Η ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΔΗΜΟΣΙΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΝΕΟΤΕΡΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ

Transcript

1 Η ΜΟΡΙΑΚΗ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΔΗΜΟΣΙΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΝΕΟΤΕΡΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Στρεπτόκοκκοι-Εντερόκοκκοι Έφη Πετεινάκη

2 Επιλογή μεθόδου τυποποίησης σε «στρεπτοκόκκουςεντεροκόκκους» από το είδος από το ερώτημα που χρήζει απάντησης διερεύνηση επιδημικών εξάρσεων παραγωγή εμβολίων Oροτυπία, MLST και PFGE παραμένουν οι τρείς πυλώνες της μοριακής επιδημιολογικής τυποποίησης

3 Streptococcus pyogenes η τυποποίηση του Streptococcus pyogenes γίνεται στα πλαίσια συσχέτισης συγκεκριμένων οροτύπων και κλινικών εκδηλώσεων τρία σχήματα οροτυπίας έχουν χρησιμοποιηθεί, που αναφέρονται σε πρωτείνες επιφανείας με μεγάλη αντιγονική ετερογένεια: - πρωτείνη Μ - Τ-αντιγόνο - παράγοντας αδιαφάνειας του ορού (serum opacity factor, SOF) οριζόντια μεταφορά γονιδίων αυτών των πρωτεινών οδηγεί σε ανάδυση νέων στελεχών

4 Δομή κυττάρου β-αιμολυτικού στρεπτόκοκκου ομάδας Α

5 emm pattern groups and the structure of the emm chromosomal region Bessen, 2016

6 234 διαφορετικοί emm τύποι Bessen, 2016 Μ-τύποι που σχετίζονται με φαρυγγίτιδα ( strep throat) και όχι με επιφανειακή λοίμωξη δέρματος και το αντίστροφο emm pattern A-C ενοχοποιούνται για το 47% των περιπτώσεων φαρυγγίτιδας και μόνο για το 8% των περιπτώσεων λοίμωξης δέρματος ( throat specialists ) emm pattern D ενοχοποιείται για το 50% των περιπτώσεων λοίμωξης δέρματος των περιπτώσεων φαρυγγίτιδας και μόνο για το 2% των περιπτώσεων φαρυγγίτιδας ( skin specialists ) emm pattern E παρουσιάζει ισοδύναμη συμπεριφορά σε δέρμα και λοίμωξη δέρματος ( generalists ) σχέση emm-τύπων και ST κλώνων α. pattern A-C συνήθως αντιστοιχούν σε ένα ST β. pattern D-E συνήθως αντιστοιχούν σε πολλαπλούς STs

7 Protocol of emm-typing I. Lysate preparation (Note that one can often simply boil very fresh growth with good results for DNA extracts). 1. DNAzol extraction of DNA Aliquot 50 µl of DNAzol per sample in tubes or in 96 well plate. Add 10 µl of STGG frozen culture (health, pure) or 1 µl loopful of bacterial colonies from fresh culture. Seal plate or tube. Vortex gently for 1-3 sec. Incubate at 80 C for 20 min. Proceed with PCR or store the DNA at -20 C, no heat inactivation required. Note: Recommended to use 2 µl of template DNA for PCR. 2. Alternate protocol Pick fair amount 1/5 of fresh bacterial growth from the plate with standard loop (10 µl). Resuspend in 300 µl of 0.85% NaCl. Incubate at 70 C for 15 min. Centrifuge the samples at full speed for 2 min in microfuge and pipet out supernatant. Resuspend pellet in 50 µl TE (10mM Tris, 1mM EDTA, ph8), 10 µl Mutanolysin (3,000 U/mL), and 2 µl Hyaluronidase (30 mg/ml, Sigma H-3506; U/mg). Vortex thoroughly and incubate at 37 C for 30 min. Then Incubate at 100 C for 10 min to inactivate the enzymes. Proceed with PCR or store the lysates at -20 C until use. Occasionally we encounter isolates that are hard to amplify. In these cases we alter lysate preparation as follows: Pick fair amount 1/5 of fresh bacterial growth from the plate with standard loop (10 µl). Resuspend in 300 µl of 0.85% NaCl. Incubate at 70 C for 15 min. Centrifuge the samples at full speed for 2 min in microfuge and pipet out supernatant. Resuspend pellet in 50 µl TE (10mM Tris, 1mM EDTA, ph8), 10 µl Mutanolysin (3,000 U/mL), and 2 µl Hyaluronidase (30 mg/ml, Sigma H-3506; U/mg). Vortex thoroughly and incubate at 37 C for 30 min. Then Incubate at 100 C for 10 min to inactivate the enzymes. Proceed with PCR or store the lysates at -20 C until use. II. PCR III. Sequencing

8 Σε ποιες περιπτώσεις είναι απαραίτητη η τυποποίηση στελέχους S. pyogenes? α. επιδημιολογία των σοβαρών λοιμώξεων από S. pyogenes 1. Prospective Surveillance of Pediatric Invasive Group A Streptococcus Infection. Chings et al. J Pediatric Infection Dis Society, 2017 doi: /jpids/pix099 Conclusion: emm1 was the most common emm type (29%). 2. Streptococcal toxic shock syndrome caused by the dissemination of an invasive emm3/st15 strain of Streptococcus pyogenes. Sekizuka T, et al. BMC Infect Dis Dec 18;17(1):774. Conclusion: global dissemination of emm3/st15 GAS strain has the potential to cause invasive disease 3. Streptococcus pyogenes emm Types and Clusters during a 7-Year Period (2007 to 2013) in Pharyngeal and Nonpharyngeal Pediatric Isolates. Koutouzi F, et al. J Clin Microbiol ;53(7): Conclusion: The most prevalent emm types identified were 1 (16.7%), 12 (13.6%), 77 (10.9%), 4 (10.8%), 28 (10.4%), 6 (6.8%), 3 (6.6%), and 89 (6.6%), accounting for 82.3% of total isolates. Rheumatogenic emm types comprised 16.3% of total isolates. The emm types 12, 4, and 77 were more prevalent among pharyngeal isolates, and the emm types 1, 89, 6, 75, and 11 were more prevalent among nonpharyngeal isolates. *invasive infections: bacteremia, meningitis, cellulitis, pneumonia and the more secete necrotizing fasciitis and streptococcal toxin shock syndrom

9 Σε ποιες περιπτώσεις είναι απαραίτητη η τυποποίηση στελέχους S. pyogenes? β. επιδημιολογία της αντοχής Shen Y, et al. Front Microbiol Mar 23;9:542.

10 Αρκεί μόνο το emm-typing?

11 . High Prevalence of Macrolide-resistance and Molecular Characterization of Streptococcus pyogenes Isolates Circulating in China from 2009 to Lu B et al. Front Microbiol Jun 8;8:1052.

12 Streptococcus agalactiae - 10 ορότυποι βάσει δομής του πολυσακχαριδικού αντιγόνου του ελύτρου (Ιa, Ib, II-IX) - διάφορες μεθοδολογίες είχαν εφαρμοστεί (immunoprecipitation, enzyme immunoassay, coagglutination, counterimmunoelectrophoresis and capillary precipitation, latex agglutination, fluorescence microscopy, and inhibition enzyme-linked immunosorbent assay) - εφαρμογή μοριακών μεθόδων για χαρακτηρισμό οροτύπων (J Med Microbiol ;54(Pt 12):1133-8, J Clin Microbiol Jan;40(1):216-26, etc) - δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση του οροτύπου και του γονιδιώματος (διάφοροι ορότυποι μπορούν να ανήκουν στον ίδιο ST τύπο (Jones et al, 2003, capsular switching events) - σημαντική η θέση της MLST στην τυποποίηση [στον άνθρωπο 6 κύρια CCs, CC1, CC10, CC17, CC19, CC23, and CC26 (Sørensen et al., 2010; Da Cunha et al., 2014), ενώ στα βοοειδή είναι οι CC66 και CC67, οι οποίοι ποτέ δεν έχουν βρεθεί στον άνθρωπο)

13

14 Streptococcus agalactiae *o oρότυπος IX βρέθηκε πρόσφατα στη Δανία, Slotved et al, 2007

15 Streptococcus agalactiae Sarah Shabayek and Barbara Spellerberg, 2008 STs 1, 19 και 23 αποικίζουν τις έγκυες γυναίκες (Manning et al, 2008)* CC17 ο οποίος συσχετίζεται με τον ορότυπο ΙΙΙ σχετίζεται με σοβαρές λοιμώξεις (ST17 σε μηνιγγίτιδα) (Jones et al, 2003)* επίσης ο ST1/ ορότυπος V σχετίζεται με σοβαρές λοιμώξεις (Salloum et al, 2011) Επιλογή της μεθοδολογίας τυποποίησης Σε μεγάλης κλίμακας επιδημιολογικές μελέτες εφαρμόζεται MLST με ή χωρίς προσδιορισμό οροτύπου Για σύγκριση στελεχών σε μητέρα-νεογνό εφαρμόζεται PFGE (με ή χωρίς MLST ή οροτυπία) * Παρόμοια επιδημιολογικά δεδομένα και στην Ελλάδα, περίοδος , Diagn Microbiol Infect Dis ;78(4):487-90

16 Streptococcus agalactiae

17 Streptococcus pneumoniae Πού βοηθά η τυποποίηση: εφαρμογή κατάλληλου εμβολίου εκτίμηση αποτελεσματικότητας εμβολίου επιδημιολογία της αντοχής προσδιορισμός πηγής και τρόπου μετάδοσης

18 Streptococcus pneumoniae για δεκαετίες η τυποποίηση βασιζόταν στον χαρακτηρισμό οροτύπων βάσει του πολυσακχαριδικού αντιγόνου του ελύτρου με χρήση ειδικών αντι-ορών (Quellung ή Neufeld) ή αργότερα εφαρμόζοντας PCR-based serotyping methods [Future Microbiol. 2007; 2(2): , PLoS ONE 2012; 7(12) :e50406 ] ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ 1. αδυναμία προσδιορισμού συγγένειας δύο invasive στελεχών σε γενετικό επίπεδο 2. ταυτοποίηση πηγών λοίμωξης 3. capsule switching MLST και PFGE θεωρούνται οι gold standard μέθοδοι (Future Microbiol. 2015; 10(4), ) ΜLST εφαρμόζεται στο Pneumococcal Molecular Epidemiology Network (PMEN), αναπτύχθηκε από τους Enright and Spratt, και μέχρι σήμερα υπάρχουν 9800 διαφορετικοί MLST γονότυποι χρησιμοποιείται για μελέτες τόσο σε τοπικό όσο και σε παγκόσμιο επίπεδο και δεν απαιτείται απομόνωση του στελέχους σε καλλιέργεια

19 Streptococcus pneumoniae

20 Streptococcus pneumoniae Serotype distribution and antibiotic resistance of Streptococcus pneumoniae isolates from 17 Chinese cities from 2011 to 2016 BMC Infect Dis Dec 29;17(1):804 Methods: Serotyping+MLST Conclusions: Prevalent serotypes were 19F (25.7%), 19A (14.0%), 15 (6.8%), 6B (3.6%), 6A (3.0%), and 17 (2.8%). Molecular epidemiological typing demonstrated that S. pneumoniae showed significant clonal dissemination and that ST271 (120, 28.3%), ST320 (73, 17.2%) and ST81 (27, 6.6%) were the major STs. Serotype distribution, antibiotic resistance pattern and molecular characteristics of serogroup 6 Streptococcus pneumoniae isolates collected from Chinese children before the introduction of PCV13. J Glob Antimicrob Resist Dec 20. pii: S (17) Methods: Serotyping+MLST Conclusions: The percentages of serotype 6A, 6B, 6C and 6D among the 215 serogroup 6 isolates were 50.7% (109/215), 36.3% (78/215), 12.6% (27/215) and 0.5% (1/215), respectively. The most common clonal complexes (CCs) were CC3173 (26.5%, 57/215), CC9789 (13.5%, 29/215), CC90 (13.0%, 28/215) and CC902 (8.8%, 19/215)

21 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis διερεύνηση επιδημιών σε τοπικό επίπεδο (PFGE ή ΜLST) παρακολούθηση της παγκόσμιας διασποράς συγκεκριμένων κλώνων (MLST) Σε κάποιες περιπτώσεις απαιτείται συνδυασμός PFGE και MLST Παράδειγμα: Πριν από 2 χρόνια υπήρξε επιδημία VRE στη Χειρουργική Κλινική του ΠΓΝΛ Υπάρχουσα γνώση: στα ελληνικά νοσοκομεία επικρατούν οι κλώνοι ST412, ST203, ST16 και ST17 βανκομυκίνη-ανθεκτικών E. faecium σύμφωνα με μελέτη του 2007

22 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis H εφαρμογή της MLST ήταν αρκετή για να βρεθεί η πηγή μόλυνσης? Η εφαρμογή της PFGE ήταν η ενδεικνυόμενη μέθοδος?

23 Plk

24 Ευχαριστώ πολύ