεεζά ημο ζηδκ ζηαηζζηζηή επελενβαζία ηςκ ηαιποθχκ ακαθμνάξ. Σμκ πνμπηοπζαηυ θμζηδηή Άηδ Αιμφκηγζα βζα ηδ αμήεεζά ημο ηαζ ηδκ ζοκενβαζία ιαξ ζημ ενβαζηήνζμ. Σμοξ ζοιθμζηδηέξ ηαζ θίθμοξ ιμο Ανβονχ, απθχ, Κχζηα, Αββεθζηή, Δζνήκδ, Γζάκκδ, Υανμφθα, Ακηζβυκδ, ηαζ υθμοξ ημοξ ιεηαπηοπζαημφξ, δζδαηημνζημφξ ηαζ ιεηαδζδάηημνεξ ημο ενβαζηδνίμο βζα ηδ ζοκενβαζία ιαξ ηαζ ημ εοπάνζζημ ηθίια ζημ ενβαζηήνζμ. Σμοξ βμκείξ ιμο ηαζ ηα αδένθζα ιμο βζα ηδκ ζηήνζλδ ηαζ ηδ ζοιπανάζηαζή ημοξ.

4 Σμκ Σάζμ ηαζ ημκ Ονέζηδ βζα ηδκ αβάπδ ηαζ ηδκ οπμιμκή ημοξ.

5

6 Πενζεπυιεκα 1 ΕΙΑΓΩΓΗ ΠΡΟΛΟΓΟ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΣΗ ΣΙΒΑΔΑ (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY-TLC) Ιςτορία τθσ TLC ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΣΗ ΣΙΒΑΔΑ ΤΨΗΛΗ ΑΠΟΔΟΗ (HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY-HPTLC) Γενικζσ εφαρμογζσ τθσ τεχνικισ HPTLC Εφαρμογζσ τθσ τεχνικισ HPTLC ςτθ Φυτοχθμεία φνδεςθ HPTLC με άλλεσ τεχνικζσ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΚΑΣΑΝΟΜΗ ΜΕ ΦΤΓΟΚΕΝΣΡΗΗ (FCPC) ΟΛΕΤΡΩΠΕΪΝΗ ΕΙΑΓΩΓΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕ ΙΔΙΟΣΗΣΕ ΣΗ ΟΛΕΤΡΩΠΕΪΝΗ Αντιοξειδωτικι δράςθ Αντιφλεγμονϊδθσ δράςθ Αντικαρκινικι δράςθ GENISTA HALACSYI HELDR. (LEGUMINOSAE) ΕΙΑΓΩΓΗ ΒΟΣΑΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΒΟΣΑΝΙΚΗ ΚΑΣΑΣΑΞΗ ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΗ ΣΟ ΓΕΝΟ GENISTA ΒΙΟΛΟΓΙΚΕ ΙΔΙΟΣΗΣΕ ΙΟΦΛΑΒΟΝΩΝ Αντιμικροβιακι-αντιβακτθριδιακθ δράςθ Αντιοξειδωτικι δράςθ ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ ΣΕΧΝΙΚΕ ΠΟΤ ΧΡΗΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ Χρωματογραφία επί λεπτισ ςτιβάδασ Χρωματογραφία ςτιλθσ Τγρι Χρωματογραφία Τψθλισ Απόδοςθσ (HPLC) Χρωματογραφία Κατανομισ με Φυγοκζντρθςθ (FCPC) Χρωματογραφία Λεπτισ τιβάδασ Τψθλισ Απόδοςθσ (HPTLC) Χρωματογραφικά αντιδραςτιρια ΦΑΜΑΣΟΚΟΠΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ Φαςματοςκοπία Πυρθνικοφ Μαγνθτικοφ υντονιςμοφ (ΝΜR) ΔΙΑΛΤΣΕ... 31

7 3 ΠΡΟΩΠΙΚΑ ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ AΠΟΜΟΝΩΗ ΟΛΕΤΡΩΠΕΪΝΗ ΜΕ FCPC ΑΠΟ ΦΤΛΛΑ ΕΛΙΑ ΚΑΙ ΠΟΟΣΙΚΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΦΤΣΙΚΟ ΤΛΙΚΟ ΤΝΔΕΗ ΣΕΧΝΙΚΗ HPTLC ΜΕ FCPC Εφρεςθ ςυντελεςτϊν κατανομισ με HPTLC Εφρεςθ ςυντελεςτϊν κατανομισ με HPLC φγκριςθ των αποτελεςμάτων ΑΠΟΜΟΝΩΗ ΟΛΕΤΡΩΠΕΪΝΗ ΜΕ ΧΡΩΜΑΣΟΓΡΑΦΙΑ ΚΑΣΑΝΟΜΗ ΜΕ ΦΤΓΟΚΕΝΣΡΗΗ-FCPC ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΟΟΣΙΚΟΠΟΙΗΗ Ποςοτικοποίθςθ ολευρωπεΐνθσ με τθν τεχνικι τθσ HPTLC Ποςοτικοποίθςθ ολευρωπεΐνθσ με τθν τεχνικι τθσ HPLC Ποςοτικοποίθςθ ολευρωπεΐνθσ με φαςματοςκοπία NMR φγκριςθ των αποτελεςμάτων τθσ ποςοτικοποίθςθσ τθσ ολευρωπεΐνθσ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΗ ΣΕΧΝΙΚΗ HPTLC ΣΗ ΦΤΣΟΧΗΜΙΚΗ ΜΕΛΕΣΗ ΣΟΤ ΕΙΔΟΤ GENISTA HALACSYI ΦΤΣΙΚΟ ΤΛΙΚΟ ΜΕΛΕΣΗ ΜΕΘΑΝΟΛΙΚΟΤ ΕΚΧΤΛΙΜΑΣΟ ΣΗ G. HALACSYI Χθμικό προφίλ Χρωματογραφικόσ διαχωριςμόσ του μεκανολικοφ εκχυλίςματοσ με χρωματογραφία κατανομισ με φυγοκζντρθςθ (FCPC) φνδεςθ τεχνικισ HPTLC με FCPC-Gradient Απομόνωςθ φαινολικϊν παραγϊγων με χρωματογραφία κατανομισ με φυγοκζντρθςθ (FCPC) Απομόνωςθ φαινολικϊν παραγϊγων με χρωματογραφία ςτιλθσ μοριακοφ αποκλειςμοφ (sephadex) ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ-ΠΡΟΟΠΣΙΚΕ ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ ΠΡΟΟΠΣΙΚΕ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8

9 1 Διζαγυγή ε λ ί δ α 1

10 Δζζαβςβή ε λ ί δ α 2

11 Δζζαβςβή 1.1 Ππόλογορ Έκαξ απυ ημοξ ηφνζμοξ ζηυπμοξ ημο Δνβαζηδνίμο Φανιαημβκςζίαξ ηαζ Υδιείαξ Φοζζηχκ Πνμσυκηςκ είκαζ δ ιεθέηδ πενζαίςκ ηαζ εαθάζζζςκ θοζζηχκ πνμσυκηςκ ιε ζημπυ ηδ δδιζμονβία βκχζδξ ηαζ ζδιακηζηχκ εθανιμβχκ ζημοξ ημιείξ ηδξ θανιαηεοηζηήξ, ηδξ ημζιεημθμβίαξ, ηςκ ηνμθίιςκ ηαζ ηδξ βεςνβίαξ. Ζ ένεοκα ζημκ ημιέα ηςκ θοηζηχκ ιεηααμθζηχκ έπεζ ακαπηοπεεί ζδζαζηένςξ ηα ηεθεοηαία πνυκζα, ηαζ ζ αοηυ έπεζ ζοιαάθεζ δ ελέθζλδ ηςκ ακαθοηζηχκ ηεπκμθμβζχκ. Μία απυ ηζξ κέεξ ηεπκζηέξ πμο έπμοκ ζοκδνάιεζ ζηδκ ακάπηολδ αοηή είκαζ δ Υνςιαημβναθία Λεπηήξ ηζαάδαξ Τρδθήξ Απυδμζδξ (HPTLC), ιία ελεθζβιέκδ ιμνθή ηδξ εονέςξ βκςζηήξ TLC. ημπυξ ιαξ ζηα πθαίζζα αοηήξ ηδξ δζπθςιαηζηήξ ενβαζίαξ ήηακ δ δζενεφκδζδ ηςκ δοκαημηήηςκ ηδξ HPTLC ηαζ δ πνμμπηζηή εκζςιάηςζή ηδξ ζε ηαεδιενζκέξ πεζναιαηζηέξ ενβαζίεξ, ζοιπθδνχκμκηαξ ή αηυιδ ηαζ ζε ηάπμζεξ πενζπηχζεζξ ακηζηαεζζηχκηαξ ηθαζζζηέξ ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ. Μεθεηήεδηακ δ αλζμπμίδζή ηδξ ζηδκ εφνεζδ ημο πδιζημφ πνμθίθ θοηζηχκ εηποθζζιάηςκ, ζημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ δναζηζηχκ μοζζχκ ηαζ ζηδκ απμιυκςζδ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ. οβηεηνζιέκα, πνδζζιμπμζήεδηε δ HPTLC βζα ηδκ απμιυκςζδ ηαζ ημκ πμζμηζηυ πνμζδζμνζζιυ μθεονςπεΐκδξ απυ εηποθίζιαηα θφθθςκ εθζάξ. ηδ ζοκέπεζα, ελεηάζηδηε δ εθανιμβή ηδξ ιεεμδμθμβίαξ ζηδ ιεθέηδ εκυξ πζμ ζφκεεημο, απυ πθεονάξ μοζζχκ, ιεεακμθζημφ εηποθίζιαημξ. Μεθεηήεδηε ημ πδιζηυ απμηφπςια ηαζ μζ πενζεπυιεκμζ δεοηενμβεκείξ ιεηααμθίηεξ εκυξ εθθδκζημφ εκδδιζημφ θοημφ, ηδξ Genista halacsyi. Καζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ δ απμιυκςζδ ηςκ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ ζηυπεοε ζημ ζοκδοαζιυ ηδξ HPTLC ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ πνςιαημβναθίαξ ηαηακμιήξ ιε θοβμηέκηνδζδ, FCPC, ιέζς εφνεζδξ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ ηυζμ βζα ηδκ απμιυκςζδ μθεονςπεΐκδξ υζμ ηαζ βζα ημοξ δεοηενμβεκείξ ιεηααμθίηεξ ηδξ G. halacsyi, ηάηζ ημ μπμίμ επζπεζνήεδηε βζα πνχηδ θμνά. ε λ ί δ α 3

12 Δζζαβςβή 1.2 Φπυμαηογπαθία Ζ σπυμαηογπαθία είκαζ ιία εονέςξ δζαδεδμιέκδ ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ, δ μπμία ανίζηεζ πθδεχνα εθανιμβχκ ζε δζάθμνμοξ επζζηδιμκζημφξ ηθάδμοξ. ακ ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ ακαηαθφθεδηε απυ ημ Ρχζμ αμηακμθυβμ Mikhail Tswett (Tswett, 1906) ζηζξ ανπέξ ημο εζημζημφ αζχκα, μ μπμίμξ ηαζ εζζήβαβε βζα πνχηδ θμνά ημκ υνμ χρωματογραφία. Ο Tswett εθήνιμζε ηδκ ηεπκζηή αοηή βζα κα δζαπςνίζεζ θοηζηέξ πνςζηζηέξ, υπςξ πθςνμθφθθεξ ηαζ ηανμηεκμεζδή, ιε ηδ πνήζδ οάθζκμο ζςθήκα, μ μπμίμξ ήηακ βειάημξ ιε ελαζνεηζηά θεπηυ ακεναηζηυ αζαέζηζμ ςξ πνμζνμθδηζηυ ιέζμ ηαζ δζάθοια πεηνεθασημφ αζεένα/αζεακυθδξ ςξ ιέζμ έηθμοζδξ. Οζ δζαπςνζγυιεκεξ μοζίεξ ειθακίγμκηακ ςξ πνςιαηζζηέξ γχκεξ ζηδ ζηήθδ. Αοηυξ ήηακ ηαζ μ θυβμξ βζα ημκ μπμίμ μ Tswett επέθελε (απυ ηδκ Δθθδκζηή βθχζζα) ημ παναηηδνζζηζηυ αοηυ υκμια βζα ηδκ ηεπκζηή (Scoog et al., 2002). Ο υνμξ πνςιαημβναθία απμδίδεηαζ ζε ιία ιεβάθδ πμζηζθία ηεπκζηχκ, μζ μπμίεξ πνδζζιμπμζμφκηαζ ζημ δζαπςνζζιυ μοζζχκ ιε παναπθήζζεξ πδιζηέξ ζδζυηδηεξ απυ ζφκεεηα ιίβιαηα. ημοξ πνςιαημβναθζημφξ δζαπςνζζιμφξ ημ δείβια παναζφνεηαζ απυ ιία ηζκδηή θάζδ (mobile phase), δ μπμία ιπμνεί κα είκαζ έκα αένζμ, έκα οβνυ, ή έκα οπενηνίζζιμ νεοζηυ. Ζ ηζκδηή θάζδ ελακαβηάγεηαζ κα δζέθεεζ ιέζς ιίαξ ζηαηζηήξ (stationary phase), δ μπμία είκαζ ηαεδθςιέκδ ζε ιία ζηήθδ ή ζε ιία ζηενεά επζθάκεζα. Οζ δφμ θάζεζξ επζθέβμκηαζ έηζζ, χζηε ηα ζοζηαηζηά ημο δείβιαημξ κα ηαηακέιμκηαζ ιεηαλφ ηδξ ηζκδηήξ ηαζ ηδξ ζηαηζηήξ θάζδξ ζε δζαθμνεηζηυ ααειυ. Σα ζοζηαηζηά ηα μπμία ηαηαηναημφκηαζ ζζπονυηενα απυ ηδ ζηαηζηή θάζδ ηζκμφκηαζ ανβά ηαηά ηδ νμή ηδξ ηζκδηήξ. Ακηίεεηα, ηα ζοζηαηζηά ηα μπμία ηαηαηναημφκηαζ αζεεκέζηενα απυ ηδ ζηαηζηή θάζδ, ηζκμφκηαζ ηαπφηενα. Ωξ απμηέθεζια αοηχκ ηςκ δζαθμνχκ ζηδ ζοβηνάηδζδ, ηα ζοζηαηζηά ημο δείβιαημξ δζαπςνίγμκηαζ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ιπμνμφκ κα πνμζδζμνζζημφκ πμζμηζηά ή/ηαζ πμζμηζηά (Scoog et al., 2002). ε λ ί δ α 4

13 Δζζαβςβή Φπυμαηογπαθία Λεπηήρ Σηιβάδαρ (Thin Layer Chromatography-TLC) Ζ πνςιαημβναθία θεπηήξ ζηζαάδαξ (TLC) είκαζ ιία επίπεδδ πνςιαημβναθζηή ηεπκζηή (planar chromatography) (Laurence et al., 1999). Πναβιαημπμζείηαζ ζε θφθθμ απυ βοαθί, πθαζηζηυ, ή αθμοιίκζμ, ημ μπμίμ είκαζ επζζηνςιέκμ ιε ιία θεπηή ζηνχζδ πνμζνμθδηζημφ οθζημφ, ζοκήεςξ μλεζδίμο ημο πονζηίμο, μλεζδίμο ημο ανβζθίμο, ή ηοηηανίκδ. Ζ θεπηή αοηή ζηζαάδα απμηεθεί ηδ ζηαηζηή θάζδ. Αθμφ ημ δείβια ημπμεεηδεεί πάκς ζηδκ πθάηα, έκαξ δζαθφηδξ ή ιίβια δζαθοηχκ, δ ηζκδηή θάζδ, ακένπεηαζ ζηδκ πθάηα ιέζς ηνζπμεζδχκ θαζκμιέκςκ ζοιπαναζφνμκηαξ ηαζ ηα ζοζηαηζηά ημο δείβιαημξ. Ο δζαπςνζζιυξ επζηοβπάκεηαζ ηαεχξ ηάεε μοζία δζακφεζ δζαθμνεηζηή απυζηαζδ επάκς ζηδκ πθάηα, βεβμκυξ ημ μπμίμ επδνεάγεηαζ απυ πμθθμφξ πανάβμκηεξ, υπςξ π.π. απυ ηδ ζφζηαζδ ημο δζαθφηδ ακαπηφλεςξ, απυ ηδ θφζδ ημο οθζημφ επίζηνςζδξ, η.ά (Vogel et al., 1989). Ζ ηίκδζδ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ζηδ ζηαηζηή θάζδ ακαθένεηαζ ςξ ζηάδζμ ακάπηολδξ ηαζ μδδβεί ζηδκ ανάπηςξη ηος σπωμαηογπαθήμαηορ. Μεηά ηδκ ακάπηολδ δ ηζκδηή θάζδ απμιαηνφκεηαζ ιε ελάηιζζδ ηαζ δ ζηαηζηή θάζδ ιπμνεί κα ακαθοεεί ιε ηαηάθθδθμ ακζπκεοηή. Ζ ηαηαβναθή ηδξ απυηνζζδξ ημο ακζπκεοηή μκμιάγεηαζ ποηκμιεηνία (densitometry) ηαζ απμηοπχκεηαζ ςξ ποηκμβνάθδια (densitogram) ζοκανηήζεζ ηδξ απυζηαζδξ δζαπςνζζιμφ ηςκ ζοζηαηζηχκ (Spangenberg et al., 2011) Ιζηοπία ηηρ TLC Σμ 1889, μ Beyerinck δδιμζίεοζε ημ δζαπςνζζιυ μοζζχκ ιε δζάποζδ ζε γεθαηίκδ ηδκ μπμία είπε ρεηάζεζ ζε ιία βοάθζκδ πθάηα (Beyerinck, 1889). Αοηή ήηακ δ πνχηδ πνμζπάεεζα δζελαβςβήξ επίπεδδξ πνςιαημβναθίαξ ιε ηδ πνήζδ ζηαηζηήξ θάζδξ, δζαθμνεηζηήξ απυ ημ πανηί πμο πνδζζιμπμζμφζακ ιέπνζ ηυηε. Σμ 1938, μζ Shraiber ηαζ Izmailov επδνεαζιέκμζ απυ ηδκ ενβαζία ημο Tswett, ιεηαθένμοκ ηα απμηεθέζιαηα ηδξ πνςιαημβναθίαξ ζηήθδξ ζηζξ θεβυιεκεξ ακμζηηέξ ζηήθεξ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, ημπμεέηδζακ θεπηέξ ζηνχζεζξ (πενίπμο 2 mm) απυ δζάθμνα πνμζνμθδηζηά οθζηά υπςξ αζαέζηζμ, μλείδζμ ημο ιαβκδζίμο, ή μλείδζμ ημο αθμοιζκίμο πάκς ζε βοάθζκεξ πθάηεξ (Shraiber & Izmailov, 1995) ηαζ πναβιαημπμίδζακ δζαπςνζζιμφξ πανυιμζμοξ ιε αοημφξ ημο Grüs, μ μπμίμξ είπε πνδζζιμπμζήζεζ κςκλική σπωμαηογπαθία επί σάπηος ημπμεεηχκηαξ ηα δείβιαηά έηζζ χζηε κα δδιζμονβμφκηαζ δαηηφθζμζ βφνς απυ ημ ε λ ί δ α 5

14 Δζζαβςβή ηέκηνμ ημο πανηζμφ. Σμ 1992, δ Shraiber πενζβνάθεζ ηδκ ακαβηαζυηδηα βζα ηδκ ακαηάθορδ ηδξ TLC ςξ ελήξ : The use of column chromatography for the analysis of pharmaceutical samples took a lot of time. This limited the application of the method throughout pharmaceutical analysis. For this reason our thoughts and efforts were directed to studying opportunities for accelerating the separation process for complex samples (Berezkin, 1995). Δπζπθέμκ, δ Shraiber δδθχκεζ υηζ δ ανπζηή ζδέα βζα ηδκ επίπεδδ πνςιαημβναθία πνμήθεε απυ ημκ Tswett ηαζ βνάθεζ: Thin layer chromatographic adsorption analysis was elaborated as a result of a number of experiments based on the separation of a mixture of compounds into zones on a thin layer of adsorbent using one drop of sample. Developing M. S. Tswett s idea, it was demonstrated that the planar adsorbent layer is an analog of the chromatographic column (Berezkin et al., 2008). Σμ 1949, μζ Meinhardt ηαζ Hall πανμοζίαζακ ιία ζδιακηζηή ελέθζλδ ζηδκ επίπεδδ πνςιαημβναθία. Σμπμεέηδζακ μλείδζμ ημο αθμοιζκίμο ζε βοάθζκδ πθάηα πνδζζιμπμζχκηαξ άιοθμ ςξ ζοκδεηζηυ ιέζμ (Meinhard et al., 1949) δδιζμονβχκηαξ ιε αοηυκ ημκ ηνυπμ ζηαεενέξ πθάηεξ πςνίξ δζαζπάζεζξ. Οζ Kirchner Miller ηαζ Keller ηνμπμπμίδζακ ηδ ιέεμδμ πνμζεέημκηαξ ζημ πνμζνμθδηζηυ ιέζμ πονζηζηυ ρεοδάνβονμ ςξ δείηηδ. Με αοηυ ημκ ηνυπμ μζ μοζίεξ πμο απμννμθμφζακ ηδκ οπενζχδδ αηηζκμαμθία ειθακίγμκηακ ςξ ζημονυπνςιεξ ηδθίδεξ έκακηζ ηδξ πθάηα πμο θευνζγε. οκεπχξ μζ μοζίεξ ιπμνμφζακ κα παναηδνδεμφκ πάκς ζηδκ πθάηα πςνίξ κα πνεζάγμκηαζ πνςζηζηέξ ή κα ηαηαζηνέθμκηαζ απυ πδιζηέξ ιεευδμοξ, πνδζζιμπμζχκηαξ ιζηνυ ιήημξ ηφιαημξ οπενζχδμοξ αηηζκμαμθίαξ (254 nm) ςξ γχκεξ θεμνζζιμφ. Οκυιαζακ ηζξ βοάθζκεξ αοηέξ πθάηεξ σπωμαηογπαθικέρ ηαινίερ ηαζ έπεζηα ηζξ πνδζζιμπμίδζακ βζα ημ δζαπςνζζιυ ηενπεκίςκ (Kirchner et al., 1951). Σμ 1954, μ Reitsema πνδζζιμπμίδζε βοάθζκεξ πθάηεξ (δζαζηάζεςκ 12.5 cm x 17.5 cm) επζζηνςιέκεξ ιε βέθδ μλεζδίμο ημο πονζηίμο (silica gel), ηαζ ηζξ μκυιαζε σπωμαηογπαθικέρ πλάκερ. Καηάθενε ηδκ ακάθοζδ ιεβάθμο ανζειμφ δεζβιάηςκ ιε ηδκ ηαοηυπνμκδ εθανιμβή ηαζ ακάπηολδ ημοξ (Reitsema, 1954). Σμ ζδιακηζηυηενμ αήια ζηδκ ζζημνία ηδξ TLC, ηυζμ βζα ηδκ ηαεζένςζή ηδξ ςξ ακαθοηζηή ηεπκζηή υζμ ε λ ί δ α 6

15 Δζζαβςβή ηαζ βζα ηδ εέζπζζδ ημο μκυιαηυξ ηδξ, έβζκε απυ ημκ Stahl, μ μπμίμξ απυ ημ 1955 ηαζ ιεηά ηαεζένςζε αοηή ηδκ ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ ηαζ ηδκ εζζήβαβε ζε ακαθφζεζξ νμοηίκαξ (Stahl et al., 1956). Ο Stahl πνδζζιμπμίδζε βοάθζκεξ πθάηεξ 20 x 20 cm επζζηνςιέκεξ ιε δζάθμνα πνμζνμθδηζηά οθζηά. Δλέδςζε ημ εβπεζνίδζυ ημο ημ 1962, ηαοηυπνμκα ιε ηδκ έηδμζδ ημο αζαθίμο ημο Randerath, εκυξ άθθμο ενεοκδηή ηδξ πνςιαημβναθίαξ, ηάκμκηαξ ηδκ ηεπκζηή αοηή παβημζιίςξ βκςζηή ιε ηδ ζοκημιμβναθία TLC. Εικόνα 1 Μία από τισ πρϊτεσ πλάκεσ TLC από τον Stahl, το Aπεικονίηει τον διαχωριςμό ελαίου βαλεριάνασ. Η πλάκα ψεκάςτθκε με δ/μα SbCl 3 ςε CHCl 3 και ζπειτα κερμάνκθκε. Ζ επυιεκδ ελέθζλδ έβζκε ζηζξ ανπέξ ημο 1970 απυ ημκ Kaiser ζημ ζκζηζημφημ πνςιαημβναθίαξ ζημ Bad Dürkheim (Γενιακία). Καηαζηεφαζε πθάηεξ ιε βέθδ μλεζδίμο ημο πονζηίμο πςνίξ ζοκδεηζηυ οθζηυ, πνδζζιμπμζχκηαξ ιζηνμζςιαηίδζα (5 mm) ιε ζηεκή ηαηακμιή ιεβέεμοξ. Ο πνυκμξ δζαπςνζζιμφ ιεζχεδηε απυ χνεξ ζε θεπηά, εκχ πανάθθδθα αεθηζχεδηε ηαζ δ ακάθοζδ (Kreuzig, 1998). Αοηυ ημκ μδήβδζε ημ 1977 ζηδκ έηδμζδ εκυξ αζαθίμο ιε ηίηθμ HPTLC-High Performance Thin Layer Chromatography, ημ μπμίμ δζεοηυθοκε ηδκ ηαηακυδζδ αοηήξ ηδξ ελεθζβιέκδξ, έςξ εηείκδ ηδκ πενίμδμ, ηεπκζηήξ. ηα ιέζα ημο 1970, μ Halpaap απυ ηδ Merck (Darmstadt, Germany) ακαηάθορε ηζξ θεβυιεκεξ HPTLC silica gel πθάηεξ δζαζηάζεςκ 10 x 10 cm, ηζξ μπμίεξ δζέεεζε ζηδκ αβμνά. Οζ RP-18-HPTLC πθάηεξ ειθακίζηδηακ ημ 1980, αημθμφεδζακ μζ amino πθάηεξ απυ ημοξ Jost ηαζ Hauck ημ 1982, μζ Cyano HPTLC πθάηεξ ημ 1985 ηαζ ηέθμξ μζ Diol HPTLC πθάηεξ ημ 1987 (Wall, 2005). ε λ ί δ α 7

16 Δζζαβςβή Φπυμαηογπαθία Λεπηήρ Σηιβάδαρ Υτηλήρ Απόδοζηρ (High Performance Thin Layer Chromatography-HPTLC) H Υνςιαημβναθία Λεπηήξ ηζαάδαξ (TLC) εεςνείηαζ βεκζηά ςξ ιία ημζκή ακαθοηζηή ηεπκζηή. Δίκαζ εονέςξ βκςζηή ηαζ πνδζζιμπμζείηαζ ζε ηάπμζμ ααειυ ζπεδυκ ζε ηάεε ενβαζηήνζμ ημο ηυζιμο. Γοζηοπχξ βζα ημοξ πενζζζυηενμοξ ακαθοηέξ δ TLC παναιέκεζ αοηυ πμο ήηακ εδχ ηαζ πμθθά πνυκζα: ιζα βνήβμνδ, απθή, ακέλμδδ, αθθά υπζ πμθφ αηνζαήξ ηεπκζηή. ιςξ, ακ θάαμοιε οπυρδ ηζξ ηεθεοηαίεξ ηεπκμθμβζηέξ ηαζ ιεεμδμθμβζηέξ ελεθίλεζξ, δ ζφβπνμκδ Τρδθήξ Απυδμζδξ Υνςιαημβναθία Λεπηήξ ηζαάδαξ (HPTLC), έπεζ ακαααειζζηεί ζε ιζα αλζυπζζηδ ηαζ ζζπονή ακαθοηζηή ηεπκζηή. Ζ TLC είκαζ δ ιέεμδμξ πμο επζθέβεηαζ, υηακ πνέπεζ κα ακαθοεμφκ ηαζ κα ζοβηνζεμφκ πμθθά δείβιαηα, υηακ δ εοεθζλία είκαζ ζδιακηζηή, ηαζ υηακ απαζημφκηαζ βνήβμνα πμζμηζηά ηαζ διί-πμζμηζηά δεδμιέκα ιε παιδθυ ηυζημξ ακά δείβια (Schibli & Reich, 2005). Ζ HPTLC ζήιενα δεκ είκαζ δ παθζά TLC πμο πναβιαημπμζμφκηακ ζε πθάηεξ HPTLC ιε αηνζαυ ελμπθζζιυ, αθθά ιία ηαζκμφνβζα έκκμζα. Δίκαζ μ αέθηζζημξ ζοκδοαζιυξ ιμκηένκμο ελμπθζζιμφ, ζζπονήξ εεςνδηζηήξ εειεθίςζδξ ηαζ ζοβηεηνζιέκδξ ιεεμδμθμβίαξ. Με ηδ πνήζδ ηδξ ποηκμιεηνίαξ, βζα ηδ ιέηνδζδ ηαζ πμζμηζημπμίδζδ ημο πνςιαημβναθήιαημξ θεπηήξ ζηζαάδαξ, δ HPTLC ζήιενα έπεζ βίκεζ απμδεπηή ςξ ιία ακαθοηζηή ηεπκζηή πμζμηζημπμίδζδξ, ζηακή κα ζοβηνζεεί ιε ηδκ Τβνή Υνςιαημβναθία Τρδθήξ Απυδμζδξ (High Performance Liquid Chromatography HPLC ), ηαζ ηδκ Αένζα Υνςιαημβναθία (Gas Chromatography GC ). Ζ πςκνομεηπία είκαζ δ ακίπκεοζδ ηςκ δζαπςνζζιέκςκ μοζζχκ πάκς ζε ιία πθάηα TLC ηαζ δ παναβςβή ακαθμβζηχκ ηαιποθχκ απυ ηα ηιήιαηα ημο πνςιαημβναθήιαημξ βζα πμζμηζηή ηαζ πμζμηζηή ακάθοζδ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, οπμθμβίγεηαζ δ έκηαζδ (μπηζηή ποηκυηδηα) ηιδιάηςκ ηδξ πθάηαξ ζε θςημβναθζηυ θζθι. ε έκα ηθαζζζηυ ποηκυιεηνμ, ιία δέζιδ ιμκμπνςιαηζημφ θςηυξ ηζκείηαζ ηαηά ιήημξ ηςκ ηιδιάηςκ ηδξ πθάηαξ. Ζ πμζυηδηα ημο θςηυξ πμο επζζηνέθεζ πίζς απυ ηδκ πθάηα ζε έκακ ακζπκεοηή οπμθμβίγεηαζ ηαζ ηαηαβνάθεηαζ ςξ function of position. Γζα ημ θυβμ αοηυ ηα ποηκυιεηνα ακαθένμκηαζ ηαζ ςξ scanners (ζανςηέξ). ε λ ί δ α 8

17 Δζζαβςβή Ζ HPTLC πανμοζζάγεζ ανηεηά πθεμκεηηήιαηα ζοβηνζηζηά ιε άθθεξ πνςιαημβναθζηέξ ηεπκζηέξ: i. Οπηικά αποηελέζμαηα, αθμφ είκαζ δ ιυκδ πνςιαημβναθία πμο πνμζθένεζ ηδκ επζθμβή ειθάκζζδξ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ςξ εζηυκα. Σμ πνςιαημβνάθδια ιπμνεί κα πανμοζζαζηεί ςξ ιία αημθμοεία απυ ζημφνεξ, πμθφπνςιεξ, ή θεμνίγμοζεξ γχκεξ πάκς ζηδκ πθάηα ηαζ ιπμνεί εφημθα κα απμεδηεοηεί ζακ θςημβναθία. ii. Απλόηηηα, εθυζμκ ηαιία άθθδ πνςιαημβναθζηή ηεπκζηή δεκ ιπμνεί κα ακηαβςκζζηεί ηδκ HPTLC υζμκ αθμνά ζηδκ απθυηδηα ηδξ, υπζ ιυκμ ζηδκ πνμεημζιαζία ηςκ πνμξ ακάθοζδ δεζβιάηςκ ηαζ ζημ πεζνζζιυ ηςκ ιδπακδιάηςκ, αθθά αηυια ηαζ ζηδ ιεθέηδ ηαζ ζηδκ ενιδκεία ηςκ απμηεθεζιάηςκ. iii. Παπάλληλερ αναλύζειρ δειγμάηων, ηαεχξ πνμζθένεζ ηδ δοκαηυηδηα ακάθοζδξ πμθθχκ δεζβιάηςκ, έςξ 72 ζε ιία πθάηα HPTLC 20 x 10 cm. ε ζοκδοαζιυ ιε ηδκ μπηζηή αλζμθυβδζδ, δίκεηαζ δ δοκαηυηδηα βζα έκα πμθφ βνήβμνμ έθεβπμ (screening). Δίκαζ επίζδξ ζδιακηζηυ κα ημκζζηεί υηζ υθα ηα δείβιαηα (πνυηοπα ηαζ άβκςζηα) ημπμεεημφκηαζ ζηδκ ίδζα πθάηα ιε απμηέθεζια κα επζηναημφκ μζ ίδζεξ πνςιαημβναθζηέξ ζοκεήηεξ. iv. Γπήγοπα αποηελέζμαηα. Δηηυξ απυ ηδκ ηαοηυπνμκδ ακάθοζδ πμθθχκ δεζβιάηςκ, ημ μπμίμ μδδβεί ζε ηαπφηαηα απμηεθέζιαηα, δ πεζναιαηζηή δζάνηεζα είκαζ πμθφ ζφκημιδ. Ζ πνμεένιακζδ ηδξ θάιπαξ UV, ηαζ μ ημνεζιυξ ημο εαθάιμο ακάπηολδξ απμηεθμφκ ημ ιυκμ πνυκμ ακαιμκήξ.. v. Εςελιξία, ηαεχξ οπάνπμοκ πάνα πμθθμί πανάβμκηεξ πμο ιπμνμφκ κα ιεηααθδεμφκ βζα κα επδνεάζμοκ ημ απμηέθεζια ημο δζαπςνζζιμφ. Μία ζπεδυκ απενζυνζζηδ επζθμβή ηζκδηήξ θάζδξ ηαζ έκαξ ιεβάθμξ ανζειυξ δζαθμνεηζηχκ ζηαηζηχκ θάζεςκ. Καηά ηδκ ακίπκεοζδ δ ηζκδηή θάζδ έπεζ ήδδ απμιαηνοκεεί απυ ηδκ πθάηα ιε απμηέθεζια κα είκαζ δοκαηή δ πνήζδ ε λ ί δ α 9

18 Δζζαβςβή δζαθοηχκ μζ μπμίμζ απμννμθμφκ ζημ οπενζχδεξ. Δπίζδξ, δεκ παναηδνμφκηαζ πενζμνζζιμί θυβς δζαανςηζηυηδηαξ ή πανειαμθχκ ζηδκ ακίπκεοζδ απυ ημοξ πνδζζιμπμζμφιεκμοξ δζαθφηεξ, δζυηζ ηαζ μζ πθάηεξ ηαζ μζ εάθαιμζ ακάπηολδξ είκαζ αδνακείξ ζοβηνζηζηά ιε ηα οθζηά πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ ζηδκ HPLC. vi. Πολλαπλή ανίσνεςζη, αθμφ δ ακεπηοβιέκδ πθάηα TLC δνα ζακ ζοζηεοή απμεήηεοζδξ ηναηχκηαξ ηζξ δζαπςνζζιέκεξ μοζίεξ ζηδ εέζδ ημοξ. Καηά ζοκέπεζα δ ακίπκεοζδ ηαζ δ αλζμθυβδζδ ιπμνεί κα βίκεζ ηαη επακάθδρδ. Δπζπθέμκ δ ίδζα πθάηα ιπμνεί κα παναηδνδεεί, ιε ή πςνίξ ρεηαζιυ ιε ακηζδναζηήνζα ηαζ πνδζζιμπμζχκηαξ δζαθμνεηζηέξ πδβέξ θςηυξ. vii. Χαμηλό κόζηορ, ηαεχξ ιπμνεί μ πθήνδξ ελμπθζζιυξ ηδξ HPTLC κα ιδ δζαθένεζ πμθφ ζε ηυζημξ ιε αοηυκ ηδξ HPLC, υιςξ δ πναβιαηζηή μζημκμιία πνμηφπηεζ ηαηά ηδκ εθανιμβή ηδξ ηεπκζηήξ. πςξ ήδδ ακαθένεδηε ιία πθάηα TLC ιπμνεί κα πνδζζιμπμζδεεί βζα πμθθά δείβιαηα, δ πμζυηδηα ηςκ μοζζχκ πμο πνεζάγμκηαζ είκαζ ηδξ ηάλεςξ ηςκ ιg, δ απαναίηδηδ πμζυηδηα δζαθφηδ ςξ ηζκδηή θάζδ είκαζ πμθφ ιζηνή ηαζ ηέθμξ μ πνυκμξ ακάθοζδξ είκαζ ζδιακηζηά ιζηνυηενμξ ζοβηνζηζηά ιε υθεξ ηζξ άθθεξ πνςιαημβναθζηέξ ηεπκζηέξ (Reich & Schibli, 2007) Βέααζα υπςξ ηάεε ηεπκζηή έηζζ ηαζ δ HPTLC πανμοζζάγεζ μνζζιέκμοξ πενζμνζζιμφξ ηαζ ηάπμζα ιεζμκεηηήιαηα. Ανπζηά δ TLC είκαζ έκα ακμζπηυ ζφζηδια. Ζ πθάηα εηηίεεηαζ ζε πενζααθθμκημθμβζηέξ επζδνάζεζξ, υπςξ είκαζ μ αέναξ (μλοβυκμ), ηθζιαηζημφξ πανάβμκηεξ (εενιμηναζία, οβναζία), θςξ, ακαεοιζάζεζξ η.α. οκεπχξ πηδηζηά ηαζ εοαίζεδηα δείβιαηα απαζημφκ ιεβάθδ πνμζμπή. Δπζπθέμκ, παν υθμ πμο υθεξ μζ δζαδζηαζίεξ βίκμκηαζ αοηυιαηα απυ ιδπακήιαηα, δ ιεηάααζδ ζε ηάεε ζηάδζμ βίκεηαζ πεζνμηίκδηα. Έηζζ, βζα κα επζηεοπεεί επακαθδρζιυηδηα εα πνέπεζ υθεξ μζ απαναίηδηεξ δζενβαζίεξ κα βίκμκηαζ ιε ζδζαίηενδ πνμζμπή. Σέθμξ, δ δζαςνζζηζηή - δζαηνζηζηή ζηακυηδηα ηδξ HPTLC είκαζ ιζηνυηενδ απυ αοηή ηδξ HPLC, ηαηά ζοκέπεζα ζε πμθφπθμηα δείβιαηα είκαζ ζοπκά δφζημθμ κα πναβιαημπμζδεεί επανηή ακάθοζδ βζα υθεξ ηζξ μοζίεξ. ε λ ί δ α 10

19 Δζζαβςβή Γενικέρ εθαπμογέρ ηηρ ηεσνικήρ HPTLC Ζ HPTLC ανίζηεζ εθανιμβέξ ζε δζάθμνμοξ ημιείξ, ηυζμ βζα πμζμηζηέξ υζμ ηαζ βζα πμζμηζηέξ ακαθφζεζξ. ζμκ αθμνά ζημοξ πμζμηζημφξ πνμζδζμνζζιμφξ έπεζ πνδζζιoπμζδεεί ζημοξ παναηάης ημιείξ : Βζμπδιεία / αζμηεπκμθμβία (θςζθμθζπίδζα, ιεεεζμκίκδ ζε γςιυ γφιςζδξ η.α.) Κθζκζηέξ ακαθφζεζξ (ηαθεΐκδ ζε μφνα, ηαπημπνίθδ ζε μφνα ηαζ πθάζια, ζεθήκζμ ζε κενυ ηαζ ζε μνυ, η.α.) Κμζιεημθμβία (πνμζδζμνζζιυξ άπμθςκ θζπζδίςκ ηαζ ηεναιζδίςκ ζημ δένια, οδνμημνηζγυκδ ηαζ ηζκπμηαΐκδ ζε αθμζθή θακμθίκδξ, η.α,) Πενζααθθμκημθμβζηέξ ακαθφζεζξ (εφνεζδ θοημθανιάηςκ ηαζ οδνανβφνμο ζε πυζζια κενά) Ακαθφζεζξ ηνμθίιςκ (Βζηαιίκδ C ζημ ποιυ θνμφηςκ, Αθθαημλίκεξ Β1, Β2, G1 ηαζ G2 ζηα ηνυθζια, Αθθαημλίκδ Μ1 ζημ βάθα ηαζ ηα βαθαηημημιζηά πνμσυκηα, η.α.) Ακαθφζεζξ θανιαηεοηζηχκ ηαζ πδιζηχκ μοζζχκ (πνμζδζμνζζιυξ ιεηνμκζδαγυθδξ ζε θανιαηεοηζηά ζηεοάζιαηα, αζηαιίκδ Β1 ζε θανιαηεοηζηά πνμσυκηα, η.α.) Φοζζηά πνμσυκηα ηαζ θοηζηά ζοζηαηζηά (αζεένζα έθαζα ηαζ βθοημγίηεξ ζε θοηζηά θάνιαηα, πνμζδζμνζζιυξ ανηειζζίκδξ ζε θφθθα ημο θοημφ Artemisia annua, η.α.) Σμλζημθμβία ηαζ ζαηνμδζηαζηζηέξ ένεοκεξ (ιμνθίκδ ηαζ ιμκμαηεηοθμιμνθίκδ (monoacetylmorphine) ζε ακενχπζκδ ηνίπα, έθεβπμξ πανάκμιςκ μοζζχκ, η.α.) Ακαθφζεζξ βζα πανάκμιεξ μοζίεξ (doping) (πειμθίκδ ζε μφνα, μλπνεκμθυθδ ζημ αίια, η.α.) ε λ ί δ α 11

20 Δζζαβςβή Δθαπμογέρ ηηρ ηεσνικήρ HPTLC ζηη Φςηοσημεία Ζ θοημπδιεία ηαζ δ ιεθέηδ θανιαηεοηζηχκ θοηχκ είκαζ έκαξ ημιέαξ υπμο δ ηεπκζηή ηδξ HPTLC πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ ηαζ ανίζηεζ εθανιμβέξ ζε πμθθέξ ακαθφζεζξ. Μία απυ ηζξ ααζζηέξ εθανιμβέξ ηδξ είκαζ δ ακάθοζδ ημο πδιζημφ απμηοπχιαημξ ή αθθζχξ μ έθεβπμξ ηςκ ζοζηαηζηχκ θοηζηχκ εηποθζζιάηςκ (fingerprinting/screening), δίκμκηαξ ηδ δοκαηυηδηα εφνεζδξ ηςκ πενζεπμιέκςκ μοζζχκ εκυξ θοηζημφ εηποθίζιαημξ ηαζ ηαη επέηηαζδ, ιέζς ζφβηνζζδξ ιε βκςζηά ζοζηαηζηά (ζοζηαηζηά δείηηεξ) πανέπεζ ηδ δοκαηυηδηα ηαοημπμίδζδξ ημοξ. οκεπχξ δ HPTLC πνδζζιμπμζείηαζ ςξ ενβαθείμ πμζμηζημφ εθέβπμο ζε θανιαηεοηζηά, θοηζηά εηποθίζιαηα ηαζ ζηδκ ακίπκεοζδ κμεεζχκ ζε θοηζηά πνμσυκηα. Δπίζδξ, είκαζ ηαηάθθδθμ αηυια ηαζ βζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηδξ ηαθθζένβεζαξ, ηδξ ζοβημιζδήξ ηαζ ηδξ δζαδζηαζίαξ ελαβςβήξ ηςκ θοηζηχκ πνμσυκηςκ. Δπζπθέμκ, είκαζ ιία πμθοδζάζηαηδ ιέεμδμξ δζαπςνζζιμφ θοζζηχκ πνμσυκηςκ ζε θοηζηά εηποθίζιαηα. Τπάνπεζ πθδεχνα απυ δζαθμνεηζηέξ HPTLC πθάηεξ ηαζ ιεβάθδ εοεθζλία ζηδκ επζθμβή ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ ακάπηολδξ ακάθμβα ιε ημκ δζαπςνζζιυ πμο επζεοιμφιε κα επζηφπμοιε. Δπίζδξ, ιε ηδ πνήζδ ακηζδναζηδνίςκ βζα ηδκ ειθάκζζδ ηςκ πνςιαημβναθδιάηςκ δίκεηαζ δ δοκαηυηδηα ακίπκεοζδξ μοζζχκ μζ μπμίεξ δεκ ακζπκεφμκηαζ ζε αηηζκμαμθία UV. Μία άθθδ ζδιακηζηή εθανιμβή είκαζ δ πνήζδ ηδξ HPTLC βζα αζμθμβζηέξ ακαθφζεζξ ηαζ εθέβπμοξ ιέζς ηδξ ακάπηολδξ αζμ-αοημβναθζηχκ ιεευδςκ, ηονίςξ βζα ηδκ ακίπκεοζδ μοζζχκ ιε ακηζμλεζδςηζηή ηαζ ακηζιζηνμαζαηή δνάζδ. Σέθμξ ιία ζδιακηζηή εθανιμβή ηδξ μονηέπναρ HPTLC ζηδ θοημπδιεία είκαζ δ δοκαηυηδηα πμζμηζηήξ ακάθοζδξ βκςζηχκ μοζζχκ ζε θοηζηά εηποθίζιαηα ιέζς ηαιπφθδξ ακαθμνάξ. Αοηυ δίκεζ ηδ δοκαηυηδηα ιε ιία βνήβμνδ ηαζ απθή ηεπκζηή κα θαιαάκμοιε άιεζα απμηεθέζιαηα υζμκ αθμνά ηδκ πενζεηηζηυηδηα εκδζαθενυκηςκ ζοζηαηζηχκ ζε θοηζηά εηποθίζιαηα (Kaale et al., 2011). ε λ ί δ α 12

21 Δζζαβςβή Σύνδεζη HPTLC με άλλερ ηεσνικέρ Έκα ηαζκμφνβζμ πεδίμ ιε ζδζαίηενμ εκδζαθένμκ είκαζ δ ζφκδεζδ ηδξ επίπεδδξ πνςιαημβναθίαξ ιε ηδ θαζιαημιεηνία ιάγαξ (MS). Ζ άιεζδ εζζαβςβή ημο δείβιαημξ ζημ θαζιαημβνάθμ ηαζ δ ζηακυηδηα θήρδξ θάζιαημξ ιάγαξ ζε πμθφ ιζηνυ πνμκζηυ δζάζηδια ζοιαάθθμοκ εεηζηά ζηδκ πνυμδμ ηδξ επίπεδδξ πνςιαημβναθίαξ. Ζ ηαηαβναθή ηςκ θαζιάηςκ ιάγαξ απυ ηζξ αλζυθμβεξ γχκεξ ηδξ πθάηαξ πναβιαημπμζείηαζ ιεηά απυ ηδκ αλζμθυβδζδ ημο πνςιαημβναθήιαημξ ιε θάζια UV, ιε ζημπυ ηδκ επζθμβή ηςκ ηδθίδςκ πμο πανμοζζάγμοκ εκδζαθένμκ, πνμζθένμκηαξ έηζζ ορδθή απυδμζδ ζηδκ ακάθοζδ (Morlock, 2010). Δηηυξ υιςξ απυ ηδκ άιεζδ ζφκδεζδ ηςκ δφμ αοηχκ ηεπκζηχκ δ HPTLC ανίζηεζ εθανιμβέξ ηαζ ζε off-line ζοκδέζεζξ, υπςξ ιε ηδκ αένζα πνςιαημβναθία (GC), ή ηδ θαζιαημζημπία πονδκζημφ ιαβκδηζημφ ζοκημκζζιμφ (NMR). Σέθμξ, δ αοημιαημπμζδιέκδ ιέεμδμξ ηδξ HPTLC πνδζζιμπμζείηαζ ζε ζοκδοαζιυ ιε ηδ πνςιαημβναθία ηαηακμιήξ ιε θοβμηέκηνδζδ (FCPC), βζα ημ βνήβμνμ ηαζ αλζυπζζημ έθεβπμ ηςκ ηθαζιάηςκ πμο ζοθθέβμκηαζ Φπυμαηογπαθία Καηανομήρ με Φςγοκένηπηζη (FCPC) Ζ Υνςιαημβναθία Καηακμιήξ ιε Φοβμηέκηνδζδ (Fast Centrifugal partition chromatography, FCPC) είκαζ ιζα ηεπκζηή δζαπςνζζιμφ, δ μπμία ααζίγεηαζ ζηδκ φπανλδ δφμ ιδ ακαιεζβκουιεκςκ οβνχκ θάζεςκ, εη ηςκ μπμίςκ δ ιία παναιέκεζ ζηαηζηή, εκχ δ άθθδ απμηεθεί ηδκ ηζκδηή θάζδ. Ζ υθδ δζαδζηαζία επζηεθείηαζ ιέζα ζε ζπεζνμεζδή ζηήθδ δ μπμία είκαζ πθδνςιέκδ ιε ηδ ζηαηζηή θάζδ (υπμο είκαζ δζαθοιέκμ ημ πνμξ ακάθοζδ ιίβια), εκχ δ ηζκδηή θάζδ δζένπεηαζ ιέζς ηδξ ζηαηζηήξ. Ζ ανπή θεζημονβίαξ ηδξ ιεευδμο πενζθαιαάκεζ ημ δζαπςνζζιυ ηςκ ζοζηαηζηχκ εκυξ ιίβιαημξ ιε αάζδ ημοξ ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ ημοξ (Kd) ζηζξ δομ οβνέξ θάζεζξ. Καεχξ δ ηζκδηή θάζδ δζένπεηαζ δζαιέζμο ηδξ ζηαηζηήξ, παναζφνεζ ηα ζοζηαηζηά ημο ιίβιαημξ ιε δζαθμνεηζηή ηαπφηδηα ημ ηαεέκα ηαζ ακάθμβα ιε ημ ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ ημοξ, ηάκμκηαξ έηζζ δοκαηυ ημ δζαπςνζζιυ ηαζ ηδκ απμιυκςζδ ημοξ (Ito, 2005). Έκα δζθαζζηυ ζφζηδια δζαθοηχκ είκαζ ζηακυ κα δζαπςνίζεζ ηα ζοζηαηζηά εκυξ εηποθίζιαημξ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ οβνήξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ (CPC) υηακ μζ ε λ ί δ α 13

22 Δζζαβςβή ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ ηςκ ζοζηαηζηχκ αοηχκ δεκ απέπμοκ πμθφ απυ ηδ ιμκάδα ηαζ επίζδξ μζ θυβμζ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ (α) είκαζ ιεβαθφηενμζ απυ 1.5. Ζ επζθάκεζα πμο πενζηθείεζ ιζα ημνοθή ζε έκα πνςιαημβναθδια (HPLC, GC) είκαζ ακάθμβδ ηδξ ζοβηέκηνςζδξ ηδξ μοζίαξ ζηδκ μπμία ακηζζημζπεί δ ημνοθή αοηή. Έηζζ δ επζθάκεζα ηδξ ημνοθήξ ιζαξ μοζίαξ ζηδ ιία θάζδ πνμξ ηδκ επζθάκεζα ηδξ ημνοθήξ ηδξ ίδζαξ μοζίαξ ζηδκ άθθδ θάζδ δίκεζ ημ ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ ηδξ μοζίαξ αοηήξ ζε έκα δζθαζζηυ ζφζηδια δζαθοηχκ. K x = C x α θάζη C x β θάζη = Δ x σπυμαηογπαθημα α θάζηρ Δ x σπυμαηογπαθημα β θάζηρ υπμο: Kx= ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ ηδξ μοζίαξ Υ Cx= ζοβηέκηνςζδ ηδξ μοζίαξ Υ Ex= επζθάκεζα ηδξ ημνοθήξ ηδξ μοζίαξ Υ ζημ πνςιαημβνάθδια α, α= μζ δομ θάζεζξ ημο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ Πανάζηαζδ ζηήθδξ οβνήξ οβνήξ πνςιαημβναθίαξ. Α) ηαηζηή δ ηάης θάζδ Β) ηαηζηή δ άκς θάζδ ε λ ί δ α 14

23 Δζζαβςβή Έκαξ επζηοπήξ δζαπςνζζιυξ ιε ηδκ ηεπκζηή ημο CPC, ελανηάηαζ απυ ηδκ επζθμβή εκυξ ηαηάθθδθμο ιδ ιζβκουιεκμο ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ. Ζ επζθμβή ημο ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ είκαζ ηυζμ ζδιακηζηή υζμ δ ζοκδοαζιέκδ επζθμβή ζηήθδξ ηαζ δζαθοηχκ ζε άθθεξ πνςιαημβναθζηέξ ηεπκζηέξ. ηδ αζαθζμβναθία οπάνπεζ δζαεέζζιδ ιία ιεβάθδ πμζηζθία ιδ ιζβκουιεκςκ ζοζηδιάηςκ δζαθοηχκ ιε πζμ βκςζηυ ηαζ εονέςξ πνδζζιμπμζδιέκμ έκα ζφζηδια απμηεθμφιεκμ απυ επηάκζμ, μλζηυ αζεοθεζηένα, ιεεακυθδ ηαζ κενυ ζε δζάθμνεξ ακαθμβίεξ. Σμ ζφζηδια αοηυ, ημ μπμίμ ακαπηφπεδηε απυ ημοξ Margraff ηαζ Foucault, είκαζ βκςζηυ ςξ ζφζηδια Arizona (Foucault, 1995). Ζ αλζμθυβδζδ ηδξ απμηεθεζιαηζηυηδηαξ εκυξ δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ πναβιαημπμζείηαζ ιε ημκ πνμζδζμνζζιυ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ (K d ) ηδξ έκςζδξ ζηυπμο ιεηαλφ ηςκ δφμ θάζεςκ. ηδ πενίπηςζδ εκυξ ζφκεεημο ιίβιαημξ, δ υθδ δζαδζηαζία επζθμβήξ ιπμνεί κα βίκεηαζ δζα ηδξ αηυπμο απαβςβήξ, ηαζ ηαηά ζοκέπεζα είκαζ πνμκμαυνα (Qi et al., 2010). Πανά ημ βεβμκυξ υηζ ημ CPC είκαζ έκα πμθφ απμηεθεζιαηζηυ ενβαθείμ βζα ημ δζαπςνζζιυ ηαζ ημκ ηαεανζζιυ θοζζηχκ πνμσυκηςκ, ηα θοηζηά εηποθίζιαηα ζοκήεςξ πενζέπμοκ έκα ιεβάθμ ανζειυ δζαθμνεηζηχκ εκχζεςκ ιε εονφ θάζια πμθζηυηδηαξ. Σζξ πενζζζυηενεξ θμνέξ, υηακ ηαηά ηδ δζάνηεζα ιζαξ ηακμκζηήξ έηθμοζδξ (elution mode) πνδζζιμπμζείαζ έκα ιυκμ δζθαζζηυ ζφζηδια δζαθοηχκ, δεκ επζηοβπάκεηαζ μ ιέβζζημξ δοκαηυξ δζαπςνζζιυξ ηςκ μοζζχκ. Γζα ημ θυβμ αοηυ ηαζ πανάθθδθα βζα ηδκ ιείςζδ ημο πνυκμο δζαπςνζζιμφ, έπμοκ εθανιμζηεί δζάθμνμζ ηνυπμζ έηθμοζδξ υπςξ, ζηαδζαηή έηθμοζδ, (stepwise elution), ααειζδςηή έηθμοζδ (gradient elution), έηθμοζδ-ελχεδζδ (extrusion-elution) ηαζ πνςιαημβναθία ηαη ακηζννμή ( simulated moving bed (SMB) method) (Pan & Lu, 2007). Με ηδκ εθανιμβή ηδξ ααειζδςηήξ έηθμοζδξ (gradient elution), ηαθφπηεηαζ έκα εονφηενμ θάζια πμθζηυηδηαξ ιε ιία ιυκμ εθανιμβή ημο FCPC, ζε ακηίεεζδ ιε υηζ ζοιααίκεζ ιε ηδκ ζζμηναηζηή ηεπκζηή (Berthod et al, 1998). Έηζζ, εηποθίζιαηα ηα μπμία πενζέπμοκ εθεφεενα ή ηαζ βθοημζοθζςιέκα θθααμκμεζδή, έπμοκ ζοζηαηζηά ιε ιεβάθεξ δζαθμνέξ ζηδκ πμθζηυηδηα ηαζ ςξ εη ημφημο, είκαζ ςθεθζιυηενμ κα πνδζζιμπμζείηαζ δ ααειζδςηή έηθμοζδξ (Leitaõ et al, 2005). Βέααζα, δ εθανιμβή ημο gradient elution ζηδκ οβνή-οβνή πνςιαημβναθία δεκ είκαζ πθήνςξ ηαηακμδηή ςξ gradient, δζυηζ δ ζηαδζαηή αθθαβή ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ ιπμνεί κα επδνεάζεζ, ηαζ πνάβιαηζ αοηυ ζοιααίκεζ, ηδ ζφκεεζδ ηδξ οβνήξ ζηαηζηήξ θάζδξ. ε λ ί δ α 15

24 Δζζαβςβή οκεπχξ, δ εθανιμβή ημο δεκ είκαζ ηυζμ απθή υζμ ζηδκ οβνή πνςιαημβναθία ορδθήξ απυδμζδξ (HPLC) (Ignatova et al, 2011). Ζ πνχηδ εθανιμβή ζημ FCPC ιε gradient elution πναβιαημπμζήεδηε απυ ημοξ Ito ηαζ Bowman ημ 1973, ηαηαθένκμκηαξ ημ δζαπςνζζιυ επηά δζπεπηζδίςκ (Ito & Bowman, 1973). Απυ ηυηε ημ gradient elution έπεζ πνδζζιμπμζδεεί ζηδ ιεθέηδ θοηχκ ιε ζηυπμ ηδκ απμιυκςζδ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ(renault et al., 1997, Yin et al., 2010). ε λ ί δ α 16

25 Δζζαβςβή 1.3 Ολεςπυπεΐνη Διζαγυγή H ολεςπυπεΐνη (oleuropein, άθθεξ εθθδκζηέξ απμδυζεζξ: εθεονςπαΐκδ, εθαζμεονςπαΐκδ, μθεονςπαΐκδ, εθαζμεονςπεΐκδ) (εζη. 2) είκαζ έκαξ ζεημσνζδμεζδήξ βθοημγίηδξ πμο παναηηδνίγεζ ηδκ μζημβέκεζα Oleaceae. Απμηεθεί ημ ηφνζμ θαζκμθζηυ ζοζηαηζηυ ηδξ εθζάξ (Olea europaea). Δηηυξ απυ ηδκ Oleaceae ηα ζεημσνζδμεζδή ανίζημκηαζ ζε αθεμκία ηαζ ζηζξ μζημβέκεζεξ, Gentianaceae ηαζ Cornaleae. Σα ζνζδμεζδή ηαζ ηα ζεημσνζδμεζδή είκαζ εκχζεζξ πμο έπμοκ ζοκήεςξ βθοημγζηζημφξ δεζιμφξ ηαζ πανάβμκηαζ απυ ημ δεοηενμβεκή ιεηααμθζζιυ ηςκ ηενπεκίςκ, έπμκηαξ ςξ πνυδνμιεξ μοζίεξ αθηαθμεζδή ζκδμθίμο. Σα ζεημσνζδμεζδή ζηδκ μζημβέκεζα Oleaceae ζοκήεςξ πνμένπμκηαζ απυ ημκ μθεμζίδδ, μ μπμίμξ απανηίγεηαζ απυ ημ εθεκμθζηυ μλφ, ιε ελςηοηθζηυ 8,9 μθεθζκζηυ δεζιυ ηαζ ζάηπανμ. H μθεονςπεΐκδ ακαηαθφθεδηε ημ 1908 απυ ημοξ Bourquelot ηαζ Vintilesco ζημ εθαζυθαδμ, μζ μπμίμζ ηαζ ηδξ έδςζακ ημ παναηηδνζζηζηυ ηδξ υκμια (Bourquelot, 1908). Πμθφ ανβυηενα, ημ 1960, μζ Panizzi, Scarpati ηαζ Oriente οπέδεζλακ υηζ ημ ιυνζμ ηδξ μοζίαξ αοηήξ πενζέπεζ βθοηυγδ, β-3,4-δζοδνμλοθαζκοθαζεακυθδ (οδνμλοηονμζυθδ) ηαζ έκα μλφ ημ Εικόνα 2 Δομι Ολευρωπεΐνθσ μπμίμ είκαζ βκςζηυ ςξ εθεκμθζηυ μλφ. Σμ μλφ αοηυ ήηακ ήδδ βκςζηυ (παναζηεοαγυηακ ιε οδνυθοζδ εηποθίζιαημξ ηςκ εθαζμηάνπςκ ιε θςζθμνζηυ μλφ) ηαζ είπε πνμηαεεί απυ ημ 1962 ςξ θάνιαημ ηαηά ηδξ οπένηαζδξ (Guiso, 2005). Ζ μθεονςπεΐκδ ανίζηεηαζ ηονίςξ ζηα θφθθα ηδξ εθζάξ ηαζ ζημκ εθαζυηανπμ. Ζ πενζεηηζηυηδηα ζε μθεονςπεΐκδ είκαζ ιεβαθφηενδ ζημοξ ακχνζιμοξ εθαζυηανπμοξ ηαζ ζηδκ μοζία αοηή μθείθεηαζ ηονίςξ δ έκημκα πζηνή βεφζδ ημοξ. Σα εηποθίζιαηα θφθθςκ εθζάξ άνπζζακ κα ιεθεηχκηαζ απυ ηα ιέζα ημο 20μο αζχκα ηαζ επέδεζλακ ζδιακηζηέξ θανιαημθμβζηέξ δνάζεζξ, μζ μπμίεξ απμδυεδηακ ζηδκ πενζεηηζηυηδηά ημοξ ζε αζμθαζκυθεξ (Fleming, 1973). Οζ αζμθαζκυθεξ είκαζ ιζηνά ιυνζα πμο πενζέπμοκ ιία ή πενζζζυηενεξ θαζκμθζηέξ μιάδεξ. Σα ιυνζα αοηά είκαζ ιζηνυηενα απυ ηζξ πμθοθαζκυθεξ, ηαζ πενζέπμοκ θζβυηενεξ απυ 12 θαζκμθζημφξ ε λ ί δ α 17

26 Δζζαβςβή δαηηοθίμοξ. Μπμνμφκ κα παναηηδνζζημφκ ςξ απθέξ θαζκυθεξ, ιε ιία ιυκμ θαζκμθζηή μιάδα, δζ-, ηνζ-, ηαζ μθζβμθαζκυθεξ, ιε δφμ, ηνείξ, ή πενζζζυηενεξ θαζκμθζηέξ μιάδεξ ακηίζημζπα. Μπμνμφκ κα ανεεμφκ αηυιδ ηαζ ζε εζηενμπμζδιέκεξ ιμνθέξ ιε ηενπεκζηέξ εκχζεζξ. Ζ μθεονςπεΐκδ είκαζ δ πζμ άθεμκδ αζμθαζκυθδ πμο πενζέπεηαζ ζηα θφθθα εθζάξ ηαζ πανμοζζάγεζ ιεβάθμ εκδζαθένμκ θυβς ηςκ πμθθχκ αζμθμβζηχκ ηδξ δνάζεςκ, in vitro ηαζ in vivo Βιολογικέρ ιδιόηηηερ ηηρ ολεςπυπεΐνηρ Εικόνα 3 Ζ μθεονςπεΐκδ έπεζ πμθθέξ θανιαηεοηζηέξ ζδζυηδηεξ (εζη. 3), υπςξ ακηζμλεζδςηζηή (Visioli et al., 2002), ακηζθθεβιμκχδδ (Visioli et al., 1998), ακηζαεδνςιαηζηή (Carluccio et al., 2003), ακηζηανηζκζηή (Owen et al., 2000), ακηζιζηνμαζαηή (Tripili et al., 2005), ηαζ ακηζ-ζζηή (Fredrickson et al., 2000), ηαζ βζα ημοξ θυβμοξ αοημφξ είκαζ δζαεέζζιδ ζημ ειπυνζμ ςξ ζοιπθήνςια δζαηνμθήξ ηονίςξ ζηζξ Μεζμβεζαηέξ πχνεξ. Δπζπθέμκ, δ μθεονςπεΐκδ έπεζ απμδεζπεεί υηζ είκαζ ηανδζμπνμζηαηεοηζηή εκάκηζα ζε μλεία ηανδζμημλζηυηδηα ζε αδνζαιοηίκδ (Andreadou et al., 2007) ηαζ υηζ ειθακίγεζ ακηζ-ζζπαζιζηή ηαζ οπμθζπζδαζιζηή δνάζδ (Andreadou et al., 2006) Ανηιοξειδυηική δπάζη Ζ μθεονςπεΐκδ ακαζηέθθεζ ζζπονά ηδκ μλείδςζδ ηδξ παιδθήξ ποηκυηδηαξ θζπμπνςηεΐκδξ (LDL) πμο επάβεηαζ απυ εεζζηυ παθηυ. Έπεζ επίζδξ ηδκ ζηακυηδηα κα πνμζηαηεφεζ ηα ηφηηανα απυ ημ ιμκμλείδζμ ημο αγχημο ηαζ κα πνμηαθεί αφλδζδ ηδξ ε λ ί δ α 18

27 Δζζαβςβή ζοκεεηάζδξ ημο επαβχβζιμο κζηνζημφ μλεζδίμο (inos). Δπζπθέμκ δ μθεονςπεΐκδ ειθάκζζε πνμζηαηεοηζηή δνάζδ έκακηζ ημο οπμπθςνζχδμοξ μλέμξ (HOCl). Σμ HOCl είκαζ έκαξ μλεζδςηζηυξ πανάβμκηαξ πμο πανάβεηαζ in vivo απυ μοδεηενυθζθεξ ιοεθμτπενμλεζδάζεξ ζημ ζδιείμ ηδξ θθεβιμκήξ ηαζ ιπμνεί κα πνμηαθέζεζ αθάαεξ ζε πνςηεΐκεξ, ζοιπενζθαιαακμιέκμο ηαζ ηςκ εκγφιςκ Ανηιθλεγμονώδηρ δπάζη Ένεοκεξ έδεζλακ υηζ δ μθεονςπεΐκδ αολάκεζ ηδκ παναβςβή ημο ιμκμλεζδίμο ημο αγχημο (NO) ζηα ιαηνμθάβα ηφηηανα ιεηά απυ πμνήβδζδ θζπμπμθοζαηπανίηδ ιέζς επαβςβήξ ηδξ θεζημονβζηήξ ιμνθήξ ημο εκγφιμο, ζοκεεηάζδ ημο κζηνζημφ μλεζδίμο, δζεβείνμκηαξ ιε αοηυ ημκ ηνυπμ ηδ θεζημονβία ηςκ ακμζμεπανηχκ ηοηηάνςκ. Δίκαζ βκςζηυ υηζ δ μθεονςπεΐκδ επζθένεζ ακηζθθεβιμκχδδ δνάζδ ιέζς πανειπυδζζδξ ηδξ δναζηδνζυηδηαξ ηδξ θζπμλοβεκάζδξ ηαζ ηδξ παναβςβήξ ηδξ θεοημηνζέκδξ Β Ανηικαπκινική δπάζη Μία πνυζθαηδ ιεθέηδ έδεζλε υηζ δ μθεονςπεΐκδ πανειπυδζζε ημκ πμθθαπθαζζαζιυ ηαζ ηδ ιεηακάζηεοζδ πνμπςνδιέκμο ααειμφ ηανηζκζηχκ ηοηηανζηχκ ζεζνχκ ηαηά ηνυπμ δυζδξ-απυηνζζδξ. Δπζπθέμκ, ζε ιία άθθδ δμηζιή, δ μθεονςπεΐκδ μδήβδζε ζε ιδ ακαζηνέρζιδ αθθαβή ημο ζπήιαημξ ηανηζκζηχκ ηοηηάνςκ, απμηνέπμκηαξ ηδκ ακηζβναθή ημοξ, ηδκ ηζκδηζηυηδηα ηαζ ηδκ εζζαμθή ημοξ ζε άθθεξ πενζμπέξ, δνάζδ πμο ήηακ ακαζηνέρζιδ ζε οβζή ηφηηανα. ηακ δ μθεονςπεΐκδ πμνδβήεδηε απυ ημ ζηυια ζε πμκηίηζα ηα μπμία είπακ ακαπηφλεζ αοευνιδημοξ υβημοξ, μδήβδζε ζηδκ οπμπχνδζδ ηςκ υβηςκ ζε δζάζηδια 9-12 διενχκ. ηακ μζ υβημζ αθαζνέεδηακ πνζκ ηδκ πθήνδ οπμπχνδζδ ημοξ, παναηδνήεδηε υηζ δεκ είπακ ζοκμπή ηαζ ήηακ εφενοπημζ. Κακέκα γςκηακυ ηφηηανμ δεκ ακαηηήεδηε απυ αοημφξ ημοξ υβημοξ. Αοηέξ μζ παναηδνήζεζξ ακάβμοκ ηδκ μθεονςπεΐκδ απυ έκα ιδ-ημλζηυ ακηζμλεζδςηζηυ ζε έκα απμηεθεζιαηζηυ ακηζηανηζκζηυ πανάβμκηα ιε άιεζδ επίδναζδ εκακηίμκ ηςκ υβηςκ. Σα απμηεθέζιαηα αοηά είκαζ δοκαηυ κα ελδβμφκ ηδκ πνμζηαηεοηζηή έκακηζ ημο ηανηίκμο δνάζδ ηδξ Μεζμβεζαηήξ δίαζηαξ, δ μπμία είκαζ πθμφζζα ζε πνμσυκηα εθζάξ (Hamdi, 2005). ε λ ί δ α 19

28 Δζζαβςβή 1.4 Genista halacsyi Heldr. (Leguminosae) Διζαγυγή H μζημβέκεζα Leguminosae (Fabaceae) απμηεθεί ιία απυ ηζξ ιεβαθφηενεξ μζημβέκεζεξ θοηχκ, ιε ακηζπνμζχπμοξ ζπεδυκ ζε υθεξ ηζξ δπείνμοξ. Πενζθαιαάκεζ πμθθά εδχδζια θοηά, απυ ηα μπμία, άθθα πνδζζιμπμζμφκηαζ ςξ ηνμθή απυ ημκ άκενςπμ ηαζ άθθα απυ ηα γχα. Πμθθά θοηά αοηήξ ηδξ μζημβέκεζαξ έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί παναδμζζαηά απυ πμθθμφξ θαμφξ ηαζ ςξ θανιαηεοηζηά θοηά. Ζ ζοζηδιαηζηή ηαηάηαλδ ηδξ θοθήξ tribe Genisteae ηδξ μζημβέκεζαξ Leguminosae, έπεζ οπμζηεί πμθθέξ αθθαβέξ ηζξ ηεθεοηαίεξ δεηαεηίεξ, θυβς πθήεμοξ ηςκ κέςκ επζζηδιμκζηχκ δεδμιέκςκ, ηα μπμία ένπμκηαζ ζηδκ επζθάκεζα. Μία απυ ηζξ πνχηεξ πνμζπάεεζεξ μζ μπμίεξ έβζκακ βζα ηδκ ζοζηδιαηζηή ηαηάηαλδ ηδξ θοθήξ Genistae, ήηακ απυ ημκ Hutchinson (Hutchinson 1964), μ μπμίμξ μιαδμπμίδζε υθα ηα βέκδ πμο πενζθαιαάκεζ αοηή δ θοθή, ζφιθςκα ιε ημκ Rothmaler (Rothmaler, 1944). Δζδζηυηενα ημ βέκμξ Genista πενζθαιαάκεζ εάικμοξ, μζ μπμίμζ ζοπκά είκαζ θοθθμαυθμζ, άθθμηε αβηαεςημί ηαζ άθθμηε υπζ. Σα θφθθα ημοξ έπμοκ έκα ή ηνία θοθθάνζα ηαζ μζ ιίζπμζ ημοξ είκαζ εθθείπμκηεξ ή ιζηνμί ηαζ ζοπκά παναηηδνίγμκηαζ απυ ηδκ φπανλδ εκυξ ιζηνμφ οπμζθαζνζημφ ελμβηχιαημξ. Σα άκεδ ημοξ ζπδιαηίγμοκ ναηέιζα ή ηεθάθζα ή ηαζ ιαζπαθζαίεξ ζοζηάδεξ, μζ μπμίεξ ζπάκζα ανίζημκηαζ ιυκεξ ημοξ. Ο ηάθοηαξ ημοξ έπεζ δφμ πείθδ, ημ πάκς ζζπονά δζπμημιδιέκμ ηαζ ημ ηάης πείθμξ ιε ηνία δυκηζα. Ζ ζηεθάκδ ημο άκεμοξ είκαζ ηίηνζκδ, μζ ζηήιμκεξ ιμκάδεθθμζ ηαζ μ ηανπυξ δζανοβκχιεκμξ ή υπζ, ςμεζδήξ έςξ βναιιμεζδχξ ζηεκυιαηνμξ, εκχ ηα ζπένιαηα ιπμνεί κα είκαζ απυ έκα έςξ πμθθά. Σα πενζζζυηενα είδδ Genista θοηνχκμοκ ζε πεηνχδεζξ πθαβζέξ θυθςκ, ζε εάικμοξ ή αηυια ηαζ ζε λενά δάζδ. Σμ βέκμξ Genista ζηδκ Δονχπδ πενζθαιαάκεζ πενίπμο ελήκηα είδδ, ηα μπμία δζαπςνίγμκηαζ ηαζ ηαηαηάζζμκηαζ ζφιθςκα ιε ηδκ Flora Europaea ζε δέηα μιάδεξ (Heywood & Ball, 1968). Ζ G. halacsyi είκαζ ημ έκα απυ ηα ηέζζενα εκδδιζηά είδδ Genista ηδξ Δθθάδαξ. Πθδεοζιμί ημο έπμοκ ηαηαβναθεί ζηδκ Πεθμπυκκδζμ ζηα αμοκά Πάνκςκαξ ηαζ Σαΰβεημξ (Tan & Iatrou, 2001). ε λ ί δ α 20

29 Δζζαβςβή Βοηανική πεπιγπαθή Εικόνα 4 Σο φυτό G. halacsyi H Genista halacsyi Heldr. (εζη. 4, εζη. 5-8) (ηαοημπμζήεδηε-ακαβκςνίζηδηε ημ 1899). Δίκαζ έκαξ ημκηυξ εάικμξ, φρμοξ ιέπνζ 40 cm, ιε πμθθά θεπηά, ακενπυιεκα, ζπεδυκ θεία έςξ ποηκά ηνζπςηά, αοθαηςιέκα ζηεθέπδ. Σα θφθθα ημο είκαζ ςμεζδή εκαθθαζζυιεκα, (2-4 x 1-2 mm) μλοηυνοθα έςξ αιαθοηυνοθα, ποηκά ηνζπςηά έςξ θεία ζηδκ πάκς επζθάκεζα ηαζ ποηκά ηνζπςηά ζηδκ ηάης επζθάκεζα. Σα ανάηηζα είκαζ πνάζζκα (2-3 mm) ηαζ ιμζάγμοκ ιε ηα θφθθα. Σα άκεδ έπμοκ ιίζπμ ηαζ είκαζ ποηκά ηεθάθζα, ιε 2-5 άκεδ ζηδκ άηνδ αδφκαηςκ ηθαδίζηςκ, ζηδνζγυιεκα απυ δφμ ιζηνά θμβπμεζδή ανάηηζα (1-1,5 mm). Ο ηάθοηαξ, (5-6 mm) είκαζ πςνζζιέκμξ ζηδ ιέζδ, ηνζπςηυξ, δίπεζθμξ. Σα δυκηζα ημο πάκς πείθμοξ είκαζ ηνζβςκζηά, πενίπμο 3 mm, εκχ ηα δυκηζα ημο ηάης πείθμοξ βναιιμεζδή έςξ ηνζβςκζηά, εθαθνχξ ημκηφηενα. Ζ ζηεθάκδ (12-15 mm) είκαζ πνοζμηίηνζκδ, μ πέηαζμξ είκαζ ζηνμββοθειέκμξ ιε έκα ααεμφθςια ζηδκ άηνδ ηαζ πκμοδςηυξ πνμξ ηα πίζς, εκχ μζ πηένοβεξ είκαζ θείεξ ηαζ δ ηνμπίδα πενίπμο ίζδ ιε ημκ πέηαζμ, πκμοδςηή. Ο ηανπυξ είκαζ επζιήηδξ έςξ ςμεζδήξ (5-8 mm) θεοηυξ, πκμοδςηυξ ηαζ πενζέπεζ ζοκήεςξ δφμ ζπένιαηα (Tan & Iatrou, 2001). Ακ ηαζ μζ αμηακζηέξ ακαθμνέξ ακαθένμοκ πενζμνζζιέκμοξ πθδεοζιμφξ ηδξ G. halacsyi, ηαηά ηδ ζοθθμβή ημο θοημφ εκημπίζηδηακ μθυηθδνα μνεζκά θζαάδζα ιε πθδεοζιμφξ ημο θοημφ (Δζη. 6). Εικόνα 5 Σο φυτό G. halacsyi ε λ ί δ α 21

30 Δζζαβςβή Εικόνα 6 Πλθκυςμόσ του ενδθμικοφ φυτοφ G. halacsyi ςτθν Πελοπόννθςο Εικόνα 7 Σα άνκθ του ενδθμικοφ φυτοφ G. halacsyi Εικόνα 8 Οι καρποί του ενδθμικοφ φυτοφ G. halacsyi ε λ ί δ α 22

31 Δζζαβςβή Βοηανική καηάηαξη Ζ αμηακζηή ηαλζκυιδζδ ημο είδμοξ G. halacsyi πανμοζζάγεηαζ ζημκ παναηάης πίκαηα. Βοηανική ηαξινόμηζη ηος θςηού G. halacsyi Βαζίλειο Plantae Άθποιζμα Magnoliophyta (Angiospermae) Κλάζη Magnoliopsida (Dicotyledonae) Υποκλάζη Rosidae Τάξη Fabales Οικογένεια Leguminosae (Fabaceae) Υπoοικογένεια Papillionoideae Φςλή Genisteae Γένορ Genista Είδορ G. halacsyi Heildreich ε λ ί δ α 23

32 Δζζαβςβή Φλαβονοειδή ζηο γένορ Genista Δίκαζ βκςζηυ υηζ ηα θοηά ηδξ μζημβέκεζαξ Leguminosae είκαζ ζδζαίηενα πθμφζζα, ζε ζζμθθααυκεξ ηαζ βεκζηυηενα ζε θθααμκμεζδή. Δίκαζ παναηηδνζζηζηή δ απμιυκςζδ άκς ηςκ 1200 θθααμκμεζδχκ απυ ηα 385 βέκδ ηδξ μζημβέκεζαξ, εκχ ιυκμ απυ ηα 199 είδδ ηδξ θοθήξ Genisteae έπμοκ απμιμκςεεί πενζζζυηενα απυ 110 θθααμκμεζδή. Παναηάης πανμοζζάγμκηαζ ιενζηέξ παναηηδνζζηζηέξ μοζίεξ πμο απακηχκηαζ ζημ βέκμξ Genista. Ιςοφλαβόνεσ Γενιζηεΐνη R 1 = OH R 2 = ΟH Νηενηζεΐνη R 1 = H R 2 = OH Φοπμονεηίνη R 1 = H R 2 = OCH 3 Ιζοπποςνεηίνη R 1 = OCH 3 R 2 = OH Φλαβόνεσ Απιγενίνη R 1 = OH R 2=H Λοςηεολίνη R 1 = OH R 2=OH Φλαβονόλεσ Καιμπθεπόλη R 1 = OH R 2 = H Κεπκεηίνη R 1 = OH R 2 = OH Φιζεηίνη R 1 = H R 2 = ΟH ε λ ί δ α 24

33 Δζζαβςβή Οζ ζζμθθααυκεξ είκαζ δ πζμ βκςζηή ηαζ ιεθεηδιέκδ ηαηδβμνία θςηοοιζηπογόνυν. Ήηακ μζ δναζηζηέξ εκχζεζξ πμο πνμηάθεζακ ηδκ αζεέκεζα ημο ηνζθοθθζμφ ζε πνυααηα ζηδκ Αοζηναθία ηαηά ηδκ δεηαεηία ημο 1940, ιε ζμαανά πνμαθήιαηα οπμβμκζιυηδηαξ. Ζ βεκζζηεΐκδ ηαζ δ κηεκηγεΐκδ ήηακ μζ πνχημζ ακηζπνυζςπμζ πμο απμιμκχεδηακ. Ζ ζζημνία ηςκ θςηοοιζηπογόνυν είκαζ πμθφ παθζά. Απυ ηδκ ανπαζυηδηαηα έπμοκ απμδμεεί ζε μνζζιέκα θοηά αθνμδζζζαηέξ ή μνιμκμνοειζζηζηέξ ζδζυηδηεξ ηαζ έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί εηηεηαιέκα ζηδ θασηή εεναπεοηζηή. ηδκ ανπαία Δθθάδα, ημ ζφιαμθμ ηδξ βμκζιυηδηαξ, ηδξ αεακαζίαξ ηαζ ημο ένςηα πμο ήηακ ημ νυδζ (Punica granatum) ηαζ ζηδκ ανπαία Αίβοπημ, δ βφνδ απυ ημ θμίκζηα (Phoenix dactylifera) έπμοκ πνδζζιμπμζδεεί βζα κα αολήζμοκ ηδ βμκζιυηδηα ηςκ βοκαζηχκ. Ζ ζφβπνμκδ ιεθέηδ ηδξ ζφζηαζδξ ημοξ έπεζ μδδβήζεζ ζηδκ απμιυκςζδ μζζηνυκδξ πμο είκαζ έκα εκδμβεκέξ μζζηνμβυκμ ημο ακενχπμο (Brandi, 1997). Ο Ηππμηνάηδξ πνδζζιμπμίδζε θζκανυζπμνμ ηαζ οπενζηυ, βζα κα νοειίζεζ ιία ηαεανά μνιμκζηή θεζημονβία αοηή ηδξ έιιδκδξ νφζδξ, βζα ηα μπμία ζήιενα είκαζ βκςζηυ υηζ πενζέπμοκ θζβκάκζα ηαζ θθααμκμεζδή ακηίζημζπα, πμο είκαζ βκςζηά θοημμζζηνμβυκα (Λοπμονθήξ, 2001) Βιολογικέρ ιδιόηηηερ ιζοθλαβονών Ζ πνήζδ ηςκ ζζμθθααoκχκ ηαζ ηςκ παναβχβςκ ημοξ έπεζ επεηηαεεί ηα ηεθεοηαία πνυκζα ζημ πχνμ ηδξ πνμθδπηζηήξ ζαηνζηήξ, ζοιπθδνςιάηςκ δζαηνμθήξ, αβνμπδιζηχκ ηαζ ηαθθοκηζηχκ. Οζ ζζμθθααυκεξ απακηχκηαζ ζε ακχηενα θοηά ηονίςξ ζε ακηζπνμζχπμοξ ηδξ οπμμζημβέκεζαξ Papilionoideae (Leguminosae), ζε ηανπμφξ, θνμφηα ηαζ θαπακζηά (Dewick, 1994). ε ιεβάθδ αθεμκία οπάνπμοκ ζηδ ζυβζα (soyabean) (Goto et al., 2009), ιε ηονζυηενμοξ εηπνμζχπμοξ ηδ Soya bean κηεκηγεΐκδ, ηδ βεκζζηεΐκδ, ηδ βθοηζηεΐκδ, ηδ αζμπακίκδ ηαζ ηδ θμνιμκμκεηίκδ. Soya ε λ ί δ α 25

34 Δζζαβςβή Δπζδδιζμθμβζηέξ ιεθέηεξ έπμοκ απμδείλεζ πςξ πθδεοζιμί πμο ηαηακαθχκμοκ ορδθά επίπεδα θίπμοξ ηαζ γςζηχκ πνςηεσκχκ έπμοκ πενζζζυηενεξ πζεακυηδηεξ κα ειθακίζμοκ μνιμκμελανηχιεκμοξ ηανηίκμοξ ζε ζπέζδ ιε πθοεδζιμφξ ηςκ μπμίςκ δ δζαηνμθή ζηδνίγεηαζ ζε ηαηακάθςζδ ηνμθχκ πθμφζζςκ ζε ζζμθθααμκμεζδή, δδθαδή θαπακζηά, ζυβζα ηαζ παναβχβςκ ηδξ (Houerou et al., 2000, Tham, 1998). Οζ θυβμζ αοημί μδήβδζακ ζηδκ εηηεηαιέκδ ιεθέηδ ηδξ αζμθμβζηήξ δνάζδξ ηςκ ζζμθθααμκχκ Ανηιμικποβιακή-ανηιβακηηπιδιακη δπάζη Ανηεηέξ ζζμθθααυκεξ ακάιεζα ημοξ ηαζ δφμ απυ ημοξ ααζζηυηενμοξ εηπνμζχπμοξ ημοξ, δ βεκζζηεΐκδ ηαζ δ κηεηγεΐκδ, ειθακίγμοκ ακηζιζηνμαζαηή δνάζδ βεβμκυξ πμο μδδβεί ζημ ζοιπέναζια πςξ ιπμνμφκ κα ειπθέημκηαζ ζημοξ ιδπακζζιμφξ άιοκαξ ηςκ θοηχκ υηακ αοηά πνμζαάθθμκηαζ απυ ιζηνμμνβακζζιμφξ. Γνμοκ δδθαδή ζακ θοημαθελίκεξ. Ακάιεζα ζηζξ ζζμθθααυκεξ πμο ειθακίγμοκ ακηζιζηνμαζαηή δνάζδ εκημπίγμκηαζ ηαζ ηάπμζα πνεκοθζςιέκα πανάβςβα ηδξ βεκζζηεΐκδξ ηαζ ηδξ κηεηγεΐκδξ πμο έπμοκ απμιμκςεεί απυ ημ Phaseolus vulgaris ηαζ βεκζηυηενα απυ θοηά ηδξ μζημβέκεζαξ Leguminosae (Dewick et al.,1982, Sujata et al., 2004) Ανηιοξειδυηική δπάζη Ζ βεκζζηεΐκδ ηαζ δ κηεηγεΐκδ, ζζμθθααυκεξ πμο έπμοκ απμιμκςεεί απυ ηδ ζυβζα πανμοζζάγμοκ ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ ζε in vitro αθθά ηαζ ζε in vivo πεζνάιαηα. Ζ πνυζθδρδ βεκζζηεΐκδξ ηαζ κηεηγεΐκδξ έπεζ δείλεζ υηζ πανέπεζ πνμζηαζία έκακηζ ηδξ μλεζδςηζηήξ ηνμπμπμίδζδξ ηςκ ιμνίςκ ηδξ LDL ζημκ ακενχπζκμ μνβακζζιυ. ηακ επςάγμκηαζ ζε ακενχπζκμ πθάζια, ηάπμζα ιυνζα βεκζζηεΐκδξ ηαζ κηεηγεΐκδξ εκζςιαηχκμκηαζ ζε ιυνζα ηδξ LDL. Ζ εκζςιάηςζδ αοηή αολάκεζ ηδκ ακηίζηαζδ ηδξ LDL ζε in vitro μλείδςζδ. Ζ ηαηακάθςζδ ζζμθθααμκχκ απυ ζυβζα ανέεδηε επίζδξ κα είκαζ πνμζηαηεοηζηή εκάκηζα ζηδκ μλείδςζδ ημο DNA ζε ακενχπζκα θειθμηφηηανα. Δπζπθέμκ, δ βεκζζηεΐκδ ηαζ δ κηεηγεΐκδ έδεζλακ, ζε in vitro πεζνάιαηα, ζζπονή ακηζμλεζδςηζηή δνάζδ ζε θζπμζχιαηα εηηεεεζιέκα ζε UV αηηζκμαμθία, ηαζ ζε εθεφεενεξ νίγεξ οδνμλοθίμο (Lee et al., 2005). ε λ ί δ α 26

35 2 Πειπαμαηικό ε λ ί δ α 27

36 Πεζναιαηζηυ ε λ ί δ α 28

37 Πεζναιαηζηυ 2.1 Τεσνικέρ πος σπηζιμοποιήθηκαν Φπυμαηογπαθικέρ Μέθοδοι Φπυμαηογπαθία επί λεπηήρ ζηιβάδαρ Γέθδ μλεζδίμο ημο πονζηίμο ιε δείηηδ θεμνζζιμφ ζε θφθθα αθμοιζκίμο 20 x 10 cm. Πάπμξ ζηζαάδαξ 0.1 mm (ακαθοηζηή πνςιαημβναθία). Γέθδ μλεζδίμο ημο πονζηίμο ακηζζηνυθμο θάζεςξ ιε δείηηδ θεμνζζιμφ ζε βοάθζκεξ πθάηεξ 5 x 10 cm. Πάπμξ ζηζαάδαξ 0.25 mm (ακαθοηζηή πνςιαημβναθία). Γέθδ μλεζδίμο ημο πονζηίμο ακηζζηνυθμο θάζεςξ ιε δείηηδ θεμνζζιμφ ζε θφθθα αθμοιζκίμο 20 x 10 cm. Πάπμξ ζηζαάδαξ 0.25 mm (ακαθοηζηή πνςιαημβναθία). Φπυμαηογπαθία ζηήληρ Sephadex LH-20, βέθδ οδνμλοπνμποθζςιέκδξ δεληνάκδξ (Pharmacia Fine Chemicals). Μέβεεμξ ηυηηςκ: ι. Πνζκ απυ ηδ πνήζδ αθήκεηαζ κα δζμβηςεεί ιε ημ δζαθφηδ έηθμοζδξ επί 24 χνεξ. Αημθμφεςξ, θένεηαζ ζηδ ζηήθδ ηαζ εηπθφκεηαζ ιε ημκ ίδζμ δζαθφηδ πέκηε θμνέξ (ακηεκδείηκοηαζ δ ιδπακζηή ηαζ ηονίςξ δ ιαβκδηζηή ακάδεοζδ, δζυηζ ηαηαζηνέθμκηαζ μζ ηυηημζ). Υγπή Φπυμαηογπαθία Υτηλήρ Απόδοζηρ (HPLC) Ζ ζοζηεοή πμο πνδζζιμπμζήεδηε είκαζ ηδξ Σhermo Finnigan ηαζ απμηεθείηαζ απυ ηα αηυθμοεα ηιήιαηα: Ακηθία SpectraSystem P4000, ιε ηδκ ζηακυηδηα ακάιεζλδξ ηεζζάνςκ δζαθμνεηζηχκ δζαθοηχκ, ζε μπμζαδήπμηε ακαθμβία, Απαενςηήξ (degasser) SpectraSystem 1000, Αοηυιαημξ δεζβιαημθήπηδξ SpectraSystem AS3000, ηαζ έκαξ ακζπκεοηήξ θςημδζυδςκ (PDA) SpectraSystem UV6000LP. H πνςιαημβναθζηή ζηήθδ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημκ πμζμηζηυ έθεβπμ ηςκ εηποθζζιάηςκ ήηακ δ Supelco RPHS C18 δζαζηάζεςκ 250 x 4.6 mm i.d., 5.0 ιm (Discovery). Ωξ ηζκδηή θάζδ πνδζζιμπμζήεδηακ ιίβιαηα αηεημκζηνζθίμο:οδαηζημφ δζαθφιαημξ 2% μλζημφ μλέμξ ηαζ ιεεακυθδξ: οδαηζημφ δζαθφιαημξ 1% μλζημφ μλέμξ. Σαπφηδηα νμήξ: 1.0 ml/min. ε λ ί δ α 29

38 Πεζναιαηζηυ Φπυμαηογπαθία Καηανομήρ με Φςγοκένηπηζη (FCPC) Ζ ιέεμδμξ πενζθαιαάκεζ δομ ααζζημφξ ηφπμοξ ελζζμννυπδζδξ ακάθμβα ιε ημκ ηνυπμ πμο επζηοβπάκεηαζ δ ζζμννμπία ζημ ζφζηδια. Σμ φζηδια Τδνμζηαηζηήξ Δλζζμννυπδζδξ (HSES) ηαζ ημ φζηδια Τδνμδοκαιζηήξ Δλζζμννυπδζδξ (HDES). Ζ ζοζηεοή ημο ενβαζηδνίμο ιαξ είκαζ ηαηαζηεοαζιέκδ κα θεζημονβεί ιε ημ ζφζηδια HSES. Ζ ζοζηεοή πμο πνδζζιμπμζήεδηε είκαζ δ Kromaton FCPC. Φπυμαηογπαθία Λεπηήρ Σηιβάδαρ Υτηλήρ Απόδοζηρ (HPTLC) Ζ ζοζηεοή πμο πνδζζιμπμζήεδηε πενζθαιαάκεζ: CAMAG Linomat 5 βζα ηδκ εθανιμβή ημο δείβιαημξ. CAMAG TLC Scanner 3 βζα ηδκ ποηκμιεηνζηή αλζμθυβδζδ ημο πνςιαημβναθήιαημξ ηαζ ηδκ θήρδ θαζιάηςκ απμννυθδζδξ. CAMAG TLC Visualizer βζα ηδκ απμηφπςζδ ημο πνςιαημβναθήιαημξ ςξ έβπνςιδξ εζηυκαξ ζηα 254 nm, 366 nm ηαζ ημ μναηυ. Φπυμαηογπαθικά ανηιδπαζηήπια Σα πνςιαημβναθήιαηα παναηδνμφκηαζ ανπζηά ζημ οπενζχδεξ θςξ (254nm, 366nm). Γζα ηδκ ειθάκζζή ημοξ πνδζζιμπμζήεδηε ημ αηυθμοεμ ακηζδναζηήνζμ : Γζάθοια Α: αακζθθίκδ 5% ζε ιεεακυθδ, Γζάθοια Β: π. H 2 SO 4 5% ζε ιεεακυθδ (Stahl, 1969). Ίζμζ υβημζ ακαιζβκφμκηαζ αιέζςξ πνζκ ημκ ρεηαζιυ ηαζ ημ πνςιαημβνάθδια εενιαίκεηαζ βζα 5 min ζημοξ C Φαζμαηοζκοπικέρ Μέθοδοι Φαζμαηοζκοπία Πςπηνικού Μαγνηηικού Σςνηονιζμού (ΝΜR) Γζα ηδκ θήρδ ηςκ θαζιάηςκ Πονδκζημφ Μαβκδηζημφ οκημκζζιμφ (ΝΜR) πνδζζιμπμζήεδηε μ αηυθμοεμξ θαζιαημβνάθμξ: Φαζιαημβνάθμξ Bruker Avance III 600 MHz. ε λ ί δ α 30

39 Πεζναιαηζηυ Οζ πδιζηέξ ιεηαημπίζεζξ (δ) είκαζ εηθναζιέκεξ ζε ppm, εκχ μζ ζηαεενέξ ζφγεολδξ (J) ζε Hz. Ζ πμθθαπθυηδηα ηςκ ημνοθχκ εηθνάγεηαζ ςξ s (απθή), brs (εονεία απθή), d (δζπθή), t (ηνζπθή), q (ηεηναπθή), dd (δζπθή-δζπθή) ηαζ m (πμθθαπθή), εκχ μ δζαθφηδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ θήρδ ηςκ θαζιάηςκ ήηακ δ δεοηενζςιέκδ ιεεακυθδ (CD 3 OD). Υνδζζιμπμζήεδηακ μζ αηυθμοεεξ ηεπκζηέξ: COSY (Correlation Spectroscopy). HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence). HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation). 2.2 Γιαλύηερ Υνδζζιμπμζήεδηακ μζ ελήξ δζαθφηεξ: δζπθςνμιεεάκζμ (CH 2 Cl 2 ), ιεεακυθδ (MeOH), μλζηυξ αζεοθεζηέναξ (EtOAc), ελάκζμ (Hex), αζεακυθδ (EtOH) ηαζ αμοηακυθδ (BuOH). Δπίζδξ πνδζζιμπμζήεδηε απζμκζζιέκμ ηαζ απεζηαβιέκμ κενυ (Ζ 2 Ο). Γζα ηζξ πνςιαημβναθζηέξ ακαθφζεζξ ζε ζοζηεοή HPLC πνδζζιμπμζήεδηακ μζ αηυθμοεμζ δζαθφηεξ: αηεημκζηνίθζμ (ACN), κενυ, ιεεακυθδ ηαζ μλζηυ μλφ (A.A.). Πνζκ πνδζζιμπμζδεμφκ μζ δζαθφηεξ ζηδκ HPLC δζδεήεδηακ οπυ ηεκυ ηαζ απαενχεδηακ. ε λ ί δ α 31

40 Πεζναιαηζηυ ε λ ί δ α 32

41 3 Πποζυπικά Αποηελέζμαηα ε λ ί δ α 33

42 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα ε λ ί δ α 34

43 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα 3.1 Aπομόνυζη ολεςπυπεΐνηρ με FCPC από θύλλα ελιάρ και ποζοηικοποίηζή ηηρ Φςηικό ςλικό Φφθθα εθζάξ ζοθθέπεδηακ ημκ Ημφκζμ ημο 2008 απυ ηδκ Πακεπζζηδιζμφπμθδ Εςβνάθμο. Μεηά ηδ ζοθθμβή ηα θφθθα αθέεδηακ κα λδναεμφκ ζε δνμζενυ ηαζ ζηζενυ πχνμ επί 20 διένεξ. Γζα ηδκ εηπφθζζδ ηςκ θφθθςκ πνδζζιμπμζήεδηακ kg λδνμφ θοημφ, αδνμιενχξ ηεηιδιέκςκ. Σα θφθθα εθζάξ εηποθίζηδηακ, ιε ηδκ ηθαζζηή ιέεμδμ ηδξ δζαανμπήξ πνδζζιμπμζχκηαξ αηεηυκδ. Πνμέηορακ 388 g αηεημκζημφ εηποθίζιαημξ (OLE_A), απυ ηα μπμία 200 g εηπθφεδηακ ιε CH 2 Cl 2 /MeOH ζε ακαθμβία 98:2, δίκμκηαξ 130 g εηποθίζιαημξ (OLE_AA). ΥΖΜΑΣΗΚΖ ΑΝΑΠΑΡΑΣΑΖ ΔΚΥΤΛΗΖ ΦΤΛΛΩΝ ΔΛΗΑ ε λ ί δ α 35

44 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Σύνδεζη ηεσνικήρ HPTLC με FCPC Πνμηεζιέκμο κα απμιμκςεεί μθεονςπεΐκδ ορδθήξ ηαεανυηδηαξ βζα κα πνδζζιμπμζδεεί ζακ πνυηοπδ μοζία βζα ηδκ πμζμηζημπμίδζή ηδξ ζηα εηποθίζιαηα OLE_A ηαζ OLE_AA, πναβιαημπμζήεδηε ακάθοζδ ημο εηποθίζιαημξ OLE_AA ιε δκ ηεπκζηή FCPC. Απαναίηδημ ζηάδζμ βζα ημ δζαπςνζζιυ ιε ηδκ ηεπκζηή αοηή είκαζ δ εφνεζδ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ ηςκ μοζζχκ ημο εηποθίζιαημξ, δ μπμία πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ HPTLC. Ανπζηά παναζηεοάζηδηακ ηαζ εθέβπεδζακ δζάθμνα ζοζηήιαηα δζαθοηχκ ηυζμ ςξ πνμξ ηδ δζθαζζηυηδηά ημοξ, δδθαδή ηδκ ζηακυηδη δζαπςνζζιμφ ηςκ δφμ θάζεςκ, υζμ ηαζ ςξ πνμξ ηδ δζαθοηζηή ημοξ ζηακυηδηα. Έπεζηα απυ δμηζιέξ ζε δμηζιαζηζημφξ ζςθήκεξ επζθέπεδηε ημ ζφζηδια CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O ζε ακαθμβία 4:3:2 ςξ ημ ηαηαθθδθυηενμ (ακαθμβία θάζεςκ 50:50, πςνίξ δδιζμονβία βαθαηηχιαημξ) βζα ηδκ απμιυκςζδ ηδξ μθεονςπεΐκδξ απυ ημ εηπφθζζια OLE_AA Δύπεζη ζςνηελεζηών καηανομήρ με HPTLC Εοβίζηδηακ mg απυ ημ εηπφθζζια OLE_AA, ηα μπμία ημπμεεηήεδηακ ζε δμηζιαζηζηυ ζςθήκα ηαζ δζαθφεδηακ ζε 4 ml ημο επζθεβιέκμο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ, CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O (4:3:2) (S1). Έπεζηα απυ ηαθή ακάδεοζδ, ημ ζφζηδια αθέεδηε ζε δνειία βζα πενίπμο 60 sec, χζπμο επήθεε μ δζαπςνζζιυξ ηςκ δφμ θάζεςκ. ηδ ζοκέπεζα, ιε πζπέηα αηνζαείαξ, 1 ml απυ ηδκ πάκς θάζδ (S1 up) (οδαηζηή) ηαζ 1 ml απυ ηδκ ηάης θάζδ (S1 down) (μνβακζηή), ιεηαθένεδηακ ζε δφμ λεπςνζζηά θζαθίδζα ηαζ ημπμεεηήεδηακ ζε λδνακηήνα οπυ ηεκυ έςξ υημο ελαηιίζηδηε υθδ δ πμζυηδηα ηςκ δζαθοηχκ. Μεηά ηδκ λήνακζδ, ηα 2 δείβιαηα επακαδζαθφεδηακ ζε 1 ml MeOH ημ ηάεε έκα, ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ άιεζα βζα ηδκ εφνεζδ ηςκ ζοκηεθεζηχκ βζα κα ιδκ οπάνλμοκ ζθάθιαηα θυβς ελάηιζζδξ ημο δζαθφηδ. ε λ ί δ α 36

45 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα 5 ιl απυ ηάεε θάζδ ημπμεεηήεδηακ πάκς ζε TLC πθάηα Rp_18 (20 x 10) cm ιε ημ Linomat 5 δδιζμονβχκηαξ band 6 mm (εζη. 9). Σμ ιήημξ ηδξ ιπάκηαξ επζθέπηδηε ιεηά απυ πνμδβμφιεκμ πεζναιαηζζιυ ιε δζάθμνα εηποθίζιαηα ςξ ημ πθέμκ ηαηάθθδθμ ιε αάζδ ηδκ πθάηα, ηδ ζοβηέκηνςζδ ημο δζαθφιαημξ ηαζ ηδκ πμζυηδηα πμο ημπμεεηείηαζ ζηδκ πθάηα. S1 up S1 down Εικόνα 9 TLC πλάκα με το ςφςτθμα S1 ςτα 254 nm ηδ ζοκέπεζα, δ πθάηα ημπμεεηήεδηε ζε εάθαιμ ημνεζιέκμ απυ ημ ζφζηδια ακάπηολδξ (H 2 O/ACN 70:30 + 1% Α.Α.). Μεηά ηδκ ακάπηολδ ημο πνςιαημβναθήιαημξ, δ πθάηα ζηεβκχεδηε ιε ηδ αμήεεζα εενιμφ αένα ηαζ παναηδνήεδηε ζημ Visualizer ζηα 254 ηαζ ζηα 366 nm. Έπεζηα ιε ημ Scanner 3, θήθεδηε ημ πνςιαημβνάθδια ζηα 240 nm, ημ ιέβζζημ ιήημξ ηφιαημξ ημ μπμίμ πανμοζζάγεζ δ μθεονςπεΐκδ, (εζη. 10) απυ ημ μπμίμ οπμθμβίζηδηε ημ ειααδυ ηδξ ημνοθήξ ηδξ ζε ηάεε θάζδ, ηαζ ζηδ ζοκέπεζα μ ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ, μ μπμίμξ πανμοζζάγεηαζ ζημκ πίκαηα 1. ε λ ί δ α 37

46 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα total S1 up S1 down Εικόνα 10 Χρωματογραφιματα του ολικοφ εκχυλίςματοσ OLE_AA (total), τθσ πάνω φάςθσ (S1 up) και τθσ κάτω φάςθσ (S1 down) του ςυςτιματοσ S1 Πίνακασ 1 kd ολευρωπεΐνθσ από HPTLC ΤΣΗΜΑ AREA Kd (C down /C up ) S1 down S1 up Δύπεζη ζςνηελεζηών καηανομήρ με HPLC Με ζημπυ ηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηδξ HPTLC, ηα ίδζα δείβιαηα, ηδκ ίδζα διένα, πνδζζιμπμζήεδηακ ιε ζημπυ κα οπμθμβίζμοιε ημοξ ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ ηαζ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ HPLC. Ζ ιέεμδμξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα 2. Σα HPLC πνςιαημβναθήιαηα εθήθεδζακ ζηα 240 nm (εζη. 11) ηαζ οπμθμβίζηδηε μ ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ ηδξ μθεονςπεΐκδξ (πίκαηαξ 3) αάζδ ημο ειααδμφ ηδξ ημνοθήξ πμο ειθάκζζε. ε λ ί δ α 38

47 mau mau Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 2 Μζκοδοσ HPLC Χρόνος (min.) MeOH % H 2O+1% A.A. Ροή (ml/min) 0,0 0,0 100,0 1,00 2,0 5,0 95,0 1,00 10,0 25,0 75,0 1,00 20,0 40,0 60,0 1,00 30,0 50,0 50,0 1,00 34,0 50,0 50,0 1,00 40,0 0,0 100,0 1,00 45,0 0,0 100,0 1,00 Εικόνα 11 Χρωματογραφιματα OLE_AA τθσ πάνω φάςθσ (S1up) και τθσ κάτω φάςθσ (S1down) ςτα 240nm ολευρωπεΐνθ S1 up S1 down Minutes Πίνακασ 3 Kd ολευρωπεΐνθσ από HPLC ΤΣΗΜΑ AREA Kd (C down /C up ) S1 down S1 up ε λ ί δ α 39

48 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Σύγκπιζη ηυν αποηελεζμάηυν ημκ πίκαηα 4 πανμοζζάγμκηαζ ζοβηνζηζηά μζ ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ πμο ανέεδηακ, απυ ηδκ HPTLC ηαζ απυ ηδκ HPLC βζα ηδκ απμιυκςζδ ηδξ μθεονςπεΐκδξ ιε ηδκ ηεπκζηή FCPC. Πίνακασ 4 Kd ολευρωπεΐνθσ από HPTLC και HPLC HPTLC Kd ολευρωπεΐνθσ HPLC 0.45 Kd ολευρωπεΐνθσ 0.57 Απυ ηδ ζφβηνζζδ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ ζοιπεναίκεηαζ υηζ ηαζ ιε ηζξ δφμ ηεπκζηέξ ακαιέκεηαζ ημ ίδζμ πενίπμο απμηέθεζια. Πζμ ακαθοηζηά, μ ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ ηδξ μθεονςπεΐκδξ (Kd=C ηάης θάζδξ/c πάκς θάζδξ) είκαζ πενίπμο ίζoξ ιε 0.50 ηαζ ζηζξ δφμ πενζπηχζεζξ. Αοηυ δείπκεζ υηζ ιε ημ ζοβηεηνζιέκμ ζφζηδια δζαθοηχκ δζπθάζζα πμζυηδηα μθεονςπεΐκδξ ηαηακέιεηαζ ζηδκ πάκς θάζδ απυ υηζ ζηδκ ηάης. οκεπχξ ακ ζηδκ εθανιμβή ημο FCPC δ πάκς θάζδ πνδζζιμπμζδεεί ςξ ηζκδηή, δ μθεονςπεΐκδ εα εηθμοζηεί ζπεηζηά βνήβμνα Απομόνυζη ολεςπυπεΐνηρ με σπυμαηογπαθία καηανομήρ με θςγοκένηπηζη-fcpc Μεηά ηδκ επζθμβή ημο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ ηαζ ηδκ εφνεζδ ημο ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ ηδξ μθεονςπεΐκδξ, αημθμφεδζε δ απμιυκςζή ηδξ ιε ηδκ ηεπκζηή FCPC απυ ημ εηπφθζζια OLE_AA. Ανπζηά παναζηεοάζηδηακ 500 ml απυ ημ ζφζηδια δζαθοηχκ CH 2 Cl 2 :MeOH:H 2 O ζε ακαθμβία 4:3:2, ζε δζαπςνζζηζηή πμάκδ. Μεηά απυ ηαθή ακάδεοζδ, ημ ζφζηδια αθέεδηε ζε δνειία ηαζ δδιζμονβήεδηακ δφμ θάζεζξ μζ μπμίεξ πςνίζηδηακ ηαζ ημπμεεηήεδηακ ζε δφμ δζαθμνεηζηέξ ηςκζηέξ θζάθεξ. ηδ ζοκέπεζα έβζκε πθήνςζδ ηδξ ζηήθδξ ιε ηδκ ηάης θάζδ, ηαζ έπεζηα εζζήπεδ ηαζ δ πάκς θάζδ έςξ ηδκ ελζζμννυπδζδ ημο ζοζηήιαημξ ιέζα ζηδκ ζηήθδ. Μεηά ηδκ ελζζμννυπδζδ ημο ζοζηήιαημξ εζζήπεδζακ 200 mg απυ ημ εηπφθζζια OLE_AA ηαζ λεηίκδζε δ ζοθθμβή ηςκ ηθαζιάηςκ. Οζ ζοκεήηεξ θεζημονβίαξ ημο μνβάκμο ήηακ μζ ελήξ : Ροή 2ml/min, πεπιζηποθή 800 rpm, πίεζη 162 psi. οκμθζηά ζοθθέπεδηακ 27 ε λ ί δ α 40

49 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα ηθάζιαηα ηαζ έπεζηα απυ έθεβπμ ιε TLC (TLC plate Rp_18, ζφζηδια ακάπηολδξ H 2 O/ACN 70:30 + 1% Α.Α.) ζοκεκχεδηακ ςξ ελήξ ηαηυπζκ εθέβπμο ιε TLC: ηθάζιαηα αάνμξ (mg) παναηδνήζεζξ Έθεβπμξ ιε 1 Ζ-NMR Έθεβπμξ ιε 1 Ζ-NMR Σα ζοκεκςιέκα ηθάζιαηα εθέπεδζακ λακά ιε TLC, ηαζ αημθμφεδζε πεναζηένς έθεβπμξ ηςκ ηθαζιάηςκ ηαζ ιε 1 H-NMR, απυ υπμο ημ ηθάζια ηαοημπμζήεδηε ςξ μθεονςπεΐκδ (Calis et al, 1993). Εικόνα 12 Φάςμα 1 Η NMR ολευρωπεΐνθσ (CD 3 OD, 600 MHz) ε λ ί δ α 41

50 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 2 Χθμικζσ μετατοπίςεισ 1 Η NMR ολευρωπεΐνθσ ΘΔΣΗ 1 H NMR δ ζε ppm, (J ζε Hz) ( 1H, d, J= 1.3) (1H, s ) (1H, dd, J= 9.0, 4.6) 6a 2.70 (1H, dd, J= 14.0, 4.6) 6b 2.44 (1H, dd, J= 14.0, 9.0) (1H, q, J = 7.2 ) (1H, dd, J= 7.2, 1.3) 11-OCH (3H, s ) (1H, d, J = 2.0) (1H, d, J = 8.0) (1H, dd, J = 8.0, 2.0) 7a 4.20 (1H, dt, J = 10.8, 7.0) 7b 4.11 (1H, dt, J = 10.8, 7.0) (2H, t, J = 7.0) ( 1H, d, J= 8.0) (3H, *) 6a 3.89 (1H, dd, J= 12.0, 1.6) 6b 3.67 (1H, dd, J= 12.0, 5.6) *Οι πολλαπλότθτεσ και οι ςυηεφξεισ δεν διακρίνονται λόγω αλλθλοεπικάλυψθσ των ςθμάτων Μέθοδοι ποζοηικοποίηζηρ Μεηά ηδκ απμιυκςζδ ηδξ μθεονςπεΐκδξ, αημθμφεδζε δ εφνεζδ ηδξ πενζεηηζηυηδηάξ ηδξ ζηα δφμ εηποθίζιαηα, OLE_A ηαζ OLE_AA. Ανπζηά πνδζζιμπμζήεδηε δ ηεπκζηή ηδξ HPTLC βζα ημκ πνμζδζμνζζιυ αοηυ, ηαζ ζηδ ζοκέπεζα έβζκε αλζμθυβδζδ ηαζ ζφβηνζζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ιε δφμ ηεπκζηέξ πμο πνδζζιμπμζμφκηαζ εονέςξ βζα πμζμηζημπμίδζδ θοζζηχκ πνμσυκηςκ, ηδ πνςιαημβναθία HPLC ηαζ ηδ θαζιαημζημπία NMR (Pauli et al., 2005, Wolfender, 2009, Holzgrabe, 2010). Ζ αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πναβιαημπμζήεδηε ζφιθςκα ιε ηζξ μδδβίεξ ημο ICH (HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE) Q2(R1) (2005). ε λ ί δ α 42

51 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Ποζοηικοποίηζη ολεςπυπεΐνηρ με ηην ηεσνική ηηρ HPTLC Ζ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ μθεονςπεΐκδξ ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ HPTLC πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ αμήεεζα ηαιπφθδξ ακαθμνάξ, βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ μπμίαξ πνδζζιμπμζήεδηακ δζαθμνεηζηέξ πμζυηδηεξ ηδξ μθεονςπεΐκδξ, ηδξ μπμίαξ δ απμιυκςζδ πενζβνάθδηε παναπάκς. Ωξ ζηαηζηή θάζδ πνδζζιμπμζήεδηακ TLC πθάηεξ ακηζζηνυθμο θάζεςξ, Rp_18, 20x10 cm, ηαζ ςξ ηζκδηή θάζδ, ζφζηδια δζαθοηχκ απμηεθμφιεκμ απυ H 2 O/ACN ζε ακαθμβία 70:30 + 1% Α.Α. Ανπζηά παναζηεοάζηδηε stock δζάθοια ηαεανήξ μθεονςπεΐκδξ (stock 1), ζοβηεκηνχζεςξ 1 mg/ml ζε MeOH. Με ζφνζββα 100 ιl ημπμεεηήεδηακ έλζ δζαθμνεηζηέξ ηδθίδεξ, δζαθμνεηζηήξ πμζυηδηαξ, ηαζ δζαθμνεηζηήξ πενζεηηζηυηδηαξ ζε μθεονςπεΐκδ ζηδκ πθάηα, ζε band 6 mm, ιε ημ Linomat 5. Οζ πμζυηδηεξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ θαίκμκηαζ ζημκ πίκαηα 3. Πίνακασ 3 υγκεντρϊςεισ τθσ πρότυπθσ ουςίασ που χρθςιμοποιικθκαν για τθν καταςκευι τθσ καμπφλθσ αναφοράσ τθσ ολευρωπεΐνθσ ςε μl/κθλίδα και αντίςτοιχα ςε μg ολευρωπεΐνθσ/κθλίδα standards μl δ/ηορ stock 1 μg ολεςπωπεΐνηρ ηδ ζοκέπεζα παναζηεοάζηδηακ δφμ stock δζαθφιαηα βζα ηα άβκςζηα OLE_A ηαζ OLE_AA, stock_a ηαζ stock_b ακηίζημζπα, ζοβηεκηνχζεςξ 1 mg/ml ζε MeOH. Με ηδκ ίδζα δζαδζηαζία, ημπμεεηήεδηακ ζηδκ TLC πθάηα 5.5 ιl απυ ημ stock_a, ηαζ 5.0 ιl απυ ημ stock_b. Οζ ηδθίδεξ ηςκ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ ημπμεεηήεδηακ ζε ηέζζενζξ επακαθήρεζξ ηαζ ζε ίδζεξ ζοκεήηεξ ιε αοηέξ ηςκ πνμηφπςκ. Έπεζηα δ πθάηα ημπμεεηήεδηε ζε εάθαιμ ακάπηολδξ, ημνεζιέκμ απυ ημ ζφζηδια δζαθοηχκ ηδξ ηζκδηήξ θάζδξ, υπμο πανέιεζκε έςξ υημο ημ φρμξ ημο δζαθφηδ έθεαζε ηα 8 cm. Μεηά ηδκ ακάπηολδ ηδξ, δ πθάηα απμιαηνφκεδηε απυ ημ εάθαιμ ακάπηολδξ ηαζ μ δζαθφηδξ ε λ ί δ α 43

52 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα ελαηιίζηδηε ιε ηδ αμήεεζα εενιμφ αένα. Ζ ακεπηοβιέκδ πθέμκ πθάηα ημπμεεηήεδηε ζημ Visualizer υπμο παναηδνήεδηε ηαζ θςημβναθήεδηε ζηα 254 (εζη. 13) ηαζ 366 nm. Εικόνα 13 Ανεπτυγμζνθ TLC πλάκα με τα standards και τα άγνωςτα ςτα 254nm Έπεζηα δ πθάηα ημπμεεηήεδηε ζημ Scanner 3, βζα ηδ θήρδ ημο θάζιαημξ UV, υθςκ ηςκ δεζβιάηςκ. Ζ ιέβζζηδ απμννυθδζδ πνμζδζμνίζεδηε ζηα 240 nm ηαζ θήθεδηε ημ πνςιαημβνάθδια βζα ηα πνυηοπα ηαζ βζα ηα δφμ άβκςζηα (εζη.14). Std5 Std6 Std4 Std3 Std2 OLE_AA Std1 OLE_AA OLE_A OLE_A Εικόνα 14 Χρωματογραφιματα των standards (std) και των 2 αγνϊςτων (OLE_A, OLE_AA) ε λ ί δ α 44

53 Au Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Απυ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ πνμηφπςκ ηαζ απυ ηα ειααδά ηςκ ημνοθχκ ηδξ μθεονςπεΐκδξ ζημ πνςιαημβνάθδια ηαηαζηεοάζηδηε δ ηαιπφθδ ακαθμνάξ. Ζ ηαιπφθδ ακηζζημζπεί ζε πμθοςκοιζηή ελίζςζδ δεοηένμο ααειμφ, πςνίξ γφβζζδ, ιε R 2 = Y= (± 924.2) (± 717.2)X 182.6(± 129.3)X 2.. Ζ ηαιπφθδ ακαθμνάξ δεκ ελακαβηάζηδηε κα δζέθεεζ απυ ημ ζδιείμ 0.0, ηαζ ημ ζδιείμ αοηυ δεκ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ζδιείμ ηδξ ηαιπφθδξ. Δπζπθέμκ οπμθμβίζηδηε ημ LOQ (limit of quantitation) πμο είπε ηζιή 0.50 ιg, ηαζ ημ LOD (limit of detection) ιε ηζιή 0.17 ιg. Ζ ηαιπφθδ ακαθμνάξ εθέβπεδηε ςξ πνμξ ηδκ αηνίαεζα ηςκ ίδζςκ ηςκ ζδιείςκ ηδξ βζα κα δζαπζζηςεεί ακ ημ ιμκηέθμ πνμαθέπεζ ζςζηά ηζξ εεςνδηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ. οβηεηνζιέκα οπμθμβίζηδηε ημ ιέβζζημ Δr% = 5.6, ηαζ υθεξ μζ άθθεξ ηζιέξ ήηακ ηάης απυ αοηυ μg Εικόνα 15 Καμπφλθ αναφοράσ ολευρωπεΐνθσ Βάζεζ ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ οπμθμβίζηδηε δ πενζεηηζηυηδηα ηςκ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ ζε μθεονςπεΐκδ, υπςξ θαίκεηαζ ζημοξ παναηάης πίκαηεξ: Πίνακασ 4 Περιεκτικότθτα (μg) των εκχυλιςμάτων OLE_A και OLE_AA ςε ολευρωπεΐνθ με τθν τεχνικι τθσ HPTLC n = 4 Average μg ολευρωπεΐνθσ sd %RSD OLE_A OLE_AA ε λ ί δ α 45

54 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 5(%) περιεκτικότθτα των εκχυλιςμάτων OLE_A και OLE_AA ςε ολευρωπεΐνθ με τθν τεχνικι τθσ HPTLC n = 4 Average %περιεκτικότθτα ςε ολευρωπεΐνθ %RSD OLE_A 33.2 (± 0.4) 1.4 OLE_AA 49.0 (± 4.0) Ποζοηικοποίηζη ολεςπυπεΐνηρ με ηην ηεσνική ηηρ HPLC Γζα ηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ πμο πνμέηορακ απυ ηδκ εθανιμβή ηδξ HPTLC, πναβιαημπμζήεδηε πμζμηζηυξ πνμζδζμνζζιυ ηδξ μθεονςπεσκδξ ζηα εηποθίζιαηα ιε ηδκ ηεπκζηή HPLC. θα ηα δείβιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ, stock 1 (πνυηοπμ μθεονςπεΐκδξ), stock_a, ηαζ stock_b (OLE_A ηαζ OLE_AA, ακηίζημζπα) ήηακ ηα ίδζα ιε αοηά πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ HPTLC ηαζ ημ πείναια πναβιαημπμζήεδηε ηδκ ίδζα ιένα βζα ηδκ απμθοβή ζθαθιάηςκ. Οζ ζοβηεκηνχζεζξ ηδξ πνυηοπδξ μοζίαξ πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ ήηακ μζ ελήξ: Πίνακασ 6 υγκεντρϊςεισ τθσ πρότυπθσ ουςίασ που χρθςιμοποιικθκαν για τθν καταςκευι τθσ καμπφλθσ αναφοράσ τθσ ολευρωπεΐνθσ standards C (mg/ml) stock 1 μg ολεςπωπεΐνηρ ε λ ί δ α 46 Απυ ηα δφμ stock δζαθφια ηα ηςκ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ, stock_a ηαζ stock_b, έβζκακ μζ ηαηάθθδθεξ αναζχζεζξ βζα ηδκ παναζηεοή δζαθοιάηςκ ζοβηεκηνχζεςξ 0.15 mg/ml, πμο ακηζζημζπμφζακ ζε 3 ιg εηποθίζιαημξ. θα ηα πνυηοπα (εζη.16) ηαζ ηα δφμ άβκςζηα δείβιαηα

55 mau mau Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα (εζη.17,18), ακαθφεδηακ ιε HPLC βζα ηδ θήρδ ηςκ πνςιαημβναθδιάηςκ. Ζ ιέεμδμξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα Minutes Εικόνα 16 Χρωματογραφιματα τθσ πρότυπθσ ουςίασ ςε ζξι διαφορετικζσ ςυγκεντρϊςεισ ςτα 240 nm Παναηάης πανμοζζάγμκηαζ εκδεζηηζηά δφμ πνςιαημβναθήιαηα βζα ηάεε άβκςζημ ίδζαξ ζοβηέκηνςζδξ ημ ηάεε έκα (εζη. 17, 18). ε λ ί δ α 47

56 mau mau mau mau Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα 1200 OLE_A 240 nm ολευρωπεΐνθ Minutes Εικόνα 17 Χρωματογραφιματα του OLE_A, ίδιασ ςυγκζντρωςθσ ςτα 240 nm OLE_AA 240 nm ολευρωπεΐνθ Minutes -200 Εικόνα 18 Χρωματογραφιματα OLE_AA ίδιασ ςυγκζντρωςθσ ςτα 240 nm Απυ ηζξ ζοβηεκηνχζεζξ ηςκ πνμηφπςκ ηαζ απυ ηα ειααδά ηςκ ημνοθχκ ηδξ μθεονςπεΐκδξ ζημ πνςιαημβνάθδια ηαηαζηεοάζηδηε δ ηαιπφθδ ακαθμνάξ. Ζ ηαιπφθδ ακηζζημζπεί ζε πμθοςκοιζηή ελίζςζδ δεοηένμο ααειμφ, πςνίξ γφβζζδ, ιε R 2 = ε λ ί δ α 48

57 Αu Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Y= (± ) *10 6 (± )X (± 64129)X 2.. Ζ ηαιπφθδ ακαθμνάξ δεκ ελακαβηάζηδηε κα δζέθεεζ απυ ημ ζδιείμ 0.0, ηαζ ημ ζδιείμ αοηυ δεκ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ζδιείμ ηδξ ηαιπφθδξ. Δπζπθέμκ οπμθμβίζηδηε ημ LOQ πμο είπε ηζιή 0.22 ιg, ηαζ ημ LOD ιε ηζιή 0.07 ιg. Ζ ηαιπφθδ ακαθμνάξ εθέβπεδηε ςξ πνμξ ηδκ αηνίαεζα ηςκ ίδζςκ ηςκ ζδιείςκ ηδξ βζα κα δζαπζζηςεεί ακ ημ ιμκηέθμ πνμαθέπεζ ζςζηά ηζξ εεςνδηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ. οβηεηνζιέκα οπμθμβίζηδηε ημ ιέβζζημ Δr% = 4.5, ηαζ υθεξ μζ άθθεξ ηζιέξ ήηακ ηάης απυ αοηυ ,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 μg Εικόνα 19 Καμπφλθ αναφοράσ ολευρωπεΐνθσ Βάζεζ ηδξ πνυηοπδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ οπμθμβίζηδηε δ πενζεηηζηυηδηα ηςκ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ ζε μθεονςπεΐκδ (πίκαηεξ 7, 8). Πίνακασ 7 Περιεκτικότθτα (μg) των εκχυλιςμάτων OLE_A και OLE_AA ςε ολευρωπεΐνθ με τθν τεχνικι τθσ HPLC n = 4 Average μg ολευρωπεΐνθσ sd %RSD OLE_A OLE_AA ε λ ί δ α 49

58 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 8 (%) Περιεκτικότθτα των εκχυλιςμάτων OLE_A και OLE_AA ςε ολευρωπεΐνθ με τθν τεχνικι τθσ HPLC n = 4 Average %περιεκτικότθτα ςε ολευρωπεΐνθ %RSD OLE_A 36.2 (± 3.1) 8.60 OLE_AA 50.8 (± 2.5) Ποζοηικοποίηζη ολεςπυπεΐνηρ με θαζμαηοζκοπία NMR Θεςνήεδηε απαναίηδηδ δ εθανιμβή ιζαξ ηνίηδξ ακελάνηδηδξ ιεευδμο δ μπμία εα αμδεμφζε ζηδκ αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ηςκ δφμ πνμακαθενυιεκςκ ηεπκζηχκ. Γζα ημ ζημπυ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηε δ θαζιαημζημπία NMR. Σμ ααζζηυ πθεμκέηηδιά ηδξ ζε ζφβηνζζδ ιε άθθεξ ακαθοηζηέξ ηεπκζηέξ είκαζ υηζ πνυηεζηαζ βζα ιία ιέεμδμ ιέηνδζδξ ακαθμβζχκ, δεδμιέκμο υηζ ημ ειααδυκ ηςκ ημνοθχκ είκαζ ακάθμβμ ιε ημκ ανζειυ ηςκ ακηίζημζπςκ πονήκςκ πμο πνμηαθμφκ ηα ζήιαηα. Ζ ααεααζυηδηα ζηζξ ιεηνήζεζξ πμζμηζημπμίδζδξ ιε θαζιαημζημπία NMR είκαζ παιδθή ηαζ δ απυδμζή ηδξ είκαζ πανυιμζα ιε εηείκδ ηςκ εκαθθαηηζηχκ ακαθοηζηχκ ηεπκζηχκ. Γζα ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ μθεονςπεΐκδξ απυ ηα δείβιαηα OLE_A ηαζ OLE_AA ιε θαζιαημζημπία NMR, πνδζζιμπμζήεδηακ, ςξ πνυηοπμ δ μθεονςπεΐκδ δ μπμία απμιμκχεδηε απυ ημ FCPC. Δπίζδξ, πνδζζιμπμζήεδηε εζςηενζηυ πνυηοπμ, ημ μπμίμ είπε ηα ελήξ παναηηδνζζηζηά : Να δίκεζ ιμκαδζηά ηαζ ζηαεενά ζήιαηα (πδιζηή ιεηαηυπζζδ) ζημ θάζια 1 Ζ NMR. Να είκαζ δζαεέζζιμ ζε ηαεανή ιμνθή. Να είκαζ δζαθοηυ ζε δζάθμνμοξ δεοηενζςιέκμοξ δζαθφηεξ. Να είκαζ εφημθμ ζηδκ γφβζζδ ηαζ κα ιδκ είκαζ οβνμζημπζηυ. Να ιδκ είκαζ πηδηζηυ. Να είκαζ πδιζηά αδνακέξ. Να είκαζ ζηαεενυ βζα ιεβάθμ πνμκζηυ δζάζηδια. Να έπεζ ημ αέθηζζημ ιμνζαηυ αάνμξ (εκχζεζξ ιζηνμφ ιμνζαημφ αάνμοξ απαζημφκ ιζηνέξ πμζυηδηεξ βζα ηδκ ακάθοζδ). ε λ ί δ α 50

59 Hz (f1) Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Οζ ημνοθέξ ημο ζημ θάζια 1 Ζ NMR κα ιδκ επζηαθφπημοκ ηαζ κα ιδκ επζηαθφπημκηαζ απυ ηάπμζα ημνοθή πνςημκίμο ηςκ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ (Holzgrabe, 2010, Rundlöf, et al., 2010). Γζα ηδκ πανμφζα ιεθέηδ επζθέπεδηε κα πνδζζιμπμζδεεί ςξ εζςηενζηυ πνυηοπμ ημ ημοιανζηυ μλφ ιε αάζδ ηα θαζιαημζημπζηά ημο δεδμιέκα ηαζ ηζξ θοζζημπδιζηέξ ημο ζδζυηδηεξ. Σμ ημοιανζηυ μλφ, ημ μπμίμ έπεζ ιία δζπθή ημνοθή (d) (ιε J = 15.9 Hz) ζε δ 7.61, δ μπμία μθμηθδνχκεζ βζα έκα πνςηυκζμ ηαζ ακηζζημζπεί ζημ H-7 (Kim et al, 2010), πθδνεί αοηέξ ηζξ πνμτπμεέζεζξ ηαζ βζα ημ θυβμ αοηυ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ εζςηενζηυ πνυηοπμ ppm (f1) 5.0 Εικόνα 20 Φάςμα 1 H-NMR κουμαρικοφ οξζοσ (CD 3 OD, 600 MHz) Ακηίζημζπα ημ πνςηυκζμ ηδξ μθεονςπεΐκδξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ, ήηακ ημ Ζ-3 ημ μπμίμ δίκεζ ιία απθή ημνοθή (s), ζηα 7.53 ppm. Ανπζηά παναζηεοάζηδηακ stock δζαθφιαηα βζα ημ πνυηοπμ (μθεονςπεΐκδ), βζα ηα δφμ άβκςζηα δείβιαηα (OLE_A, OLE_AA), ηαζ βζα ημ εζςηενζηυ πνυηοπμ (ημοιανζηυ μλφ) ζοβηεκηνχζεςξ 10 mg/ml ζε MeOH ημ ηάεε έκα. Απυ ημ stock δζάθοια ηδξ ηαεανήξ μθεονςπεΐκδξ έβζκακ μζ ηαηάθθδθεξ αναζχζεζξ ιε ζημπυ κα παναζηεοαζημφκ 6 δείβιαηα, δζαθμνεηζηήξ πενζεηηζηυηδηαξ ζε μθεονςπεΐκδ ημ ηάεε έκα. Οζ πμζυηδηεξ ημο πνμηφπμο πμο πνδζζιμπμζήεδηακ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ ηδξ μθεονςπεΐκδξ θαίκμκηαζ ζημκ πίκαηα 10. Ακηίζημζπα βζα ηάεε άβκςζημ παναζηεοάζηδηακ απυ ηα stock δζαθφιαηα 3 δείβιαηα πενζεηηζηυηδηαξ ε λ ί δ α 51

60 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα 8 mg εηποθίζιαημξ ημ ηάεε έκα. θα ηα δείβιαηα αθέεδηακ έςξ υημο ελαηιζζηεί υθδ δ πμζυηδηα ημο δζαθφηδ, ηαζ ζηδ ζοκέπεζα επακαδζαθφεδηακ ζε 0.7 ml CD 3 OD. Πίνακασ 9 υγκεντρϊςεισ standards ολευρωπεΐνθσ standards C (mg/ml) MeOH mg ολεςπωπεΐνηρ ολεςπωπεΐνηρ Σέθμξ οπμθμβίζηδηε δ πμζυηδηα ημο εζςηενζημφ πνμηφπμο (ημοιανζηυ μλφ) πμο έπνεπε κα πνδζζιμπμζδεεί έηζζ χζηε ζημ δζάθοια ηαεανήξ μθεονςπεΐκδξ ιε πενζεηηζηυηδηα 6 mg, δ ιμνζαηυηδηα μθεονςπεΐκδξ : ημοιανζημφ μλέμξ κα είκαζ 1:1. Καηά ζοκέπεζα πνμζηέεδηακ ζε υθα ηα δείβιαηα, standards ηαζ άβκςζηα, 1.8 mg ημοιανζημφ μλέμξ. Η-7 κουμαρικοφ οξζοσ Η-3 ολευρωπεΐνθσ 10 mg 8 mg 6 mg 4 mg 2 mg 1 mg ε λ ί δ α 52

61 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Εικόνα 21 Φάςματα 1 Η NMR ολευρωπεΐνθσ με εςωτερικό πρότυπο ςε ζξι διαφορετικζσ ςυγκεντρϊςεισ, από 1 εωσ 10 mg Απυ ηα θάζιαηα 1 Ζ-NMR, οπμθμβίζηδηε δ μθμηθήνςζδ ηςκ ημνοθχκ ηςκ πνςημκίςκ Ζ-3 ηαζ Ζ-7, βζα ηδκ μθεονςπεΐκδ ηαζ ημ ημοιανζηυ μλφ ακηίζημζπα, ηαεχξ ηαζ δ ακαθμβία ημοξ βζα ηδκ ηαηαζηεοή ηδξ ηαιπφθδξ ακαθμνάξ. mg ολεςπυπεΐνηρ Ολοκλήπυζη Η-3/Ολοκλήπυζη Η-7 1 1/8 2 1/4 4 1/2 6 1/ /1 10 1/0.86 Η-7 κουμαρικοφ οξζοσ Η-3 ολευρωπεΐνθσ Εικόνα 22 Φάςματα 1 H ΝΜR OLE_A με εςωτερικό πρότυπο ίδιασ ςυγκζντρωςθσ ε λ ί δ α 53

62 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Η-7 κουμαρικοφ οξζοσ Η-3 ολευρωπεΐνθσ Εικόνα 23 Φάςματα 1 H NMR OLE_AA με εςωτερικό πρότυπο ίδιασ ςυγκζντρωςθσ Ζ ίδζα επελενβαζία πναβιαημπμζήεδηε ηαζ βζα ηα θάζιαηα ηςκ δφμ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ, OLE_A ηαζ OLE_AA (εζη. 22,23) ηαζ ανέεδηακ μζ αηυθμοεεξ ακαθμβίεξ: Άγνυζηα δείγμαηα mg αγνώζηυν δειγμάηυν Ολοκλήπυζη Η-3/Η-7 OLE_A 1 8 1/2.87 OLE_A 2 8 1/2.81 OLE_A 3 8 1/2.84 OLE_AA 1 8 1/1.92 OLE_AA 2 8 1/1.88 OLE_AA 3 8 1/1.92 Απυ ηδκ πενζεηηζηυηδηα ηςκ standards ζε μθεονςπεΐκδ ηαζ ημ θυβμ ηδξ μθμηθήνςζδξ ηςκ πνςημκίςκ H-3 ηαζ H-7, ηαηαζηεοάζηδηε δ ηαιπφθδ ακαθμνάξ ηδξ μθεονςπεΐκδξ (εζη. 24), αάζδ ηδξ μπμίαξ οπμθμβίζηδηε δ πενζεηηζηυηδηα ηςκ αβκχζηςκ δεζβιάηςκ ζε αοηήκ (πίκαηεξ 10, 11). ε λ ί δ α 54

63 H-3/H-7 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Ζ ηαιπφθδ ακηζζημζπεί ζε πμθοςκοιζηή ελίζςζδ δεοηένμο ααειμφ, πςνίξ γφβζζδ, ιε R 2 = Y= (± ) (± )X (± )X 2.. Ζ ηαιπφθδ ακαθμνάξ δεκ ελακαβηάζηδηε κα δζέθεεζ απυ ημ ζδιείμ 0.0, ηαζ ημ ζδιείμ αοηυ δεκ πνδζζιμπμζήεδηε ςξ ζδιείμ ηδξ ηαιπφθδξ. Δπζπθέμκ οπμθμβίζηδηε ημ LOQ πμο είπε ηζιή 0,34 mg, ηαζ ημ LOD ιε ηζιή 0,11 mg. Δπίζδξ εθέβπεδηε ςξ πνμξ ηδκ αηνίαεζα ηςκ ίδζςκ ηςκ ζδιείςκ ηδξ βζα κα δζαπζζηςεεί ακ ημ ιμκηέθμ πνμαθέπεζ ζςζηά ηζξ εεςνδηζηέξ ζοβηεκηνχζεζξ. οβηεηνζιέκα οπμθμβίζηδηε ημ ιέβζζημ Δr% = 3.5, ηαζ υθεξ μζ άθθεξ ηζιέξ ήηακ ηάης απυ αοηυ. 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, mg Εικόνα 24 Καμπφλθ αναφοράσ ολευρωπεΐνθσ Πίνακασ 10 Περιεκτικότθτα (mg) των εκχυλιςμάτων OLE_A και OLE_AA ςε ολευρωπεΐνθ με φαςματοςκοπία NMR n = 3 Average mg ολευρωπεΐνθσ sd %RSD OLE_A OLE_AA ,3 ε λ ί δ α 55

64 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 11 (%) περιεκτικότθτα των εκχυλιςμάτων OLE_A και OLE_AA ςε ολευρωπεΐνθ με φαςματοςκοπία NMR n = 3 Average %περιεκτικότθτα ςε ολευρωπεΐνθ %RSD OLE_A 34.9 (± 0.7) 1.1 OLE_AA 52.4 (±0.4) Σύγκπιζη ηυν αποηελεζμάηυν ηηρ ποζοηικοποίηζηρ ηηρ ολεςπυπεΐνηρ Παναηάης πανμοζζάγεηαζ ζοβηνζηζηυξ πίκαηαξ ιε ηα απμηεθέζιαηα απυ ηδκ πμζμηζημπμίδζδ ηδξ μθεονςπεΐκδξ ιε ηζξ ηνείξ δζαθμνεηζηέξ ηεπκζηέξ, βζα ηάεε άβκςζημ. Δπζπθέμκ οπμθμβίζηδηε δ αηνίαεζα (Er%) βζα ηδκ HPTLC ζοβηνζηζηά ιε ηδκ HPLC ηαζ ιε ημ NMR. Πίνακασ 12 υγκριτικόσ πίνακασ αποτελεςμάτων ποςοτικοποίθςθσ ολευρωπεΐνθσ ςε άγνωςτα δείγματα Άγνωςτο Σεχνικι Average %περιεκτικότθτα ςε ολευρωπεΐνθ %RSD Er% HPTLC ςυγκριτικά με τθν HPLC και το NMR HPTLC 33.2 (± 0.4) 1.4 OLE_A HPLC 36.2 (± 3.1) NMR 34.9 (± 0.7) HPTLC 49.0 (± 4.0) 8.9 OLE_AA HPLC 50.8 (± 2.5) NMR 52.4 (± 0.4) Οζ ιεεμδμθμβίεξ πμο ακαπηφπεδηακ ηαζ ιε ηζξ ηνεζξ ηεπκζηέξ βζα ηδκ εφνεζδ ηδξ πενζεηηζηυηδηαξ (%) ηδξ μθεονςπεΐκδξ ζε δφμ εηποθίζιαηα θφθθςκ εθζάξ πανέπμοκ αηνίαεζα, εοαζζεδζία ηαζ επακαθδρζιυηδηα, υπςξ παναηδνήεδηε απυ ηδκ επζιένμοξ αλζμθυβδζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ( , , ). Δπζπθέμκ, δζαπζζηχεδηε ε λ ί δ α 56

65 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα (Πζκ. 12) υηζ ηα απμηεθέζιαηα πμο θήθεδηακ δεκ πανμοζζάγμοκ ζηαηζζηζηά ζδιακηζηέξ δζαθμνέξ ιεηαλφ ηςκ ηνζχκ ηεπκζηχκ. Δκημφημζξ, δ HPTLC πανμοζζάγεζ ηάπμζα πθεμκεηηήιαηα ζοβηνζκυιεκα ιε ηζξ δφμ άθθεξ ιεευδμοξ, ακαθμνζηά ιε ημ πνυκμ, ημ ηυζημξ ηαζ ηδκ εοημθία. Ζ HPLC είκαζ δ ιέεμδμξ πμο πνδζζιμπμζείηαζ εονέςξ βζα πμζμηζηέξ ακαθφζεζξ ηαζ δ πμζμηζημπμίδζδ ιε ημ NMR πνδζζιμπμζείηαζ πμθφ ηα ηεθεοηαία πνυκζα ηονίςξ βζα ζοβηεηνζιέκεξ εθανιμβέξ. ιςξ ηαζ μζ δφμ ηεπκζηέξ είκαζ πνμκμαυνεξ, δαπακδνέξ ηαζ απαζημφκ εζδζηά ελεζδζηεοιέκμ πνμζςπζηυ. ε λ ί δ α 57

66 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα 3.2 Δθαπμογή ηηρ ηεσνικήρ HPTLC ζηη θςηοσημική μελέηη ηος είδοςρ Genista halacsyi Φςηικό ςλικό Πμζυηδηα 2.4 Kg ηςκ οπένβεζςκ ηιδιάηςκ ημο εκδδιζημφ θοημφ Genista halacsyi ζοθθέπεδηε ημ Μάζμ ημο 2000, ηαηά ηδκ ακεμθμνία ημο, απυ ημ αμοκυ Πάνκςκαξ ηδξ Πεθμπμκκήζμο. Μεηά ηδκ ζοθθμβή ημο, αημθμφεδζε λήνακζδ, ημκζμπμίδζδ ηαζ εηπφθζζδ. Με ζημπυ ηδκ παναθααή ηςκ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ πναβιαημπμζήεδηε δζαδμπζηή εηπφθζζδ ιε δζαθφηεξ αολακυιεκδξ πμθζηυηδηαξ (CH 2 Cl 2, MeOH, H 2 O) ηαζ έηζζ πνμέηορακ ηνία ηθάζιαηα ηςκ πενζεπυιεκςκ ζοζηαηζηχκ. ΥΖΜΑΣΗΚΖ ΑΝΑΠΑΡΑΣΑΖ ΔΚΥΤΛΗΖ ΣΟΤ ΦΤΣΟΤ G. halacsyi ε λ ί δ α 58

67 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Μελέηη μεθανολικού εκσςλίζμαηορ ηηρ G. halacsyi Απυ ηα ηνία εηποθίζιαηα επζθέπεδηε πνμξ πεναζηένς επελενβαζία, ιε ζημπυ ηδκ απμιυκςζδ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ, ημ ιεεακμθζηυ εηπφθζζια δζυηζ πενζέπεζ μοζίεξ ιε αλζμζδιείςηδ αζμθμβζηή δνάζδ πμο ακήημοκ ζηδκ ηαηδβμνία ηςκ ζζμθθααμκμεζδχκ Φημικό πποθίλ Σμ πνχημ ζηάδζμ ζηδ ιεθέηδ ημο ιεεακμθζημφ εηποθίζιαημξ ηδξ G. halacsyi ήηακ δ εφνεζδ ημο πδιζημφ πνμθίθ ημο εηποθίζιαημξ ηαζ ηαη επέηηαζδ ηςκ ηφνζςκ μοζζχκ ημο, ημ μπμίμ πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδκ ηεπκζηή ηδξ HPTLC. 10 mg ιεεακμθζημφ εηποθίζιαημξ (Ghal_total), δζαθφεδηακ ζε 1 ml MeOH. 4 ιl απυ ημ δζάθοια αοηυ ημπμεεηήεδηακ ζε βοάθζκδ TLC πθάηα Rp_18 δζαζηάζεςκ 5 x 10 cm, ιε ημ Camag Linomat 5. ηδ ζοκέπεζα δ πθάηα ημπμεεηήεδηε ζε εάθαιμ ακάπηολδξ ημνεζιέκμ απυ ημ ζφζηδια δζαθοηχκ, H 2 O/ACN 70:30 + 1% Α.Α., έςξ υημο μ δζαθφηδξ έθεαζε ζηα 8 cm φρμξ. Έπεζηα ιε ηδ αμήεεζα εενιμφ αένα μ δζαθφηδξ απμιαηνφκεδηε απυ ηδκ πθάηα, δ μπμία ημπμεεηήεδηε ζημ Camag Visualizer υπμο θςημβναθήεδηε ζηα 254 ηαζ 366nm (εζη. 25). ηδ ζοκέπεζα δ πθάηα ημπμεεηήεδηε ζημ Camag Scanner 3, βζα ηδ θήρδ ημο θάζιαημξ UV ηαζ ημο πνςιαημβναθήιαημξ ημο εηποθίζιαημξ. 254nm 366nm Εικόνα 25 Χθμικό προφίλ Ghal_total ςτα 254 και 366nm Απυ ημ πδιζηυ απμηφπςια ημο εηποθίζιαημξ πάκς ζηδκ TLC πθάηα, παναηδνήεδηε υηζ ζημ εηπφθζζια οπάνπμοκ 7 ηφνζεξ ηδθίδεξ. ε λ ί δ α 59

68 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Φπυμαηογπαθικόρ διασυπιζμόρ ηος μεθανολικού εκσςλίζμαηορ με σπυμαηογπαθία καηανομήρ με θςγοκένηπηζη (FCPC) Γζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ δεοηενμβεκχκ ιεηααμθζηχκ, απυ ημ ιεεακμθζηυ εηπφθζζια ηδξ G.halacsyi, πνδζζιμπμζήεδηε δ ηεπκζηή ημο FCPC. Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηε ιεθέηδ βζα ηδκ εφνεζδ ημο ηαηάθθδθμο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ, πμο εα μδδβμφζε ζημκ ηαθφηενμ δοκαηυ δζαπςνζζιυ ηςκ μοζζχκ. Με ηδ αμήεεζα ηνζβςκζηχκ δζαβναιιάηςκ (Foucault, 1995), έβζκακ δμηζιέξ ζε δζάθμνα δζθαζζηά ζοζηήιαηα ιε ηνεζξ ή ηαζ πενζζζυηενμοξ δζαθφηεξ, ζε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ (ζζμηναηζηή έηθμοζδ). θεξ μζ δμηζιέξ πναβιαημπμζήεδηακ ζε δμηζιαζηζημφξ ζςθήκεξ, δ πμζυηδηα ημο εηποθίζιαημξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηάεε δμηζιή ήηακ mg ηαζ ημο ιίβιαημξ δζαθοηχκ 4 ml. Σμ εηπφθζζια δζαθφεδηε ζημ εηάζημηε δζθαζζηυ ζφζηδια, ημ μπμίμ αθέεδηε ζε δνειία έςξ υημο δζαπςνίζηδηακ μζ δφμ θάζεζξ. ηδ ζοκέπεζα ηάεε θάζδ εθέβπεδηε ιε πνςιαημβναθία TLC. Παναηδνήεδηε υηζ ιε ηδκ εθανιμβή ηςκ ζοζηδιάηςκ αοηχκ δεκ ήηακ εθζηηυξ μ επζεοιδηυξ δζαπςνζζιυξ ηςκ μοζζχκ. ηδ ζοκέπεζα απμθαζίζηδηε κα πνδζζιμπμζδεεί ααειζδςηή έηθμοζδ (gradient elution) ιε έλζ δζαθμνεηζηά ζοζηήιαηα πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ ζηαηζηή θάζδ ηδκ ανπζηή ηάης θάζδ ηαζ αθθάγμκηαξ ηδκ ηζκδηή θάζδ ιε ηδκ εηάζημηε πάκς θάζδ απυ ηα έλζ ζοζηήιαηα δζαθοηχκ. Μεηά απυ δμηζιέξ ιε δζάθμνμοξ δζαθφηεξ, ζε δζαθμνεηζηέξ ακαθμβίεξ, ηαζ ιε έθεβπμ ηςκ απμηεθεζιάηςκ ιε πνςιαημβναθία TLC, παναηδνήεδηε υηζ ιε ηα ζφζηδιαηα S1-S6 (πίκ. 13) ηαζ ιε gradient έηθμοζδ ιπμνμφζε κα επζηεοπεεί μ επζεοιδηυξ δζαπςνζζιυξ ηςκ μοζζχκ. ε λ ί δ α 60

69 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 13 φςτθμα για FCPC gradient elution, με ςτακερι αναλογία MeOH/H 2 O φςτθμα Hexane EtOAc BuOH MeOH H 2 O S S S S S S Σύνδεζη ηεσνικήρ HPTLC με FCPC-Gradient Δπυιεκμ ζηάδζμ, ιεηά ηδκ εφνεζδ ημο ηαηάθθδθμο ζοζηήιαημξ δζαθοηχκ, ήηακ δ εφνεζδ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ (Kd) ηςκ μοζζχκ ιε ζημπυ κα ανεεεί δ ακαιεκυιεκδ ζεζνά έηθμοζήξ ημοξ. Ζ δζαδζηαζία αοηή πναβιαημπμζήεδηε ιε ηδ κέα ηεπκζηή HPTLC, ηαζ ηα απμηεθέζιαηα ζοβηνίεδηακ ιε ηδκ ιέπνζ ηχνα πνδζζιμπμζμφιεκδ ηεπκζηή HPLC Δύπεζη ζςνηελεζηών καηανομήρ με HPTLC ε έλζ δμηζιαζηζημφξ ζςθήκεξ γοβίζηδηακ 18 mg απυ ημ εηπφθζζια Ghal_total. ε ηάεε δμηζιαζηζηυ ζςθήκα παναζηεοάζηδηε ημ ακηίζημζπμ δζθαζζηυ ζφζηδια απυ ηα ζοζηήιαηα S1-S6. Μεηά απυ ηαθή ακάδεοζδ, ηα ζοζηήιαηα αθέεδηακ ζε δνειία έςξ υημο επήθεε δζαπςνζζιυξ ηςκ δφμ θάζεςκ. ηδ ζοκέπεζα, ιε πζπέηα αηνζαείαξ ιεηαθένεδηακ ζε vials 1 ml ηάεε θάζδξ, απυ ηάεε ζφζηδια. Σα vials ημπμεεηήεδηακ ζε λδνακηήνα οπυ ηεκυ βζα ηδκ ελάηιζζδ ηςκ δζαθοηχκ ηαζ ζηδ ζοκέπεζα ημ ηάεε έκα δζαθφεδηε ζε 1 ml MeOH. Με ηδ πνήζδ ημο Camag Linomat 5, ηαζ ιε ζφνζββα 100 ιl, ημπμεεηήεδηακ ζε TLC πθάηα Rp_18, 20 x 10 cm, 4 ιl ζε band ηςκ 6 mm, απυ ημ μθζηυ εηπφθζζια (stock 10 mg/ml) ηαζ απυ ηάεε θάζδ ηςκ έλζ ζοζηδιάηςκ. Ζ πθάηα ακαπηφπεδηε ζε εάθαιμ ακάπηολδξ ημνεζιέκμ απυ ημ ζφζηδια ηςκ δζαθοηχκ H 2 O/ACN 70:30 + 1% Α.Α. Μεηά ηδκ ακάπηολδ ηδξ πθάηαξ μ δζαθφηδξ απμιαηνφκεδηε ιε ηδ αμήεεζα εενιμφ ε λ ί δ α 61

70 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα αένα ηαζ ημπμεεηήεδηε ζημ Camag Scanner 3 βζα ηδ θήρδ ημο πνςιαημβναθήιαημξ (εζη. 26). Οι κορυφζσ των ουςιϊν 3 και 4 Εικόνα 26 Χρωματογράφθματα των ςυςτθμάτων S1-S6 Απυ ηα ειααδά ηςκ ημνοθχκ ζε ηάεε θάζδ οπμθμβίζηδηακ μζ ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ Κd ηαζ μζ ζοκηεθεζηέξ α ηςκ μοζζχκ (πίκαηεξ 14, 15). πςξ θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα πμο αημθμοεεί δεκ πανμοζζάγμκηαζ απμηεθέζιαηα βζα ηζξ μοζίεξ 3 ηαζ 4 δζυηζ μζ ημνοθέξ ηςκ δφμ αοηχκ μοζζχκ ζημ πνςιαημβνάθδια αθθδθεπζηαθφπημκηαζ. Με ζημπυ ηδκ εφνεζδ ηςκ πνμακαθενυιεκςκ ζοκηεθεζηχκ εθέβπεδηακ δζάθμνα ζοζηήιαηα ακάπηολδξ ημο πνςιαημβναθήιαημξ ηαζ ηεθζηά επζθέπεδηε αοηυ ζημ μπμίμ είκαζ δζαηνζηέξ μζ πενζζζυηενεξ απυ ηζξ μοζίεξ πμο εεςνμφκηαζ ζδιακηζηέξ ιε αάζδ ηδκ πενζεηηζηυηδηά ημοξ ζημ μθζηυ εηπφθζζια. ε λ ί δ α 62

71 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 14 Εμβαδά και Κd από τα χρωματογραφιματα των ςυςτθμάτων S1-S6 από τθν HPTLC system/compound s1d s1up Kd up/down S2d 5228, ,34 0, , ,64 S2up 0,00 0, , , ,71 Kd up/down 1,07 1,17 S3d 5001, , , , ,48 S3up 0,00 866,51 513, , ,45 Kd up/down 0,08 0,13 1,43 2,67 S4d 4547, , , , ,11 S4up 0, , , , ,52 Kd up/down 0,18 0,34 1,55 3,18 S5d 4987, , , , ,92 S5up 319, , , , ,04 Kd up/down 0,06 0,31 0,53 1,66 3,83 S6d 4149, , , , ,80 S6up 0, , , , ,28 Kd up/down 0,31 0,67 1,55 3,24 ε λ ί δ α 63

72 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 15 υντελεςτζσ α για τισ ουςίεσ 1,2,5,6 και 7 System compound Kd(up/down) α S2 2 1,07 1 1,17 1,09 S3 6 0,08 5 0,13 1,87 2 1, ,67 1,87 S4 6 0,18 5 0,34 1,89 2 1,55 4,56 1 3,18 2,05 S5 7 0,06 6 0,31 5,17 5 0,53 1,71 2 1,66 3,13 1 3,83 2,31 S6 6 0,31 5 0,67 2,16 2 1,55 2,31 1 3,24 2,09 ηδ ζοκέπεζα ιεθεηήζαιε ηζξ οπμθμβζγυιεκεξ ηζιέξ ημο ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ (Kd = Cu/Cd) ηαζ ημο ζοκηεθεζηή α (θυβμξ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ δφμ μοζζχκ ζε έκα ζφζηδια) βζα ηζξ μοζίεξ 1, 2, 5, 6, 7 ζηα πνμακαθενυιεκα δζθαζζηά ζοζηήιαηα (Πίκ. 14 ηαζ 15), ιε ζημπυ κα πνμαθέρμοιε ηυζμ ηδ ζεζνά έηθμοζδξ ηςκ μοζζχκ υζμ ηαζ ηδ δοκαηυηδηα δζαπςνζζιμφ ημοξ. Πζμ ζοβηεηνζιέκα, υζμ ιζηνυηενμξ είκαζ μ ζοκηεθεζηήξ ηαηακμιήξ ιζαξ μοζίαξ ζε έκα δζθαζζηυ ζφζηδια, ηυζμ ιεβαθφηενδ είκαζ δ ηαηακμιή ηδξ ζηδκ ηάης θάζδ ημο ζοζηήιαημξ. Δπεζδή, δ ηάης θάζδ ζηδκ πενίπηςζή ιαξ έπεζ επζθεβεί ςξ ζηαηζηή θάζδ, εφημθα βίκεηαζ ακηζθδπηυ υηζ υζμ ιεβαθφηενδ είκαζ δ ηζιή ημο Kd ηυζμ ιζηνυηενδ εα είκαζ δ ηαπφηδηα ιε ηδκ μπμία εα ηζκδεεί δ ακηίζημζπδ μοζία ιέζα ζηδ πνςιαημβναθζηή ζηήθδ ηαζ επμιέκςξ ηυζμ ιεβαθφηενμξ εα είκαζ μ πνυκμξ έηθμοζή ηδξ απυ αοηή. Πναηηζηά, βζα 0 < Kd < 0.3 δ έηθμοζδ ηδξ ακηίζημζπδξ μοζίαξ απυ ηδ ζηήθδ εα είκαζ είηε αδφκαηδ (Kd = 0) είηε ε λ ί δ α 64

73 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα πάνα πμθφ ηαεοζηενδιέκδ. Δπίζδξ, βζα κα είκαζ εθζηηυξ μ δζαπςνζζιυξ δφμ μοζζχκ εα πνέπεζ μ θυβμξ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ ημοξ (α) κα είκαζ ιεβαθφηενμξ απυ 1.5. Μάθζζηα, υζμ ιεβαθφηενδ είκαζ δ ηζιή αοημφ ημο ζοκηεθεζηή ηυζμ πζμ πζεακυξ είκαζ μ δζαπςνζζιυξ ηςκ ακηίζημζπςκ μοζζχκ. Με αάζδ ηα πνμακαθενυιεκα εα ιπμνμφζαιε κα ζοιπενάκμοιε ηα αηυθμοεα: Με ηζκδηή ηδκ πάκς θάζδ ημο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ S1 δεκ είκαζ δοκαηή δ έηθμοζδ ηςκ ελεηαγυιεκςκ μοζζχκ απυ ηδ ζηήθδ (Kd = 0), αθθά δ πνδζζιμπμίδζή ηδξ ηνίεδηε απαναίηδηδ βζα ηδκ απμιάηνοκζδ ηςκ πενζεπυιεκςκ πθςνμθοθθχκ. Με ηδκ μνβακζηή θάζδ ημο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ S2 είκαζ δοκαηή ιυκμ δ έηθμοζδ ηςκ μοζζχκ 1 ηαζ 2 (Kd = 1.17 ηαζ 1.07, ακηίζημζπα), αθθά δεκ είκαζ εθζηηυξ μ δζαπςνζζιυξ ημοξ (α 1,2 = 1.09). Ωζηυζμ, πνδζζιμπμζχκηαξ ζηδ ζοκέπεζα ηδκ πάκς θάζδ ημο ζοζηήιαημξ S3 εα επζηεοπεεί μ δζαπςνζζιυξ ηςκ μοζζχκ αοηχκ (α 1,2 = 1.87) ηαζ εα ανπίζεζ ζζβά-ζζβά δ ιεηαηίκδζδ ηςκ μοζζχκ 5 ηαζ 6 ιέζα ζηδ ζηήθδ (Kd = 0.13 ηαζ 0.08, ακηίζημζπα). Ζ ηίκδζδ ηςκ μοζζχκ 5 ηαζ 6 ιέζα ζηδ ζηήθδ εα είκαζ πζμ βνήβμνδ ιε ηδκ πνδζζιμπμίδζδ ηςκ μνβακζηχκ θάζεςκ ηςκ ζοζηδιάηςκ S4 (Kd = 0.34 ηαζ 0.18, ακηίζημζπα) ηαζ S5 (Kd = 0.53 ηαζ 0.31, ακηίζημζπα), εκχ πανάθθδθα θαίκεηαζ εθζηηυξ ηαζ μ δζαπςνζζιυξ ημοξ (α 5,6 = 1.89 ηαζ α 5,6 = 1.71, ακηίζημζπα). Με ηακέκα απυ ηα ελεηαγυιεκα ζοζηήιαηα δεκ ιπμνεί κα επζηεοπεεί δ έηθμοζδ ηδξ μοζίαξ 7 (Kd < 0.06). οιπεναζιαηζηά εα ιπμνμφζαιε κα πμφιε υηζ πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ ηζκδηέξ θάζεζξ δζαδμπζηά ηζξ μνβακζηέξ θάζεζξ ηςκ ζοζηδιάηςκ S1- S6 εα εηθμοζεμφκ λεπςνζζηά μζ μοζίεξ 1, 2, 5 ηαζ 6 (ιε ηδ ζεζνά ιε ηδκ μπμία ακαθένμκηαζ), εκχ δ μοζία 7 εα παναιείκεζ ζηδ ζηήθδ ηαζ εα παναθδθεεί ζημ ηέθμξ ιεηά απυ ακηζζηνμθή ηςκ θάζεςκ. ε λ ί δ α 65

74 mau mau Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Δύπεζη ζςνηελεζηών καηανομήρ με HPLC Σμ πείναια επακαθήθεδηε ηδκ ίδζα διένα ιε ηδκ ηεπκζηή HPLC, πνδζζιμπμζχκηαξ ηα ίδζα δείβιαηα πμο πνδζζιμπμζήεδηακ ζηδκ HPTLC βζα ηδ ζφβηνζζδ ηςκ απμηεθεζιάηςκ. Ζ ιέεμδμξ πμο πνδζζιμπμζήεδηε βζα ημκ έθεβπμ ημο πενζεπμιέκμο ηςκ δφμ θάζεςκ ηάεε δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ πανμοζζάγεηαζ ζημκ πίκαηα 16. Σα HPLC πνςιαημβναθήιαηα εθήθεδζακ ζηα 254 nm (εζη. 27 ) ηαζ επελενβάζηδηακ βζα ηδκ εφνεζδ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ ηςκ μοζζχκ. Πίνακασ 16 Μζκοδοσ HPLC Χρόνος (min.) ACN % H 2O+2% Α.Α. Ροή (ml/min) 0,0 4,0 96,0 1,00 10,0 6,0 94,0 1,00 40,0 12,0 88,0 1,00 50,0 15,0 85,0 1,00 60,0 20,0 80,0 1,00 75,0 50,0 50,0 1,00 80,0 4,0 96,0 1,00 85,0 4,0 96,0 1, S2up S2down Ghal_tota l Minutes Εικόνα 27 Χρωματογραφιματα του μεκανολικοφ εκχυλίςματοσ (Ghal_total), και των δφο φάςεων του ςυςτιματοσ S2 (S2up, S2d), ςτα 254 nm ε λ ί δ α 66

75 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Απυ ηα ειααδά ηςκ μοζζχκ ζηζξ δφμ θάζεζξ οπμθμβίζηδηακ μζ ζοκηεθεζηέξ ηαηακμιήξ Kd ηαζ μ ζοκηεθεζηήξ α, βζα υθεξ ηζξ μοζίεξ, ηαζ βζα ηα έλζ δζθαζζηά ζοζηήιαηα (πίκ. 15, 16). Πίνακασ 17 Εμβαδά και Κd από τα χρωματογραφιματα HPLC για τα ςυςτιματα S1-S6 system/ compound s1d s1up Kd up/down s2d s2up 0,00 0,00 0, Kd up/down 0,13 0,06 0,63 0,60 s3d s3up 0,00 0,00 0, Kd up/down 0,82 0,43 1,26 1,97 s4d s4up 0, Kd up/down 0,12 0,22 1,42 0,94 1,90 6,61 s5d s5up Kd up/down 0,12 0,21 0,30 0,93 0,90 1,19 1,70 s6d s6up Kd up/down 0,11 0,19 0,27 0, ,18 1,94 ε λ ί δ α 67

76 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 18 υντελεςτζσ α για τισ ουςίεσ 1 ζωσ 7 compound Kd(up/down) α S2 2 0,63 1 0,60 1,05 4 0,13 10,6 3 0,06 2,17 S3 1 1,97 2 1,26 1,56 4 0,82 1,54 3 0,43 1,91 S4 1 6,61 2 1,90 3,48 4 1,42 1,34 3 0,94 1,51 5 0,22 4,27 6 0,12 1,83 S5 1 1,70 2 1,19 1,43 4 0,93 1,28 3 0,90 1,03 5 0,30 3,00 6 0,21 1,43 7 0,12 1,75 S6 1 1,94 2 1,18 1,64 3 0,89 1,33 4 0,81 1,10 5 0,27 3,00 6 0,19 1,42 7 0,11 1,73 ηδ ζοκέπεζα ιεθεηήζαιε ηζξ οπμθμβζγυιεκεξ ηζιέξ ημο ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ (Kd = Cu/Cd) ηαζ ημο ζοκηεθεζηή α (θυβμξ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ δφμ μοζζχκ ζε έκα ζφζηδια) βζα ηζξ μοζίεξ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ζηα ελεηαγυιεκα δζθαζζηά ζοζηήιαηα (Πίκ. 17 ηαζ 18), ιε ζημπυ κα πνμαθέρμοιε ηυζμ ηδ ζεζνά έηθμοζδξ ηςκ μοζζχκ υζμ ηαζ ηδ δοκαηυηδηα δζαπςνζζιμφ ημοξ. Έηζζ πνμέηορακ ηα αηυθμοεα ζοιπενάζιαηα: ε λ ί δ α 68

77 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Με ηδ πνήζδ ηδξ μνβακζηή θάζδξ ημο δζθαζζημφ ζοζηήιαημξ S2 ςξ ηζκδηήξ θάζδξ είκαζ δοκαηή ιυκμ δ έηθμοζδ ηςκ μοζζχκ 1 ηαζ 2 (Kd = 0.60 ηαζ 0.63, ακηίζημζπα), αθθά δεκ είκαζ εθζηηυξ μ δζαπςνζζιυξ ημοξ (α 1,2 = 1.05). Ωζηυζμ, πνδζζιμπμζχκηαξ ζηδ ζοκέπεζα ηδκ πάκς θάζδ ημο ζοζηήιαημξ S3 εα επζηεοπεεί μ δζαπςνζζιυξ ηςκ μοζζχκ αοηχκ (α 1,2 = 1.56), υπςξ επίζδξ ηαζ ηςκ μοζζχκ 3 ηαζ 4 (α 2,4 = 1.54 / α 3,4 = 1.91). Ζ ηίκδζδ ηςκ μοζζχκ 5 ηαζ 6 ιέζα ζηδ ζηήθδ εα λεηζκήζεζ ιε ηδκ πνδζζιμπμίδζδ ηςκ μνβακζηχκ θάζεςκ ηςκ ζοζηδιάηςκ S4 (Kd = 0.22 ηαζ 0.12, ακηίζημζπα) ηαζ S5 (Kd = 0.30 ηαζ 0.21, ακηίζημζπα), εκχ πανάθθδθα θαίκεηαζ εθζηηυξ ηαζ μ δζαπςνζζιυξ ημοξ (α 5,6 = 1.83 ηαζ α 5,6 = 1.43, ακηίζημζπα). Ωζηυζμ, μζ ιζηνέξ ημο ζοκηεθεζηή ηαηακμιήξ θακενχκμοκ υηζ δ έηθμοζδ ηςκ μοζζχκ 5 ηαζ 6 εα ηαεοζηενήζεζ ανηεηά ηαζ εα απαζηήζεζ ιεβάθεξ πμζυηδηεξ ηζκδηήξ θάζδξ. Με ηακέκα απυ ηα ελεηαγυιεκα ζοζηήιαηα δεκ ιπμνεί κα επζηεοπεεί δ έηθμοζδ ηδξ μοζίαξ 7 (Kd < 0.12). οιπεναζιαηζηά εα ιπμνμφζαιε κα πμφιε υηζ πνδζζιμπμζχκηαξ ςξ ηζκδηέξ θάζεζξ δζαδμπζηά ηζξ μνβακζηέξ θάζεζξ ηςκ ζοζηδιάηςκ S1- S6 εα εηθμοζεμφκ λεπςνζζηά μζ μοζίεξ 1, 2, 4, 3, 5 ηαζ 6 (ιε ηδ ζεζνά ιε ηδκ μπμία ακαθένμκηαζ), εκχ δ μοζία 7 εα παναιείκεζ ζηδ ζηήθδ ηαζ εα παναθδθεεί ζημ ηέθμξ ηδξ δζαδζηαζίαξ ιεηά απυ ακηζζηνμθή ηςκ θάζεςκ. ε λ ί δ α 69

78 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Απομόνυζη θαινολικών παπαγώγυν με σπυμαηογπαθία καηανομήρ με θςγοκένηπηζη (FCPC) Μεηά ηδκ εφνεζδ ηςκ ζοκηεθεζηχκ ηαηακμιήξ Kd ηαζ ηςκ ζοκηεθεζηχκ α, αημθμφεδζε δ εθανιμβή ημο FCPC βζα ηδκ απμιυκςζδ ηςκ μοζζχκ απυ ημ ιεεακμθζηυ εηπφθζζια. Ανπζηά πναβιαημπμζήεδηε δμηζιή ζημ ακαθοηζηυ FCPC (ζηήθδ 50 ml), ιε πμζυηδηα εηποθίζιαημξ 200 mg. Μεηά απυ έθεβπμ ηςκ ηθαζιάηςκ ιε πνςιαημβναθία TLC, παναηδνήεδηε πμθφ ηαθυξ δζαπςνζζιυξ ηςκ μοζζχκ ηαζ έβζκε ιεηάααζδ ζημ FCPC παναζηεοαζηζηήξ ηθίιαηαξ (ζηήθδ 1000 ml). Γζα ηδκ εθανιμβή ημο παναζηεοαζηζημφ FCPC πνδζζιμπμζήεδηακ 10 g απυ ημ ιεεακμθζηυ εηπφθζζια G. halacsyi, ηαζ παναζηεοάζηδηακ 3 lt απυ ηάεε ζφζηδια δζαθοηχκ (S1 έςξ S6) ζε δζαπςνζζηζηή πμάκδ. Ωξ ζηαηζηή θάζδ πνδζζιμπμζήεδηε δ ηάης θάζδ ημο ζοζηήιαημξ S1. Ζ πάκς θάζδ ημο ζοζηήιαημξ S1 ηαζ μζ πάκς θάζεζξ απυ ηα οπυθμζπα ζοζηήιαηα ιεηαθένεδηακ ζε ηςκζηέξ θζάθεξ ηαζ πνδζζιμπμζήεδηακ ααειζδςηά ςξ ηζκδηέξ θάζεζξ, πενκχκηαξ απυ ηδ ζηήθδ πενίπμο 500 ml απυ ηάεε ιία (ηθάζιαηα 1-106). Μεηά ημ πέναξ υθςκ ηςκ μνβακζηχκ θάζεςκ έβζκε ακηζζηνμθή, ιε πνδζζιμπμίδζδ ηδξ οδαηζηήξ θάζδξ ςξ ηζκδηήξ (ηθάζιαηα ). Ζ ζοθθμβή ηςκ ηθαζιάηςκ έβζκε ιε νμή 20 ml/min, ιε πενζζηνμθή 500 rpm ηαζ πίεζδ 400 psi. οκμθζηά ζοθθέπεδηακ 117 ηθάζιαηα. Σεθζηά 100% MeOH πνδζζιμπμζήεδηε βζα ηδκ έηπθοζδ ηδξ ζηήθδξ ηαζ ηδκ απμιάηνοκζδ πζεακχκ μοζζχκ πμο δεκ εηθμφζηδηακ ηαζ ζοθθέπεδηε ημ ηεθζηυ ηθάζια (Ghal_ΣΔΛΟ) ιε αάνμξ mg. Σα ηθάζιαηα εθέπεδζακ ιε πνςιαημβναθία TLC ηαζ ζοκεκχεδηακ υπςξ θαίκεηαζ ζημκ πίκαηα 17. Δπζθεβιέκα ηθάζιαηα εθέπεδζακ ζηδ ζοκέπεζα ιε θαζιαημζημπία NMR (εζη. 28). ε λ ί δ α 70

79 Πνμζςπζηά απμηεθέζιαηα Πίνακασ 19 Κλάςματα του φυτοφ G.halacsyi μετά από κλαςμάτωςθ με FCPC κλάζμαηα Βάπορ mg παπαηηπήζειρ κλάζμαηα Βάπορ mg παπαηηπήζειρ Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Έθεβπμξ ιε θαζιαημζημπία NMR Εικόνα 28 TLC πλάκα των ςυνενωμζνων κλαςμάτων τθσ G.halacsyi από FCPC ε λ ί δ α 71