Μεθοδολογία μοριακής αναλύσεως, τεχνικές απαιτήσεις, διαπίστευση Ευστράτιος Κ. Κοσμίδης Λέκτορας Φυσιολογίας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης
Disclosure of Potential Conflicts of Interest Efstratios K. Kosmidis receives research-related funding from Amgen
Θέλετε να στείλετε ένα δείγμα για έλεγχο μεταλλαγών σε κάποιο εργαστήριο... Τι αντιδραστήρια χρησιμοποιούν; Σε πόσο χρόνο θα έχω την απάντηση; Τι είδους απάντηση θα πάρω; Ποια είναι η τιμή της εξέτασης; Με ποιά τεχνική δουλεύουν; Πως μπορώ να ξέρω ότι είναι αξιόπιστοι;
Προαναλυτική διαδικασία Macrodissection
Εξαγωγή DNA από κύβο παραφίνης t=4-4.5h
Polymerase Chain Reaction 1993 Nobel Prize In Chemistry Kary B. Mullis Prize motivation: "for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method" Field: biochemistry
Real-Time PCR Τεχνολογίες ανίχνευσης σημειακών μεταλλαγών SYBR Green Hydrolysis (TaqMan) Probes Molecular Beacons Dual Hybridization Probes Eclipse Probes Amplifluor Assays Scorpions PCR Primers LUX PCR Primers QZyme PCR Primers
Scorpions PCR Primers
Sanger Sequencing Frederick Sanger 1918 Nobel Prize in Chemistry 1958, 1980
Next Generation Sequencing Bridge PCR
Τι με νοιάζει; + Χαμηλή Γνώση όλης της αλληλουχίας μικρού αριθμού γονιδίων ή η αλληλούχιση μεγάλων τμημάτων (>500 νουκλεοτίδια) DNA Έχει γενικά χαμηλό κόστος Sanger Sequencing - ευαισθησία. Σε καρκινικό FFPE απαιτείται η παρουσία 50-70% καρκινικών κυττάρων στο υπό εξέταση δείγμα (10-20% παρουσία κυττάρων που φέρουν τη μεταλλαγή) Απαιτεί πολύ ιστό Απαιτεί συγκριτικά μεγαλύτερο χρόνο απάντησης
Τι με νοιάζει; + Aνίχνευση Υψηλή ευαισθησία. >10% σε καρκινικά κύτταρα (<5% μεταλλαγμένων αντιγράφων σε υπόβαθρο φυσιολογικού DNA) Απαιτεί λίγο ιστό Γρήγορα αποτελέσματα Real Time PCR - (και ποσοτικοποίηση) πεπερασμένου αριθμού προκαθορισμένων μεταλλαγών σε γονίδια (multiplex) Μεγάλο κόστος
Τι με νοιάζει; + Αξιόπιστη NGS Παράλληλη πλήρης αλληλούχιση μεγάλου αριθμού γονιδίων ή ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων Γρήγορα αποτελέσματα Μείωση κόστους - αλληλούχιση μικρών τμημάτων (<400 νουκλεοτίδια) DNA Επίπονη βιοπληροφορική ανάλυση Μεγάλο βάθος αλληλούχισης για να επιτευχθεί υψηλή ευαισθησία (τουλάχιστον 50x σε ιστό)
Κατηγορίες αντιδραστηρίων Συνοδευτικά διαγνωστικά (companion diagnostics) Χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια των προοπτικών κλινικών μελετών για συγκεκριμένο φάρμακο του οποίου αποτελούν συνοδευτικό διαγνωστικό RUO (Research Use Only) Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στις κατευθυντήριες οδηγίες για τις Ιατρικές Συσκευές (MEDDEV. 2.14/2 rev.1) για την αποφυγή χρήσης RUO αντιδραστηρίων για διαγνωστικούς σκοπούς. CE-IVD Αντιδραστήρια που πληρούν τις προϋποθέσεις της Ευρωπαϊκής Ένωσης για χρήση σε διαγνωστικές εξετάσεις Για την εφαρμογή των τεχνικών απαιτούνται και τα ανάλογα αντιδραστήρια In-house τεχνικές Βοηθήματα που κατασκευάζονται και χρησιμοποιούνται μόνο μέσα σ ένα και αυτό ίδρυμα υγείας και στον τόπο κατασκευής τους, ή που χρησιμοποιούνται σε αμέσως γειτονικούς χώρους, χωρίς να μεταβιβάζονται σε άλλη νομική οντότητα. Η Ευρωπαϊκή οδηγία που διέπει τη χρήση των αντιδραστηρίων για διαγνωστικούς σκοπούς είναι η Οδηγία 98/79/EC
Πιστοποίηση εργαστηρίου Εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος ISO9001 Οργάνωση εργαστηρίου Ειδικά για διαγνωστικά εργαστήρια ISO15189 για συγκεκριμένες εξετάσεις External Quality Assessments, EQAs) EMQN (European Molecular Quality Network) UKNEQAS (United Kingdom National External Quality Assessment Scheme) ESP (European Society of Pathology) CAP (College of American Pathologists)
Απαντητικό εργαστηρίου μοριακής βιολογίας Πληροφορίες Εργαστηρίου 1. Επωνυμία, διεύθυνση και στοιχεία επικοινωνίας του Εργαστηρίου (τηλέφωνο, FAX, e-mail, website). Δημογραφικά στοιχεία και στοιχεία ταυτοποίησης ασθενή 1. Ονοματεπώνυμο ασθενούς, στοιχεία ταυτότητας και/ή ημερομηνία γέννησης. 2. Κωδικός εξέτασης εργαστηρίου και κωδικός του δείγματος αναφοράς. 3. Ημερομηνία δειγματοληψίας και παραλαβής δείγματος στο εργαστήριο. 4. Ημερομηνία απάντησης. 5. Είδος δείγματος. 6. Παραπέμπων Ιατρός. 7. Οικογενειακό ιστορικό (όπου απαιτείται). 8. Κλινικό ιστορικό (αν είναι διαθέσιμο). Αποτελέσματα 1. Αναφορά αποτελέσματος ανά μεθοδολογία. Ερμηνεία: αναλυτική ή/και κλινική. Σχόλια 1. Σύσταση πιθανά απαιτούμενων περαιτέρω ελέγχων. 2. Σχόλια για την κατάσταση του δείγματος κατά την παραλαβή. 3. Σχόλια για την ακρίβεια, ευαισθησία, ειδικότητα της μεθόδου. 4. Βιβλιογραφικές αναφορές σε peerreviewed επιστημονικά περιοδικά ή αξιόπιστες ιστοσελίδες σχετικά με τον διενεργούμενο έλεγχο και την κλινική του σημασία. 5. Αναφορά στην περίπτωση που χρησιμοποιήθηκαν μη πιστοποιημένες in-house τεχνικές, RUO αντιδραστήρια για την εξαγωγή του αποτελέσματος. Στην περίπτωση πιστοποιημένης in-house τεχνικής, αναφορά στην πιστοποίηση.
Συνήθεις λόγοι αποτυχίας σε εξωτερικό ποιοτικό έλεγχο Λάθος αποτέλεσμα Αποτυχία αναφοράς περιεχομένου σε καρκινικά κύτταρα Λανθασμένη ή απούσα ερμηνεία του αποτελέσματος Αποτυχία αναφοράς της μεθόδου Διαφοροποιήσεις σε κακρινικό περιεχόμενο από τομή σε τομή στον ίδιο όγκο Χρήση λάθους ονοματολογίας
Οικογένεια RAS, BRAF
Μεταλλαγές στα γονίδια KRAS, NRAS, BRAF EXON 1 KRAS EXON 2 EXON 3 EXON 4 12 13 59 61 117 146 40% 5% 6% 12 13 61 117 146 EXON 1 NRAS EXON 2 EXON 3 EXON 4 12 13 59 61 117 146 12 13 59 61 117 146 4% 4% 0% EXON 1 BRAF EXON 15 EXON 16 600 600 9% Based on Douillard JY, et al. N Engl J Med 2013; 369:1023-34; Oliner KS, et al. EJC 2013; 49 (suppl 3):abstract 2275 (and poster). Percentages have been rounded; 7 patients harboured either KRAS or NRAS codon 59 mutations
Οικογένεια RAS Για τη χορήγηση του panitumumab στον μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου ή του ορθού απαιτείται μοριακός έλεγχος για απουσία ενεργοποιητικών μεταλλαγών στα εξώνια 2, 3 και 4 των γονιδίων KRAS και NRAS Ο έλεγχος μπορεί να γίνει στον πρωτοπαθή όγκο ή/και σε ιστό από μετάσταση Διαθέσιμες τεχνικές και αντιδραστήρια Sanger Sequencing In-house, RUO, CE-IVD NGS In-house, RUO Σε αναμονή Real-Time PCR CE-IVD NGS CE-IVD
BRAF Το BRAF παραμένει ισχυρός προγνωστικός δείκτης. Ασθενείς μεταλλαγμένοι στο BRAF έχουν χειρότερη πρόγνωση ανεξαρτήτου θεραπείας Ο προβλεπτικός ρόλος του BRAF βρίσκεται υπό διερεύνηση Διαθέσιμες τεχνικές και αντιδραστήρια Real-Time PCR Companion Diagnostic CE-IVD, RUO Sanger Sequencing In-house, RUO NGS RUO Σε αναμονή NGS CE-IVD
Μικροδορυφορική αστάθεια (Micro Satellite Instability) Οι μικροδορυφόροι είναι μικρές αλληλουχίες DNA (1-6 βάσεις) οι οποίες επαναλαμβάνονται συχνά σε περιοχές του γονιδιώματος (π.χ. (CA) n, n=3 100) Ο φαινότυπος της μικροδορυφορικής αστάθειας εκδηλώνεται όταν έχουμε ανώμαλη σμίκρυνση ή επιμήκυνση των μικροδορυφορικών περιοχών του καρκινικού ιστού σε σχέση με τον φυσιολογικό Οι οδηγίες του NCI για τον έλεγχο της μικρο- δορυφορικής αστάθειας προτείνουν τον έλεγχο των εξής περιοχών: BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 and D17S250 Ως MSI-H χαρακτηρίζονται οι όγκοι με αλλαγές σε 2 ή περισσότερους μικροδορυφορικούς δείκτες Ως MSI-L χαρακτηρίζονται οι όγκοι με καμία ή 1 αλλαγή στους μικροδορυφορικούς δείκτες Έχει προταθεί μια pentaplex τεχνική ελέγχου 5 ημι-μονομορφικών μονονουκλεοτιδικών επαναλήψεων η οποία είναι πιο ευαίσθητη για τους MSI-H όγκους και δεν απαιτεί υλικό προς σύγκριση. Με αυτή την τεχνική ως MSI-H χαρακτηρίζονται οι όγκοι με 3 ή περισσότερες αλλαγές
Miss Match Repair proteins Vilar, E. & Gruber, S. B. (2010) Microsatellite instability in colorectal cancer the stable evidence Nat. Rev. Clin. Oncol. doi:10.1038/nrclinonc.2009.237
MSI Το MSI (~15%) είναι ισχυρός προγνωστικός δείκτης Οι ασθενείς με MSI- H/dMMR όγκους σταδίου ΙΙ έχουν καλύτερη πρόγνωση από εκείνους με MSI-L ή MSS/pMMR όγκους Ο κίνδυνος υποτροπής στους MSI-H/dMMR είναι εξαιρετικά χαμηλός και για αυτό το όφελος από ενδεχόμενη συμπληρωματική θεραπεία είναι μικρό ή ανύπαρκτο Διαθέσιμες τεχνικές και αντιδραστήρια Sequencing In-house HRM Real-Time PCR In-house Συνιστάται ταυτόχρονος έλεγχος με αντισώματα anti- MLH1, anti-msh2, anti- PMS2 και anti-msh6 με IHC
Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας?