Organizacija i prika`uvawe imunoglobulinski geni Edna od najizvonrednite osobini na imuniot sistem kaj r betnicite pretstavuva sposobnosta da

Organizacija i prikaùvawe imunoglobulinski geni Edna od najizvonrednite osobini na imuniot sistem kaj r betnicite pretstavuva sposobnosta da odgovori na bezgrani~na grupa tu i protivgeni. Kako {to se sobiraa podatoci za imunoglobulinskata sekvenca (Ig), skoro za sekoe protivtelo koe se prou~uva{e se otkri deka sodrì unikatna sekvenca od amino kiselini vo negovoto varijabilno podra~je, no samo edna od ograni~eniot broj nepromenlivi sekvenci vo negovoto konstantno podra~je. Genskata osnova za ovaa kombinacija od postojanost i golema varijabilnost vo edna proteinska molekula leì vo organizacijata na imunoglobulinskite geni. Vo zarodi{nata linija od DNK, mnogu genski segementi gi kodiraat delovite od edna imunoglobulinska te{ka i lesna veriga. Ovie genski segmenti se nao aat vo zarodi{nite kletki no ne moàt da se prepi{at i prevedat vo celosni verigi dodeka ne se preuredat vo funkcionalni geni. Pri zreeweto na B-kletkite vo koskenata sr`, del od ovie genski segmenti se me{aat po slu~aen izbor vo dinami~kiot genski sistem koj e sposoben za sozdavawe pove}e od 10 kombinacii. Posledovatelnite procesi ja zgolemuvaat raznovidnosta (razli~ieto) za protivtelno vrznite mesta do golem broj koj nadminuva 10. Pri razvojot na B-kletkite, zreeweto na B-kletkata progenitor minuva niz redosled od sekvenci na preureduvawe na Ig genite koi pridonesuvaat za razli~ieto na krajnite produkti. Do krajot na ovoj proces, zrelite, imunokompetentni B kletki }e sodràt kodira~ki sekvenci za edno funkcionalno varijabilno podra~je od te{kite verigi i edno varijabilno podra~je od lesnite verigi. Spored toa, edna B kletka se sozadava so ve}e predodredena specifi~nost. Po protivgenata stimulacija na zrelite B kletki vo perifernite limfoidni organi, ponatamo{noto preureduvawe na genskite segmenti sv konstantnoto podra~je moè da sozdade promeni vo prikaàniot izotip, koj sozdava promeni vo biolo{kite efektorni funkcii na imunoglobulinskata molekula bez da ja menuva nejzinata specifi~nost. Na toj na~in, zrelite B-kletki sodràt hromosomna DNK koja pove}e ne e identi~na so DNK od zarodi{nata linija. Iako smetame deka genomskata DNK e stabilen genski nacrt, limfocitnata kleto~na linija ne zadrùva neo{tetena kopija od ovoj nacrt. Genomskoto preureduvawe pretstavuva osnovna karakteristika na lmfocitnoto diferencirawe, a se pokaà deka ni eden drug vid kletki ne e podloèn na ovoj proces. 1

Ova poglavje prvo ja opi{uva detalnata organizacija na imunoglobulinskite geni, procesot na preureduvawe Ig-genite i mehanizmite preku koi dinami~kiot imunoglobulinski genski sistem sozdava pove}e od 10 razli~ni protivgeni specifi~nosti. Potoa go opi{uva mehanizmot za prevklu~uvawe u klasi, ulogata na diferencijalnoto prerabotuvawe r RNK pri prikaùvaweto na imunoglobulinskite u geni i regulacijata na prepi{uvaweto Ig-genot. Poglavjeto zavr{uva so upotreba na na{eto znaewe za molekulskata biologija na imunoglobulinskite geni do modificirawe protivtelnite molekuli za terapevtska i istraùva~ka primena. Poglavje 11 detalno go opfa}a celiot proces na razvoj na B kletkite od prvoto gensko preureduvawete vo progenitornata B kletka do krajnoto diferencirawe vo pamte~ki B kletki i plazma kletki koi la~at protivtelo. Slika 5-1 dava redosleden pregled na fazite od razvojot na B kletkite, pri {to mnogu od niv se javuvaat kako rezultat na zna~ajnite preureduvawa. (slika-pregled 5-1 Razvoj na B kletka Nastanite koi je javuvaat za vreme zreeweto vo koskenata sr` ne baraat protivgen, dodeka aktiviraweto i diferenciraweto na zrelite B kletki vo perifernite limfoidni organi baraat protivgen. Nazivite migm i migd se odnesuvaat na imunoglobulinite koi se vrzani za membrana. IgG, IgA i IgE se izla~eni imunoglobulini. Sozdavawe genski model koj e kompatibilen so strukturata na Ig Rezultatite od analizata na imunoglobulinskata sekvenca koja e objasneta vo poglavje 4 go otkri brojot na osobini od strukturata na imunoglobulinite {to be{e te{ko da se dobie so klasi~nite genski modeli. Sekoj ostvarliv model na imunoglobulinski geni treba da gi poseduva slednive osobini na protivtelata: Mo{ne raznovidni specifi~nosti na protivtelata Prisustvoto na imunoglobulinot so te{ki i lesni verigi od varijabilnoto podra~je vo amino krajniot i konstantnoto podra~je od karbkislno krajniot del i Postoeweto na izotipovi so ista protivgenska karakteristika, {to se javuva kako rezultat od povrzuvaweto na daden varijabilno podra~je so razli~ni konstantni podra~ja so te{ki verigi. Sprotivstaveni modeli na zarodi{na linija i somatski varijacii za objasnuvawe protivtelnoto razli~ie Vo tekot na nekolku decenii, imunolozite se trudea da zamislat genski mehanizam koj moè da ja objasni golemata raznovidnost vo strukturata na protivtelata. Se pojavija dve razli~ni teorii. Teorijata na zarodi{na linija se zadràa na toa deka genomot od zarodi{nite kletki, jajceto i spermata, sodràt golema grupa imunoglobulinski geni. Spored toa, ovie teorii odgovornosta za raznovidnosta na genite ne ja stavaat vrz nieden poseben genski mehanizam. Tie raspravaat za toa deka opstojuva~koto preìvuvawe na imuniot sistem ja opravduva posvetenosta na zna~aen del od genomot za kodirawe protivtela. Nasproti toa, teorijata za somatska varijacija se drì do toa deka genomot sodrì relativno mal broj imunoglobulinski geni, od koi vo somatskite kletki so mutacii i rekombinacii se sozdavaat golem broj specifi~ni protivtela. Kako {to se utvrdija sekvencite na amino kiselinite od s# pove}e imunoglboulini, stana jasno deka mora da postojat mehanizmi ne samo za sozdavawe raznovidni protivtela tuku i za odrùvawe postojanost. Dali raznovidnosta e sozdadena od zarodi{nite linii ili od somatskite mehanizmi, ostanuva paradoksot: Kako moè da se odrì stabilnosta vo konstantnoto (K) podra~je dodeka odreden vid na mehanizmi za razli~ie go sozdavaat varijabilnoto (V) podra~je? Nitu zastapnicite na teorijata za zarodi{nata linija nitu zastapnicite na teorijata za somatskata varijacija ne moèa da ponudat logi~no objasnuvawe za ovaa centralna karakteristika vo strukturata na imunoglobulinite. Na zastapanicite na zarodi{nata linija im be{e te{ko da gi otkrijat evoluciskite mehanizmi koi moàt da sozdadat raznovidnost vo varijabilniot del od mnogute geni so te{ki i lesni verigi dodeka konstantniot del go odrùvaat nepromenet. Na zastpanicite na somatskata varijacija im be{e te{ko da go izmislat mehanizmot koj varijabilnoto podra~je od genot so edna te{ka i edna lesna veriga moè da go napravi raznoviden bez da dozvoli menuvawe sekvencata na amino kiselinite koi se kodirani vo konstantnoto podra~je. Trettata strukturna karakteristika koja bara objasnuvawe se pojavi koga sekvenciraweto na amino kiselinite od human mielomski protein nare~en Ti1 otkri deka identi~ni sekvenci od varijabilno podra~je se povrzani so gama i mi konstantnite podra~ja od te{kite verigi. Sli~en fenomen be{e zabeleàn kaj zajacite od strana na C. Tod, koj otkri deka odreden alotipen obeleùva~ vo varijabilnoto podra~je od te{kata veriga moè da se povrze so alfa, gama i mi konstantnite podra~ja so te{ki verigi. Zna~itelen dopolnitelen dokaz potvrdi deka edna sekvenca od varijabilno podra~je, koja definira odredena protivgena specifi~nost, moè da se povrze so pove}e sekvenci od konstantnoto podra~je vo te{kata verigi. So drugi zborovi, razli~ni klasi, ili izotipovi, na protivtela (na pr. IgG, IgM) moè da bidat prikaàni so identi~na sekvenca od varijabilnoto podra~je. 2

Drejer i Benet predloìja revolucionaren model so dva geni i eden polipeptid Pri obid da se razvie genski model koj e uporen so poznatite naodi za strukturata na imunoglobulinite, V. Drejer i X. Benet predloìja, vo nivniot klasi~en teoretski napis od 1965 godina, deka dva razli~ni geni kodiraat edna te{ka ili edna lesna veriga od imunoglobulinite, eden gen za V regionot (varijabilnoto podra~je) i drugiot za K regionot (konstantnoto podra~je). Tie tvrdea deka ovie dva geni mora nekako da se se spojat na nivo na DNK za da sozdadat posledovatelna poraka koja moè da se prepi{e i prevede vo edna Ig te{ka ili lesna veriga. Vo toa vreme be{e op{to prifateno deka eden gen kodira eden polipeptid, taka {to nivniot predlog be{e revolucioneren. Pokraj toa, tvrdea deka stotici ili iljadnici geni so V podra~ja se smesteni vo zarodi{nata linija, dodeka postoi samo edna kopija za klasata i podklasata na geni vo K podra~jeto. Silata na ovoj tip na model na rekombinacija (koj kombinira elementi od teoriite za zarodi{na linija i somatska varijacija) se sostoe{e vo toa {to toj se odnesuva{e na onie imunoglobulin vo koi edno V podra~je se kombinira so razli~ni K podra~ja. So predlagawe eden gen so postojano podra~je za sekoj klasa i potklasa na imunoglobulini, modelot isto taka ovozmoùvawe za~uvuvawe neophodnite biolo{ki efektorni funkcii dodeka ovozmoùva evoluciska diversifikacija na geni so promenlivi podra~ja. Na po~etokot, poddr{kata za hipotezata na Drejer i Benet be{e indirektna. Prvite prou~uvawa na DNK hibridizaciskata kinetika so upotreba na radioaktivna proba na DNK za konstantnoto podra~je ukaà na faktot deka modelot hibridiziral samo so eden ili so dva geni, potvrduvaj}i go predviduvaweto na modelot samo so edna ili so dve kopii od sekoja klasa ili potklasa na genot vo konstantnoto podra~je. Sepak, indirektniot dokaz ne be{e dovolen za nadminuvawe èstokiot otpor vo nau~nata zaednica za hipotezata na Drejer i Benet. Tvrdeweto deka dva geni kodiraat eden polipeptid se sprotivstavuva{e na principot eden gen eden polipeptid i be{e bez prethoden primer vo biolo{kite sistemi. Kako {to ~esto se slu~uva vo naukata, teoretskoto i intelektualnoto sfa}awe za organiziraweto na Ig-genite napreduva{e zaedno so dostapnata metodologija. Iako modelot na Drejer i Benet ovozmoì teoretska ramka za re{avawe dilemata pome u podatocite za sekvencata na Ig i organizacijata na genite, vistinskoto priznanie na nivnata hipoteza treba{e da ~eka nekolku zna~ajni tehnolo{ki napredoci vo poleto na molekulskata biologija. [okot na Tonegava - imunoglobulinskite geni se preureduvaat Vo 1976 godina, S. Tonegava i N. Hocumi go otkrija prviot direkten dokaz deka oddelni geni gi kodiraat V i K podra~ja vo imunoglobulinite i deka genite se preureduvaat za vreme na B-kleto~no diferencirawe. So selektirawe DNK od emrbionski kletki i mielomska kletka od vozrasno lice - kletki so dosta razli~na faza na razvoj - Tonegava i Hocumi koristea razli~ni restrikciski endonukleazi za sozdavawe DNK fragmenti. Potoa fragmentite gi dvoea po golemina i ja analiziraa nivnata sposobnost da hibridiziraat so radioozna~ena proba od mrnk. Dva razli~ni restrikciski fragmenti od DNK na embrionot hibridiziraa so mrnk, dodeka samo eden restrikciski fragment od mielomskata DNK od vozrasno lice hibridizira{e so istiot model. Tonegava i Hocumi tvrdea deka pri diferencijata na limfocitite od embrionska sostojba do faza na celosno diferencirawe na plazma kletkite (vo nivniot sistem pretstaveni so mielomski kletki), V i K genite pretrpuvaat preureduvawe. Vo embrionot, V i K genite sodràt golem segment od DNK koj sodrì restrikcisko endonukleazno mesto. Pri diferencirawe, V i K genite se spojuvaat, a sekvenca na DNK pome u nive se otstranuva. Ovaa rabota go promeni poleto na imunologija, a vo 1987 godina, Tonegava dobi Nobelova nagrada. Prvite eksperimenti na Tonegava i Hocumi pretstavuvaa naporna i dolga postapka koja od toga{ navamu e zameneta so dosta pomo}eniot pristap so analiza na boeweto na Sadernovi damki. Ovoj metod, koj sega sestrano se koristi za ispituvawe i preureduvawe imunoglobulinskite geni, ja eliniminira potrebata za eluirawe (izdvojuvawe) odvoeni DNK restrikciski fragmenti od par~iwata gel pred da se analizira so hibridizacija so probi od imunoglobulinskite genski segmenti. Slika 5-2 go prikaùva otkrivaweto na preureduvaweto vo lokusot na kapa lesnata veriga vo sporedba so fragmetite dobieni so razgraduvawe na DNK od klon na B kletki so oblikot tie dobieni so razgraduvawe na Ne-B kletki (na primer, sperma ili crnodrobni kletki). Preureduvaweto na V genite bri{e dolg del od DNK vo zarodi{nata linija, pri toa sozdava razliki pome u preuredenite i nepreuredenite Ig lokusi vo raspredelbata i brojot na restrikciskite mesta. Ova doveduva do sozdavawe razli~ni restrikciskite oblici od preuredenite i nepreuredenite lokusi. Zgolemenata upotreba na ovoj pristap pokaà deka dvogenskiot model na Drejer i Benet, pri {to edniot gen kodira varijabilno podra~je a drugiot gen kodira konstantno podra~je, se odnesuva na genite i so te{ki i so lesni verigi. (slika-5-2 Eksperimentalna osnova za dijagnoza na preureduvawe imunoglobulunskoto podra~je. Brojot i goleminata na restrikciskite fragmenti koi se sozdavaat pri tretiraweto na DNK so restrikciski enzim se odredeni od sekvencata na DNK. Digestijata na preuredenata DNK so restrikciskiot enzim (RE) dava oblik na restrikciski fragmenti koi se razlikuva od tie koi se dobivaat so digestija na nepreuredenoto podra~je so istiot RE. Obi~no, fragmentite se analiziraat so tehnikata na Sadernovi damki (blotirawe). Vo ovoj primer, probata {to go vklu~uva J segmentot se koristi za identifikacija na RE razgradenite fragmenti koi gi vklu~uvaat site ili del od ovoj segment. Kako {to e prikaàno, preureduvaweto doveduva do otse~uvawewe segment od DNK vo zarodi{nata linija i gubitok na restrikciskite mesta. Isto taka ima rezultat i vo spojuvaweto na genskite segmenti, vo ovoj slu~aj V i J segmentot, koi se odvoeni vo zarodi{nata linija. Spored toa, fragmentite koi zavisat od prisustvoto na ovoj segment za nivnoto sozdavawe se otsutni so restrikciskoto enzimsko razgraduvawe na DNK od preuredeniot lokus. Pokraj toa, preuredenata DNK sozdava novi fragmenti koi se nema po digestijata na DNK vo od zarodi{nata linija. Ova moè da bide korisno zatoa {to i B kletkite i ne-b kletkite imaat dva imunoglobulinski lokusii. Edna od niv se preureduva, a drugiot ne se preureduva. Spored toa, dodeka ne se slu~i genetska nesre}a koja }e dovede do zaguba na lokusot vo zarodi{nata linija, digestijata na DNK od mielomskiot ili od B kleto~niot klon }e sozadade oblik na restrikcija {to gi vklu~uva site klonovi dobieni so digestijata no zarodi{nata linija plus koj bilo nov fragment koj se nastanuva od promenata DNK sekvenca vo koja nstanalo preureduvawe. Zabeleète deka prikaàn e samo eden od prisutnite J genski segmenti. 3

Pove}egenska organizacija na Ig genite Kako {to privr{uva{e r kloniraweto i sekvenciraweto na DNK so te{ki i lesni verigi, be{e otkriena u{te pogolema kompleksnost od kolku {to be{e predvideno od Drejer i Benet. Kapa i lambda lesnite i te{kite verigi se kodirani od oddelni pove}egenski familii postaveni vo razli~ni hromozomi (tabela 5-1). Vo DNK od zarodi{nata linija, sekoja od ovie pove}egenski familii sodrì nekolku kodira~ki sekvenci, nare~eni genski segmenti, odvoeni so nekodira~kite podra~ja. Pri zreeweto na B kletkite, ovie genski segmenti se preureduvaat i spojuvaat za da formiraat funkcionalni imunoglobulinski geni. Sekoja pove}egenska familija ima razli~ni osobini Familiite na kapa i lambda lesnite verigi sodràt V,JiKgenskisegmenti, preuredenite VJ segmenti go kodiraat varijabilnoto podra~je od lesnite verigi. Familijata na te{kite verigi sodrì V, D, J i K genski segmenti, preuredenite VDJ genski segmenti go kodiraat varijabilnoto podra~je od te{kata veriga. Vo sekoja familija na geni, K genski segmenti gi kodiraat konstantnite podra~ja. Pred sekoj V genski segment koj e postaven na negoviot 5prim krajot predhodi mal egzon koj kodira kratok signal ili liderski (L) peptid koj gi vodi te{kata i lesnata veriga niz endoplazmatskiot retikulum. Signalniot peptid se oddeluva od prvobitnite te{ki i lesni verigi pred rdkompletiraweto na imunoglobulinskata u molekula. Spored rd toa, amino kiselinite koi se kodirani od ovaa lider sekvenca ne se pojavuvaat vo zavr{nata imunoglobulinska molekula. Pove}egena familija od lambda - veriga Prviot dokaz deka varijabilnoto podra~je od lesnata veriga vsu{nost e kodirano od dva genski segmenti se pojavi koga Tonegava ja klonira{e DNK od zarodi{nata linija koja go kodira varijabilnoto podra~je na lambda lesnata veriga od glu{ecot i ja odredi celosnata negova nukleinska sekvenca. Koga nukleinskata sekvenca be{e sporedena so poznatata sekvenca na amino kiselini od varijabilnoto podra~je na lambda - verigata, se zabeleà neobi~no nespovpa awe. Iako prvite 97 amino kiselini od varijabilnoto podra~je na lambda - verigata odgovaraa na sekvencata od nukleinskiot kodon, 13 karboksilno krajni amino kiselini od varijabilnoto podra~je na proteinot ne odgovaraa. Se ispostavi deka mnogu bazni podalku, osobeno, 39-bp genski segment, nare~en J za spojuvawe, gi kodira ostanatite 13 amino kiselini od varijabilnoto podra~je na lambda verigata. Spored toa, funkcionalnoto varijabilno podra~je od lambda verigata sodrì dva kodira~ki segmenti, 5 V segment i 3 J segment, koi se odvoeni so nekodira~ka sekvencaod DNK vo nepreuredena DNK od zarodi{nata linija. Pove}egenskata lmbda familija vo gluv~e{kata zarodi{na linija sodrì dva V lambda genski segmenti, tri funkcionalni J lambda genski segmenti i tri funkcionalni K lambda genski segmenti (slika 5-3a). Dopolnitelno na funkcionalnite verzii od ovie geni, nekoi formi se psevdogeni, defektni geni koi se nesposobni za kodirawe protein, takvite geni se ozna~eni so gr~kata bukva psi (ψ). Interesno e toa {to, J lambda 4 partnerot vo konstantnoto podra~je, K lambda 4, pretstavuva sovr{eno funkcionalen gen. V lambda i trite J lambda funkcionalni genski segmenti go kodiraat varijabilnoto podra~je od lesnata veriga, a sekoj od trite funkcionalni K lambda genski segment go kodira konstantnoto podra~je na eden od tritte podtipovi na lambda - lesnata veriga (lambda1, lambda2 i lambda3). Kaj lu eto, lambda lokusot e pokompleksen. Postojat 30 funkcionalni V lambda genski segmenti, ~etiri funkcionalni J lambda segmenti i sedum K lambda segmenti, pri {to samo ~etiri od niv se funkcionalni. Vo odnos na funkcionalnite genski segmenti, lambda kompleksot kaj lu eto sodrì mnogu V lambda ij lambda psevdogeni. Pove}egenska familija na kapa - veriga Pove}egenskata kapa familija voglu{ecot sodrì pri`bli`no 85 V kapa genski segmenti, sekoj so sosedna liderska dr sekvenca na po~etokot so kratko rastojanie (t.e. na 5 stranata). Ima pet J kapa genski segmenti (edniot od niv e nefunkcionalen psevdogen) i eden K kapa genski segment (slika 5-3b). Kako i vo pove}egenskata lambda familija, V kapa ij kapa genskite segmenti go kodiraat varijabilnoto podra~je na kapa lesnata veriga, a K kapa genskiot segment go kodira konstantnoto podra~je. Bidej}i ima samo eden K kapa genski segment, nema podtipovi na kapa lesnite verigi. Sporedbata na delovite a i b na slika 5-3 pokaùva deka rasporedot na genskite segmenti e dosta razli~en vo familiite kapa i lambda geni. Pove}egenskata familija na kapa verigata kaj lu eto, koja ima organizacija sli~na na onaa kaj glu{ecot, sodrì pribli`no 40 V kapa genski segmenti, pet J kapa segmenti i eden K kapa genski segment. 4

Pove}egenska familija na te{kite verigi Organizacijata na imunoglobulinskite geni od te{kata veriga e sli~na na, no dosta posloèna od, organizacijata na genite od kapa i lambda lesnite verigi (slika 5-3v). Dopolnitelen genski segment kodira del od varijabilnoto podra~je vo te{kata veriga. Na postoeweto na ovoj genski segment najprvo be{e ukaàno od strana na Liroj Hud i negovite kolegi, koi ja sporedija skvencata na amino kiselinite od varijabilnoto podra~je na te{kata veriga so V T ij T nukleinskite sekvenci. Se otkri deka V T genskiot segment gi kodira amino kiselinite od 1 do 94 a J T genskiot segment gi kodira amino kiselinite od 98 do 113. Sepak, nitu eden od ovie genski segmenti ne nose{e informacija za kodirawe amino kiselinite od 95 do 97. Koga se utvrdi nukleinskata sekvenca za preuredenata DNK od mielomot i se sporedi so sekvencata na DNK od zarodi{nata linija, be{e zabeleàna dopolnitelna nukleinska sekvenca pome u V T ij T genskite segmenti. Ovaa nukleinska sekvenca odgovara{e na amino kiselinite 95 do 97 od te{kata veriga. Od ovie rezultati, Hud i negovite kolegi tvrdea deka tret genski segment od zarodi{nata linija mora da im se pridruì na V T ij T genskite segmenti koi go kodiraat celoto varijabilno podra~je vo te{kata veriga. Ovoj genski segment, koj gi kodira{e amino kiselinite vo tretoto komplementarno determinira~ko podra~je (KDR3), be{e ozna~en so D za raznovidnost (diversity), poradi negoviot pridones vo sozdavaweto raznovidni protivtela. Tonegava i negovite kolegi go lociraa D genskiot segment vo DNK od zarodi{nata linija na glu{ecot so proba od kdnk (klonirana DNK) komplementarna za D podra~jeto, koja hibridizira{e so veriga od DNK koja se prostira pome u V T ij T genskite segmenti. Pove}egenskata familija od te{kata veriga vo hromozomot 14 kaj lu eto e prikaàna so direktno sikvencionirawe DNK i sodrì 39 V T genski segmenti locirani na krajot od grupata na 29 funkcionalni D T genski segmenti. Kako i kaj genite od lesnite verigi, pred sekoj V T genski segment se nao a liderska sekvenca na kratko rastojanie nagore. Podolu od D T genskiot segment se nao aat {est funkcionalni J T genski segementi, po koi sledi serija od K T genski segmenti. Sekoj K T genski segment go kodira konstantnoto podra~je od imunoglobulinskiot izotip od te{kata veriga. K T genskite segmenti se sostojat od kodira~ki egzoni i nekodira~ki introni. Sekoj egzon kodira razli~en domen na postojan podra~je od te{kata veriga. Sli~na organizacija na genite od te{ka veriga ima kaj glu{ecot. Za~uvuvaweto na zna~ajni biolo{ki efektorni funkcii na protivtelnata molekula se odrùva preku ograni~eniot broj geni so konstantni podra~ja od te{kite verigi. Kaj lu eto i gluvcite, K T genskite segmenti se uredeni redosledno K mi,k delta,k gama,k epsilon,k alfa (vidi slika 5-3v). Ovoj redosleden raspored ne e slu~aen. Vo osnova e povrzan so redoslednoto prikaùvawe na klasite na imunoglobulinite pri razvojot na B kletkite i prvi~niot IgM odgovor na B kletkata kon nejziniot prv kontakt so protivgenot. (pregled slika 5-3 Organizacija na genskite segmenti od zarodi{nata linija na imunoglobulinite kaj glu{ecot (a) lambda lesna veriga, (b) kapa lesna veriga i (v) te{ka veriga. Lambda i kapa lesnite verigi se kodirani so V, J i K genski segmenti. Rastojanijata vo kilobazi (kb) koi gi oddeluvaat razli~nite genski segmenti vo DNK od zarodi{nata linija kaj glu{ecot se prikaàni dolu pod sekoj dijagram. 5

Gensko preureduvawe vo varijabilnoto podra~je Predhodnite delovi ni pokaàa deka funkcionalnite geni koi gi kodiraat te{kite i lesnite verigi od imunoglobulinite se spoeni od rekombinaciite koi se slu~uvaat na nivo na DNK. Ovie nastani i paraleni nastani koi gi vklu~uvaat T kleto~nite geni, se edinstveno poznatite preureduvawa na DNK na specifi~no mesto kaj r betnicite. Preureduvawata na genite vo varijabilno podra~je se slu~uva po opredeln redosled za vreme na zreeweto na B-kletkite vo koskenata sr`. Prvo se preureduvaat genite od varijabilno podra~je vo te{kite verigi, potoa se preureduvaat genite vo varijabilno podra~je od lesnite verigi. Na kraj od ovoj proces, sekoja B kletka sodrì edna funkcionalna sekvenca na DNK od varijabilnoto podra~je za te{kata veriga i u{te edna za lesnata veriga. Procesot na gensko preureduvawe vo varijabilno podra~je sozdava zreli, imunokompetentni B kletki. Sekoja vakva kletka e posvetena da sozdade protivtelo so vrzuva~ko mesto kodirano od opredelena sekvenca na negovite preuredeni V geni. Kako {to e objasneto ponatamu vo ova poglavje, preureduvawata na genite vo varijabilno podra~je od te{kite verigi, proces nare~en prevklu~uvawe, }e sozdade ponatamo{ni promeni vo imunoglobulinskite kali (izotipovi) prikaàni vrz B kletkata, no tie promeni nema da vlijaat na dobienata protivgena specifi~nost. êkorite na preureduvawe genot vo varijabilno podra~je se pojavuvaat vo opredelen redosled, no za celite na ovaa diskusija moè da se smetaat kako sekvenci po slu~aen izbor kako rezultat na slu~ajno opredeluvawe B kleto~na specifi~nost. Redosledot, mehanizamot i posledicite od ovie preureduvawa se objasneti vo ova poglavje. (slika 5-4 Gensko preureduvawe na kapa lesnata veriga i stapkite na RNK prekrojuvawe (obrabotka) potrebni za sozdavawe protein za kapa lesnata veriga. Vo ovoj primer, preureduvaweto gi spojuva V kapa 23 i J kapa 4. DNK od lesnata veriga pretrpuva preureduvawe na V-J Prikaùvaweto na kapa i lambda lesnite verigi bara preureduvawe varijabilnoto podra~je od V i J genskite segmenti. Kaj lu eto, koi bilo funkcionalni V lambda geni moè da se kombiniraat so koj bilo od ~etirite funkcionalni J lambda -K lambda kombincii. Kaj gluvcite, rabotite se malku po komplicirani. Preureduvaweto na DNKmoèdagispoiV lambda 1 genskiot segment ili so J lambda 1ilisoJ lambda 3 genskiot segment, ili V lambda 2 genskiot segmentmoèdasespoisoj lambda 2 genskiot segment. Kaj DNK od kapa lesna veriga kaj lu eto i gluvcite, koj bilo od V kapa genskite segmenti moè da se spoi so koj bilo funkcionalen J kapa genski segment. Preuredenite kapa i lambda geni gi sodràt slednive podra~ja po redosled od 5 kon 3 krajot: kratok liderski (L) egzon, nekodira~ka sekvenca (intron), povrzan VJ genski segment, vtor intron i konstantno podra~je. Pred sekoj liderski genski segment ima promoterska sekvenca. Preuredenata sekvenca od lesna veriga se prepi{uva od strana na RNK polimeraza od L egzonot preku K segmentot do stop signalot (prekinuva~kiot signal), sozdavaj}i prvi~en RNK zapis od lesnata veriga (slika 5-4). Intronite vo prvi~niot zapis se otstranuvaat so RNK procesira~kite enzimi, a dobienata lesno veri`na mesinxer RNK (mrnk) go napu{ta jadroto. mrnk od lesnata veriga se vrzuva za ribozomite i se preveduva vo lesno verièn protein. Liderskata sekvenca od amino krajniot del od raste~kata polipeptidna veriga se protega do prostorot vo grubiot endoplazmatski retikulum, se se~e, taka {to ne e prisutna vo krajniot proteinski produkt od lesnata veriga. 6

(slika 5-5 Gensko preureduvawe te{ki verigi i prerabotuvawe RNK potrebni za sozdavawe kraen protein so te{ki verigi mi ili delta. Potrebni se dve DNK spojuvawa za da se sozdade funkcionalen gen za te{kata veriga: povrzuvawe D T so J T i spojuvawe V T so D T J T.Vo ovoj primer, spoeni se V T 21, D T 7iJ T 3. Prikaùvaweto funkcionalni geni za te{ka veriga, iako e sli~no na prikaùvaweto na lesnite verigi, vklu~uva diferencirano prerabotuvawe RNK, koe sozdava nekolku razli~ni produkti, vklu~uvaj}i mi i delta te{ki verigi. Sekoj K (C) gen e nacrtan kako edna kodira~ka sekvenca. Vo realnosta, sekoj gen e organiziran kako serija egzoni i introni. DNK od te{kata veriga pretrpuva r preureduvawa na V-D-J Sozadavaweto funkcionalen imunoglobulinski gen za te{kata veriga bara dva oddelni procesi preureduvawe vo varijabilnoto podra~je. Kako {to e prikaàno na slika 5-5, D T genskiot segment prvo se spojuva so J T genskiot segment za da sozdade ednica V T D T J T koja go kodira celoto varijabilno podra~je. Vo DNK od te{kata veriga, preureduvawata vo varijabilnoto podra~je sozdava preureden gen koj se sostoi od slednive sekvenci, po~nuvaj}i od 5 krajot: kratok L egzon, intron, povrzan VDJ segment, drug intron i serija K genski segmenti. Kako i kaj genite za lesni verigi, promoterskata sekvenca e smestena na nagorno so kratko rastojanie od sekoja lider sekvenca za te{kata veriga. [tom zavr{i genskoto preureduvawe, DNK polimerazata moè da se vrze za promoterskata sekvenca i da go prepi{e celiot gen od te{kata veriga, klu~uvaj}i gi intronite. Na po~etokot, se prepi{uvaat istovremeno i K mi ik delta genskiot segment. Diferenciskata poliadinilacija i prekrojuvaweto na RNK gi otstranuva intronite i se obrabotuva prvi~niot mrnk zapis vklu~uvaj}i go prepi{uvaweto ili na K mi ili na K delta. Potoa ovie dve mrnk se preveduvaat, a liderot peptid od prvobitniot polipeptid se otse~uva, sozdavaj}i zavr{eni mi i delta verigi. Sozdavaweto dve razli~ni mrnk so te{ka veriga $ ovozmoùva na zrelata, imunokompetentna B kletka da prikaùva i IgM i IgD so identi~na protivgena specifi~nost vrz nivnite povr{ini. 7

Mehanizam za preureduvaweto DNK vo varijabilnoto podra~je Sega koga gi vidovme rezultatite od gensko preureduvawe vo varijabilno podra~je, ajde detelno da ispitame kako ovoj proces se slu~uva pri zreeweto B kletkite. Rekombinaciskite signalni sekvenci ja upravuvaat rekombinacijata Otkritieto na dve tesno povrzani naglaseni sekvenci vo DNK so te{ka veriga od zarodi{nata linija go is~isti patot za potpolno razbirawe mehanizmot za gensko preureduvawe. Prou~uvawata na sekvenciraweto na DNK go otkrija prisustvoto na unikatni rekombinaciski signalni sekvenci (RSS) koi go opkruùvaat sekoj V, D i J genski segment od zarodi{nata linija. Edna RSS e lociran na 3 vo sekoj V genski segment, 5 vo sekoj J genski segment i na dvete strani od sekoj D segment. Ovie sekvenci funkcioniraat kako signali za procesot na rekombinacija koj gi podreduva genite. Sekoj RSS sodrì konzerviran palindromen heptamer i konzervirana sekvenca bogata so AT nonamer odvoena so edna vmetnata sekvenca od 12 do 23 bazni parovi (slika 5-6a). Vmetnatite 12 do 23 bp sekvenci odgovaraat, na edno i dve svrtuvawa na DNK spiralata. Poradi ovaa pri~ina sekvencite se nare~eni ednokratna rekombinaciska signalna sekvenca i dvokratna rekombinaciska signalna sekvenca. V kapa signalnata sekvenca ima ednokraten razdeluva~, a J kapa signalnata sekvenca ima dvokraten razdeluva~. Kaj DNK za lambda lesnata veriga, ovoj redosled e obraten. Taka {to, V lambda signalnata sekvenca ima dvokraten razdeluva~, a J lambda signalnata sekvenca ima ednokraten razdeluva~. Kaj DNK od te{kite verigi, signalnite sekvenci na V T ij T genskite segmenti imaat dvokraten razdeluva~, signalite na sekoja strana od D T genskite segmenti ima ednokraten razdeluva~ (slika 5-6b). Signalnite sekvenci koi imaat ednokraten razdeluva~ moè da se spojat samo so sekvenci koi imaat dvokraten razdeluva~ (t.n. ednokratno/dvokratno pravilo). Ova pravilo na spojuvawe obezbeduva, na primer, deka VL segmentot se spojuva samo so JL segment a ne so drug VL segment. Praviloto isto taka obezbeduva b V T, D T, J T segmentite da se spojuvaat vo pravilen redosled i da ne se spojuvaat segmenti od ist tip. (slika 5-6 Dve konzervirani sekvenci DNK za lesnata i za te{kata veriga funkcioniraat kako rekombinaciski signalni sekvenci (RSS). (a) I dvete signalni sekvenci se sostojat od konzerviran palindromen heptamer i konzerviran nonamer bogat so AT. Tie se odvoeni so nekonzerviran razdeluva~ od 12 do 23 bazni parovi. (b) Dvata tipa na RSS- nare~eni ednokraten RSS i dvokraten RSS - imaat karakteristi~ni lokacii vo lambda- verigata, kapa verigata i vo DNK za te{kata veriga vo zarodi{nata linija. Pri preureduvaweto DNK, genskite segmenti koi se sosedi na ednokraten RSS moè da se svrzat samo so segmenti bliski na dvokraten RSS. 8

Genskite segmenti se povrzuvaat so rekombinazi Rekombinacijata na V-(D)-J, koja seslu~uvaprispojuvawata pome u RSS i kodira~kite sekvenci, e katalizirana od enzimi koi zaedno se nare~eni V(D)J rekombinazi. Utvrduvaweto na eznimite koi ja kataliziraat rekombinacijata na genskite segmenti V, D i J zapo~na vo kasnite 80-ti godini od dvaesettiot vek i trae s#u{te. Vo 1990 godina Dejvid [atc. Marxori Otinger i Dejvid Baltimor bea prvite koi go objavija utrduvaweto na dva rekombinacija aktivira~ki geni, nare~eni RAG-1 i RAG-2, ~ii kodirani proteini se odnesuvaat sinergisti~ki i se potrebni da ovozmoàt povrzuvawe V-(D)-J. Proteinite RAG-1 i RAG-2 se edinstvenite proizvodi od limfoidno specifi~ni geni koi se vklu~eni vo preureduvaweto V-(D)-J. Rekombinacijata na genskite segmenti od varijabilno podra~je se sostojat od slednive ~ekori, katalizirani po sistem na rekombinazni enzimi (slika 5-7): Po prepoznavaweto na rekombinaciski signalni sekvencite (RSS) od rekombinaznite enzimi, sledi sinapsa vo koja dvete signalni sekvenci i sosednite kodira~ki sekvenci (genski segmenti) se spojuvaat so kraevite. Se~ewe na edna veriga od DNK so RAG-1 i RAG-2 na spojnicite od signalnite sekvenci i kodira~kite sekvenci. Reakcija katalizirana od strana na RAG-1 i RAG-2 vo koja slobodnata grupa 3 -ON na presekot od DNK ja napa a fosfodiesterskataf vrska koja go povrzuva sprotivniot kraj od signalnata sekvenca, vo isto vreme sozdavaj}i {nolesta struktura na prese~eniot kraj od kodira~kata sekvenca i ramniot, 5 fosforiliran dvojno verièn presek vo signalnata sekvenca. Se~eweto {nolestata struktura sozdava mesta za dodavawe nukleotidi od P-podra~jeto, sledeno so opremuvawe nekolku nukleotidi od kodira~kata sekvenca so ednoveri`na endonukleaza. Dodavawe do 15 nukleotidi, nare~eni nukleotidi od N-podra~jeto, na prese~enite delovi od V, D i J kodira~kite sekvenci od te{kata veriga so enzimot terminalnata deoksinukleotidna transferaza. Popravkata i povrzuvawe na kodira~kite sekvenci i povrzuvawe signalnite sekvenci, katalizirani so normalni dvoveri`ni enzimi za reparacija na prekinot (DVRP) (slika 5-7 Prikaàn e model so V kapa i J kapa koj go objasnuva op{tiot proces na rekombinacija imunoglobulinskite genski segmenti. (a) Otstranuva~ko spojuvawe nastanuva koga genskite segementi koi treba da se povrzat imaat ista prepi{uva~ka nasoka (pokaàno so horizontalnite sini strelki). Ovoj proces dava dva produkti: preuredena VJ edinica koja gi vklu~uva proivodite od kodnata vrska i trkalezniot otse~en produkt koj se sostoi od rekombinaciska signalna sekvenca (RSS), signalno povrzuvawe i vmetnata DNK. (b) Prevrteno povrzuvawe se javuva koga genskite segmenti imaat sprotivna prepi{uva~ka nasoka. Vo ovoj slu~aj, za~uvani se RSS, signalnoto povrzuvawe i vmetnatata DNK, a orientacijata na eden od povrzanite segmenti e prevrtena. I vo dvata slu~ai na rekombinacija, nekolku nukleotidi moè da bidat otse~eni ili dodadeni na prese~enite kraevi od kodnite sekvenci pred tie da se povrzat povtorno. 9

Rekombinacijata doveduva do sozdavawe koden spoj, koj se nao a pome u kodira~kite sekvenci i signalen spoj, pome u RSS. Prepi{uva~kata orientiranost na genskite segmenti koi treba da se spojat ja odreduvaat sudbinata na signlaniot spoj i vmetnatata DNK. Koga dvata genski segmenti se so ista prepi{uva~kata nasoka, povrzuvaweto doveduva do otstranuvawe na signalniot spoj i vemtnatat DNK vo vid na trkalezno otse~uvawe (slika 5-8). Poretko, dvata genski segmenti imaat sprotivna nasoka. Vo takov slu~aj povrzuvaweto se slu~uva so prevrtuvawe na DNK, {to doveduva do za~uvuvawe i na kodira~kiot i na signalniot spoj (i vmetnatata DNK) vo hromozomot. Vo ~ovekoviot kapa lokus, okolu polovina od V kapa genskite segmenti se prevrteni vo odnos na J kapa i zatoa nivnoto spojuvawe se ostvaruva so prevrtuvawe. (slika 5-8 Trkalezna DNK izolirana od timocitite vo koja DNK kodiranite verigite od T-kleto~niot receptor (TKR) pretrpuvaat preureduvawe sli~en na toj od imunoglobulinskite geni. Izolacija na ovoj trkalezen otse~en produkt e direkten dokaz za mehnizmot na otstranuva~ko otse~uvawe prika`an na slika 5-7. 10

Preureduvaweto na imunoglobulinskite geni moè da bide produktivno ili neproduktivno Edna od zna~ajnite karakteristki na rekombinacijata na gen-segment e raznovidnosta na kodira~kite spoevi koi se sozdavaat pome u koi bilo dva genski segmenti. Iako dvoveri`nite DNK prekini koi go zapo nuvaat preureduvaweto na V-(D)-J se ostvaruvaat precizno na spojnicata od signalnite segmenti i kodira~kite sekvenci, posledovatelnoto spojuvawe na kodira~kite sekvenci ne e precizno. Spojuva koto razli ie vo V-J I vo V-D-J kodira kite spojnici se ostvaruva so brojni mehanizmi: varijacii vo se~eweto na {nolata za sozdavawe P-nukleotidi, varijacija vo se eweto na kodira~kite sekvenci, varijacii vo dodavaweto na N-neukletodite i fleksibilnost pri povrzuvaweto kodnite sekvenci. Vnesuvaweto slu~ajnost vo povrzuva~kite procesi pomaga da se sozdadat raznovidni protivtela so u estvo na hiperpromenlivosta na protivgen vrzuva koto mesto. (Ovoj fenomen e podetalno objasnet ponatamu vo delot za sozdavawe raznovidni protivtela). (slika 5-9 Svrzna fleksibilnosta na genskite segmenti od imunoglobulinite e prikaàna so V kapa i J kapa. Faznoto povrzuvawe (strelki 1, 2 i 3) sozdava produktivno preureduvawe, koe moè da se prevede vo protein. Nefaznoto povrzuvawe (strelki 4 i 5) vodi kon neproduktivno preureduvawe koe sodrì stop kodoni i ne se preveduva vo protein. Druga posledica od nepreciznoto svrzuvawe e toa {to genskite segmenti moè da se povrzat nadovor od fazata, taka {to ramkata za itawe tripleti za preveduvawe ne e so uvata. Pri takvo neproduktivno preureduvawe, dobienite edinki VJ i VDJ verojatno sodràt brojni sopira~ki (stop) kodoni, koi go prekinuvaat preveduvaweto (slika 5-9). Koga genskite segmenti se povrzuvaat vo faza, ramkata na ~itawe e za~uvana. Pri takvo produktivno preureduvawe, edinicite VJ i VDJ koi se javuvaat moàt da se prevedat celosno, {to }e sozdade celosno protivtelo. Ako eden alel se preuredi neproduktivno, B kletkata s#u{te }e moè produktivno da go preuredi drugiot alel. Ako vo tekot na fazata ne se sozdadat geni so te{ki i lesni verigi, B kletkata umira so apoptoza. Proceneto e deka samo eden od tri obidi pri povrzuvaweto V L ij L i eden pri tri obidi za povrzuvawe V T -D T J T, se produktivni. Kako rezultat na toa, pomalku od 1/9 (11%) od pred-b klekite vo rana faza vo koskenata sr` se razvivaat do zrelost i koskenata sr` ja napu{taat kako zreli imunokompetentni B kletki. 11

(slika 5-10 Poradi alelskoto isklu~uvaweto, imunoglobulinskite geni za te{kite i za lesnite verigi od samo eden roditelski hromozom se prikaàni po }elija. Procesot obezbeduva B kletkite da poseduvaat edna protivgena specifi~nost. Alelot koja e izbran za preureduvawe e izbran po slu~aen izbor. Spored toa, prikaàniot imunoglobulin moè da sodrì edna veriga od majkata i eden veriga od tatkoto ili i dvete verigi moè da se dobijat samo od eden roditel. Samo B i T kletkite imaat alelsko isklu~uvawe. Yvezdi~kata (*) gi ozna~uva prikaànite aleli. Alelskoto isklu~uvawe obezbeduva edine na protivgena specifi~nost B kletkite, kako i site somatski kletki, se diploidni i sodràt hromozomi i od majkata i od tatkoto. Iako B kletkata e diploidna, taa prikaùva preuredeni geni so te{ki verigi samo od eden hromozom i preuredeni geni za lesnata veriga od samo eden hromozom. Procesot so koj se postignuva ova, nare~en alelsko isklu~uvawe, obezbeduva funkcionalnite B kletki nikoga{ oa ne treba da sodràt pove}e oeeodod edna edinica V T TD T J T i edna edinica V L J L (slika 5-10). Ova, se razbira, e neophodno za protivgenata specifi~nost na B kletkata, bidej}i prikaùvaweto na dvata aleli B keltkata }e ja napravi pove}especifi~na. Fenomenot alelsko isklu uvawe ukaùva na faktot deka {tom se pojavat produktivnite preureduvawa na V T D T J T i V L J L, ma{inerijata za rekombinacija e isklu~ena za da ne se prikaàt geni so te{ki i lesni verigi od homolognite hromozomi. 12

G. D. Jankopulos i F. V. Alt ponudija model koj se odnesuva na alelskoto isklu uvawe (slika 5-11). Tie tvrdea deka {tom se postigne produktivno preureduvawe, rurdu negoviot kodira~ki protein se prikaùva, a prisustvoto na ovoj protein dejstvuva kako signal za spre~uvawe ponatamo{no gensko preureduvawe. Spored nivniot model, prisustvoto na mi te{kite verigi i signalizira na B kletka koja sozreva da go isklu~i preureduvaweto na drugiot alel so te{ki verigi i da go vklu~i preureduvaweto na genite so kapa lesnite verigi. Ako se pojavi produktivno kapa preureduvawe, se zozdavaat kapa lesni verigi, a potoa se spojuvaat so mi te{kite verigi za da formiraat kompletna protivtelna molekula. Potoa prisustvoto na ova protivtelo go isklu~uva ponatamo{noto preureduvawe lesnite verigi. Ako kapa preureduvaweto e neproduktivno za dvata kapa aleli, zapo~nuva preureduvawe na genite za lambda lesnite verigi. Ako nitu eden lambda alel ne se preuredi produktivno, B kletkata najverojatno prestanuva da zree i brzo umira so apoptoza. (slika 5-11 Model koj se odnesuva na alelskoto isklu~uvawe. Prvo se preureduvaat genite za te{kite verigi i {tom nastane produktivno gensko preureduvawe na te{kite verigi, proteinskiot produkt mi go spre~uva preureduvaweto na drugite aleli so te{ki verigi i pottiknuva gensko preureduvawe na genite za lesnite verigi. Kaj gluvcite, preureduvaweto na genite za kapa lesnite verigi predhodi na preureduvawe lambda genite, kako {to e prikaàno ovde. Kaj lu eto, ili preureduvaweto na genite za kapa ili za lambda moè da prodolì {tom nastane preureduvawe te{kite verigi. Sozdavaweto na celosen imunoglobulin podocna go popre~uva preureduvaweto genite so lesni verigi. Ako kaj eden alel nastane neproduktivno preureduvawe, toga{ kletkata probuva preureduvawe drug alel. (referenca). Dve prou~uvawa so transgenski gluvci ja podrùvaat hipotezata deka proteinskite produkti koi se kodirani od preuredenite geni vo te{kata i lesnata veriga go reguliraat preureduvaweto na ostanatite aleli. Pri ednoto prou~uvawe, bea podgotveni transgenski gluvci koi nosele preureden transgen so mi te{ka veriga. Produktot mi od transgenot bil prikaàn vo golem procent vrz B kletkite, a preureduvaweto na endogenite imunoglobulinski geni so te{ki verigi bilo blokirano. Sli~no na toa, kletkite od transgenskiot glu{ec koj nosel transgen so kapa lesni verigi ne gi preuredil endogenite geni za kapa verigata koga kapa transgenot bil prikaàn i bil povrzan so te{kata veriga za sozdavawe celosen imunoglobulin. Ovie prou~uvawa sugeriraat deka prikaùvaweto na proteinite so te{ki i lesni verigi moè navistina da go spre~at preureduvaweto na ostanatite aleli i spored toa se odgovorni za alelskoto isklu~uvawe. 13

Sozdavawe protivtelno razli~ie (raznovidnost) Kako {to se de{ifrira{e organizacijata na genite vo imunoglobulinite, po~naa da se pojavuvaat mnogu teorii za izvorite na razli~ieto vo varijabilnoto podra~je. Teorijata na zarodi{nata linija, koja ja spomenavme prethodno, tvrde{e deka celoto razli~ie vo promenlivoto podra~je e kodirano vo zarodi{nata linija od organizamot i se prenesuva od roditelot na deteto preku zarodi{nite kletki (jajce ili sperma). Teorijata na somatski varijacii tvrde{e deka zarodi{nata linija sodrì ograni~en broj promenlivi geni, koi pri razvojot na imuniot sistem se diverzificiraat vo somatskite kletki preku procesi na mutacii ili rekombinacii. So klonirawe i sekvencionirawe imunoglobulinskite geni, delumno se opravdaa i dvata modeli. Denes, utvrdeni se sedum mehanizmi za diverzifikacija na protivtelata kaj lu eto i gluvcite: Pove}e genski segmenti vo zarodi{nata linija Kombinatorsko povrzuvawe V-(D)-J Fleksibilnost pri povrzuvawe Dodavawe nukleotidi vo P-podra~jeto (P-dodavawe) Dodavawe nukleotidi vo N-podra~jeto (N-dodavawe) Somatska hipermutacija Kombinatorsko povrzuvawe lesnite i te{ki verigi Iako to~niot pridones na sekoj od ovie mehanizmi za diverzifikacija na vkupnoto protivtelno razli~ie ne e poznat, sekoj od niv zna~ajno pridonesuva za normalniot broj razli~ni protivtela koj imuniot sistem kaj cica~ite moè da gi sozdade. Postojat brojni zarodi{ni V, D i J genski segmenti Listata na funkcionalni V, D i J genski segmenti vo DNK od zarodi{nata linija kaj eden ~ovek otkriva 48 V T,23D T,6J T,41V kapa,5 J kapa,34v lambda i5j lambda genski segmenti. Vo odnos na ovie funkcionalni segmenti, postojat mnogu psevdogeni. Treba da se ima predvid deka ovie brojki vo golem del se izvedeni od zna~ajnoto prou~uvawe {to ja sekvencionira{e DNK od imunoglobuliskite lokusi kaj edno lice. Imunoglobulinskite lokusi od drugo lice moè da sodràt malku porazli~en broj na oddelni vidovi genski segmenti. Kaj gluvcite, iako brojot koj e poznat e poneprecizen otkolku kaj lu eto, iznesuva 85 V kapa genski segmenti i 134 V T genski segmenti, 4 funkcionalni J T, 4 funkcionalni J kapa, 3 funkcionalni J lambda i proceneti 13 D T genski segmenti, no samo tri V lambda genski segmenti. Iako brojot na geni od zarodi{nata linija koj be{e otkrien i kaj lu eto i kaj guvcite e dosta pomal od onoj koj be{e previden so prvite zastpnici na zarodi{niot model, pove}eto V, D i J genski segmenti od zarodi{nata linija jasno pridonesuvaat za raznovidnosta na protivgen vrzuva~kite mesta vo protivtelata. Kombinatorskoto povrzuvawe V-J i V-D-J sozdava razli~ie Pridonesot na pove}e genski segmenti od zarodi{nata linija za raznovidnosta na protivtelata e zgolemen so slu~ajnoto preureduvawe ovie segmenti vo somatskite kletki. Mo`no e da se presmeta kolku raznovidnost moè da se postigne so gensko preureduvawe (tabela 5-2). Kaj lu eto, sposobnosta na koj bilo od 48 V T genski segmenti da se kombiniraat so koj bilo od 23 segmenti i koj bilo od 6 J T segmenti ovozmoùva sozdavawe zna~itelen broj razli~ie kaj genite za te{kite verigi (48 h 23 h 6 = 6624 mo`ni kombinacii). Sli~no na toa, 41 genski segementi koi se kombiniraat po slu~aen izbor so 5 J kapa segmenti imaat potencijal za sozdavawe 205 mo`ni kombinacii za kapa lokusot, dodeka 34 V lambda i5j lambda genski segmenti ovozmoùvaat do 170 mo`ni kombinacii vo lambda lokusot kaj lu eto. Va`no e da se svati deka ova se minimalni presmetki za potencijalnoto razli~ie. Fleksibilnosta za spojuvawe i dodavaweto na P i N nukleotidite, kako {to spomenavme prethodno, a, posebno, somatskata hipermutacija, koja }e ja objasnime na kratko, zaedno pravat ogromen pridones za raznovidnosta na protivtelata. Iako ne e mo`no da se napravi precizna presmetka za nivniot pridones, pove}eto istraùva~i vo ova pole se soglasni deka tie go zgolemuvaat potencijalot za protivtelno razli~ie od kombinatorskoto mesto kaj lu eto do stepen od 10. Ova ne zna~i deka, vo sekoe vreme, edno lice ima grupa od 10 razli~ni protivtela so kombinira~ki strani. Ovoj golem broj ja opi{uva grupata na razli~ni varijacii, pri {to edno lice nosi podgrupa koja e pomala za nekolku broja. 14

Svrzanata fleksibilnost dodava razli~ie Ogromnata raznovidnost sozdadena so kombinirawe V, D i J se zgolemuva so fenomenot nare~en svrzna fleksibilnost. Kako {to objasnivme prethodno, rekombinacijata vklu~uva i povrzuvawe sekvenci za signalno rekombinirawe za sozdavawe signalen spoj i povrzuvawe na kodni sekvenci za sozdavawe kodira~ki spoj (slika 5-7). Iako signalnite sekvenci sekoga{ se povrzuvaat precizno, povrzuvaweto na kodnite sekvenci ~esto e neprecizno. Na primer, pri edno prou~uvawe se analizira{e povrzuvaweto na kodnite sekvenci V kapa 21 i J kapa 1 vo nekolku lozi od pred-b kletkata. Sekvenciskata analiza na signalnite i kodnite spoevi go otkrija kontrastot vo preciznosta na povrzuvaweto (slika 5-12). (slika 5-12 Eksperimentalen dokaz za svrznata fleksibilnost vo preureduvaweto na imnoglobulinskite geni. Nukleotidnite sekvenci okolu kodira~kiot spoj pome u V kapa 21 i J kapa 1 i soodvetnata signalna spojna sekvenca bea opredeleni kaj ~etiri pred-b kletki. Postojanosta na sekvencata vo signalnite spoevi e razli~na od promenlivosta na sekvencata vo kodira~ki spoevi. Rozovata i `oltata boja gi ozna~uvaat nukleotidite izvedeni od V kapa 21 i J kapa 1, a violetovata i portokalovata boja gi ozna~uvaat nukleotidite od dvete RSS. 15

Kako {to e prethodno prika`ano, svrzna fleksibilnost vodi kon mnogu neproduktivni preureduvawa, no isto taka sozdava produktivni kombinacii koi kodiraat alternativni amino kiselini pri sekoj kodira~ki spoj (vidi slika 5-9), pri toa zgolemuvaj}i go protivtelnoto razli~ue. Varijacijata vo sekvencata na amino kiselinite sozdadena od strana na svrznata fleksibilnost vo kodira~kite spoevi se poka`a deka se nao vo tretoto hipervarijabilno podra~je (KOP3) vo DNK za te{kite i za lesnite verigi od imunoglobilinite (tabela 5-3). Bidej}i KOP3 ~esto ima glaven udel vo vrzuvaweto protivgen za protivtelnata molekula, promenite vo amino kiselinite sozdadena so svrznata fleksibilnost se zna~ajni za sozdavawe protivtelno razli~ie. 16

P-dodavaweto pridava razli~e vo palindromskite sekvenci Kako {to objasnivme prethodno, po po~etnoto delewe DNK, posle po~etnoto ednoveri`no rase~uvawe na DNK na spojot od varijabilniot genski segment i prika~enata signalna sekvenca, nukleotidite na krajot od kodira~kata sekvenca se svitkuvaat za da sozdadat {nolesta struktura (slika 5-7). Ovaa {nola podocna se rase~uva od endonukleazi. Ova vtoro se~ewe ponekoga{ nastanuva na pozicija koja ostava kratko edine~no del~e na krajot kodira~kata sekvenca. Dopolnitelnoto dodavawe komplementarni nukleotidi na ovaa veriga (P-dodavawe) so reparativni enzimi sozdava palindromna sekvenca na kodira~kiot spoj, i zatoa ovie nukleotidi se nare~uvaat P- nukleotidi (slika 5-13a). Varijaciite na mestoto kade {to se se~e {nolata doveduva do varijacii vo sekvencite na kodira~kiot spoj. N-dodavaweto pridava zna~itelno razli~ie so dodavawe nukleotidi Se pokaà deka kodira~kite spoevi vo promenlivite podra~ja vo preuredenite geni za te{kite verigi sodràt kratki amino kiselinski sekvenci koi ne se kodirani od V, D ili J genskite segmenti od zarodi{nata linija. Ovie amino kiselini se kodirani od nukleotidno dodavawe za vreme na procesite na spojuvawe na D-J i V kon D-J vo reakcija katalizirana od deoksinukleotidil transferaza (TdT, slika 5-13b). Dokazot deka TdT e odgovoren za dodavaweto ovie N-nukleotidi doa a od transfekciskite prou~uvawa na fibroblastite. Koga fibroblastite bea transfektirani so genite RAG-1 i RAG-2, nastana preureduvawe V-D-J, no nema{e N-nukleotidi prisutni vo kodira~kite spoevi. Me utoa, koga fibroblastite bea transfektirani so genot koj go kodira enzimot TdT, preureduvaweto V-D-J be{e pridruùvano od dodavaweto na N-nukleotidi. Najmnogu do 15 N-nukleotidi moè da se dodadat i kaj D T -J T ikajv T -D T J T spoevite. Spored toa, celoto varijabilno podra~je od te{kata veriga e kodirano od edinicata V T ND T -NJ T. Dopolnitelnata raznovidnost na te{kata veriga sozdadena od dodavaweto na nukelotidot vo N-podra~je e dosta golemo bidej}i N podra~jata sodràt sekvenci koi se celosno po slu~aen izbor. Bidej}i ova razli~ie se pojavuva pri V-D-J kodira~kite spoevi, toa e lokaliziran vo KOR3 od genite za te{kite verigi. (slika 5-13 Dodavawe P i N nukleotidi pri povrzuvaweto. (a) Ako rase~uvaweto na {nolata dava dvoverièn kraj vo kodira~kata sekvenca, toga{ ne se slu~uva dodavawe P-nukleotidi. Me utoa, vo mnogu slu~ai, rase~uvaweto dava ednoverièn kraj. Pri ponatamo{nata popravka, se dodavaat komplementari nukleotidi, nare~eni P- nukleotidi, za sozdavawe palindromni sekvenci (ozna~eni so zagradi). Vo ovoj primer, ~etiri dopolnitelni bazni parovi (sino) se prisutni vo kodira~kiot spoj kako rezultat na dodavaweto P-nukletidot. (b) Pokraj dodavaweto P-nukleotidi, pri spojuvaweto na kodira~kite sekvenci so te{ki verigi moè da nastene dodavawe N- nukleotidi po slu~aen izbor (svetlo crveno) od strana na terminalnata deoksinukleotidil transferaza (TdT). 17