H ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩΣΗΣ

H ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩΣΗΣ Χαρά Γακιοπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομικής Α Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής, ΕΚΠΑ

ΑΜΥΛΟΕΙΔΕς (1842 MATTHIAS SCHLEIDEN/1854 RUDOLPH VIRCHOW) Ακυτταρική & εξωκυττάρια ουσία ιστική εναπόθεση ιστική καταστροφή και οργανική δυσλειτουργία Dember L, J Am Soc Nephrol 17: 3458 3471, 2006

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς H διάγνωση της αμυλοείδωσης βασίζεται στη βιοψία του(των) προσβεβλημένου(ων) ιστού(ών) Ο ρόλος της βιοψίας διττός: Διάγνωση αμυλοείδωσης Τυποποίηση αμυλοείδωσης

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Παρά την ετερογένεια των πολυάριθμων διαφορετικών τύπων αμυλοειδούς όλα μοιράζονται μία κοινή χρωστική ιδιότητα στην οποία βασίζεται η ιστολογική διάγνωση της αμυλοείδωσης σε οποιονδήποτε ιστό: Χαρακτηριστική πράσινη διπλοθλαστικότητα στο πολωμένο φως μετά από χρώση του ιστού με Ερυθρό του Congo κατά την οποία το αμυλοειδές αποκτά πορτοκαλί/κόκκινο χρώμα. Υποψία Ερυθρό του Congo (+) Τελική επιβεβαίωση και διάγνωση

Η ιστολογική διάγνωση της αμυλοείδωσης οποιασδήποτε αιτιολογίας- προϋποθέτει: εργαστήριο με εμπειρία στην ιστοχημική χρώση Ερυθρό του Congo χρήση θετικών και αρνητικών μαρτύρων και εξέταση με πολωτικό μικροσκόπιο. Σημείωση: για την ανάδειξη μικρών εναποθέσεων αμυλοειδούς και λόγω της ανομοιογενούς κατανομής του στους ιστούς, προτιμούνται τομές πάχους 4-8μm (2-4μm το σύνηθες πάχος των τομών παραφίνης) ή/και διενέργεια της χρώσης σε > 1 τομές.

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς H χρώση Ερυθρό του Congo μπορεί να ειδωθεί και σε μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού με φίλτρα FITC (fluorescein isothiocyanate) ή TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate ) πορτοκαλί ή κόκκινο χρώμα αντίστοιχα Ανάδειξη μικρών ποσοτήτων αμυλοειδούς Σάρωση μεγάλων ιστικών εκτάσεων Picken MM. Generic diagnosis of amyloid: a summary of current recommendations and the editorial comments on Chapters 12-15. In: Picken MM, Dogan A, Herrera GA, eds. Amyloid and Related Disorders in Surgical Pathology and Clinical Correlations. New York: Springer, 2012:209-217.

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Χρώση thioflavin (Τ ή S) με εξέταση σε μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού (πιο ευαίσθητη από το Ερυθρό του Congo) Άλλες χρώσεις: crystal violet, methyl violet, Sirius red, sulfated Alcian blue (SAB): ευαισθησία, ειδικότητα Maria M. Picken Heptinstall Pathology of the Kidney 7th Edition

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Συστατικό P του αμυλοειδούς/ P-component (ανοσοϊστοχημική χρώση): θετική σε όλα τα είδη αμυλοειδούς

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο: μη διακλαδούμενα ινίδια7,5-10 nm ΗΜ: Ινίδια σε τυχαία διάταξη, διαμέτρου ~ 10 nm (Images courtesy of Helmut Rennke, MD. J Am Soc Nephrol 17: 3458 3471, 2006 )

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΝΕΦΡΙΚΗς ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Ένα σύνηθες ιστορικό: ενήλικας / ηλικιωμένος ασθενής πρωτεϊνουρία (συχνά νεφρωσικού εύρους) χωρίς ενεργό ίζημα ούρων με ή χωρίς επηρεασμένη νεφρική λειτουργία υποβάλλεται σε νεφρική βιοψία

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο Η τυπική ιστολογική εικόνα: Αιματοξυλίνη -Ηωσίνη

Αιματοξυλίνη -Ηωσίνη Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο Αμυλοείδωση ; Διαβήτης ; Νόσος μονοκλωνικής εναπόθεσης ελαφρών ή βαρέων αλύσων ; Ινιδιακή σπειραματονεφρίτιδα ; Ανοσοτακτοειδής ΣΝ ; Ιδιοπαθής οζώδης σκλήρυνση ; Κολλαγονώδης ΣΝ ;

Ιστοχημική χρώση pas Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Ιστοχημική χρώση masson Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο Χρώση Αργύρου (Silver Methenamine): αρνητική Ιστοχημική χρώση silver ΔΔ από Σακχαρώδη διαβήτη

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο ΕΡΥΘΡO ΤΟΥ CONGO (ΙςΤΟΧΗΜΙΚΗ ΧΡΩςΗ) Ιστοχημική χρώση Ερυθρό του Congo (+)

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

P-COMPONENT (+) Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο AΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΝΕΦΡΟΥ Εναποθέσεις αμυλοειδούς σε: Σπειράματα Αρτηρίες (συχνότερα αρτηριόλια και μεσολοβίδιες) Διάμεσο υπόστρωμα Ουροφόρα σωληνάρια Διάμεσος ιστός Σπείραμα (μεσάγγειακές εναποθέσεις) Αρτηριόλια

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο AΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΝΕΦΡΟΥ Σπειράματα: μεσαγγειακές εναποθέσεις διεύρυνση μεσαγγείου επέκταση στα τοιχώματα των τριχοειδών κατάληψη τριχοειδών αυλών κατάληψη σπειράματος

ΙςΤΟΛΟΓΙΚH ΔΙΑΓΝΩςΗ ΝΕΦΡΙΚΗς ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Προσπάθειες ιστολογικής βαθμοποίησης της αμυλοείδωσης (scoring + grading) σε αναλογία με τις ταξινομήσεις του SEL και της ΒΑΝFF Απουσία ευρείας αποδοχής & επικύρωσης Sait Şenand & Banu Sarsık, Proposed Histopathologic Classification, Scoring, and Grading System for Renal Amyloidosis: Standardization of Renal Amyloid Biopsy Report, Arch Pathol Lab Med, 134, 532, 2010

Η θετικότητα στο Ερυθρό του Congo υπό πολωμένο φως και στο p- component επιβεβαιώνει την παρουσία αμυλοειδούς (οποιασδήποτε προέλευσης) Επόμενο βήμα: Προσπάθεια περαιτέρω προσδιορισμού του τύπου του αμυλοειδούς (τυποποίηση)

AΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΝΕΦΡΟΥ ΤΥΠΟΙ ΝΕΦΡΙΚΗς ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς AL/AH/AHL αμυλοείδωση(68-81%) ΑΑ (7-12,5%) ΑLECT2 (Leukocyte chemotactic factor 2) AFib (Fibrinogen a-chain amyloidosis) AGel (Gelsolin amyloidosis) Aπολιποπρωτεϊνικές αμυλοειδώσεις (ΑΙ, ΑΙΙ, ΑΙV, CII) Αμυλοείδωση λυσοζύμης (ALys) Σπανίως >1τύποι αμυλοειδούς στον ίδιο ασθενή (πχ ΑL αμυλοείδωση στα σπειράματα + ΑΑ αμυλοείδωση στα αγγεία)

ΤΥΠΟΠΟΙΗςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε τομές παραφίνης Ανοσοφθορισμός (IF) σε τομές κρυοστάτη (ανώτερος της IHC ιδιαίτερα για την ΑL αμυλοείδωση) (Ανοσο-ηλεκτρονικό μικροσκόπιο) Laser microdissection & mass spectrometry Δυσκολίες ICH ή και IF : απουσία ειδικών αντισωμάτων για τις αμυλοειδικές πρωτεΐνες (τα εμπορικά διαθέσιμα αντισώματα αναπτύσσονται έναντι επιτόπων των φυσικών πρωτεϊνών) ετερογένεια και ποικιλία αμυλοειδικών πρωτεινών (απουσία αντισωμάτων για όλους τους τύπους) χρώση υποστρώματος (IHC) Χρήση «συγκριτικής ανοσοϊστοχημείας» [χρήση panel δεικτών και σύγκριση με Ερυθρό του Congo ή P-component (θετικό σε όλα τα είδη αμυλοειδούς)]

ΙςΤΟΛΟΓΙΚΗ ΤΥΠΟΠΟΙΗςΗ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗς Ανοσοϊστοχημεία για την ανίχνευση ΑΑ (του τύπου της δευτεροπαθούς αμυλοείδωσης) Μονοτυπικής έκφρασης κ ή λ ελαφράς αλύσου (AL αμυλοείδωση) Άλλων τύπων αμυλοείδωσης πχ ΑLECT2 Ανοσοφθορισμός Ανάδειξη μονοτυπικής καθήλωσης έλαφράς ή βαριάς αλύσου

ΑL /AH /AHL - ΑΜΥΛΟΕΙΔΩΣΗ Σχέση με υποκείμενη πλασματοκυτταρική δυσκρασία ΑL αμυλοείδωση: ο συνηθέστερος τύπος νεφρικής αμυλοείδωσης (68%-81% των νεφρικών αμυλοειδώσεων) Said SM et al, Clin J Am Soc Nephrol 2013; 8: 1515 1523, Bergesio F et al, Nephrol Dial Transplant 2008; 23: 941 951 Συχνότερα οφείλεται σε παθολογικές λ-ελαφρές αλύσους Προσβολή όλων των νεφρικών διαμερισμάτων: σπειράματα τα συχνότερα προσβεβλημένα σπανίως περιορισμένη στα αγγεία (συσχέτιση με Cr και χαμηλότερη πρωτεϊνουρία) Εirin A et al, Nephrol Dial Transplant 2012; 27: 1097 1101

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο ΑΑ (Α-ΑMYLOID) ΑΝΟςΟΪςΤΟΧΗΜΙΚΗ ΧΡΩςΗ

λ-ελαφρά άλυσος Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

κ-ελαφρά άλυσος χ200 Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο λ-ελαφρά άλυσος κ-ελαφρά άλυσος

ΑΑ - ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ Συσχέτιση με χρόνια φλεγμονή στο πλαίσιο χρονίων λοιμώξεων, χρονίων φλεγμονωδών νόσων, κακοηθειών, κληρονομικών νοσημάτων υπερπαραγωγή SAA (Serum amyloid A) Σπειράματα προσβολή (ήπια έως σοβαρή) σε όλες τις περιπτώσεις Αγγειακή συμμετοχή 95% των βιοψιών Μόνο αγγειακή συμμετοχή (αγγειακοί σπειραματικοί πόλοι + αρτηριόλια) σπανίως Εστιακή συμμετοχή διαμέσου υποστρώματος με περισωληναριακή επίταση ή εναπόθεση στις ΤΒΜs (62,5%) Συμμετοχή μυελού πιθανή

ΗΕ Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Ερυθρό του Congo Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

P-component Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο κ- ελαφρά άλυσος (-) λ- ελαφρά άλυσος (-)

ΑΑ Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

LEUKOCYTE CHEMOTACTIC FACTOR 2 (ALECT2) ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ Προσφάτως περιγραφείσα (Βenson et al, Kidney Int 74:218 222, 2008) Συχνή (o 3 ος και σε κάποιες μελέτες ο 2 ος συχνότερος τύπος μετά την ΑL αμυλοείδωση) Συχνή στους Ισπανόφωνους ηλικιωμένους Τείνει να περιορίζεται στο νεφρό και στο ήπαρ (απουσία καρδιακής ή νευρικής συμμετοχής) Προοδευτική χρόνια νεφρική νόσος με ποικίλη πρωτεϊνουρία (νεφρωσικό σύνδρομο : σπάνιο) Σχετικά καλοήθης τύπος νεφρικής αμυλοείδωσης με αργή έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας

LEUKOCYTE CHEMOTACTIC FACTOR 2 (ALECT2) ΑΜΥΛΟΪΔΩΣΗ Διάχυτη προσβολή του νεφρικού φλοιού Προσβολή μυελού: απούσα ή σπάνια Χαρακτηριστικές «μπάντες» στο διάμεσο υπόστρωμα Διάγνωση : ανοσοϊστοχημεία για ALECT2 Sethi S & Theis JD, J Nephrol 2017 (DOI 10.1007/s40620-017-0426-6)

LEUKOCYTE CHEMOTACTIC FACTOR 2 (ALECT2) ΑΜΥΛΟΪΔΩΣΗ Section of frozen kidney treated with monoclonal anti-lect2 antibody showing localization to glomerular and interstitial deposits. Formalin-fixed tissue sections gave similar distribution of staining but was less intense. Original magnification 100. Benson et al, Kidney Int 74:218 222, 2008 Electron microscopy of renal glomerulus showing nonbranching fibrils (original magnification 4800). Average diameter of fibrils is 10nm (original magnification (inset) 98 000).

ΑFIB (FIBRINOGEN A-CHAIN AMYLOIDOSIS) Η συχνότερη ίσως μορφή κληρονομικής νεφρικής αμυλοείδωσης Αξιοσημείωτος νεφρικός τροπισμός Πρωτεϊνουρία + νεφρική ανεπάρκεια Μετάλλαξη στο ινωδογόνο (αντικατάσταση βαλίνης από γλουταμινικό οξύ στη θέση 526) Οικογενειακό ιστορικό νεφρικής νόσου: απόν σε ~46% Διάμεσος χρόνος έως ESRD: 4,6έτη, διάμεση επιβίωση 15,2έτη από την κλινική εμφάνιση Picken MM. Fibrinogen amyloidosis: the clot thickens! Blood 2010; 115:2985 Μεταμόσχευση ήπατος + νεφρού ή Μεταμόσχευση ήπατος πριν την εμφάνιση νεφρικών εκδηλώσεων

ΑFIB (FIBRINOGEN A-CHAIN AMYLOIDOSIS) Τυπική ιστολογική εικόνα: Μαζικές σπειραματικές εναποθέσεις αμυλοειδούς Μεταμόρφωση σπειραμάτων σε μεγάλες «μπάλλες» αμυλοειδούς με απόφραξη των τριχοειδών και απώλεια της αρχιτεκτονικής Αγγεία + διάμεσο υπόστρωμα + μυελός συνήθως ελεύθερα IF: - για ανοσοσφαιρίνες Ασαφείς εναποθέσεις ινωδογόνου ΙCH: + με Αb έναντι της Αfib Yποτροπή στο νεφρικό μόσχευμα: μικρές μεσαγγειακές εναποθέσεις (πρώιμο στάδιο) Sethi S & Theis JD, J Nephrol 2017

GELSOLIN AMYLOIDOSIS Σπάνιος τύπος Τυπική η προσβολή κρανιακών και περιφερικών νεύρων Νεφρική προσβολή: πρωτεϊνουρία, συχνά νεφρωσικού εύρους Μεταλλάξεις (συχνή η αντικατάσταση ασπαρτικού από ασπαραγίνη ή τυροσίνη στη θέση 187) Περιορισμένη στα σπειράματα HM: στροβιλοειδές πρότυπο παράλληλων ινιδίων (η μόνη αμυλοείδωση με αυτό το πρότυπο) Sethi et al Am J Kidney Dis. 2013;61(1):161-166

ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΙΚΕς ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΕΙς Απολιποπρωτεϊνες : πρόδρομες πρωτεϊνες σε διάφορους τύπους αμυλοείδωσης. (Η απολιποπρωτεϊνη Ε κοινή σε όλες τις μορφές αμυλοείδωσης) Απολιποπρωτεϊνη Ι, ΙΙ, IV & CII Απολιποπρωτεϊνη Ι & IV : προσβολή μυελού Απολιποπρωτεϊνη ΙΙ & CII: προσβολή σπειραμάτων

ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗς Α1 Σπάνια Ετερόζυγη μετάλλαξη στο γονίδιο της ΑPOA1 Αναλόγως μετάλλαξης : προσβολή νεφρού, ήπατος και όρχεος ή καρδιάς, λάρυγγα και δέρματος Επί νεφρικής συμμετοχής συχνότερη μετάλλαξη: Leu75Pro Νεφρική νόσος με αργή εξέλιξη Πρωτεϊνουρία : απούσα ή ελάχιστη Μεταμόσχευση ήπατος : συνήθως θεραπευτική Εναποθέσεις αμυλοειδούς στην έσω μυελώδη μοίρα ± διαμεσοσωληναριακή νεφρίτιδα (απουσία σπειραματικής προσβολής)

ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗς ΙV Νεφρική νόσος με αργή εξέλιξη Πρωτεϊνουρία:απούσα ή ελάχιστη Δεν έχουν εντοπιστεί μεταλλάξεις (Bergström J et al, 2001) Χαρακτηριστική ιστολογική εικόνα: Μαζικές εναποθέσεις στο μυελό με περισωληναριακή επίταση χωρίς ιδιαίτερη φλεγμονή Φείδεται σπειραμάτων, διαμέσου ιστού φλοιού, αγγείων αν η βιοψία δεν περιέχει μυελό απώλεια διάγνωσης Sethi S & Theis JD, J Nephrol 2017

ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗς AΙΙ Σπάνια Μεταλλάξεις στο Αpo II γονίδιο Νεφρική ανεπάρκεια + πρωτεϊνουρία ( νεφρωσικού εύρους) Ήπαρ, δέρμα, καρδιά, επινεφρίδια Kidney International, Vol. 64 (2003), pp. 11 16 Προσβολή σπειραμάτων + αγγείων Φείδεται τον διάμεσο ιστό

ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗς CΙΙ Προσφάτως περιγραφείσα (Νasr et al, JASN 2017) Ετερόζυγες μεταλλάξεις στο γονίδιο ΑpoCII Σπειραματική κυρίως προσβολή:μεσαγγειακοί όζοι Ελάχιστη αγγειακή συμμετοχή Φείδεται τον διάμεσο ιστό της φλοιώδους μοίρας Προσβολή μυελού: συχνά έντονη

ΑΜΥΛΟΕΙΔΩςΗ ΛΥςΟΖΥΜΗς (ALYS) Σπάνιος τύπος κληρονομικής αμυλοείδωσης (αυτόσωμος επικρατής τύπος) Μεταλλάξεις στο γονίδιο της λυσοζύμης Προσβολή κυρίως νεφρού και γαστρεντερικού Προσβολή σπειραμάτων, αρηριολίων, αρτηριών, μυελού, βασικών μεμβρανών αθροιστικών σωληναρίων και ευθέων αγγείων Ανοσοϊστοχημική επιβεβαίωση της διάγνωσης. Nasr SH et al, J Am Soc Nephrol 28: 431 438, 2017

TAKE HOME MESSAGES Η ιστολογική διάγνωση της αμυλοείδωσης βασίζεται στη διπλοθλαστικότητα πράσινου μήλου υπό πολωμένο φως της θετικής χρώσης Ερυθρό του Congo (αποφυγή ψευδώς θετικών ή και αρνητικών ευρημάτων από την εξέταση μόνο της χρώσης Ερυθρό του Congo) Η χρώση Ερυθρό του Congo απαιτεί τομές ικανού πάχους (~ 4-8μm) ή χρώση πολλαπλών τομών. H διάγνωση της νεφρικής αμυλοείδωσης προϋποθέτει βιοψία που να περιέχει τόσο φλοιώδη μοίρα (με σπειράματα και αγγειακούς κλάδους) όσο και μυελώδη μοίρα Η νεφρική αμυλοείδωση μπορεί να παρατηρηθεί και επί πρωτεϊνουρίας ή να είναι ελάχιστη στον ιστό ή να συνυπάρχει τυχαία με άλλη σπειραματοπάθεια : χρώση Ερυθρό Congo χρώση ρουτίνας

TAKE HOME MESSAGES Η ιστολογική έκθεση θα πρέπει να αναφέρει: α) τη μέθοδο ανίχνευσης του αμυλοειδούς, β) τις μεθόδους τυποποίησης του αμυλοειδούς, γ) το πρότυπο κατανομής του αμυλοειδούς στον ιστό Είναι δυνατό >1 τύποι αμυλοείδωσης να συνυπάρχουν στον ίδιο ασθενή. Σε παρασκευάσματα νεφρεκτομής για άλλους λόγους (πχ νεοπλάσματα) είναι σκόπιμη η εξέταση των αγγείων και του παρακείμενου «φυσιολογικού» νεφρού προς αποκλεισμό ενδεχόμενης αμυλοείδωσης.

Χ. Γακιοπούλου / Προσωπικό αρχείο

Ε υ χ α ρ ι σ τ ώ