Φ. ΚΟΛΟΝΙΤΣΙΟΥ Αν. Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών

Φ. ΚΟΛΟΝΙΤΣΙΟΥ Αν. Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών

H εναρμόνιση όλων των ευρωπαϊκών χωρών σε ένα κοινό σύστημα ελέγχου της μικροβιακής ευαισθησίας European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) - εξασφαλίζει : Μία κοινή γλώσσα επικοινωνίας σε εργαστηριακό και κλινικό επίπεδο Την επιδημιολογική επιτήρηση της αντοχής Τη θέσπιση κοινών κατευθυντήριων οδηγιών

Σε ευρωπαϊκό επίπεδο οι περισσότερες χώρες έχουν πλέον υιοθετήσει τις οδηγίες και τα όρια ευαισθησίας της EUCAST

Εθνική Επιτροπή Αντιβιογράμματος -1/8/2017 Αποφάσισε την εναρμόνιση των Εργαστηρίων στις οδηγίες και τα κριτήρια της Eucast

Η μετάβαση στη EUCAST προϋποθέτει την εναρμόνιση των υφιστάμενων διαδικασιών στις οδηγίες του νέου συστήματος. 1. Αγορά κατάλληλων θρεπτικών υλικών και δίσκων αντιβιοτικών 2. Αλλαγή του λογισμικού των αυτόματων μηχανημάτων ελέγχου του αντιβιογράμματος 3. Επίλυση διοικητικών θεμάτων (προσαρμογή διαγωνισμών / γραφείο προμηθειών) 4. Εκπαίδευση του ιατρικού και τεχνολογικού προσωπικού του εργαστηρίου 5. Ενημέρωση κλινικών ιατρών

Απαιτείται βούληση και καλός σχεδιασμός Ορισμός υπευθύνου: Ανατίθεται σε ένα άτομο η ευθύνη και ο συντονισμός των απαραίτητων διαδικασιών για την προσαρμογή στο νέο σύστημα Επισημαίνονται οι διαφορές με το υπάρχον σύστημα Έλεγχος τεχνολογικού εξοπλισμού Διασφαλίζεται η προμήθεια των απαραίτητων υλικών Ενημέρωση κλινικών γιατρών Χρονικό πλάνο εκπαίδευσης του προσωπικού Πιθανή ημερομηνία αλλαγής

Εκπαίδευση προσωπικού: Πρέπει να γίνεται σταδιακά, καθημερινά και με υπομονή Αφορά όλα τα βήματα της διαδικασίας: Υλικό Προετοιμασία ενοφθαλμίσματος Ενοφθαλμισμός στα τρυβλία Δίσκοι αντιμικροβιακών Επώαση Ανάγνωση ζωνών αναστολής Αξιολόγηση QC Error analysis Οδηγίες για όλα τα βήματα διαδικασίας: http://www.eucast.org

18/12/2009 Η EUCAST ανέπτυξε μία πρωτυπωμένη μέθοδο διάχυσης σε άγαρ βασιζόμενη στην Kirby Bauer Οι ζώνες αναστολής είναι βαθμονομημένες με τις MIC τιμές, οι οποίες καθορίσθηκαν σύμφωνα με τις διεθνείς standard μεθόδους ελέγχου της αντιμικροβιακής ευαισθησίας Θέσπιση κριτηρίων ποιοτικού ελέγχου

Mueller Hinton Agar (ΜΗA) Οδηγίες προτεινόμενες από τον κατασκευαστή ΜΗ-Fastidious (MHF) ΜΗA εμπλουτισμένο με: Μηχανικά απινιδωμένο αίμα αλόγου, 5% β-nad 20 mg/l για τους απαιτητικούς μικροοργανισμούς

Μικροοργανισμός Μη απαιτητικοί μικροοργανισμοί: Enterobacterales, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Aeromonas spp. Υλικό Mueller Hinton Agar (ΜΗA) Απαιτητικοί μικροοργανισμοί Streptococci group A,B,C,G,S. pneumoniae Viridans group streptococci, Haemophilus spp., M.catarrhalis, N.meningitidis, L. monocytogenes, Corynebacterium spp, C. jejuni,campylobacter coli, Kingella ΜΗ-Fastidious Agar (MHF) Άλλοι απαιτητικοί μικροοργανισμοί Pending

Το MH άγαρ ποικίλλει μεταξύ των διαφορετικών εταιρειών αλλά και μεταξύ των διαφορετικών παρτίδων της ίδιας εταιρείας. H EUCAST δεν προτείνει τη χρήση του υλικού κάποιας συγκεκριμένης εταιρείας. Έλεγχος κάθε παρτίδας με το internal control της EUCAST Μπορούμε να χρησιμοποιούμε και το Mueller Hinton II Agar-αρκεί τα όρια να εμπίπτουν στο εύρος των τιμών του internal control της EUCAST ISO Standard

ΔΕΝ χρησιμοποιούμε αίμα προβάτου: Όλα τα breakpoints έχουν καθορισθεί στο MH-F με αίμα αλόγου 5% και 20% θυμιδίνη Ο H. influenzae ΔΕΝ αναπτύσσεται στο MH-F με αίμα προβάτου Πρέπει να χρησιμοποιούμε β-nad καθαρότητας = ή > του 98%- για την ανάπτυξη του H. influenzae Σημαντικό Η απινίδωση του αίματος να γίνεται μηχανικά και όχι χημικά- ζώνες εκτός ορίων- και προσοχή στη λύση των ερυθρών

Καθοριστικός παράγων το πάχος του υλικού Ζώνη αναστολής επιφάνεια 4 mm βάση Μεγάλες ζώνες <4 mm Μικρές ζώνες >4 mm

Πάχος του υλικού τεσσάρων χιλιοστών: 25 ml υλικού στα τρυβλία διαμέτρου 90 mm 31 ml σε τρυβλία διαμέτρου 100 mm 40 ml στα τετράγωνα τρυβλία των 100 mm 71 ml στα τρυβλία διαμέτρου 150 mm Το ph του υλικού να είναι 7,2-7,4 Να μην τοποθετείται το αίμα και το NAD πριν το υλικό φθάσει στους 42-45 0 c Καλή ανάμειξη,άμεση τοποθέτηση στα τρυβλία

Σε κάθε νέα παρτίδα Στο έτοιμο υλικό και στα τρυβλία που παρασκεύαζονται στο εργαστήριο Πρότυπα στελέχη που προτείνονται για κάθε μικροοργανισμό Σε ΜΗA Σε ΜΗ-F Υψηλή ή χαμηλή συγκέντρωση δισθενών ιόντων: υψηλή ή χαμηλή διάμετρο της P.aeruginosa (ATCC 27853) στην γενταμυκίνητομπραμικίνη Υψηλή συγκέντρωση θυμιδίνης: Χαμηλή διάμετρο του εντερόκοκκου (E. faecalis ATCC 29212)

Όταν χρησιμοποιούνται τα τρυβλία δεν θα πρέπει να έχουν υγρασία Όχι over-dried Η συντήρηση των τρυβλίων που παρασκευάζονται στο εργαστήριο καθορίζεται ανάλογα με τις δυνατότητες του εργαστηρίου Οι συνθήκες συντήρησης των εμπορικών τρυβλίων ορίζεται από την κατασκευάστρια εταιρεία

Θολερότητα εναιωρήματος: CFU/ml) έλεγχος με θολοσίμετρο ή φωτόμετρο ή σύγκριση με την πρότυπη κλίμακα MacFarland 0,5 MacFarland(1-2Χ10 8 Εξαίρεση: Ο S.pneumoniae αν έχει απομονωθεί σε: Αιματούχο άγαρ :θολερότητα ίση με 0,5 MacFarland Σοκολατόχρωμο άγαρ:θολερότητα ίση με 1 MacFarland Προσθέτουμε βακτήρια ή saline για διόρθωση της θολερότητας

Gram negative Ποτέ στα Gram positive Eπίστρωση με το χέρι ή rotator

Τα τρυβλία επωάζονται: 35 Ο 2 ΜHA στους 35±1 0 C, σε αερόβιες συνθήκες για 16-20 ώρες 24 ώρες για τα γλυκοπεπτίδια στους εντεροκόκκους MHF στους 35±1 0 C, σε συνθήκες CO2 5±1%, για 16-20 ώρες Campylobacters σε 41±1 0 C για 24-48 ώρες. 35 C CO 2

Θα πρέπει να ακολουθούμε τον μνημονοτεχνικό κανόνα 15-15-15 λεπτών? ΝΑΙ Ετοιμάζουμε εναιωρήματα ώστε: Μέσα σε 15 λεπτά να γίνει επίστρωση των τρυβλίων Ποτέ > 60 min Μέσα σε 15 λεπτά να τοποθετηθούν οι δίσκοι των αντιμικροβιακών Μέσα σε 15 λεπτά να τοποθετηθούν στον επωαστικό κλίβανο

Μπορούμε να χρησιμοποιούμε για το ενοφθάλμισμα αποικίες από εκλεκτικά υλικά? ΟΧΙ Τα εκλεκτικά υλικά περιέχουν ουσίες οι οποίες μπορεί να αναστέλλουν ή να ευνοούν την ανάπτυξη των βακτηρίων Πρέπει να χρησιμοποιούμε περισσότερες της μίας αποικίας για να μην χάσουμε το φαινόμενο της ετεροαντοχής? ΟΧΙ Η χρήση περισσότερων αποικιών δεν επηρεάζει την ανίχνευση της ετεροαντοχής

Υπάρχουν κάποιες διαφορές στις συγκεντρώσεις των αντιβιοτικών σε σχέση με το CLSI. Οι εμπορικές εταιρείες έχουν προσαρμόσει τις προτεινόμενες κατά EUCAST συγκεντρώσεις των αντιβιοτικών στα δισκία Σκόπιμη είναι η επιμονή στην εκπαίδευση του προσωπικού σε αυτό το σημείο.

Συγκέντρωση αντιβιοτικού EUCAST CLSI Benzylpenicillin 1 unit 10 units Ampicillin 2 και 10 μg 10 Amoxicillin-clavulanate 2 1 και 20 10 μg 20 10 μg Piperacillin 30 μg 100 μg Piperacillin-tazobactam 30 6 μg 100 10 μg Cefotaxime 5 μg 30 μg Ceftaroline 5 μg 30 μg Ceftazidime 10 μg 30 μg Netilmicin 10 μg 30 μg Gentamicin (για HLAR, high-level aminoglycoside resistance) 30 μg 120 μg Vancomycin 5 μg 30 μg Linezolid 10 μg 30 μg Nitrofurantoin 100 μg 300 μg Amp 2μg για H. influenzae, P. multocida, L. monocytogenes, S. saprophyticus και viridans streptococci Amox/clav 2 1 μg για H. influenzae, M. catarrhalis και P. multocida.

Τα β-λακταμικά αντιβιοτικά, η ιμιπενέμη και το κλαβουλανικό οξύ :διατηρούνται αυστηρά σε κατάψυξη 20 C Η μετρονιδαζόλη, η χλωραμφαινικόλη και οι φθοριοκινολόνες:ευαίσθητες στο φώς Φυλάσσονται σε ειδικούς περιέκτες που συνοδεύονται με αφυγραντική ουσία Τα δισκία μεταφέρονται από το ψυγείο ή τον καταψύκτη 1-2 ώρες πριν από τη χρήση τους Απαιτείται προσοχή στην ημερομηνία λήξης αφυγραντικό

MHA Πίσω πλευρά τρυβλίου, σκούρο background με τη βοήθεια προσπίπτοντος φωτισμού Linezolid και Benzylpenicillin για τους σταφυλοκόκκους και της Vancomycin για τους εντεροκόκκους «διαβάζονται» με διερχόμενο φωτισμό. MH-F «διαβάζονται» με διερχόμενο φωτισμό

Συστηματική άσκηση του προσωπικού Ανάγνωση από όλο το προσωπικό των ίδιων τρυβλίων δείγματα και qc strains Οι μέσες τιμές και αποκλίσεις συγκρίνονται με τις τιμές αναφοράς των qc strains 1mm μεταξύ 15-20 ατόμων Σύγκριση της κατανομής των in-house διαμέτρων των κλινικών στελεχών (>50) με τις κατανομές της EUCAST Διαφορά > 2 mm : συστηματική απόκλειση

Βακτηριοκτόνα και Βακτηριοστατικά αντιμικροβιακά διαβάζονται με τον ίδιο τρόπο Ζώνη απόλυτης αναστολής-30cm από το μάτι EUCAST Reading guide Θα πρέπει να μετράμε όλες τις ζώνες αναστολής? Θα πρέπει να τις μετράμε όλες με την αλλαγή της μεθόδου και να τις αναφέρουμε Αυτό επιτρέπει στο εργαστήριο να συγκρίνει την κατανομή των δικών της ζωνών αναστολής σε σχέση με της διαμέτρους αναφοράς : EUCAST zone diameter distribution website Οι ζώνες αναστολής των control tests θα πρέπει πάντοτε να μετρώνται. http://www.eucast.org/clinical_breakpoints Clinical breakpoints - bacteria (v 9.0) - pdf for printing Clinical breakpoints - bacteria (v 9.0) - excel file for screen

Οι διαδικασίες είναι ίδιες με αυτές που ισχύουν σήμερα σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστριών εταιρειών. Σύμφωνα με δήλωσή τους έχουν προσαρμόσει και έχουν ελέγξει τις ταινίες με διαβαθμισμένη συγκέντρωση αντιβιοτικού σε ΜΗΑ και ΜΗF Η ανάπτυξη των αναεροβίων και της N. gonorrhoeae συνήθως είναι ανεπαρκής στο MHF και προτείνεται ο έλεγχος να γίνεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή των Etest EUCAST file Compliance of manufacturers of susceptibility testing devices and materials

Θρεπτικό υλικό Mueller Hinton Broth (ΜΗB) ΜΗ-F broth αίμα αλόγου 5% β-nad καθαρότητας >98% σε αναλογία 0,1% Αποστείρωση του υλικού κατά τις οδηγίες της προμηθεύτριας εταιρείας Η προσθήκη του αίματος και του β-nad σε θερμοκρασία 42-45 C και Η διανομή και η συντήρηση σε βιδωτά σωληνάρια σε θερμοκρασία 4-8 C αντίστοιχα.

Πρότυπα στελέχη: E. coli ATCC 25922 (wt) P. aeruginosa ATCC 27853 (wt) S. aureus ATCC 29213 (weak β-lactamase producer) Ε. faecalis ATCC 29212 (wt) S. pneumoniae ATCC 49619 (Penicillin low level resistance) H. influenzae ATCC 49766 C. jejuni ATCC 33560

Πίνακες με: Acceptable ranges - target values

Η αγορά των προτύπων στελεχών πραγματοποιείται από αξιόπιστη εταιρεία του εμπορίου Η ανασύσταση τους γίνεται ακολουθώντας τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρείας. Φυλάσσονται σε κατάλληλο υλικό συντήρησης : Tryptic soy broth +15% glycerol Brucella broth + 15% glycerol σε φιαλίδια τύπου cryovials τα οποία φέρουν μικρά πλαστικά σφαιρίδια- κατά προτίμηση σε θερμοκρασίες από -20 για τα μη απαιτητικά μικρόβια μέχρι -70o C για τα απαιτητικά.

Η EUCAST προτείνει: Ημερήσιο έλεγχο για τουλάχιστον ένα μήνα μετά την εφαρμογή της μεθόδου Όταν διαπιστωθεί ότι η μεθοδολογία λειτουργεί μπορούμε να περάσουμε σε εβδομαδιαίο έλεγχο Οι μέσες τιμές επαναλαμβανόμενων tests ( 10) θα πρέπει να συμπίπτουν με τις τιμές των QC, ±1 mm Μόνο ένα στα 20 επαναλαμβανόμενα tests θα πρέπει να είναι εκτός ορίων Συστηματικές αποκλίσεις στις μέσες τιμές των QC, πάνω ή κάτω, για ωρισμένα αντιμικροβιακά πρέπει να διερευνηθεί Οδηγίες :http://www.eucast.org/mic_distributions_and_ecoffs

Για την ανίχνευση συστηματικών λαθών ή προβλημάτων στους δίσκους ή τα υλικά ή σε ειδικούς συνδιασμούς μικροοργανισμούαντιμικροβιακού Είναι πιο αποτελεσματική H σύγκριση του εύρους κατανομής των διαμέτρων από ένα εργαστήριο με τις κατανομές αναφοράς στην ιστοσελίδα της EUCAST Kατανομές αναφοράς: MIC distributions Agent Organism Zone diameter distributions by Agent Organism

Κατανομή ζωνών E. coli Cefotaxime 5μg σε 17 Σουηδικά Εργαστήρια Συστηματική απόκλιση ενός εργαστηρίου EUCAST reference zone Matuschek et al. The EUCAST disk diffusion testing method. Clinical Microbiology and Infection,2013

Σταδιακή εκπαίδευση του προσωπικού : Επιλογή δύο προτύπων στελεχών π.χ. E. coli ATCC 25922 και S.aureus ATCC 29213 Επιλογή τεσσάρων αντιβιοτικών ελέγχου Τα αντιβιοτικά που θα επιλεγούν πρέπει να δίνουν σαφείς ζώνες αναστολής χωρίς δυσκολίες Εφαρμογή αντιβιογράμματος για τρεις συνεχείς ημέρες Καταγραφή αποτελεσμάτων, σύγκριση με τις αναμενόμενες ζώνες αναστολής Συζήτηση των προβλημάτων.

Επαναλαμβάνεται η παραπάνω διαδικασία αρχικά για άλλα δύο πρότυπα στελέχη π.χ.p.aeruginosa ATCC 27853 και E.faecalis 29212 Επαναλαμβάνεται η παραπάνω διαδικασία τέλος για τα πρότυπα στελέχη H.influenzae ATCC 49766 και S.pneumoniae ATCC 49619. Σιγά σιγά με αυτόν τον τρόπο εκπαιδεύεται όλο το προσωπικό στην ανάγνωση των ζωνών αναστολής και εξοικειώνεται με τη χρήση του προσπίπτοντος ή διερχόμενου φωτισμού. Ακολουθεί η εκπαίδευση στην προετοιμασία του μικροβιακού εναιωρήματος αυστηρά με τη χρήση του θολοσιμέτρου ή της πρότυπης καμπύλης MacFarland.

Η χώρα μας πρέπει να εναρμονιστεί με τις οδηγίες EUCAST στη διαδικασία του αντιβιογράμματος-εθνική υποχρέωση Οι διαφορές με την εφαρμοζόμενη μεθοδολογία κατά CLSI είναι μικρές, πρακτικά όμως εφαρμόσιμες, αρκεί να υπάρξει βούληση κυρίως από τους βιοπαθολόγους Όλες οι οδηγίες είναι διαθέσιμες στην ιστοσελίδα της EUCAST