Rickettsia, Brucella, Francisella και Pasteurella

Rickettsia, Brucella, Francisella και Pasteurella Μαρία Μαυρούλη Ακαδημαϊκή Υπότροφος Εργαστήριο Μικροβολογίας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ

Ζωονόσοι Λοιμώδη νοσήματα που μεταδίδονται μεταξύ των σπονδυλωτών ζώων και του ανθρώπου με φυσικό τρόπο. > 180 (αρνητική επίδραση: δημόσια υγεία & οικονομία χωρών) Δεξαμενές: σκύλοι, γάτες, βοοειδή, χοίροι, πίθηκοι, πτηνά, ερπετά, αρθρόποδα (κρότωνες, κουνούπια) Τρόποι μετάδοσης επαγγελματικές νόσοι ή τροφιμογενείς δήγματα, νύγματα, εξ επαφής ή μηχανικά Ομάδες υψηλού κινδύνου κτηνοτρόφοι, αγρότες, κυνηγοί κτηνίατροι, ερευνητές ανοσοκατασταλμένοι

Rickettsia Gram (-), υποχρεωτικά ενδοκυττάρια βακτήρια Τάξη: α-πρωτεοβακτηρίων, Υποτάξη: Rickettsiales, Οικογένεια: Rickettsiaceae, Γένη: Rickettsia και Orientia

Γένος Rickettsia Γένος Rickettsia: Oμάδα εξανθηματικού τύφου (Typhus Group, TG) (3 είδη) R. typhi, R. prowazekii και R. canadensis Oμάδα κηλιδοβλατιδώδους πυρετού (Spotted Fever Group, SFG) (15 είδη) R. rickettsii, R. conorii, R. akari, R. africae, R. australis, R. helvetica, R. slovaca, R. massiliae, R. rhipicephali, R. aesclimannii, R. mongolotimonae, R. japonica, R. montana, R. parkeri, R. sibirica, R. honei Ομάδα αταξινόμητων ρικετσιών R. bellii, male-killing rickettsia spp., R. endosymbiont CDC

Επιδημιολογία Είδος Νόσος Φορέας Ξενιστής R. prowazekii Επιδημικός τύφος Ψείρα σώματος Άνθρωπος R. typhi Ενδημικός τύφος Ψύλλοι Τρωκτικά R. rickettsii R. conorii Κηλιδοβλατιδώδης πυρετός των Βραχωδών Ορέων Μεσογειακός κηλιδοβλατιδώδης πυρετός Κρότωνες Κρότωνες Σκύλος, πτηνά, τρωκτκά Σκύλος, Τρωκτικά Γεωγραφική κατανομή Παγκόσμια Παγκόσμια (υπο)τροπικές χώρες ΗΠΑ Μεσόγειος Parola et al., Clin Microbiol Rev, 2013

Φορείς και ξενιστές ρικετσιών Typhus Group Aρθρόποδα Πεπτικός σωλήνας: Πολλαπλασιασμός σε επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου Πρόκληση μικρής ή μεγάλης καταστροφής των κυττάρων Φορέας ρικετσιών Ψύλλος ή ψείρα (flea-borne ή louse-borne ricketsiae) εναπόθεση μολυσμένων περιττωμάτων ή ιστών στο δέρμα των ξενιστών είσοδος μικροοργανισμών στους ιστούς κατά τον κνησμό ή την τριβή ρούχων Άνθρωπος Διασπορά στο κυκλοφορικό σύστημα (ρικετσιαιμία) Είσοδος και πολλαπλασιασμός σε ενδοθηλιακά κύτταρα μικρών αιμοφόρων αγγείων πρόκληση αγγειίτιδας

Κλινικές εκδηλώσεις - Ιστορικό Τυπική κλινική εικόνα ρικετσίωσης υψηλός πυρετός (40 o C), κεφαλαλγία, εξάνθημα* (* δε παρατηρείται σε όλες τις μορφές της νόσου) Διάρκεια νόσου: ~ 2-4 εβδομάδες Λήψη λεπτομερούς ιστορικού Μέγιστη συμβολή στη διάγνωση της νόσου ανεύρεση κρότωνα στο σώμα του ασθενούς επαγγελματική ενασχόληση με κτηνοτροφία, γεωργία ή υλοτομία μόνιμη ή περιστασιακή διαβίωση σε ενδημική περιοχή + κλινική εικόνα υποψία για ρικετσίωση Έναρξη αντιμικροβιακής θεραπείας πριν από την επιβεβαίωση της λοίμωξης

Επιδημικός Εξανθηματικός Τύφος Αιτιολογικός παράγοντας: R. prowazekii Φυσικός ξενιστής: άνθρωπος Μετάδοση: ψείρες σώματος (Pediculus hominis corporis) P. h. corporis Kλινική εικόνα: υψηλός πυρετός, ρίγος, κακουχία, πονοκέφαλος, αρθραλγία, μυαλγία 7 ημέρες από την έναρξη των συμπτωμάτων εμφάνιση μακροφυσαλλιδώδους εξανθήματος (πετεχειώδες ή αιμορραγικό) έναρξη από τον κορμό και επέκταση στα άκρα Συχνές επιπλοκές: μυοκαρδίτιδα, αναπνευστική ανεπάρκεια, νεφρική ανεπάρκεια, σύνδρομο ενδοαγγειακής πήξης και νευρολογικές εκδηλώσεις Θνησιμότητα: 10-30% Η μετάδοση ευνοείται από συνθήκες συγχρωτισμού (εμπόλεμη περίοδος)

Κύκλος ζωής της R. prowazekii Νόσος του Brill-Zinsser Υποτροπιάζων επιδημικός τύφος Παραμονή ρικεττσιών στα λεμφογάγγλια Επανεμφάνιση δεκαετίες μετά την αρχική λοίμωξη ΗΠΑ: ξενιστές της R. prowazekii Άνθρωπος + ιπτάμενος σκίουρος Bechah et al., The Lancet, 2008

Ενδημικός Εξανθηματικός Τύφος Αιτιολογικός παράγοντας: R. typhi Μετάδοση: ψύλλος Xenopsylla cheopis Φυσικός ξενιστής: τρωκτικά (γένος Rattus) Xenopsylla cheopis Μόλυνση: τραυματισμοί δέρματος, αναπνευστικό σύστημα, επιπεφυκότας Γεωγραφική κατανομή: θερμότερες χώρες (ΗΠΑ, Αφρική, Ευρώπη και Ασία) Kλινική εικόνα: πυρετός, μετωπιαία και οπισθοκογχική κεφαλαλγία Εμφάνιση συμπτωμάτων 2-3 εβδομάδες μετά τη μόλυνση εμφάνιση κηλιδώδους ή κηλιδοβλατιδώδους εξανθήματος περιορισμός στον κορμό Ήπια νόσος, υποχώρηση σε 3 εβδομάδες ακόμη και χωρίς θεραπεία

Ενδημικός Εξανθηματικός Τύφος Περιοικιακά ζώα: γάτες, σκύλοι, μαρσιποφόρο ζώο opossum και οι ψύλλοι τους R. felis (αιτιολογικός παράγοντας του ενδημικού τύφου) Φορέας: γάτες και opossum Mεταβιβαστής: ψύλλος της γάτας (Ctenocephalides felis)

Διάγνωση Απομόνωση και ταυτοποίηση ρικετσιών Δείγματα ολικού αίματος, πλάσματος, ΕΝΥ, βιοψίας δέρματος, νεκροτομικού υλικού Ενοφθαλμισμός παθολογικών υλικών σε εμβρυοφόρα αυγά όρνιθας και πειραματόζωα (ινδικά χοιρίδια, επίμυες) κυτταροκαλλιέργειες (L929, Vero, HEL) - Διάρκεια καλλιέργειας: 10 ημέρες Τεχνική καλλιέργειας ρικετσιών σε shell-vials - ταχεία μέθοδος διάγνωσης Ανεύρεση ρικετσιών σε 2-3 ημέρες από την ημέρα ενοφθαλμισμού (IFA ή PCR) Λήψη βιολογικών υλικών (αίμα, βιοψία) * πριν τη χρήση αντιβιοτικών Εργαστήρια αναφοράς με βιοασφάλεια επιπέδου 3 Vero cells Vero cells

Focus Diagnostics Διάγνωση Ορολογικές μέθοδοι Έμμεσος ανοσοφθορισμός, IFA μέθοδος αναφοράς ακέραιες ρικέτσιες (Abs έναντι Ags πάνω στην επιφάνεια κυττάρων) ειδικότητα και ευαισθησία Μικροανοσοφθορισμός (MIF): τροποποίηση έμμεσου ανοσοφθορισμού κηλίδες αντιγονικού υποστρώματος ανεύρεση Abs έναντι διαφόρων ειδών R. rickettssii R. typhi Άμεσος ανοσοφθορισμός (ανίχνευση Ags) -FITC R. rickettsii R. typhi Vero cells

Διάγνωση Ορολογικές μέθοδοι Ανοσοενζυμική μέθοδος, ELISA (εκχυλίσματα ρικετσιών) Ανίχνευση IgG και IgM Abs 7-10 ημέρες μετά την έναρξη της νόσου Παραμονή Ab για μήνες ή χρόνια Λήψη 2 δειγμάτων ορού (έναρξη νόσου και μετά από 15-20 ημέρες) Τετραπλάσια ή μεγαλύτερη αύξηση του τίτλου IgG Abs μεταξύ 1 ου και 2 ου ορού ή Υψηλός τίτλος IgM Abs σε ένα μόνο δείγμα Ένδειξη πρόσφατης λοίμωξης

Διάγνωση Ορολογικές μέθοδοι Συγκόλληση με latex ανίχνευση κυρίως IgM Abs κάλυψη σωματιδίων latex με αντιγόνα ειδικά της ομάδας Δοκιμασία σύνδεσης συμπληρώματος αντιγονικά εκχυλίσματα (λιποπολυσακχαρίτες) ευαισθησία τις 3 πρώτες εβδομάδες μετά την έναρξη της λοίμωξης Αντίδραση Weil-Felix (μέθοδος συγκόλλησης) αντιγόνα τριών στελεχών Πρωτέα (P. vulgaris OX2 και OX19, P. mirabilis OXK) ευαισθησία (33%) και ειδικότητα (46%)

Διάγνωση Μοριακές μέθοδοι Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Real-time PCR Ολικό αίμα, λευκοκύτταρα (buffy coat), βιοψία δέρματος και ιστών οργάνων, ΕΝΥ, πλευριτικό υγρό, πλάσμα, ορός, ιστοί εγκλεισμένοι σε παραφίνη Βασική προϋπόθεση: Λήψη δείγματος τις πρώτες ημέρες της νόσου πριν ανάπτυξη ειδικών αντισωμάτων έναρξη αντιμικροβιακής θεραπείας Ανίχνευση γονιδίου 16S rrna (γονίδιο rrs) και εκείνων που κωδικοποιούν πρωτεΐνη 17 kda (htr), κιτρική συνθετάση (glta), πρωτεΐνες εξωτερικής μεμβράνης Α και Β (rompα και rompβ) και επιφανειακά κυτταρικά αντιγόνα (sca1 και sca4) Πλεονεκτήματα PCR ευαισθησία και ειδικότητα ταχύτητα ολοκλήρωσης της εξέτασης δυνατότητα διάγνωσης στα αρχικά στάδια της νόσου Μειονεκτήματα PCR ψευδώς (+) αποτέλεσμα: επιμόλυνση (-) αποτέλεσμα: δεν αποκλείει λοίμωξη

Χρήση μοριακών και ορολογικών μεθόδων ανάλογα με το χρόνο λήψης κλινικού δείγματος Richards A., FEMS, 2011

Διάγνωση ρικετσιώσεων (Ευρώπη) Δείγμα αίματος Ορός Αντιπηκτικό Βιοψία δέρματος Ιστοί αρθροπόδων EDTA Κιτρικό Ανοσοανίχνευση Ορολογικές μέθοδοι Κυτταροκαλλιέργεια σε shell vials Ανοσοφθορισμός Χρώση Gimenez Μοριακές μέθοδοι (PCR) Brouqui et al., CMI, 2004

Θεραπεία Δοξυκυκλίνη: φάρμακο εκλογής Συνηθισμένη διάρκεια θεραπείας: 2-5 ημέρες, μέχρι 24 ώρες μετά την απυρεξία Τετρακυκλίνες: οδοντικές διχρωμίες και υποπλασίες σε παιδιά κάτω των 8 ετών Χλωραμφενικόλη: πρόκληση σοβαρών επιπλοκών (απλαστική αναιμία, υποτροπές) Κινολόνες (σιπροφλοξασίνη)

Brucella Gram (-), προαιρετικά ενδοκυττάρια βακτήρια Τάξη: α-πρωτεοβακτήρια, Υποτάξη: Rhizobiales, Οικογένεια: Brucellaceae, Γένος: Brucella

Brucella Μικρός, ακίνητος, μη σπορογόνος κοκκοβάκιλλος, χωρίς έλυτρο Urease test Ευαίσθητο στο ηλιακό φως και την ιονίζουσα ακτινοβολία Καταστροφή με το βρασμό και την παστερίωση Ανθεκτικότητα στην ξήρανση και την κατάψυξη Παραγωγή ουρεάσης (προστασία από όξινο ph στομάχου) _ + οξειδάση + Ασθενώς + _ non-motile motile

Ταξινόμηση Είδος Βιότυπος Ξενιστής Παθογόνο για τον άνθρωπο B. melitensis 1-3 Αιγοπρόβατα (70%) B. abortus 1-6, 9 Βοοειδή (25%) B. suis B. canis 1-3 4 5 - Χοίροι Τάρανδοι Τρωκτικά Σκύλοι Αλεπούδες B. ovis - Αίγες B. neotomae - Τρωκτικά (5%) (σπάνια)

Νέα είδη Brucella * * * * Εξέλιξη γένους Ανάδυση νέων ειδών Δυνατότητα επέκτασης σε ευρύτερο φάσμα ξενιστών

Βρουκέλλωση Η σημαντικότερη ζωοανθρωπονόσος με παγκόσμια εξάπλωση Η πλειοψηφία των κρουσμάτων προκαλείται από τη B. melitensis Ενδημικές περιοχές: λεκάνη Μεσογείου, Μέση Ανατολή, Κεντρική και Νότια Ασία, περιοχές της Αφρικής και Νότιας Αμερικής Worldwide incidence of human brucellosis

Βρουκέλλωση στα ζώα Μόλυνση ζώων κυρίως με επαφή ή με κάθετη μετάδοση Προσβολή του γεννητικού συστήματος των ζώων αποβολές, ορχεοεπιδιδυμίτιδα, υπογονιμότητα Ερυθριτόλη ανίχνευση σε υψηλό ποσοστό στον πλακούντα ζώων ενισχύση και επιτάχυνση πολλαπλασιασμού βρουκελλών Μετάδοση του βακτηρίου με ούρα κόπρανα γάλα πλακούντα προϊόντα αποβολής ή τοκετού

Bρουκέλλωση στον άνθρωπο Πεπτική οδός φρέσκο μη παστεριωμένο γάλα ή γαλακτοκομικά προϊόντα ανεπαρκώς μαγειρεμένο ή ωμό κρέας (κυρίως εντόσθια) αχλωρυδρία ή λήψη αντιόξινων ( πιθανότητα προσβολής - ph γαστρικού υγρού) Αναπνευστική οδός (πηγές μόλυνσης): Μολυσμένοι χώροι - σφαγεία, ζωοτροφεία και εργαστήρια παρασκευής εμβολίων Δέρμα Εκδοροσφαγείς, κρεοπώλες και κτηνίατροι Είσοδος μικροβίου μέσω τραυματισμών και λύσεων συνέχειας του δέρματος Ενδοφλέβια οδός: μετάγγιση αίματος ή μεταμόσχευση μυελού των οστών από μολυσμένο ασυμπτωματικό δότη Αυτοεμβολιασμός: κυρίως σε κτηνιάτρους, τυχαία μόλυνση με στέλεχος Brucella abortus S19 ή B. melitensis REV-1

Bρουκέλλωση στον άνθρωπο Kάθετη μετάδοση από την πάσχουσα μητέρα στο έμβρυο διαμέσου του πλακούντα. Απομόνωση από τον πλακούντα, το έμβρυο και τα πρόωρα νεογνά μητέρων με ενεργό βρουκέλλωση Διαπλακούντια προσβολή στον άνθρωπο: σπάνια ( περιεκτικότητα πλακούντα σε ερυθριτόλη) Μητέρες με ενεργό βρουκέλλωση που θηλάζουν Μετάδοση της νόσου στο βρέφος Απομόνωση παθογόνου από το ανθρώπινο γάλα

Μετάδοση βρουκέλλωσης Επιβίωση Brucella: > 6 μήνες σε υγρό και σκοτεινό περιβάλλον > 3 μήνες στο τρίχωμα νεογέννητων μολυσμένων αμνών ή εριφίων σκόνη, κοπριά, νερό, χώμα, κρέας, γάλα, νεκρό εμβρυϊκό υλικό Χρόνος επιβίωσης Brucella: φύση υποστρώματος, μικροβιακό φορτίο, ph, θερμοκρασία, έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία

Μελιταίος πυρετός ή πυρετός της Μάλτας 1861, J.A Martson: περιγραφή συμπτωμάτων της νόσου στον άνθρωπο 1887, D. Bruce: απομόνωση βρουκελλών από σπλήνες νεκρών στρατιωτών στη Μάλτα 1897, Wright and Smith: Ανίχνευση Abs έναντι B. melitensis σε όρο μολυσμένων ανθρώπων & ζώων 1905, Zammit et al.: απομόνωση βρουκέλλα σε γάλα μολυσμένων ζώων 1919: το μικρόβιο ονομάστηκε βρουκέλλα πυρετός της Μάλτας, της Μεσογείου, του Γιβραλτάρ Μελιταίος πυρετός Κυματοειδής πυρετός David Bruce (center), with members of the Mediterranean Fever Commission

Παθογένεια Μολυσματική δόση: 10-100 βακτήρια Χρόνος επώασης: 5 ημέρες - 5 μήνες (~ 3-4 εβδομάδες) B. melitensis & B. suis προκαλούν σοβαρότερη νόσο από B. abortus & B. canis Είσοδος βρουκελλών στον οργανισμό μέσω επιθηλιακού φραγμού (δέρμα, ρινοφάρυγγας, πνεύμονες, επιπεφυκότες) φαγοκυττάρωση από πολυμορφοπύρηνα και μονοκύτταρα μακροφάγα Προσέγγιση επιχώριων λεμφαδένων (μέσω λεμφαγγείων) Αποτυχία επιχώριων μηχανισμών κυκλοφορία αίματος (βακτηριαιμία) Μεταφορά σε περιοχές πλούσιες σε κύτταρα δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (ήπαρ, σπλήνας, λεμφαδένες, μυελός των οστών)

Παθογένεια Κοκκιώματα (μολυσμένα μακροφάγα, ενεργοποιημένα CD4+, CD8+ λεμφοκύτταρα, επιθηλιοειδή και γιγαντοειδή κύτταρα, ινώδης συνδετικός ιστός, αποτιτανώσεις) λύση μολυσμένων κυττάρων συνεχής απελευθέρωση βακτηρίων συντήρηση φλεγμονώδους αντίδρασης στην περιοχή του κοκκιώματος (Α) Πολλαπλά ηπατικά κοκκιώματα - 3 εβδομάδες μετά τη μόλυνση με Brucella melitensis (Χρώση αιματοξυλίνης - ηωσίνης) (Β) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση βακτηριακών εστιών (Anti-Brucella IgG αιγός, 3,3'-diaminobenzidine, (DAB) ως χρωμογόνο (καφέ ίζημα)

Φαγοκυττάρωση (A-D): Πρόσληψη Brucella από ανθρώπινο μακροφάγο με φαγοκυττάρωση. (E, F): Φαγόσωμα αναπαραγωγής, ενδοκυττάρια θέση παρασιτισμού του βακτηρίου Aνθρώπινα μακροφάγα: Εγκατάσταση βρουκελλών σε συμβατικά φαγοσώματα (πρώιμα φαγοσώματα: τμήμα κυτταρικής μεμβράνης μακροφάγου) Τροποποίηση περιβάλλοντος πρώιμων φαγοσωμάτων Αναστολή ωρίμανσης των πρώιμων προς όψιμα φαγοσώματα Φαγοσώματα αναπαραγωγής (replicative phagosomes) ή βρουκελλοσώματα (brucellosomes): Η μεμβράνη τους αποτελείται από τμήματα του ενδοπλασματικού δικτύου

Ανοσολογική απόκριση του ξενιστή 1 - + 5 - + http://cursoenarm.net 4 + 2 1) Εισαγωγή βρουκέλλων στον ξενιστή, φαγοκυττάρωση από μακροφάγα και επεξεργασία αντιγόνου βρουκέλλας 2) Διέγερση Τ λεμφοκυττάρων (γ/δ) για παραγωγή IFN-γ 3) Επαγωγή με IFN-γ άμεσης δράσης Τ λεμφοκυττάρων και ενεργοποίηση μακροφάγων κατά βρουκέλλας + 5) Αναστολή παραγωγής TNF-α αναστολή κυτταροτοξικής δράσης ΝΚ κυττάρων και εξουδετέρωσης μακροφάγων 6) Απελευθέρωση βακτηρίων μόλυνση άλλων κυττάρων 7 4) Επαγωγή από INF-γ της κυτταροτοξικής δράσης ΝΚ κυττάρων έναντι βακτηρίων και μολυσμένων μακροφάγων 7) Παραγωγή Abs από Β λεμφοκύτταρα οψωνοποίηση βρουκελλών επιτυχής φαγοκυττάρωση 3

Κλινική εικόνα Βρουκέλλωση: συστηματική λοίμωξη με ποικίλες κλινικές εκδηλώσεις Προσβολή οποιουδήποτε συστήματος ή οργάνου του ανθρώπου Διαφορική διάγνωση πολλών κλινικών καταστάσεων Μη ειδικά συμπτώματα 50% των περιπτώσεων Ύπουλη έναρξη νόσου ή ασυμπτωματική Αιφνίδια έναρξη με έντονα συμπτώματα ή εμφάνιση συμπτωμάτων σε συγκεκριμένη θέση προσβολής (εστιακά εντοπισμένη νόσος) Elsevier 2004

34 πιο συχνά κλινικά σημεία 1500 ασθενείς με αποδεδειγμένη νόσο Πυρετός με νυχτερινές, συνήθως δύσοσμες εφιδρώσεις, Ρίγος, Αδιαθεσία, Αρθραλγίες, Οσφυαλγία, Κεφαλαλγία, Ανορεξία, Κόπωση και Γενικευμένη αδυναμία

Κλινική εικόνα Οστεοαρθρικές εκδηλώσεις (~20-60%) (η πιο συχνή εντοπισμένη μορφή) Ιερολαγονίτιδα (54%) Περιφερική αρθρίτιδα (33%), Σπονδυλίτιδα (10%) Ουρογεννητικό σύστημα Ορχεοεπιδιδυμίτιδα (2-20%) Προσβολή πλακούντα (αποβολές) Προσβολή του ήπατος Τρανσαμινασαιμία (25%) Σπάνια: ηπατικό απόστημα, ίκτερος, χολοκυστίτιδα, περιτονίτιδα Ιστολογικά: κοκκιωματώδης νόσος Νευροβρουκέλλωση (5-7%) Δυσμενή πρόγνωση (θνητότητα 8.3%) Μηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα προσβολή εγκεφαλικών συζυγιών Αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια Σπάνια: εγκεφαλικό απόστημα, αγγειίτιδα, ανευρύσματα, απομυελινωτική νόσος, ψυχιατρικές εκδηλώσεις, υδροκέφαλος Αυχενική δυσκαμψία (<50%) MRI: μη ειδικά ευρήματα ΕΝΥ: πλειοκυττάρωση, πρωτεΐνη, σάκχαρο

Κλινική εικόνα Ενδοκαρδίτιδα (<1%) (το κύριο αίτιο θνητότητας) Προσβολή αορτικής βαλβίδας Άμεση χειρουργική επέμβαση Σχηματισμός ανευρυσμάτων, περικαρδίτιδα, μυοκαρδίτιδα Αναπνευστικό σύστημα (7%) Βήχας, δύσπνοια, θωρακικό άλγος Βρογχίτιδα, πνευμονία, πλευριτική συλλογή, εμπύημα, απόστημα Πλευριτικό υγρό: πλειοκυττάρωση με λεμφοκυτταρικό τύπο, πρωτεΐνη, ADA Διαφορική διάγνωση: TBC σαρκοείδωση Δερματικές εκδηλώσεις (1-14%) Ασθενείς με επαγγελματική έκθεση Μη ειδικό κηλιδοβλατιδώδες εξάνθημα, φυσαλίδες, οζώδες ερύθημα Δερματικά έλκη, λεμφαγγειίτιδα Οφθαλμική προσβολή Ραγοειδίτιδα, επιπεφυκίτιδα, χοριοειδίτιδα, κερατίτιδα, αιμορραγία αμφιβληστροειδούς, οίδημα οπτικής θηλής Αιματολογικές διαταραχές Αναιμία 44-74% Λευκοκυττάρωση (9%) σε εντοπισμένες μορφές Θρομβοπενία (10%)

Κλινική εικόνα 3 κλινικές κατηγορίες βρουκέλλωσης Οξεία (διάρκεια νόσου < 8 εβδομάδων) - τυπική κλινική εικόνα Υποξεία ή κυματοειδής μορφή (ασαφής κλινική εικόνα) ηπιότερα συμπτώματα σε σχέση με οξεία νόσο ασθενείς υποτροπιάζουν (5-10%) ατελής αγωγή λήψη ακατάλληλης θεραπευτικής αγωγής - λανθασμένη αρχική διάγνωση (φυματίωση, τυφοειδής πυρετός, νοσήματα συνδετικού ιστού, σαρκοείδωση, λεμφώματα) Χρόνια (διάρκεια νόσου > 12 μηνών) - με ή χωρίς εστιακή εντόπιση 10-30% ασθενών με βρουκέλλωση ενήλικες άνω 40 ετών παράταση για αρκετά έτη εμφάνιση ενδιάμεσων μακρών περιόδων χωρίς συμπτώματα ανθεκτικότητα στην αντιμικροβιακή θεραπεία

Καλλιέργεια Εξέταση εκλογής: αίμα, μυελός των οστών, ΕΝΥ, αρθρικό υγρό, ούρα, λεμφαδένες, σπλήνας, ήπαρ Θετικοποίηση καλλιέργειας αίματος: 7 η - 21 η ημέρα Kαλλιεργητικό υλικό ζωμού κρέατος εμπλουτισμένο με γλυκόζη ή σωληνάρια με καλλιεργητικό υλικό Ruiz-Castaneda (10% CO 2, 37 o C) Νέα αυτοματοποιημένα συστήματα αιμοκαλλιέργειας (Bactec, BacAlert): γρήγορη ανάπτυξη βακτηρίου, μείωση χρόνου επώασης ποσοστό θετικότητας αιμοκαλλιέργειας (50-80%): Οξεία λοίμωξη, ακόμη και σε απύρετους ασθενείς Καλλιέργεια μυελού των οστών: υψηλότερη απόδοση κατά 15-20% (προτείνεται χρόνια βρουκέλλωση) κίνδυνος εργαστηριακής μετάδοσης Διενέργεια καλλιεργειών εργαστήρια βιοασφάλειας επιπέδου 3

Ορολογική διάγνωση Ανίχνευση υψηλού τίτλου ειδικών αντιβρουκελλικών αντισωμάτων ή τετραπλασιασμό του τίτλου σε δύο δείγματα ορού με μεσοδιαστήματα δύο εβδομάδων Συγκολλητινοαντίδραση σε σωληνάρια (SAT, αντίδραση Wright) Ταυτόχρονη ανίχνευση IgG, IgM, IgA Abs έναντι s-lps Αξιολογίσιμος τίτλος 1:160 σε συμβατά κλινικά συμπτώματα 1:320 σε ενδημικές περιοχές 4πλάσια άνοδος ή μείωση σε 4-12 εβδομάδες Ψευδώς θετικά Σε ενδημικές περιοχές Διασταυρούμενες αντιδράσεις με F. tularensis, E. coli O:116 και O:157, Υ. enterocolitica, V. cholerae, S. maltophila Ψευδώς αρνητικά B. canis (δε διαθέτει s-lps) Χρόνια νόσο Φαινόμενο προζώνης

Ορολογική διάγνωση Συγκολλητινοαντίδραση επί πλακός (Rose Bengal) Αντιγόνο: εναιώρημα κυττάρων B. abortus σε όξινο περιβάλλον Απλή και ταχεία μέθοδος (2-3 min) - screening test Υψηλή ευαισθησία (>99 %) Μέθοδος ανίχνευσης σε ενδημικές περιοχές _ + Μειονεκτήματα Διασταυρούμενες αντιδράσεις (τουλαραιμία, υερσίνωση, χολέρα, ρικετσίωση, φυματίωση, λεμφώματα) Χαμηλή ειδικότητα (άτομα με παλαιό ιστορικό νόσησης ή επαναλαμβανόμενες εκθέσεις στη βρουκέλλα) Επιβεβαίωση (+) αποτελεσμάτων με συγκολλητινοαντίδραση σε σωληνάριο Ψευδώς αρνητικά στην αρχή της λοίμωξης

Ορολογική διάγνωση Έμμεση αντίδραση Coombs 4+ 3+ 2+ 1+ 0 Ανίχνευση ατελών αντισωμάτων (IgG και IgA) (χρήση αντι-ανθρώπινης σφαιρίνης) Παρόντα σε χρόνιους ασθενείς Ευαισθησία 91.5% Ειδικότητα 99.8% σε τίτλο 1:160 Ψευδώς θετικά σε ενδημικές περιοχές

Ορολογική διάγνωση Ανοσοδεσμευτική μέθοδος - Brucellacapt Ανίχνευση ολικών αντι-βρουκελλικών αντισωμάτων Αποτελέσματα σε 24 ώρες Υψηλή ευαισθησία (95.1%) και ειδικότητα (99%) Tίτλος 1:320 ενδεικτικός βρουκέλλωσης (κλινική συναξιολόγηση, επιπολασμός της νόσου) Παρακολούθηση στα πλαίσια τακτικού ελέγχου (follow-up) Anti-human immunoglobulins Antibodies in serum Antigen: stained B. abortus suspension formaldehyde treated Σε ενδημικές περιοχές, ιδιαίτερα χρήσιμη για ανίχνευση χρόνιων κρουσμάτων και εστιασμένων μορφών βρουκέλλωσης Ανίχνευση οξείας βρουκέλλωσης (αν και υπάρχουν πιο οικονομικές μέθοδοι για εύκολη ανίχνευση οξέων κρουσμάτων (SAT, Rose Bengal, Coombs, ELISA)

Ορολογική διάγνωση Ανοσοενζυμική μέθοδος - ELISA Evaluation of seven tests for diagnosis of human Brucellosis in an area where the disease is endemic Υποκλινική λοίμωξη Οξεία βρουκέλλωση Χρόνια βρουκέλλωση Gomez et al., Clin Vaccine Immunol, 2008 Ανίχνευση IgM, IgG και/ή IgA Abs έναντι επιφανειακών αντιγόνων (LPS) ευαισθησία σε περιστατικά χρόνιας βρουκέλλωσης κόστος σε σύγκριση με συγκολλητινοαντιδράσεις αξία στην παρακολούθηση απόκρισης στη θεραπεία (παραμονή τίτλων Abs) Αδυναμία διάκρισης ενεργού λοίμωξης από παρελθούσα (συνύπαρξη IgG+IgM Abs) ευαισθησία ανίχνευσης IgM στην οξεία λοίμωξη

Χρησιμότητα ορολογικών μεθόδων κατά τα διαφορετικά στάδια της βρουκέλλωσης Ορολογική μέθοδος Οξεία Χρόνια Υποτροπή Wright ++ - ± Rose Bengal +++ - ± Έμμεση Coombs ± +++ +++ IgM ELISA +++ - - IgG ELISA ++ +++ +++ IgA ELISA + +++ +++ Brucella capt + +++ +++ Αξιολόγηση αποτελεσμάτων των ορολογικών μεθόδων Ορολογική μέθοδος Οξεία Χρόνια Υποτροπή Wright 1:160 - ή < 1:160 < 1:160 Rose Bengal + + + Έμμεση Coombs 1:160 1:640 1:640 IgM ELISA + - - IgG ELISA + + τίτλου IgA ELISA + + τίτλου Brucella capt 1:320 1:1280 1:1280 ή τίτλου

Μοριακή διάγνωση Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) 16S rrna, outer membrane protein (omp2a, omp2b), 23S rrna, IS711, BCSP31 Διάγνωση πρωτοπαθούς λοίμωξης, υποτροπής μετά από θεραπεία, εστιακών επιπλοκών της νόσου Ολικό αίμα, βιοψία ήπατος ή σπληνός, αποστήματα, αρθρικό υγρό PCR πραγματικού χρόνου (Real-time PCR): ποσοστικός προσδιορισμός βακτηρίων Τυποποίηση μεθόδου σε εξειδικευμένα εργαστήρια

Στην προ αντιβιοτικών εποχή Θεραπεία Βρουκέλλωση: χρόνια υποτροπιάζουσα λοίμωξη (θνητότητα ~ 3-5%) Εποχή μετά τα αντιβιοτικά Υποχώρηση συμπτωμάτων σε ~ 4-7 ημέρες Ελάττωση συχνότητας υποτροπών και επιπλοκών Μείωση θνητότητας (<1%) Αντιβιοτικά: διείσδυση σε μακροφάγα & δράση σε όξινο ph Εκρίζωση βακτηρίου Απαραίτητη η συνδυαστική θεραπεία Μακροχρόνια θεραπεία (> 6 εβδομάδες) Συμμόρφωση ασθενούς Θεραπευτικό πρωτόκολλο για τη βρουκέλλωση ριφαμπικίνη (600-900 mg p.o., qd) + δοξυκυκλίνη (200 mg p.o., qd), 6 εβδομάδες στρεπτομυκίνη (1gr i.m., 2-3 εβδομάδες) + δοξυκυκλίνη (200 mg p.o., gd, 6 εβδομάδες) μικρότερη πιθανότητα για υποτροπή

Επιδημιολογικά στοιχεία - Ελλάδα Σύστημα υποχρεωτικής δήλωσης νοσημάτων 2005-2009 Η μέση ετήσια δηλούμενη επίπτωση του νοσήματος ήταν 2.2/100.000 πληθυσμού Θεσσαλία: 9.6/100.000 Ανατολική Μακεδονία & Θράκη:7.8/100.000 Νότιο Αιγαίο: 0.3/100.000 Κρήτη: 0.4/100000

Επιδημιολογικά στοιχεία - Ελλάδα δηλούμενη επίπτωση, 2008 μεγάλη επιδημία στη Θάσο (104 κρούσματα) Διαχρονική εξέλιξη της δηλούμενης επίπτωσης της βρουκέλλωσης στην Ελλάδα, 2000-2009 Μέση ετήσια δηλουμένη επίπτωση της βρουκέλλωσης στην Ελλάδα ανά φύλο και ηλιακή ομάδα, 2005-2009 Η συχνότητα εμφάνισης του νοσήματος στους άνδρες ήταν σχεδόν διπλάσια από αυτή στις γυναίκες

Επιδημιολογικά στοιχεία - Ελλάδα Μέση ετήσια δηλούμενη επίπτωση της βρουκέλλωσης ανά μήνα έναρξης συμπτωμάτων, 2005-2009 Εποχική διακύμανση συχνότητας (Απρίλιο, Μάιο, Ιούνιο) Κατανομή συχνότητας δηλωθέντων κρουσμάτων βρουκέλλωσης ανά επάγγελμα υψηλού κινδύνου, 2005-2009 ενασχόληση με επάγγελμα υψηλού κινδύνου (62%) κτηνοτρόφοι (45%)

Βιοτρομοκρατία * Σχετικά εύκολη διάδοση Μέτρια ποσοστά νοσηρότητας και χαμηλά ποσοστά θνησιμότητας Απαίτηση υψηλής διαγνωστικής ικανότητας και ενισχυμένης επιδημιολογικής επιτήρησης της νόσου

Francisella Gram (-), αυστηρώς αερόβιο, δυνητικώς ενδοκυττάριο βακτήριο Τάξη: γ-πρωτεοβακτήρια, Υποτάξη: Thiotrichales, Οικογένεια: Francisellaceae, Γένος: Francisella

Francisella tularensis Μικρός, ακίνητος, μη σπορογόνος, ελυτροφόρος κοκκοβάκιλλος Ασθενής χρώση με κυανούν του μεθυλενίου Χαρακτηριστική διπολική χρώση με διάλυμα φαινικούχου φουξίνης Δεν αναπτύσσεται σε κοινά θρεπτικά μέσα (αιματούχο, σοκολατόχρωμο ή McConkey) Αιματούχο άγαρ με 2.5% γλυκόζη και 0.1% υδροχλωρική κυστεΐνη Ελάχιστη μολυσματική δόση: ~ 10 βακτήρια Καταστροφή στους 55 o C για 10 λεπτά βιώσιμη για πολλά χρόνια σε καλλιέργειες, 10 o C - πολλές ημέρες σε μολυσμένο έδαφος και νερό bipolar staining Καταλάση (+) Οξειδάση ( ) Ουρεάση ( ) Φουξίνη Κυανούν του μεθυλενίου Άγαρ κυστεΐνης - γλυκόζης

Francisella tularensis Τουλαραιμία: άνθρωπος και μικρά θηλαστικά (κουνέλια, λαγοί, κάστορες, τρωκτικά) Μετάδοση άμεση επαφή με μολυσμένα ζώα (κουνέλια, λαγοί) δήγμα μυγών, κουνουπιών και κροτώνων κατανάλωση μολυσμένου νερού (κουφάρια ή περιττώματα μολυσμένων τρωκτικών) ή ανεπαρκώς μαγειρεμένου κρέατος εισπνοή βακτηρίων σε αερόλυμα (μετά από θερισμό, κοπή χόρτων, συσσώρευση μολυσμένου σανού)

Francisella tularensis 2 κύκλοι ζωής Εδαφικός Κρότωνες & τρωκτικά Τύπος Α Υδάτινος Λαγόμορφα, έντομα, προνύμφες & τρωκτικά Τύπος Β Τύπος A (F. tularensis tularensis ή F. tularensis nearctica) - πολύ παθογόνος Β. Αμερική κρότωνες πρόκληση βαριάς θανατηφόρου νόσου χωρίς θεραπεία Τύπος B (F. tularensis palaearctica ή F. tularensis holarctica) - λιγότερο λοιμογόνος Ευρώπη, Ασία, Β. Αμερική κουνούπια πρόκληση ήπιας νόσου (μικρή θνητότητα, παρατεταμένη νοσηρότητα)

Κλινική εικόνα Αιφνίδια έναρξη πυρετού, μυαλγίας, κεφαλαλγίας Εξέλιξη της νόσου σε μια από τις παρακάτω μορφές: Ελκωτική-λεμφαδενική (~75%, επίπονη κηλιδοβλατιδώδη αλλοίωση στο σημείο εισόδου, εξέλκωση, επίπονοι & έντονα φλεγμένοντες περιφερικοί λεμφαδένες) Λεμφαδενική (περιφερική λεμφαδενοπάθεια χωρίς έλκος) Οφθαλμολεμφαδενική (σοβαρή επιπεφυκίτιδα και επιχώρια λεμφαδενίτιδα) Ρινοφαρυγγική (σοβαρή εξιδρωματική στοματίτιδα,φαρυγγίτιδα ή αμυγδαλίτιδα, τραχηλική λεμφαδενοπάθεια) Τυφοειδής (υψηλός πυρετός, ηπατομεγαλία, σπληνομεγαλία) Γαστρεντερική (εντερικό άλγος, εμετός και διάρροια) Πνευμονική (πυρετός, ξηρός βήχας, θωρακικό άλγος, πυλαία λεμφαδενίτιδα) σκόπιμη απελευθέρωση των βακτηρίων σε αερόλυμα ως βιολογικό όπλο

Ανοσολογική απόκριση του ξενιστή 1) Είσοδος F. tularensis στην αναπνευστική οδό, 2) Είσοδος στο αναπνευστικό επιθήλιο (ενδοκυττάρωση βακτηρίου από Μ κύτταρα), 3) τα δενδριτικά κύτταρα φτάνουν στους επιχώριους λεμφαδένες και παρουσιάζουν τα αντιγόνα του βακτηρίου στα Th1 βοηθητικά κύτταρα, 4) τα οποία πολλαπλασιάζονται και μπορούν να επιστρέψουν στη θέση της αρχικής λοίμωξης. 5) Η επαναλαμβανόμενη διέγερση από τοπικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα οδηγεί σε παραγωγή IFN-γ και ενεργοποίηση μακροφάγων. 6) Αποτυχία εξουδετέρωσης της F. tularensis οδηγεί σε σχηματισμό κοκκιωμάτων.

Διάγνωση F. tularensis: εξαιρετικά μολυσματική - βιοασφάλεια επιπέδου 3 (χειρισμός μικροβίου, εργασία με πειραματόζωα) Καλλιέργεια: Ενοφθαλμισμός αίματος, ιστών ή εκκρίματος τοπικών βλαβών σε αιματούχο glucose-cysteine ή cysteine heart άγαρ μικρές, βλεννώδεις αποικίες Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR): έκκριμα ελκών ή υλικό αναρρόφησης Ορολογικός έλεγχος Ανίχνευση Abs έναντι F. tularensis ~ 3 εβδομάδες 4πλάσια αύξηση Abs έναντι της F. tularensis ή 1 μεμονωμένος τίτλος συγκολλητινών 1/160 * Διασταυρούμενες αντιδράσεις σε δείγματα ασθενών με βρουκέλλωση ( τίτλοι Abs)

Θεραπεία Ευαισθησία σε αμινογλυκοσίδες, χλωραμφενικόλη, φθοριοκινολόνες, τετρακυκλίνες Αντοχή στα περισσότερα β-λακταμικά αντιβιοτικά Αντιβιοτικά εκλογής (στρεπτομυκίνη / γενταμικίνη) πλήρης ίαση Διάρκεια θεραπείας: 10 ημέρες τουλάχιστον (14 αν σιπροφλοξασίνη) Τετρακυκλίνες ή χλωραμφενικόλη (βακτηριοστατικά αντιβιοτικά) υψηλές δόσεις αποτελεσματικές υποτροπές (μικρή διάρκεια θεραπείας)

Ενδοκυττάριος κύκλος Φαγοκυττάρωση βακτηριών από μακροφάγα Παραμονή βακτηρίων σε πρώιμο φαγόσωμα αποφυγή σύντηξης με αυτοφαγικά κυστίδια και λυσόσωμα Chong and Celli (2010) Frontiers in Microbiology - Cellular and Infection Microbiology Ταχεία διάσπαση του FCP κυτταρόπλασμα (έντονος πολλαπλασιασμός) Σχηματισμός νέων κυστιδίων (Francisella-containing vacuoles, FCV) ή Κυτταρικός θάνατος απελευθέρωση βακτηρίων και διαδοχική μόλυνση άλλων κυττάρων

Βιοτρομοκρατία * Εύκολη εξάπλωση ή μετάδοση από άτομο σε άτομο Υψηλά ποσοστά θνησιμότητας Σημαντικές επιπτώσεις στη δημόσια υγεία Πρόκληση αντιδράσεων πανικού και κοινωνικής αναστάτωσης Ειδική δράση για ετοιμότητα δημόσιας υγείας Η διασπορά αερολύματος 50 kg μολυσματικής F. tularensis σε μια μητροπολιτική περιοχή με 5 εκατομμύρια κατοίκους θα προκαλέσει νόσο σε 250.000 άτομα, εκ των οποίων 19.000 θα καταλήξουν. Στη συνέχεια θα εμφανιστούν υποτροπές πολλούς μήνες μετά την αρχική έκθεση, ενώ είναι δυνατό να δημιουργηθούν ενζωοτικά αποθέματα του βακτηρίου σε άγρια ζώα, με αποτέλεσμα πιθανές επακόλουθες εξάρσεις. Το 1995 τα κρούσματα τουλαραιμίας που καταγράφονταν ετησίως στις ΗΠΑ ήταν τόσο λίγα ώστε η λοίμωξη αφαιρέθηκε από τον κατάλογο των υποχρεωτικώς δηλουμένων νοσημάτων. Ωστόσο ο φόβος ότι θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικό όπλο οδηγησε στην επανεισαγωγή της στον κατάλογο το 2000.

Pasteurella Gram (-), αερόβιο, δυνητικώς ενδοκυττάριο βακτήριο Τάξη: γ-πρωτεοβακτηρίων, Υποτάξη: Pasteurellales, Οικογένεια: Pasteurellaceae, Γένη: Pasteurella

Pasteurella multocida Ακίνητος, σακχαρολυτικός, μη σπορογόνος και ελυτροφόρος Χρώση επιχρισμάτων αίματος ή ιστών: διπολική χρώση 5 αντιγόνα ελύτρου (A, B, D, E, F) & 11 σωματικά LPS αντιγόνα Εύκολη ανάπτυξη σε αιματούχο και το σοκολατόχρωμο άγαρ Δεν αναπτύσσεται σε MacConkey άγαρ Καταστροφή 55 o C για λίγα λεπτά διάλυμα φαινόλης (0.5%) για 15 λεπτά Επιβίωση και λοιμογόνος δράση ~3 εβδομάδες σε αποξηραμένο αίμα πολλοί μήνες σε ιστούς στην κατάψυξη Dextrose Maltose Lactose Sucrose Mannitol Ctrl (+) (-) (-) (+) (+) Indole VP MR Ctrl (+) (-) (-) Catalase (+)

Επιδημιολογία Ανθρώπινα παθογόνα: P. multocida multocida, P. multocida septica, P. canis, P. stomatis, P. dagmatis, P. haemolytica Αποικισμός ρινοφάρυγγα άγριων & οικόσιτων ζώων (στοματική χλωρίδα) 70-80% των γατών 25-50% των σκύλων Τραυματικός ενοφθαλμισμός (εκδορά ή δήγμα, σίελος) Εισπνοή μολυσματικών σταγονιδίων (λοίμωξη αναπνευστικού του ζώου) Ανίχνευση στο ρινοφάρυγγα ατόμων που έχουν συχνή επαφή με ζώα

Παθογένεια - Κλινική εικόνα P. multocida: εξαιρετικά λοιμογόνος για πολλά είδη ζώων και πτηνών Χολέρα των πτηνών και αιμορραγική σηψαιμία (θανατηφόρος) Λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος και ατροφική ρινίτιδα των χοίρων Λοιμογονικότητα: έλυτρο ( παθογονικότητα: λεία στελέχη), δερμονεκρωτική πρωτεϊνική τοξίνη, νευραμινιδάση, LPS Άνθρωπος: Εντοπισμένο απόστημα με κυτταρίτιδα*, αδενίτιδα, οστεομυελίτιδα * Ταχύτατη ανάπτυξη (< 24 ώρες) φλεγμονή υποδόριου συνδετικού ιστού (οίδημα, ερυθρότητα, ευαισθησία, και ορώδες ή οροαιματηρό πυώδες έκκριμα)

Κλινική εικόνα Άνθρωπος: Λοιμώξεις του αναπνευστικού (πλευρίτιδα, πνευμονία, πνευμονικό απόστημα, εμπύημα, βρογχίτιδα, παραρρινοκολπίτιδα) Μηνιγγίτιδα, εγκεφαλικό απόστημα Ενδοκαρδίτιδα, περικαρδίτιδα Σηψαιμία Λοιμώξεις οφθαλμού (επιπεφυκίτιδα, έλκος κερατοειδούς, ενδοφθαλμίτιδα), ήπατος (ηπατικό απόστημα), εντέρου (περιτονίτιδα), γεννητικού συστήματος Προδιαθεσικοί παράγοντες για βακτηριαιμία από λοίμωξη με P. multosida ηπατική νόσος ανοσοκαταστολή

Διάγνωση Καλλιέργεια σε αιματούχο άγαρ Η απομόνωση των ειδών Pasteurella από έκκριμα της τραυματισμένης περιοχής ή από άλλες περιοχές λοίμωξης (αίμα, ενδοαρθρικό υγρό, ΕΝΥ, πτύελα, πλευριτικό υγρό ή εμπύημα λεμφαδένων) θεωρείται διαγνωστική Φάρμακο εκλογής: πενικιλίνη (εναλλακτικά: αμπικιλλίνη, τετρακυκλίνες, χλωραμφενικόλη) Διάρκεια θεραπείας: 7-10 ημέρες για τις εντοπισμένες λοιμώξεις 10-14 ημέρες για τις πιο σοβαρές Θεραπεία συνέχιση για 4-6 ημέρες σε λοιμώξεις οστών & αρθρώσεων οστεομυελίτιδα (δήγμα σκύλου ή γάτας): συνέχιση αγωγής για 8 εβδομάδες παροχέτευση τραύματος ή χειρουργικός καθαρισμός