Μοριακή τυποποίηση RhD σε RhD αρνητικά ή ασθενώς θετικά δείγματα αιμοδοτών με θετική δοκιμασία Du με NOVACLONE TM Anti-D IgM + IgG στον αυτόματο αναλυτή GALILEO NEO Θ. Κουτσούρη 1*, Ζούλας Δ. 2*, Χαικάλη Ν. 3, Μαραγκάκη Λ. 2, Φλεσσιοπούλου Ι. 4, Μαυράκη Γ. 2, Μεγάλου Α. 2, Σ. Βαλσάμη 1, Σταμούλης Κ. 3, Μ. Πολίτου 1 1 Υπηρεσία Αιμοδοσίας- Αιματολογικό Εργαστήριο Π.Ν.ΑΡΕΤΑΙΕΙΟ 2 Υπηρεσία Αιμοδοσίας- Αιματολογικό Εργαστήριο Ευαγγελισμός 3 Εθνικό Κέντρο Αιμοδοσίας, Ε.Κ.Ε.Α, Αθήνα 4 Υπηρεσία Αιμοδοσίας- Αιματολογικό Εργαστήριο Π.Γ.Ν. Νίκαιας
Rhesus πολύ-διαμεμβρανική πρωτείνη Διαπερνά την μεμβράνη των ερυθροκυττάρων 12 φορές Δεν συνδέεται με σάκχαρα ΕΙΣΑΓΩΓΗ To Rhesus D (RhD) αντιγόνο (ISBT 004.001; RH1) αποτελεί τμήμα της Rhesus πρωτεΐνης Εικ 1.http://www.jic.ac.uk/corporate/about/publications/advances/images_10/protein.jpg
Κατηγορίες ποικιλιών του D: D weak, D partial, και DEL. Πίνακας 1. Αντιπροσωπευτικές μοριακές αλλαγές στα RHD αλληλόμορφα εκφράζοντας διακριτούς φαινότυπους του D αντιγόνου. Ταξινόμηση αντιγόνων Weak D Partial D D αντιγονικός φαινότυπος Ποσοτική αλλαγή Ποιοτική αλλαγή Μοριακές Βάσεις Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα Είδη Πρωτεϊνών Μηχανισμοί RHD αλληλόμορφα Αντικατάσταση του αμινοξέος στην μεμβράνη ή ενδοκυτταρικά Αντικατάσταση του αμινοξέος στην επιφάνεια του RBC. Ανταλλαγή τμήματος πρωτεΐνης στην επιφάνεια του RBC Παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη Παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη Μετατροπή γονιδίου (υβριδική πρωτείνη) Κωδικό Όνομα Νέο Rhesus αντιγόνο RHD(V270G) Weak type 1 Άγνωστο RHD(G355S) DNB Άγνωστο RHD-CE(3-6)-D DVI type 3 ΒΑRC DEL Μεγάλη Ποσοτική αλλαγή Μειωμένη μετάφραση ή πρωτεϊνική έκφραση Παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη Μετάλλαξη σε σημείο συρραφής RHD(M295I) σε CDe RHD(K409K) δεν εφαρμόζεται δεν εφαρμόζεται Άγνωστο Άγνωστο W.A. Flegel et.al.molecular genetics and clinical applications for RH. Transfusion and Apheresis Science 44 (2011) 81 91
ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ορολογική τυποποίηση του RhD δεν μπορεί να χαρακτηρίσει τις ασθενείς ποικιλίες του RhD (ποικίλη δραστικότητα έναντι των αντι-d ορών) Oι μοριακές τεχνικές συμβάλλουν στον χαρακτηρισμό των RhD σε weak και partial φαινοτύπους Η αναγνώρισή τους μπορεί να βοηθήσει τους κλινικούς ιατρούς στην χορήγηση του κατάλληλου RhD- ή RhD + αίματος.
ΣΚΟΠΟΣ Η περιγραφή της μοριακής βάσης των αρνητικών ή ασθενών θετικών RhD δειγμάτων που ήταν θετικά με το μονοκλωνικό μίγμα NOVACLONE TM Anti-D IgM + IgG στον αυτόματο αναλυτή του Galileo NEO στην έμμεση δοκιμασία αντισφαιρινικού ορού και είχαν αρνητική άμεση Coombs
ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 52 δείγματα αιμοδοτών (Ευαγγελισμός, ΕΚΕΑ, Αρεταίειο και άλλες αιμοδοσίες εντός και εκτός Αττικής) Ορολογική τυποποίηση: Aντι-D: αρνητικό ή ασθενές (+ 2 ή λιγότερο) Όλα είχαν θετική έμμεση δοκιμασία αντισφαιρινικού ορού Du (Capture-R Select Solid Phase System) με το μονοκλωνικό μίγμα NOVACLONE TM Anti-D IgM + IgG στον αυτόματο αναλυτή Galileo NEO της Immucor. Αρνητική άμεση coombs- DAT
ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Mοριακή τυποποίησή: Απομονώθηκε γενωμικό DNA από ολικό περιφερικό αίμα με τη χρήση στηλών (Ready DNA Spin Kit, inno-train) Γονοτύπηση : i)pcr-ssp (Innotrain Diagnostik GmbH, Kronberg, Germany) ii)pcr-beadchip (BioArray Solutions, Immucor, Warren, NJ, USA.
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μοριακή κατανομή δειγμάτων με θετική έμμεση δοκιμασία αντισφαιρινικού ορού και αρνητική ή ασθενής άμεση δοκιμασία συγκόλλησης ήταν ως εξής: Τα δείγματα που ταυτοποιήθηκαν ως RhD weak types έφεραν τον απλότυπο R1 / r ή R2 /r Τα δείγματα που χαρακτηρίστηκαν ως RhD partial έφεραν τον απλότυπο r. Μοριακή κατανομή 52 δειγμάτων με θετική ΙΑΤ και ασθενές (< 2+ ) ή αρνητικό αντι-d Ν. αριθμός δειγμάτων RhD weak type 1 23 12% RhD weak type 2 2 1% RhD weak type 3 6 3% RhD weak type 5 3 1,6% RhD weak type 11 12 6,2% RhD weak type 15 1 0,5% RhD partial V 3 1,6% DAR 3.1 /type 4.0 1 0,5% Μη ταυτοποιημένο 1 0,5%
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η άμεση δοκιμασία συγκόλλησης χρησιμοποιώντας τον ίδιο κλώνο ανίχνευσε 35/52 (67%) δείγματα NOVACLONE Anti-D performance Number of positive tested specimens 25 Specimen type Dweak type 1 Phenotype Direct Indirect antiglobulin CE N=52 hemagglutination test Ccee CcEe 23 20 23 Dweak type 2 ccee 2 1 2 Ccee D weak type 3 CCee 6 6 6 ccee Dweak type 5 ccee CcEe 3 3 2 Ccee Dweak type 11 CCee 12 2 12 Dweak type 15 ccee 1 0 1 Ccee D partial V ccee 3 2 3 DAR 3.1/type 4.0 ccee 1 0 1 uncharacterised ccee 1 1 1 20 15 10 5 0 Direct hemagglutination Indirect antiglobulin test
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ Η μέθοδος ΙΑΤ για την ταυτοποίηση του RhD μπορεί να ανιχνεύσει τους περισσότερους από τους RhD weak types στο σύστημα Capture-R Select Solid Phase, ενώ η άμεση δοκιμασία συγκόλλησης ανίχνευσε το 67% αυτών. Είναι ενδιαφέρον ότι το αντιδραστήριο στη μέθοδο ΙΑΤ μπορούσε να ανιχνεύσει ακόμη και RhD weak types που κλασικά θεωρούνται ως Del (όπως ο RhD weak type 11 που φέρει τον απλότυπο R1 / r ).