BchI BIOCHEMIJOS INSTITUTAS

Transcript

1 EUROPOS SĄJUNGA BchI BIOCHEMIJOS INSTITUTAS Kurkime ateitį drauge! Praktiniai mokymai "Peptidų skirstymas dviejų dimensijų chromatografine "offline" sistema: jonų mainų ir atvirkščių fazių chromatografija" Rasa Žūkienė Vytauto Didžiojo universitetas, Aplinkos tyrimų centras Šiandien dvimatė (dviejų dimensijų angl. 2D-LC) ar net daugiamatė (multidimensinė) skysčių chromatografija sujungta su masių spektroskopijos metodais (MS) yra visuotinai pripažintas proteomo analizės metodas. Mažo kompleksiškumo, nesudėtingiems baltymų/peptidų pavyzdžiams anlizuoti gali užtekti ir vienmatės skysčių chromatografijos su MS. Daugiamatė skysčių chromatografija (DMSC) su skirtingais skirstymo mechanizmais turi daug privalumų skirstant kompleksinius baltymų, suskaidytų proteolitiniais fermentais, pavyzdžius: DMSC yra lengvai automatizuojama, pasižymi geru atsikartojamumu, skirstymas vyksta skystinėje fazėje, analitės nėra užrakinamos gelyje. DMSC gerai veikia skirstant hidrofobinius, rūgštinius, bazinius, labai mažus, labai didelius ir negausius baltymus (angl. low abundance), kuriuos būtų sunku analizuoti kitais tradiciniais metodais. DMSC gali būti įvairių modifikacijų priklausomai nuo pavyzdžio tipo. Daugiamatės skysčių chromatografijos atveju išskirtinai naudojama efektyvioji skysčių chromatografija (ESC, angl. high performance liquid chromatography, HPLC) dažnai su nanoformato chromatografinėmis kolonėlėmis, užpildytomis sąlyginai mažomis dalelėmis 3-5 μm, kas sąlygoja aukštą darbinį sistemos slėgį (iki 300 barų). Iš daugiamačių dažniausiai naudojami dvimačiai skirstymo metodai, kur pirmoje dimensijoje baltymai/peptidai skirstomi jonų mainų chromatografija, o antroje dimensijoje atvirkščių fazių chromatografija (toks derinys demonstruojamas ir šiuose praktiniuose mokymuose), tačiau gali būti naudojamos ir kitos chromatografijos rūšys bei jų deriniai. Yra naudojami du dvimatės analizės techniniai sprendimai: tiesioginis (angl. on-line ) arba netiesioginis (angl. off-line ):

2 Tiesioginiame metode frakcijos iš pirmosios kolonėlės vožtuvo pagalba tiesiogiai, be užlaikymo patenka į kitą kolonėlę, kur toliau išskirstomos kitu chromatografiniu metodu. Tiesioginis 2D nano LC/MS metodas yra tinkamas metodas proteolitiškai suskaidytų baltymų, išpjautų iš gelių, tolimesniam skirstymui ir sudėtingesnių subląstelinių frakcijų skirstymui. Šis metodas naudojamas biomarkerių paieškai sukoncentruotuose pavyzdžiuose iš biologinių skysčių (kraujo, smegenų skysčio ar šlapimo). Galiausiai, tai yra geriausias pasirinkimas afiniškai išgrynintų baltymų ar peptidų su potrancliacinėmis modifikacijomis skirstymui funkcinės proteomikos tyrimuose. Netiesioginiame metode pavyzdžio, išskirstyto pirmoje dimensijoje, frakcijos yra surenkamos frakcijų kolektoriumi. Šis metodas technologiškai paprastesnis nei tiesioginis, tačiau turi keletą privalumų: gali būti surenkamos visos frakcijos, nereikia stabdyti analizės, frakcijos gali būti toliau analizuojamos ne tik antroje sistemos dimensijoje, bet ir kitais analizės metodais (imunologiniais, fermentiniais ir t.t.). Šiuo metodu identifikuojama daugiau baltymų nei tiesioginiu, tačiau yra pavyzdžio pokyčių ir sorbcijos pavojus frakcijų surinkimo etape. Netiesioginis 2D nano LC/MS metodas yra tinkamas labai sudėtingiems proteomo pavyzdžiams, tokiems kaip ląstelių ar audinių lizatai. Šis metodas gali būti naudojamas negausių baltymų gryninimui ir analizei bei biomarkerių paieškai labai sudėtingose biologinėse terpėse. Analizės praktinių mokymų metu schema: 1 dimensija 2 dimensija Bandinio įvedimas Frakcijos įvedimas Jonų mainų chromatografija Frakcijų surinkimas Atvirkščių fazių chromatografija Automatinis plokštelių paruošimas MALDI MS analizei

3 Jonų mainų chromatografija. Baltymų mišinių frakcionavimas pagrįstas elektrostatine (jonine) sąveika tarp baltymų ir nejudriosios fazės jonizuotų grupių. Nejudriosios fazės, turinčios neigiamą krūvį, traukia medžiagas (baltymus), turinčias teigiamą krūvį. Jos vadinami katijonitais, o turinčios teigiamą krūvį anijonitais. Nesąveikaujantys su nejudriąja faze baltymai iškart pasišalina iš kolonėlės. Sąveikaujantys baltymai/peptidai išplaunami keičiant druskų tirpalų (pvz., NaCl) joninę jėgą arba ph. Baltymų/peptidų frakcijos surenkamos tolimesniam skirstymui ir gryninimui. Jonitai, naudojami efektyviojoje chromatografijoje, yra silikagelinės ar polimerinės medžiagos, paviršiuje turinčios judrių jonų, kuriuos gali pakeisti kiti jonai. Jonitai absorbuoja elektrolitų tirpalų (druskų, rūgščių ar šarmų) jonus ir vietoje jų į tirpalą išskiria atitinkamą kiekį tokį patį krūvio ženklą turinčių kitų jonų. Jonų mainai priklauso nuo juose dalyvaujančių jonų savybių. Atsižvelgiant į keičiamus jonus, jonitai skirstomi į katijonitus, anijonitus ir amfolitus. Katijonitai turi fiksuotus anijonus, kurie gali keisti teigiamuosius priešjonius. Anijonitus sudaro fiksuoti katijonai, turintys galinčius keistis neigiamus priešjonius. Amfoteriniai jonitai vadinami amfolitais, jie turi ir rūgštinį, ir bazinį fiksuotus jonus. Aktyvūs katijonitų mainų sandai dažniausiai yra - C 6 H 5 O -, SO - 3, - COO -, PO 2-3 ar -AsO 2-3, anijonitų - -N + H 3, -N + H 2 R, -N + HR 2, -N - R 3 (R-organinė liekana). Atvirkščių fazių chromatografija yra pasiskirstomosios chromatografijos rūšis. Pasiskirstomojoje chromatografijoje nejudri ir judri (mobili) fazės yra sudarytos iš dviejų nesimaišančių ar sunkiai besimaišančių tirpalų (skysčių). Tokioje sistemoje ištirpinus cheminį junginį, jo molekulės pereis iš vienos skystos fazės į kitą tol, kol nusistovės pusiausvyrinė būsena, kai didesnė junginio koncentracija bus tame tirpiklyje, kuriame junginys pasižymi didesniu tirpumu. Kuo medžiaga giminingesnė (t.y. jos tirpumas didesnis) nejudriai fazei, tuo ji lėčiau juda išilgai kolonėles. Medžiagų frakcionavimas vyks priklausomai nuo jų hidrofobiškumo. Istoriškai taip jau susiklostė, kad "normalių" fazių išsidėstymu vadinamas fazių išsidėstymas, kai nejudri yra vandeninė fazė. Dėl savo drėkinamųjų savybių vandeninė fazė lengvai yra fiksuojama ant hidrofilinių matricų (celiuliozės, poliakrilamidinių arba dekstraninių gelių, silikagelių ir kt.). Judrią fazę, šiuo atveju, sudaro organiniai tirpikliai. Kai fazės yra atvirkščios, t.y. kai prie kietos matricos

4 yra fiksuojama organinio tirpiklio plėvelė, o judrią fazę sudaro vandeninis tirpalas, pasiskirstymo chromatografija vadinama atvirkščių fazių chromatografija. Baltymai/peptidai užlaikomi kolonėlėje dėl hidrofobinės sąveikos ir yra išplaunami didinant vandeninio eliuento hidrofobiškumą organiniu tirpikliu. Atvirkščių fazių chromatografijoje vienu metu vyksta pavyzdžio sukoncentravimas, nudruskinimas ir skirstymas. Naudotos chromatografijos sąlygos: Jonų mainų chromatografijos sąlygos: Kolonėlė: ZORBAX BIO-SCX II, 3,5µm, 50x0,8 mm (Agilent Technologies) Pavyzdys: tripsinizuotas citochromas c Injekcijos tūris: 10µl Detekcija: 210 nm (ref 450 nm) Tėkmės greitis: 100 µl Eliuentas A: 95% H 2 O, 5% acetonitrilo, 0,05% skruzdžių rūgšties Eliuentas B: 95% H 2 O, 5% acetonitrilo, 0,5 M NaCl, 0,05% skruzdžių rūgšties Atvirkščių fazių chromatografijos sąlygos: Kolonėlė: ZORBAX 300SB-C18, 3,5µm, 100x0,3 mm (Agilent Technologies) Pavyzdys: tripsinizuoto citochromo c frakcijos Injekcijos tūris: 0,1µl Detekcija: 210 nm (ref 450 nm) Tėkmės greitis: 5 µl/min Eliuentas A: 0,05% trifluoracto rūgšties vandenyje Eliuentas B: 0,045% trifluoracto rūgšties acetonitrile

5 Kompiuterinės programos ChemStation (Agilent Technologies) analizės duomenų surinkimo kontrolės langas:

6 2D-HPLC sistemos sudedamosios dalys Eliuentai Eliuentų nudujinimo įrenginys Mikrosrauto siurblys (0,01-20μl) Automatinis pavyzdžio įvedimo įrenginys Termostatas (pavyzdžiams) Kolonėlių termostatas Diodų matricos UV/VIS detektorius Eliuentų nudujinimo įrenginys Keturkanalis siurblys (0,01-10ml) Rankinis pavyzdžio įvedimo įrenginys Keičiamo bangos ilgio UV/VIS detektorius Mikrofrakcijų surinktuvas-lašintuvas MALDI plokštelių paruošimui Termostatas