INTRETINEREA CULTURILOR CELULARE IN LABORATOR. Tehnici uzuale si conditii de cultura

Transcript

1 INTRETINEREA CULTURILOR CELULARE IN LABORATOR Tehnici uzuale si conditii de cultura

2 Elementele cheie in tehnica culturilor celulare Mediul de cultura Conditiile de incubare Densitatea de crestere Asepsia

3 Medii naturale: Mediile de cultura fluide biologice (plasma si serul sanguin, limfa, ser din cordonul placentar, lichid amniotic), extracte tisulare (extract hepatic, splenic, tumoral, maduva hematopoietica, embrioni de vitel sau pui) cheagurile din plasma sanguina Medii artificiale, care se obtin prin suplimentarea unor medii bazale cu extracte naturale, de tipul serului fetal de vitel Medii sintetice, care sunt formulate in intregime utilizand substante chimice si nu contin suplimente naturale

4 Avantaje/Dezavantaje Mediile naturale reproduc foarte bine conditiile fiziologice si necesarul metabolic al celulelor. Principalul dezavantaj al acestora este accesibilitatea sursei si reproductibilitatea compozitiei. Mediile artificiale sunt cele mai ieftine si cele mai uzuale. Pot sustine cresterea mai multor tipuri de celule. Ca dezavantaj cunoasterea incompleta a compozitiei serului fetal Mediile sintetice nu contin adausuri naturale, au o compozitie foarte complexa si bine cunoscuta, reconstituita prin adaugarea de hormoni, factori de crestere, lipoproteine si alte molecule, cu efecte tintite pentru cresterea a unui anumit tip de celule. Ca dezavantaj foarte scumpe si specifice pentru o singura categorie de celule.

5 ph in cultura de celule Principalul compus, care modifica valoarea ph in cultura de celule este CO 2, produs ca urmare a metabolismului celular. Eliberarea CO 2 din mediu, duce la alcalinizarea mediului, dar in acelasi timp, in mediu apos, CO 2 reactioneaza cu H 2 O 2, producand acid carbonic, care reduce ph-ul mediului de cutura Pentru evitarea modificarii ph-ului prin aceste mechanisme, mediile de cultura sunt prevazute cu sisteme tampon, specifice, in functie de conditiile de incubare vizate. Majoritatea mediilor de cultura contin indicator de ph Rosu-fenol

6 Sistemele tampon din mediile de ultura Sistemul tampon pe baza de NaHCO 3 are la baza echilibru gazos al CO 2 din conditiile de incubare si continutul de CO 3 /HCO 3 din mediul de cultura Conditii de incubare cu atmosfera de 5-10% CO 2 Sistem tampon pe baza compozitie in aminoacizi bazici Mediu L-15, conceput de Leibovitz, are un ph de 7.8, care in lipsa CO 2 nu este deposit Sistemul tampon de tip chimic, prin folosirea zwiterionilor (molecule, care contin in acelasi timp, atat grupari acide, cat si grupari alcaline) HEPES (acid 4-(2-hidroxietil )-1 piperazineetanesulfonic) MOPS-ului (acid 3-(N-morfolino)propanesulfonic)

7 Osmolaritatea Presiunea osmotica exercitata de mediu asupra celulelor. Osmolaritatea este data de cantitatea de molecule solubilizate intr-o unitate de lichid si trebuie sa fie in echilibru cu presiunea osmotica intracelulara Presiunea osmotica a sangelui este de 290 mosm/kg Osmolaritatea stabilita pentru formularea mediilor de cultura, este de mosm/kg

8 COMPOZITIA CHIMICA Saruri anorganice si microelemente mentinerea unei osmolaritati fiziologice a mediului, precum si a potentialului membranar celular Aminoacizi Complexul obligatoriu de aminoacizi este alcatuit din totalitatea aminoacizilor esentiali (valina, leucina, izoleucina, triptofanul, fenilalanina, metionina, lisina și treonina) pot contine si aminoacizi neesentiali (alanina, asparagina, acidul aspartic, cisteina, acidul glutamic, glutamina, glicina, prolina, serina si tirozina) L-glutamina, care este implicate in sinteza de NAD, NADPH si alte nucleotide, are rol de sursa secundara de energie Vitamine Carbohidrati (glucoza) Proteine si peptide

9 Proteine si peptide Sunt componentele reglatoare ale functiilor celulare. Ele asigura procesele de diviziune celulara, diferentiere, adeziune de substrat dar si altele In mediile artificiale, sursa de proteine si peptide este serul fetal (5-20%) in mediile definite chimic, sau cele sintetice, proteinele si peptidele sunt adaugate sub forma de substante pure

10 Albumina Serul fetal leaga apa, saruri organice si anorganice, acizi grasi liberi, hormoni si vitamine, pe care le transporta in tesuturi si celule Rol de detoxifiere a mediului de cultura Aprotinina o proteina stabila in ph neutru si acid, este rezistenta la temperaturi ridicate si la degradarea hidrolitica a enzimelor. are capacitatea de a inhiba o serie de protease serinice, ca tripsina, pe larg utilizata in tehnicile de subcultuvare celulara Fetuina glicoproteina, care se gaseste in concentratii foarte mari in serul fetal si cel al nounascutile, ca si apotinina, are proprietatea de a inhiba serin-protazele. Fibronectina glicoproteina, care intermediaza adeziunea celulelor de substrat Transferina proteina transportoare de ioni fier, la nivelul membrane celulare

11 Exemple de proteine din mediile sintetice Albumina, transferina, fibronectina, laminina, insulina, hormonul de crestere Factori de crestere Inhibitorul tripsinei din semintele de soia, cu rol asemanator cu apotinina si fetuina din serul fetal

12 Exemple de factori de crestere Factor de crestere (Growth factor GF) EGF (Epidermal Growth Factor) bfgf (basic Fibroblast Growth Factor) EVGF (Endothelial Vascular Growth Factor) Celule tinta Keratinocyte, fibroblaste, condrocite si altele, de tip epitelial si mezenchimal Celule endoteliale, fibroblaste, condrocite, mioblaste si altele Celule endoteliale Concentartii recomandate 1 20 ng/ml ng/ml 1 3 mg/ml IGF-1 (Insulin-like Growth Factor) Majoritatea celulelor 1 10 ng/ml PDGF (Platelet Derived Growth factor) Fibroblaste, miocite, celule gliale (celule de tip mezenchimal) 1 50 ng/ml NGF (Nerve Growth Factor) Celule neuronale, celule gliale (celule senzoriale) 5 10 ng/ml TGF α (Transformator Growth factor) Fibroblaste, mioblaste, condroblaste si altele (in general de tip mezenchimal) ng/ml

13 Mentinerea de rutina a liniilor celulare Multiplicarea celulelor in cultura duce la epuizarea substantelor nutritive din mediu de cultura si acidifierea acestuia Multiplicarea celulelor duce la epuizarea suprafetei de crestere, ceea ce duce la oprirea diviziunilor prin mecanismul inhibitiei de contact in cazul culturilor primare si a liniilor celulare normale Intretinerea liniilor celulare in cultura are loc prin schimbarea perioadica a mediului de cultura Frecventa de schimbare a mediului depinde de tipul celulelor (viteza de multiplicare) In cazul celulelor transformate, cu o crestre rapida, pasajul celular se face la aproximativ fiecare 4-5 zile, iar schimbarea mediului se face la 2-3 zile In cazul celulelor cu o crestere lenta pasajul se realizeaza la fiecare 2,3 sau chiar 4 saptammani, iar schimbarea mediului intre perioadele de subcultivarese face saptamanal

14 Conditii de cultura Temperatura de 37 o C Atmosfera imbogatita cu 5-10% CO 2 Umiditate 96%

15 Asepsie Circuite adaptate Aer filtrat prin filtre HEPA (pori de 0,22 µm) Iradiere UV (254 nm) Sterilizarea instrumentarului cu aer fierbine Sterilizarea solutiilor cu abur fierbinte (autoclavare) Materiale de unica folosinta, sterile

16 Varsta cultuii celulare Numarul de pasaje numarul subculturilor celulare realizate Numarul de generatii numarul de dublari a populatiei celulare numar care indica varsta culturii Linii celulare limitate (finite) linii celulare cu durata de viata limitata la un anumit numar de generatii (aproximativ 20-80, in functie de tipul celulelor)

17 Alegerea momentului pentru schimbarea mediului si subcultivare

18

19 Ciclul de crestere si numarul de dilutii

20 Verificarea de rutina a calitatii liniilor celulare Verificarea ph Majoritatea celulelor isi opresc cresterea la ph 7 6,5 Majoritatea celulelor isi pierd viabilitatea la ph 6,5-6. Determinarea concentratiei celulare Morfologia celulara. Semne de deteriorare a culturii: Vacuolizarea Granulatiile in jurul nucleului Aspectul sferic Adaptarea grosimii stratului de mediu, in functie de consumul de O 2 Culturi consumatoare de O 2 2 mm Culturi cu un consum scazut de O 2 5 mm

21 Morfologie celulara anormala

22 CRIOCONSERVAREA SI CRIOSTOCAREA Amanarea in timp a modificarilor genotipice Prelungirea perioadei de utilizare inainte de atingerea senescentei Conservarea liniilor valoaroase sau de interes Evitarea (reducerea) contaminarii cu microorganisme Evitarea (reducerea) contaminarii cu alte linii celulare Minimizarea efectelor de manevrare improprie Minimalizarea eventualelor deficiente de incubare Economia de timp si de material Distributia catre alti utilizatori

23 Preconditii de inghetare Absenta cantaminarii cu microorganisme Verificarea caracteristicilor si a provenientei

24 Principiul crioconservarii Pentru mentinerea viabilitatii celulare la inghetare: Minimizarea formarii cristalelor de gheata in celula Evitarea efectelor citotoxice solutiilor concentrate de criocprotectie Crioconservarea cu pastrarea viabilitatii celulare: Inghetarea lenta (maxim 1 o C/min) Utilizarea crioprotectantilor care leaga apa Stocarea la temperaturi foarte joase, pentru evitarea efectului nociv a solutiilor concentrate de saruri si proteine, sub forma de micelii in gheata dezghetarea rapida, pentru evitarea formarii cristalelor de gheata si a gradientilor de concentratie a sarurilor si proteinelor

25 Concentratia celulelor la criostocate O concentratie mai mare la inghetare determina o eficienta mai mare la reluarea culturii dupa dezghetare Daca o subcultura normala este initiata cu 1x10 5 cel/ml, concentratia indicata la inghetare va fi de 1x 10 7 cel/ml, ca dupa dezghetare si dilutia de 1:20 cu mediu de cultura, sa se obtina o concentartie de insamantare de 5x10 5 cel/ml de 5 ori mai mare in comparatie cu cea necesara pentru o subcultivare proaspata Prin raportul de 1ml celule dezghetate/20ml mediu, se asigura dilutia crioprotectantului, cu minimizarea efectului sau citotoxic

26 Crioprotectanti Glicerina - devine toxica dupa un an de pastrare DMSO (dimetil sulfoxid) in concentratie de 7 10 %. Este un produs toxic pentru unele celule. Dupa adaugarea DMSO la suspensia celulara, amestecul trebuie tinut la rece (+4 o C) Polivinilpirolidona (PVP) Polietilenglicolul (PEG) Concentratii crescute de ser fetal (40 100%)

27 Viteza de inghetare Racirea la +4 o C Racirea lenta pana la 0 o C Inghetarea lenta, (1 o C/min), pana la -50 o C Inghetarea rapida (50 o C/min) pana la o C

28 Dezghetarea Criotubul cu celulele se introduce rapid in baia de apa, la +37 o C Se diluiaza foarte lent cu mediu, 1/20 (celulele dezghetate sunt sensibile la actiunile mecanice si osmotice) Se centrifugheaza imediat dupa dilutie, pentru a minimiza efectul crioprotectantului Se determina viabilitatea celulelor. O viabilitate acceptabila pentru reluarea normala a culturii este de > 65%

29 CARACTERIZAREA CELULELOR IN CULTURA

30 CARACTERIZAREA CELULELOR IN CULTURA Determinarea contaminarilor cu alte celule Determinarea (confirmarea) speciei de origine a celulelor Corelarea cu tesutul de origine a celulelor Determinarea liniei progenitoare la care apartin celulele Determinarea pozitiei celulelor in cadrul liniei progenitoare (daca sunt stem, precursoare sau diferentiate) Determinarea transformarilor aparute in cadrul liniilor celulare Daca linia celulara are viata limitata sau este continua Daca exprima caractere asociate cu malignizarea Determinarea instabilitatii genetice si a variabilitatii fenotipice Identificarea liniilor celulare in cadrul unui grup de celule cu aceeasi origine, a suselor celulare sau a liniilor celulare hibride

31 Cariotipare Metoda citogenetica Permite identificarea speciei si a sexului de origine a celulelor (umane, soarece, hamster etc) Detrmina numarul de cromozomi si structura lor prin bandare (colorarea specifica) Cariotiparea prin metoda picaturii

32 Bandarea cromozomilor pentru identificarea perechilor omologi Bandarea cu Giemsa Bandarea cu fluorescenta Hoechst 33258

33 Realizarea cariotipului

34 Caracterizarea morfologica Metoda simpla si des utilizata Este relativa si depinde de momentul examinarii, de localizarea celulelor in cultura (central sau spre periferie) sau de densitatea celulelor. Pentru morfologie se utilizeaza frecvent termenii tip fibroblastic (daca lungimea celulei depaseste de cel putin 2 ori latimea) si tip epiteloid (daca celulele sunt poligonale, cu dimensiuni uniforme si formeaza grupari celulare) Se recomanda examinarea morfologiei in starea vie a celulei (nefixata, necolorata) cu ajutorul microscopiei fotonice prin contrast de faza Daca se recurge la coloratie Giemsa este cel mai des utilizat colorant

35 Exemple de morfologie celulara in cultura

36

37

38

39

40

41

42 Detrminararea electroforetica a mobilitatii izoenzimelor Izoenzime enzime cu acelasi specific functional, insa cu structura si activitate usor diferita in functie de specie, rasa sau tesut Pentru determinarea de specie sunt utilizate 7 izoenzime, dintre care doar 4 sunt de cele mai multe ori suficiente pentru a face un diagnostic de specie, rasa sau tesut sau pentru a determina prezenta unei trans-contaminari (minm 10%) cu celule provenite de la alta specie Nucleosid fosforilasa Glucozo-6-fosfat dehidrogenaza Malat dehidrogenaza Lactat dehidrogenaza Aspartat aminotransferaza Manozo-6-fosfat izomeraza Peptidaza Se determina calitativ activitatea unei enzime in functie de viteza de deplasare si intensitatea benzii formate de aceasta in gelul de agaroza sau poliacrilamida

43 Identificarea electroforetica a izoenzimelor

44 Metoda ELISA de determinare a antigenelor de suprafata Este o metoda frecvent utilizata, care foloseste anticorpi monospecifici pentru un anumit set de antigene specifice Pentru determinare sunt necesare kituri si materiale de control

45 Identificarea prin metode de colorare imunocitochimice Metoda citochimica de identificare cu anticorpi monospecifici generatori de produsi insolubili sau colorati sau anticorpi monospecifici cuplati cu fluorocromi. Permite identificarea, vizualizarea, localizarea si apreciarea cantitativa a unor constituenti celulari specifici. Filamentele intermediare specifice unui anumit tip celular Keratine in celulele epiteliale Vimentinele in celulele de origine mesodermica Desminele in celule musculare Proteina gliala acida in astrocite Neurofilamentele in neuroni etc. Componente specifice de suprafata Proteine de legare intercelulara de tip CAM Markeri specifici de suprafata de tip CD Componente ale metabolismului specific Albumina in hepatocite adulte Α feto-proteine (AFP) in hepatocitele embrionare Hormoni in celule secretoare specifice

46 Imagini imunocitochimice Proangiogenic astrocytes. (A) fibronectin (FN, green), PECAM-1 (red), PDGFRα (blue); lectin (red), integrin α5 or β1 (green) at the sprouting vascular edges of P5 retina. (B and C) Retinal vessels. (B) PECAM-1 (red), PDGFRα (green). (C) PECAM- 1 staining. (D) PDGFRα (red) and fibronectin (green) in P7 retina.