ΥΒΡΙΔΙΚΑ ΜΟΡΙΑ ΚΙΝΟΛΙΝΟΝΩΝ-ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΜΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΔΡΑΣΗ Π. Γενναίου, Μ. Ρουσσάκη, Α. Δέτση Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π., Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 157 80 Αθήνα Θ. Λιαργκόβα, Δ. Χατζηπαύλου-Λίτινα Τμήμα Φαρμακευτικής Χημείας, Φαρμακευτική Σχολή, ΑΠΘ, Θεσσαλονίκη ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η σύνθεση υβριδικών μορίων που περιέχουν το δομικό σκελετό δύο φαρμακοφόρων ενώσεων. Ως αποτέλεσμα, τα υβριδικά μόρια που συντέθηκαν συνδυάζουν το δομικό σκελετό της κινολινόνης και ενός από τα πιο διαδεδομένα φυσικά φαινολικά οξέα, του p-κουμαρικού οξέος, και είναι πιθανό να παρουσιάζουν ισχυρή συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Σχήμα 1. Υβριδικά μόρια που συντέθηκαν στην παρούσα εργασία Τα μόρια που συντέθηκαν μελετήθηκαν για την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Η βιοδραστικότητα των υβριδικών παραγώγων είναι σημαντικά βελτιωμένη σε σχέση με τις πρόδρομες ένωσεις, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η σύνθεση υβριδικών αναλόγων κινολινονών-φαινολικών οξέων αποτελεί ενδιαφέρουσα προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων ενώσεων με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μέθοδος της σύνθεσης υβριδικών μορίων που περιέχουν το δομικό σκελετό δύο φαρμακοφόρων ενώσεων αποτελεί συνηθισμένη και αποτελεσματική μέθοδο για την αύξηση των βιοδραστικών ιδιοτήτων των προς μελέτη παραγωγών. Στην παρούσα εργασία, συνδυάστηκαν επιτυχώς στο ίδιο μόριο, ο δομικός σκελετός των κινολινονών και του p- κουμαρικού οξέος. Οι κινολινόνες αποτελούν ετεροκυκλικές ενώσεις που απαντώνται κυρίως ως αλκαλοειδή και παρουσιάζουν βιοδραστικές ιδιότητες. Η βασική δομή των κινολινονών είναι χαρακτηριστική σε πλήθος φυσικών προϊόντων και συνθετικών αναλόγων που παρουσιάζουν βιολογική δράση. Μόρια που περιέχουν τουλάχιστον το σύστημα συμπυκνωμένων δακτυλίων της κινολινόνης παρουσιάζουν αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, οι οποίες προκαλούν ενδιαφέρον για περαιτέρω έρευνα.[1] Τα φαινολικά οξέα είναι δευτερογενείς αρωματικοί μεταβολίτες ευρέως διαδεδομένοι στο φυτικό βασίλειο. Τα ανάλογα των φαινολικών οξέων έχουν μελετηθεί κυρίως ως προς την προστατευτική δράση τους απέναντι στις οξειδωτικό βλάβες που οδηγούν σε πλήθος εκφυλιστικών ασθενειών, όπως οι φλεγμονές και ο καρκίνος. Είναι, επομένως, αναμενόμενες οι αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες των φαινολικών οξέων.[2]
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. Σύνθεση των υβριδικών μορίων Η σύνθεση των επιθυμητών υβριδικών μορίων, απαιτεί αρχικά τη σύνθεση της Ν-μεθυλο-3- μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνης (3a) και της Ν-φαινυλο-3-μεθοξυκαρβονυλο-4- υδροξυ-2-κινολινόνης (3b). Η σύνθεση της ένωσης 3a πραγματοποιήθηκε σε δύο στάδια, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2. Σχήμα 2. Σύνθεση της 3-μεθοξυκαρβόνυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνης 3a Αρχικά πραγματοποιήθηκε μεθυλίωση του ισατοϊκού ανυδρίτη (1), χρησιμοποιώντας ως βάση υδρίδιο του νατρίου σε διαλύτη DMF και μεθυλοϊωδίδιο ως αλκυλιωτικό μέσο. Ο Ν- μεθυλο-ισατοϊκός ανυδρίτης (2) ελήφθη μετά από ψύξη του διαλύματος και παραλαβή του ιζήματος με διήθηση σε απόδοση 89%. Η καθαρότητα της ένωσης 2 πιστοποιήθηκε με φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Τελικά το προϊόν χρησιμοποιήθηκε χωρίς περαιτέρω καθαρισμό στο επόμενο στάδιο. Στη συνέχεια, ο Ν-μεθυλο-ισατοϊκός ανυδρίτης (2) έδρασε ως ακυλιωτικό μέσο για την C- ακυλίωση του μηλονικού διμεθυλεστέρα σε βασικό περιβάλλον. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε, όπως και προηγουμένως, χρησιμοποιώντας ως βάση υδρίδιο του νατρίου σε διαλύτη DMF. Η 3-μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνη (3a) παραλήφθηκε με διήθηση, μετά από οξίνιση του διαλύματος, σε απόδοση 58% και χρησιμοποιήθηκε χωρίς περαιτέρω επεξεργασία στο επόμενο στάδιο. Η σύνθεση της ένωσης 3b πργαματοποιήθηκε ακολουθώντας τη μεθοδολογία που έχει παλαιότερα αναπτυχθεί στο Εργαστήριο Οργανικής Χημείας ΕΜΠ (Σχήμα 3) [3]. Συνοπτικά, η μεθοδολογία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας του Ν-φαινυλοανθρανιλικού οξέος 4 με Ν-υδροξυβενζοτριαζόλιο (ΗΟΒt) παρουσία δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμιδίου (DCC) σε διαλύτη άνυδρο τετραϋδροφουράνιο (THF) και προσθήκη του παραγόμενου εστέρα χωρίς να απομονωθεί σε μίγμα υδριδίου του νατρίου (NaH):μηλονικού διμεθυλεστέρα 2:1 σε άνυδρο THF. Με κατάλληλη κατεργασία απομονώνεται η Ν-φαινυλο-3-μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνη (3b). Σχήμα 3: Σύνθεση της Ν-φαινυλο-3-μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινόνης (3b)
Στο επόμενο στάδιο παρασκευάστηκαν τα καρβοξαμίδια 5a και 5b (Σχήμα 4). Σχήμα 4. Σύνθεση των καρβοξαμιδίων 5a και 5b Η σύνθεση των μορίων 5a και 5b πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των Ν-υποκατεστημένων- 3-μεθοξυκαρβονυλο-4-υδροξυ-2-κινολινονών (3), με την αλειφατική αμίνη αιθυλενοδιαμίνη, σε διαλύτη άνυδρο τολουόλιο. Τα σχηματιζόμενα καρβοξαμίδια 5a και 5b είναι αδιάλυτα στο τολουόλιο, οπότε η παραλαβή τους ήταν απλή με διήθηση και έκπλυση με διαιθυλαιθέρα. Στη συνέχεια, για τη σύνθεση των υβριδικών μορίων ήταν απαραίτητη η ενεργοποίηση του καρβοξυλίου του p-κουμαρικού οξέος (6) με τη μορφή ενεργού εστέρα με Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο. Η σύνθεση του ηλεκτριμιδυλεστέρα του p-κουμαρικού οξέος (7) πραγματοποιήθηκε με αντίδραση μεταξύ του p-κουμαρικού οξέος και του Ν- υδροξυηλεκτριμιδίου, παρουσία δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμιδίου (DCC) ως αφυδατικού παράγοντα και σε διαλύτη τετραϋδροφουράνιο (THF). Η σύνθεση των νέων υβριδικών μορίων 8a και 8b, πραγματοποιείται με την αντίδραση μεταξύ των καρβοξαμιδίων 5a και 5b και του ενεργού εστέρα του p-κουμαρικού οξέος 7, σε διαλύτη διχλωρομεθάνιο (Σχήμα 5). Τα τελικά προϊόντα 8a και 8b παραλαμβάνονται σε καθαρή μορφή μετά από εκχύλιση και καθαρισμό με χρωματογραφία στήλης. Σχήμα 5. Σύνθεση των τελικών υβριδικών μορίων
Β. Αξιολόγηση της ικανότητας των ενώσεων να αναστέλλουν τη λιπιδική υπεροξείδωση Η αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης από τις ενώσεις που παρασκευάστηκαν υπολογίζεται από την οξείδωση του λινολεϊκού οξέος σε υδατικό αιώρημα, κάτι που παρατηρείται στα 234 nm. Το 2,2,-αζοδισ-(2-αμιδινοπροπανο)διυδροχλωρίδιο (AAPH) χρησιμοποιείται σαν εκκινητής των ελευθέρων ριζών. Συγκεκριμένα, δέκα μικρόλιτρα από το αιώρημα των 16 mm του λινολεϊκού οξέος προστίθενται στην UV κυψελίδα που περιέχει 0.93 ml από το ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων 0.05 Μ με ph= 7.4 το οποίο έχει προθερμανθεί στους 37 o C. Η αντίδραση οξείδωσης ξεκινά στους 37 ο C υπό ατμοσφαιρική πίεση με την προσθήκη 50 μl του διαλύματος AAPH των 40 mm. Η οξείδωση πραγματοποιείται παρουσία δόσεων 10 μl της υπό εξέταση ένωσης. Στην δοκιμασία χωρίς προσθήκη του αντιοξειδωτικού, η λιπιδική οξείδωση μετράται με την παρουσία ίδιας ποσότητας DMSO. Ο ρυθμός οξείδωσης στους 37 ο C παρακολουθείται καταγράφοντας την αύξηση της απορρόφησης στα 234 nm που προκαλείται από τα συζευγμένα διενικά υδροϋπεροξείδια. Γ. Υπολογισμός της αναστολής της λιποξυγονάσης (LOX) από σόγια in vitro. Οι υπό εξέταση ουσίες διαλύονται σε DMSO και αφήνονται να επωαστούν σε θερμοκρασία δωματίου με λινολεϊκό νάτριο (0.1 ml) και 0.2 ml ενζυμικού διαλύματος (1/9 x 10-4 w/v σε φυσιολογικό ορό) σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris ph= 9. Η μετατροπή του λινολεϊκού νατρίου σε 13-υδροπεροξυλινολεϊκό οξύ στα 234 nm καταγράφεται και συγκρίνεται με το κατάλληλο πρότυπο αναστολέα. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο χαρακτηρισμός της δομής των νέων ενώσεων πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Παραλήφθηκαν φάσματα πρωτονίου ( 1 Η NMR) και φάσματα άνθρακα ( 13 C NMR) για κάθε μόριο που συντέθηκε. Παρουσιάζεται ενδεικτικά παρακάτω το φάσμα πρωτονίου του υβριδικού μορίου 8a. Σχήμα 6: Φάσμα 1 H NMR (DMSO-d 6, 300MHz) της ένωσης 8a
Το φάσμα 1 H NMR (DMSO-d 6, 300MHz) της ένωσης 8a (Σχήμα 6) χαρακτηρίζεται από μια ευρεία κορυφή στα 17.36 ppm, η οποία ολοκληρώνεται για 1 υδρογόνο και αποδίδεται στο πρωτόνιο του υδροξυλίου που βρίσκεται στον άνθρακα της θέσης 4 του αρωματικού δακτυλίου. Η χημική μετατόπιση του συγκεκριμένου πρωτονίου είναι ενδεικτική της συμμετοχής του σε πολύ ισχυρό δεσμό υδρογόνου με το οξυγόνο του καρβονυλίου στη θέση 3 του ετεροκυκλικού δακτυλίου. Χαρακτηριστικές επίσης είναι οι κορυφές στα 10.41 ppm η οποία ολοκληρώνεται για 1Η και αποδίδεται στο υδρογόνο που βρίσκεται στο αμιδικό άζωτο που είναι προσδεδεμένο στον άνθρακα της θέσης 9 και η απλή κορυφή στα 9.89 ppm αποδίδεται στο υδρογόνο του έτερου αμιδικού αζώτου που είναι προσδεδεμένο στον άνθρακα της θέσης 11. Οι διπλές κορυφές στα 7.33 ppm και 6.41 ppm, με σταθερές σύζευξης 16.2 και 15 Ηz αντίστοιχα, αποτελούν χαρακτηριστικές κορυφές που οφείλονται στα πρωτόνια του βινυλικού δεσμού. Πιο συγκεκριμένα, η διπλή κορυφή στα 7.33 ppm ολοκληρώνεται για 1Η και αποδίδεται στο ηλεκτρόνιο της θέσης 13. Παράλληλα η κορυφή στα 6.41 ppm ολοκληρώνεται ομοίως για 1Η και αποδίδεται στο Η-14. Οι τιμές των σταθερών σύζευξης είναι ενδεικτικές της trans-γεωμετρίας του διπλού δεσμού. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα αξιολόγησης της βιολογικής δράσης των νέων υβριδικών μορίων 8a και 8b. Πινακας 1: Αποτελέσματα αξιολόγησης βιοδραστικότητας Ένωση Δομή Αναστολή του ενζύμου λιποξυγονάση από σόγια (LOX) % 0.1mM Βιοδραστικότητα Αναστολή της λιπιδικής υπεροξείδωσης % 0.1mM 8a >100 IC 50 =0.08mM 98.18 8b 80 78.5 NDGA 40 Trolox 63
Τα νέα υβριδικά μόρια που παρασκευάστηκαν εμφανίζουν σημαντική ικανότητα αναστολής του ενζύμου λιποξυγονάση, μεγαλύτερη από την ένωση αναφοράς NDGA, και ικανότητα αναστολής της λιπιδικής υπεροξείδωσης μεγαλύτερη από την ένωση αναφοράς trolox. Το παράγωγο 8a, που περιέχει μεθυλο-ομάδα ως υποκαταστάτη στο άζωτο του ετεροκυκλικού δακτυλίου, εμφανίζει την πιο αξιόλογη συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση καθώς αναστέλλει τη λιπιδική υπεροξείδωση κατά 98% και τη δράση του ενζύμου λιποξυγονάση από σόγια σε ποσοστό >100% (για το λόγο αυτό προσδιορίστηκε η τιμή IC50 η οποία είναι ίση με 0.08mM). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Στην παρούσα εργασία συντέθηκαν δύο νέα υβριδικά μόρια που συνδυάζουν στον ίδιο δομικό σκελετό το ετεροκυκλικό σύστημα της κινολινόνης και ένα από τα πιο διαδεδομένα φαινολικά οξέα, το p-κουμαρικό οξύ. Τα νέα παράγωγα εμφανίζουν συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση, με δραστικότερο το παράγωγο 8a. Συμπεραίνεται ότι η σύνθεση υβριδικών αναλόγων κινολινονών-φαινολικών οξέων αποτελεί ενδιαφέρουσα προσέγγιση για την ανάπτυξη νέων ενώσεων με συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Η σύνθεση αναλόγων υβριδικών ενώσεων χρησιμοποιώντας και άλλα φαινολικά οξέα προκειμένου να πραγματοποιηθεί μελέτη της σχέσης δομής-δράσης, είναι υπό εξέλιξη. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Detsi A., Bouloumbasi D., Prousis K.C., Koufaki M., Athanasellis G., Melagraki G., Afantitis A., Igglessi-Markopoulou O., Kontogiorgis C., Hadjipavlou-Litina D.J., Design and Synthesis of Novel Quinolinone-3-aminoamides and Their α-lipoic Acid Adducts as Antioxidant and Anti-inflammatory Agents. J. Med. Chem., 50: 2450-2458 (2007). [2] Saxena M., Saxena J, Pradhan A., Flavonoids and Phenolic Acids as Antioxidants in Plants and Human Health. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 28: 130-134 (2012) [3] Zikou L., Athanasellis G., Detsi A., Zografos A., Mitsos C., Igglessi-Markopoulou O., Novel Short-step Synthesis of Functionalized 4-Hydroxy-2-Quinolones Using 1-Hydroxybenzotriazole Methodology. Bull. Chem.Soc.Japan, 77:1505-1508 (2004)