ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ- ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΜΣ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ-ΑΙΜΟΔΟΣΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ- ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΜΣ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΑΣ-ΑΙΜΟΔΟΣΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Ο ρόλος της λεπτίνης στην παθογένεια της ρευματοειδούς αρθρίτιδας.» ΣΤΑΘΑΤΟΥ ΔΗΜΗΤΡΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΜΟΥΖΑΚΗ ΑΘΑΝΑΣΙΑ 1

Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή 1. Αθανασία Μουζάκη, Καθηγήτρια Εργαστηριακής Αιματολογίας-Αιμοδοσίας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών (Επιβλέπουσα Καθηγήτρια) 2. Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη, Καθηγήτρια Παιδιατρικής- Παιδιατρικής Ενδοκρινολογίας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών (Μέλος Τριμελούς Επιτροπής) 3. Μιχαήλ Λεοτσινίδης, Αναπληρωτής ΚαθηγητήςΥγιεινής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών (Μέλος Τριμελούς Επιτροπής) 2

Πρόλογος Τώρα που το ταξίδι της περιπλάνησης στον ωκεανό της γνώσης «έπιασε λιμάνι» δίνοντας αφορμή για την εξιστόρηση των εμπειριών που αποκομίσθηκαν, κρίνω σκόπιμο να αναφερθώ σε όλους εκείνους που συνέβαλαν στην πραγματοποίηση αυτού του τόσο σημαντικού «ταξιδιού». Ένα απλό «ευχαριστώ» στον εμπνευστή του «ταξιδιού», την κ. Αθανασία Μουζάκη, Καθηγήτρια Ανοσολογίας του Εργαστηρίου Αιματολογίας-Αιμοδοσίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστήμιου Πατρών, δεν είναι αρκετό. Την ευχαριστώ θερμότατα για το αμέριστο ενδιαφέρον, την έμπρακτη συμπαράσταση, την πολύτιμη προσφορά της επιστημονικής γνώσης και εμπειρίας καθώς επίσης για τις χρήσιμες παρατηρήσεις και συμβουλές της καθ όλη τη διάρκεια της παρουσίας μου στην ερευνητική της ομάδα. Ολοκληρώνοντας τη διπλωματική μου εργασία στο Εργαστήριο της αποκόμισα σημαντικά οφέλη και παρακαταθήκες από την συνεργασία μας Αισθάνομαι, επίσης, την ανάγκη να ευχαριστήσω εκ βάθους καρδιάς τον κ ΜιχαήλΛεοτσινίδηΑναπληρωτή Καθηγητή Υγιεινής του Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών, τον οποίο γνωρίσα κατά τη διάρκεια των προπτυχιακών μου σπουδών και όλα αυτά τα χρόνια μου προσέφερε πάνω από όλα τη φιλία του και την στήριξή του.επιπλέον, τον ευχαριστώ για τις εξαιρετικά γόνιμες συζητήσεις που είχαμε, οι οποίες συνέβαλαν στην άρτια παρουσίαση του κειμένου της διπλωματικής εργασίας. Είναι μεγάλη η τιμή και η χαρά την οποία μου πρόσφερε η κ. Βασιλική Γκρέκα-Σπηλιώτη, Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών που συμμετέχει ως μέλος της Τριμελούς επιτροπής αξιολόγησης της παρούσας εργασίας. Την 3

ευχαριστώ για τις χρήσιμες συμβουλές και παρατηρήσεις της κατά την ανάγνωση του κειμένου. Τον Δρ. Αναστάσιο Γεωργακόπουλο ευχαριστώ για την γόνιμη συνεργασία που είχαμε όλο αυτό το χρονικό διάστημα και για την απλόχερη μετάδοση της επιστημονικής εμπειρίας και επάρκειας του. Τον υποψήφιο διδάκτορα Γιάννη Παναγούλια ευχαριστώ θερμά για την μύηση μου στις τεχνικές του εργαστηρίου καθώς και για την αμέριστη πειραματική και ψυχολογική υποστήριξή τουκαθώς και όλα τα μέλη του εργαστηρίου για την αγαστή συνεργασία που είχαμε κατά την παραμονή μου στο εργαστήριο. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω να ευχαριστήσω την οικογένεια μου που με στηρίζει όλα αυτά τα χρόνια καθώς επίσης για τη δυνατότητα που μου προσφέρει να πραγματοποιώ τις επιλογές μου. Σε αυτούς τους σημαντικούς για μένα- ανθρώπους θέλω να αφιερώσω την παρούσα εργασία. Δήμητρα 4

Περιεχόμενα Εισαγωγή Α. Ρευματοειδης Αρθρίτιδα (σελ 11) 1. Ιστορική αναδρομή (σελ 11) 2. Ιστιοπαθολογία του αρθρικού υμένα (σελ12) 3. Αυτοαντισώματα (σελ 16) 4. Εμπλοκή κυττάρων και κυτταροκινών στην παθογένεια της ΡΑ (σελ 17) 5. Ο ρόλος γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων στην παθογένεια της ΡΑ (σελ 21) 6. Παθολογική ανατομική της ΡΑ (σελ 22) 7. Διάγνωση (σελ 23) 8. Συμπτώματα και κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου (σελ 24) 9. Εξωαρθρικές εκδηλώσεις της ρευματοειδούς αρθρίτιδας (σελ 27) 10. Φάρμακα (σελ 28) 10.1 Τα μη στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα (σελ 28) 10.2 Τα φάρμακα αργής δράσης (σελ 28) 10.3 Τα κορτικοειδή (σελ 29) 10.4 Ανοσοκατασταλτικά φάρμακα (σελ 29) 10.5 Χειρουργική επέμβαση (σελ 30) 10.6 Βιολογικοί παράγοντες (σελ 30) Β.Tο μόριο της λεπτίνης (σελ 35) 1. Δομή του μορίου της λεπτίνης (σελ 35) 2. Λειτουργία του μορίου της λεπτίνης (σελ 36) 3. Υποδοχείς της λεπτίνης (σελ 40) 4. Ο ρόλος της λεπτίνης στην αιμοποίηση και λεμφοποίηση (σελ 44) 5. Ο ρόλος της λεπτίνης στην έμφυτη ανοσία (σελ 45) 5

6. Ο ρόλος της λεπτίνης στην προσαρμοζόμενη ανοσία (σελ 48) 7. Λεπτίνη και αυτοανοσία (σελ 50) 8. Εμπλοκή της λεπτίνης στη ρευματοειδή αρθρίτιδα (σελ 53) Υλικά και μέθοδοι 1. Ασθενείς(σελ 56) 2. Φαινοτύπιση κυττάρων (σελ 56) 3. Απομόνωσηεμπύρηνωνκυττάρωναπόαίμακαικαλλιέργειες (σελ 57) 4. ΑπομόνωσηRNAαπόκύτταρα (σελ 58) 5. ΚατασκευήcDNA, RT-PCR (σελ 59) 6. PCR (PolymeraseChainReaction) (σελ 60) 7. Ενδοκυττάριαχρώσηκυτταροκινών (σελ 64) 8. Κυτταρικέςσειρές (σελ 66) 9. Διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών και καλλιέργειες (σελ 66) 10. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (σελ 67) 11. Elisa (σελ 68) 12. Στατιστική ανάλυση (σελ 69) Αποτελέσματα 1.Ασθενείς (σελ 71) 2. Κύτταρα (σελ 73) 3. Eπίπεδα λεπτίνης στον ορό (σελ 75) 4. Έκφραση των γονιδίων των Τh1/Th2 τύπου κυτταροκινών σε ασθενείς με PA. (σελ 79) 5. Ενδοκυττάριος προσδιορισμός της ΙL-10 (σελ 82) 6. Επίπεδα υποδοχέα της λεπτίνης στον ορό ασθενών (σελ 83) 7. Έκφραση των ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης σε κύτταρα τουανοσοποιητικού.(σελ 84) 6

Συζήτηση- Συμπεράσματα(σελ 86) Βιβλιογραφία(σελ 90) 7

Summary Leptin is a 16 kd peptide hormone, encoded by the ob gene and synthesized mainly by adipocytes to regulate the energy balance. In humans, leptin plasma levels are strongly correlated with body mass index (BMI) and the expression of leptin is regulated by fasting and feeding, insulin, glucocorticoids and pro-inflammatory cytokines, mainly TNFa and IL-1. Leptin is structurally similar to long-chain helical cytokines and it signals through its receptor, OB-R, which is a member of the cytokine receptor superfamily. OB-R comes in a variety of protein isoforms, and is expressed in several tissues and cells of the neuroendocrine system as well as the reproductive, hematopoietic and immune systems. Leptin has also been implicated in the pathogenesis of autoimmunity. It has also been suggested that leptin may promote the expansion and maintenance of pathogenic Th1-cell populations in autoimmune diseases. In this study to investigate the role of leptin in human autoimmunity, we measured leptin and OB-Rs levels inthe sera of patients suffering from rheumatoid arthritis (RA), a common chronicsystemic inflammatory disease, and tested for a possible correlation with disease activity and type of treatment. In addition, we studied whether leptin has an effect on the expression patterns of pro- and antiinflammatory cytokine genes in PBMC isolated from RA patients and controls.our results showed significantly elevated serum leptin levels in the rheumatoid population compared to the healthy controls.in addition, there was an absence of correlation between serum leptin levels and disease activity, as well as the nature and quantity of the medications administered to the patients. The absence of correlation between serum leptin levels and disease activity, coupled with the significantly and stably elevated levels of this hormone in the rheumatoid sera compared to the controls, are probably indicative of an insiduous pathogenetic role of leptin in rheumatoid arthritis. 8

Περίληψη Η λεπτίνη είναι μια ορμόνη 16 kd που κωδικοποιείται απότογονίδιο obκαι παράγεται από τα λιποκύτταρα ρυθμίζοντας το ενεργειακό ισοζύγιο.τα επίπεδα λεπτίνης στο πλάσμα είναι ανάλογα με το δείκτη σωματικής μάζας (BMI), ενώ η έκφρασή της εξαρτάται από τη νηστεία και τη σίτιση, την ινσουλίνη, τα γλυκοκορτικοειδή, καθώς και από προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, κύριως τον TNF-α και την IL-1. Το μόριο της λεπτίνης παρουσιάζει ομοιότητες με τη μακριά έλικα των κυτταροκινών και δρά μέσω του υποδοχέα της (OB-R), ο οποίος ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων των κυτταροκινών και εμφανίζεται σε ποικιλία ισομορφών ενώ εκφράζεται σε διάφορους ιστούς και κύτταρα του νευροενδοκρινικού, αναπαραγωγικού, αιματοποιητικού και ανοσοποιητικού συστήματος. Η λεπτίνη εμπλεκεται και σε αυτοάνοσες καταστάσεις με το να προάγει τη διατήρηση παθογόνων Th1 κυτταρικών υποπληθυσμών. Στην παρούσα μελέτη προκειμένου να διερευνήσουμε το ρόλο της λεπτίνης σε αυτοάνοσες καταστάσεις μετρήσαμε τα επίπεδα αυτής και του υποδοχέα της σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, μια χρόνια συστεμική αυτοάνοση νόσο, για να δούμε εάν αυτά σχετίζονται με το στάδιο της νόσου ή τη θεραπεία. Ακόμη μελετήθηκε η εμπλοκή της λεπτίνης στην έκφραση προ- και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών στον ορό ασθενών και μαρτύρων. Τα αποτελέσματα δείχνουν πως τα επίπεδα λεπτίνης είναι υψηλά στους ασθενέις με ΡΑ. Επιπλέον τα επίπεδα λεπτίνης δεν βρέθηκε να σχετίζονται με το στάδιο της νόσου ή τη χορηγούμενη θεραπεία. Παρόλα αυτά τα αυξημένα επίπεδα λεπτίνης σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα καταδεικνύουν ενδεχομένως έναν παθογενετικό ρόλο της λεπτίνης. 9

10 Εισαγωγή

Α. ΡΕΥΜΑΤΟΕΙΔΗΣ ΑΡΘΡΙΤΙΔΑ 1. Ιστορική αναδρομή Η ρευματοειδής αρθρίτιδα είναι η πιό κοινή φλεγμονώδης αρθρίτιδα και αποτελεί μια σημαντική αιτία αναπηρίας. Η νόσος εμφανίστηκε για πρώτη φορά πριν από αρκετές χιλιάδες χρόνια στους πρώτους αμερικανικούς πληθυσμούς ιθαγενών, ενώ πιστεύεται ότι εμφανίστηκε στην Ευρώπη μετά το 17ο αιώνα. Αν και το όνομα της ασθένειας θεσπίστηκε στη δεκαετία του 1850, τα κριτήρια κατάταξής της προσδιορίστηκαν πριν από 50 χρόνια περίπου. Μελέτες στο παρελθόν αποκάλυψαν τα βασικά χαρακτηριστικά της ΡΑ, που δείχνουν ότι πρόκειται για μια μια σοβαρή μακροχρόνια ασθένεια με δεσπόζουσες εξωαρθρωτικές εκδηλώσεις, περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές με φτωχά αποτελέσματα (Firestein 2003 και Scott 2010). Το όνομα της νόσου προέρχεται από τον όρο «ρευματικός πυρετός», νόσημα που χαρακτηρίζεται και από πόνο στις αρθρώσεις και προέρχεται από την ελληνική λέξη «ρεύμα» που δηλώνει κάτι που κινέιται. Το όνομα δόθηκε το 1859 από το βρετανό ρευματολόγο DrAlfredGarrod (Landre-Beauvais 2001). Σήμερα γνωρίζουμε ότι η ΡΑ είναι μία χρόνια αυτοάνοση φλεγμονώδης νόσος που χαρακτηρίζεται κυρίως από φλεγμονή και καταστροφή των αρθρώσεων σε συνδυασμό με ορολογικά ευρήματα αυτοανοσίας. Η ΡΑ έχει παγκόσμια κατανομή και προσβάλει το 1-2% του πληθυσμού στις περισσότερες μελέτες διεθνώς. Η νόσος είναι 2-3 φορές συχνότερη στις γυναίκες από ότι στους άνδρες. Μπορεί να αρχίσει σε οποιαδήποτε ηλικία αλλά έχει μια συχνότητα αιχμής στην ηλικία μεταξύ των 25 και 55 ετών. Σύμφωνα με μελέτες υπάρχει κάποια γεωγραφική κατανομή της νόσου, με τον αστικό πληθυσμό να προσβάλλεται συχνότερα από τον αγροτικό, ορισμένες φυλές Ινδιάνων της Βόρειας Αμερικής να προσβάλονται συχνότερα από τους Ευρωπαίους, ενώ οι πληθυσμοί της Αφρικής και της Κίνας σπανιότερα (Berg 2008). Στην Ρευματοειδή Αρθρίτιδα, το ανοσολογικό σύστημα του οργανισμού εμφανίζει ορισμένες διαταραχές. Στους ασθενείς, το σύστημα αυτό, το οποίο είναι διαπιστευμένο με την προστασία του σώματος από τις λοιμώξεις και τις νεοπλασίες,για αδιευκρίνιστους λόγους, επιτίθεται στα κύτταρα του ίδιου του οργανισμού μέσαστον αρθρικό θύλακο με αυτοβλαπτικά αποτελέσματα. Άλλωστε, για τον λόγο αυτό, η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα θεωρείται "αυτοάνοσο νόσημα". 11

2. Ιστιοπαθολογία του αρθρικού υμένα Η ρευματοειδής αρθρίτιδα είναι μια συστηματική νόσος, η οποία μπορεί να προκαλεί σημαντική ζημία σε πολλά όργανα. Οι περισσότερο καταστρεπτικές της επιδράσεις παρατηρούνται στις αρθρώσεις. Προκαλεί συμμετρική αρθρίτιδα, η οποία προσβάλλει, κατά κύριο λόγο, τις μικρές αρθρώσεις των χεριών και των ποδιών, αστραγάλους, καρπούς, αγκώνες και ώμους (εικόνα 1). Το κύριο όργανο που προσβάλλεται στη ΡΑ είναι ο αρθρικός υμένας και δευτερευόντως τα υπόλοιπα στοιχεία της άρθρωσης. Κλινικά εκδηλώνεται με φλεγμονώδη (επώδυνη και οιδηματώδη) συμμετρική αρθρίτιδα των μικρών κυρίως αρθρώσεων, χωρίς όμως να αποκλείεται η προσβολή μεγαλύτερων, όπως το γόνατο ή ο ώμος. Εικόνα 1.Αρθρώσεις που προσβάλλονται στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Τυπικά προσβάλλονται οι εγγύς μεσοφαλαγγικές και μετακαρπιοφαλαγγικές αρθρώσεις, ενώ οι άπω μεσοφαλαγγικές αρθρώσεις παραμένουν ανέπαφες. Η εμπλοκή της σπονδυλικής στήλης, όταν υπάρχει, περιορίζεται στην άνω αυχενική μοίρα. Επίσης η εμπλοκή της άρθρωσης του ισχίου είναι εξαιρετικά σπάνια. Η βλάβη της άρθρωσης στη ΡΑ προκαλείται μέσω κυττάρων. Κάτω από τα επενδυτικά κύτταρα του αρθρικού υμένα, τα CD4+ μνημονικά λεμφοκύτταρασυσσωρεύονται σε περιοχές γύρω από τα αγγεία. Διάσπαρτα ανάμεσά τους βρίσκονται αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, μακροφάγα και δενδριτικά 12

κύτταρα. Συνέπεια των αλληλεπιδράσεών τους είναι η δημιουργία διαλυτών παραγόντων που προκαλούν πολλαπλασιασμό των Τ λεμφοκυττάρων, διαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, ώστε να παράγουν αντισώματα καθώς και η παραγωγή διαφόρων κυτταροκινών (εικ. 2). Οι κυτταροκίνες του αρθρικού υμένα όπως η IL-1, TNF-a, IL-6 και GM-CSF, είναι κυρίως παράγοντες που δημιουργούνται από επενδυτικά κύτταρα παρόμοια των ινοβλαστών και από μακροφάγα, με λίγες ιντερλευκίνες που παράγονται από ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα. Έτσι αν και τα Τ λεμφοκύτταρα φαίνεται ότι έχουν κρίσιμη σημασία για την έναρξη της υμενίτιδας, με τη μετάπτωση της φλεγμονής σε χρόνια, ανενεργοποιούνται ή υπορυθμίζονται από παράγοντες στο μικροσκοπικό περιβάλλον όπως ο TGF-β, οι προσταγλαδίνες ή ένας εγγενής ανταγωνιστής του υποδοχέα της IL-1 στα Τ λεμφοκύτταρα. Τα μακροφάγα και τα κύτταρα του αρθρικού υμένα παραμένουν ανεμπόδιστα και ελεύθερα να εκφράσουν το δυναμικό τους για τη δημιουργία φλεγμονής και ιστικής βλάβης. Έτσι τα λεμφοκύτταρα και τα μακροφάγα προκαλούν φλεγμονή των ιστών (μέσω διαλυτών παραγώγων), αυξάνουν τη διαπερατότητα των αιμοφόρων αγγείων του αρθρικού υμένα καθώς και την παραγωγή πρωτεϊνασών και προσταγλαδινών από τα κύτταρα του αρθρικού υμένα και τα χονδροκύτταρα. 13

Εικόνα 2.Κύτταρα και κυτταρικά προϊόντα που συμμετέχουν στη φλεγμονή των προσβεβλημένων με ΡΑ αρθρώσεων. Από ιστολογική άποψη, οι προσβεβλημένες αρθρώσεις εμφανίζουν χρόνια αρθροθυλακίτιδα. Παρατηρείται υπερπλασία και υπερτροφία των κυττάρων που επενδύουν τον αρθρικό θύλακο και σε μερικές περιπτώσεις σχηματίζονται δακτυλοειδείς προεκβολές (λαχνοειδείς). Ο συνδετικός ιστός που βρίσκεται κάτω από τον αρθρικό θύλακο υφίσταται βαριά διήθηση από λεμφοκύτταρα, μακροφάγα και πλασματοκύτταρα, συχνά δε παρατηρείται ο σχηματισμός λεμφικών οζιδίων. Η γένεση νέων αγγείων είναι εμφανής, με ευμεγέθη ενδοθηλιακά κύτταρα να εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα μόρια προσκόλλησης. Ο φλεγμονώδης, αναδιπλούμενος αρθρικός θύλακος, με την πλούσια αγγείωση, που καλύπτει τις αρθρικές χόνδρινες επιφάνειες είναι γνωστός ως πάννος. Με την πλήρη ανάπτυξη της φλεγμονώδους εμπλοκής, συνήθως αναπτύσσεται περιαρθρικό οίδημα των μαλακών ιστών, το οποίο, με κλασικότρόπο, εκδηλώνεται πρώτα μεατρακτοειδή διόγκωση των εγγύς διαμεσοφαλαγγικών αρθρώσεων. Με την 14

πρόοδοτης νόσου, ο αρθρικός χόνδρος, που βρίσκεται δίπλα στον πάννο υφίσταται διάβρωση, και με το χρόνο πρακτικά καταστρέφεται. Επίσης, το οστό υπό την άρθρωση προσβάλλεται και διαβιβρώσκεται. Τελικά ο πάννος γεμίζει όλο το χώρο της άρθρωσης, η δε συνακόλουθη ίνωση και ασβέστωση μπορεί να προκαλέσουν μόνιμη αγκύλωση της άρθρωσης. Εικόνα 3.Διογκωμένη άρθρωση κατά το σχηματισμό του πάννου. Νωρίς κατά τη διάρκεια της νόσου, το αρθρικό υγρό αυξάνεται σε όγκο, καθίσταται θολερό εξαιτίας της παρουσίας φλεγμονώδους διηθήματος και χάνει μέρος της περιεχομένης βλέννας (και γι' αυτό σχηματίζει κακής ποιότητας θρόμβο από βλέννα όταν αναμιγνύεται με αραιό οξικό οξύ). Μολονότι ο αρθρικός θύλακος διηθείται από κύτταρα χρόνιας φλεγμονής, το αρθρικό υγρό περιέχει κύτταρα οξείας φλεγμονής. Τα περιεχόμενα ουδετερόφιλα εμφανίζουν κοκκιώδη έγκλειστα από ανοσοσυμπλέγματα που έχουν υποστεί φαγοκύτωση. Τα ρευματοειδή υποδόρια οζίδια τελικά εμφανίζονται σε περίπου το ένα τέταρτο των ασθενών. Τα οζίδια συνήθως εμφανίζονται κατά μήκος της εκτατικής επιφάνειας του αντιβραχίου ή σε άλλες περιοχές που υποβάλλονται σε μηχανική πίεση. Είναι στερεές, χωρίς ευαισθησία, ωοειδείς ή αποστρογγυλευμένες μάζες με διάμετρο μέχρι και 2 cm. Σπανιότερα, αυτά τα οζίδια, εμφανίζονται στον Αχίλλειο τένοντα, στο πίσω μέρος του κρανίου, πάνω από τα ογκώματα του ισχίου ή κατά μήκος της κνήμης. Χαρακτηρίζονται από κεντρική εστία ινωδοειδούς νέκρωσης που περιβάλλεται από 15

πασσαλόφραξη από μακροφάγα, που με τη σειρά της περιβάλλεται από κοκκιώδη ιστό. Τα ρευματοειδή οζίδια μπορούν επίσης να εμφανίζονται σε σπλάχνα συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, του σπλήνα του περικαρδίου, της αορτής και των βαλβίδων της καρδίας. Εφόσον η ρευματοειδής αρθρίτιδα είναι συστηματική νόσος, διάφορα άλλα στοιχεία μπορούν επίσης να προσβάλλονται. Η οξεία νεκρωτική αγγειίτιδα μπορεί να προσβάλει μικρές ή και μεγάλες αρτηρίες. Η εμπλοκή ορογόνων μπορεί να εκδηλώνεται ως ινώδης πλευρίτιδα ή περικαρδίτιδα ή και τα δύο. Το παρέγχυμα των πνευμόνων μπορεί να υποστεί βλάβη από προοδευτική διάμεση ίνωση. Αλλοιώσεις στα μάτια, όπως ραγοειδίτιδα και κερατοεπιπεφυκίτιδα, μπορεί να είναι εμφανείς σε μερικές περιπτώσεις. Η ιστοπαθολογική εικόνα αντανακλάται και στην ακτινολογική απεικόνιση των αρθρώσεων. Έτσι, σε πρώιμη νόσο διαπιστώνεται απλώς περιαρθρικό οίδημα, ενώ καθώς εμμένει η φλεγμονή εμφανίζονται σταδιακά περιαρθρική οστεοπόρωση, στένωση του μεσαρθρίου διαστήματος, διαβρώσεις και τελικά παραμόρφωση της άρθρωσης (Mohr 1986, Chu 1992, Xue 1997, Goldring 2003, Highton 2007και Herman2008). 3. Αυτοαντισώματα Η αρχική εκδήλωση της ΡΑ περιλαμβάνει την παραγωγή αυτοαντισωμάτων κατά της ανθρώπινης ανοσοσφαιρίνης IgG (γνωστών ωςigm and IgA ρευματοειδείς παράγοντες) ή ειδικά για τα κυκλικά κιτρουλλιωμένα πεπτίδια (CCPs). Ο ρευματοειδής παράγοντας αποτελεί το τυπικό αυτοαντίσωμα στη ΡΑ. Η οικογένεια αυτοαντισωμάτων έναντι κιτρουλλιωμένων πεπτιδίων (ACPA), περιλαμβάνει τον αντιπεριπυρηνικό παράγοντα και τα αντισώματα αντικερατίνης, αντιβιμεντίνης και αντιφιλαγκρίνης. Όλα αυτά τα αυτοαντισώματα αναγνωρίζουν επιτόπους που περιέχουν κιτρουλλίνη, ένα μη απαραίτητο αμινοξύ που ενσωματώνεται στις πρωτεΐνες κατά την μετα-μεταφραστική τροποποίηση (Linden 2009, Scott 2010). Τα κιτρουλλιωμένα παράγωγα προέρχονται από απαμίνωση της ομάδας γουανιδίνης των υπολοίπων καρβοξυτελικής αργινίνης από το ένζυμο απαμινάση πεπτιδυλ-αργινίνης (PAD). Τα αντι-ccp αντισώματα είναι τα πιο ειδικά αυτοαντισώματα της ΡΑ και εντοπίζονται στο 80% σχεδόν του ορού ασθενών με ΡΑ, με ειδικότητα 99%. Εκτός από την ειδικότητα για τη ΡΑ, τα αντισώματα μπορούν 16

ναανιχνευθούν σε πρώιμα στάδια της νόσου και να προβλέψουν την κλινική τηςπορεία.μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί πέντε ισόμορφα του PAD (PAD1, 2, 3, 4 και 6) στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 1p36, μια περιοχή που σχετίζεται με ευπάθεια στη ΡΑ(Suzuki 2003, Venrooij, Vossenaar 2004,Liao, Moutsopoulos 2009). 4. Εμπλοκή κυττάρων και κυτταροκινών στην παθογένεια της ΡΑ Με την εμφάνιση της νόσου τα λευκά αιμοσφαίρια που αποτελούν μέρος του φυσιολογικού ανοσολογικού συστήματος, συγκεντρώνονται στον αρθρικό υμένα και προκαλούν φλεγμονή. Αυτό καλείται υμενίτιδα και εμφανίζεται με θερμότητα, ερυθρότητα, οίδημα και πόνο, που είναι τυπικά συμπτώματα της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Κατά την εξέλιξη της φλεγμονής, τα κύτταρα του αρθρικού υμένα αναπτύσσονται και διαιρούνται με παθολογικό τρόπο, μεταβάλλοντας το φυσιολογικά λεπτό αρθρικό υμένα σε παχύ, και έτσι η άρθρωση διογκώνεται και είναι επώδυνη στην επαφή και την κίνηση. Καθώς η ΡΑ εξελίσσεται, τα κύτταρα που διηθούν τον αρθρικό υμένα επεκτείνονται, εισβάλλουν και διαβρώνουν τους αρθρικούς ιστούς καταστρέφοντας τους χόνδρους και τα οστά. Οι περιβάλλοντες μύες, σύνδεσμοι και τένοντες, που ενισχύουν και σταθεροποιούν την άρθρωση, εξασθενούν και αδυνατούν να λειτουργήσουν φυσιολογικά. Έτσι προκαλείται πόνος και δυσμορφία των αρθρώσεων, που παρατηρούνται συχνά στη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Επιπλέον, οι φλεγμονώδεις αντιδράσεις στην ΡΑ συμβάλλουν σε γενικευμένη απώλεια οστικής μάζας, πράγμα που μπορεί να οδηγήσει σε οστεοπόρωση (εύθραυστα οστά, επιρρεπή σε κατάγματα). Πιστεύεται ότι η καταστροφή των οστών ξεκινά στα πρώτα ένα με δύο έτη από την έναρξη της νόσου. 17

Εικόνα 4.Παθολογικές αλλαγές σε προσβεβλημένη άρθρωση ρευματοειδούς αρθρίτιδας.η προσβεβλημένη άρθρωση είναι πρησμένη, λόγω της διήθησης ποικιλίας κυττάρων, όπως ινοβλάστες, μακροφάγα, Τ και Β λεμφοκύτταρα. Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα παράγουν ποικιλία προφλεγμονωδών προϊόντων, όπως TNF-a μέσω δέσμευσης στους Fc-γ υποδοχείς. Σε υγιή άτομα τα αυτοαντισώματα προσδένονται σε κιτρουλινοποιημένα αντιγόνα (ACPA) με περιορισμένη ειδικότητα για αυτά καθώς επίσης υπάρχουν και περιορισμένοι ισότοποι, σε αντίθεση με τους ασθενείς με ΡΑ, στους οποίους παρατηρούνται περισσότερες ισομορφές και αναγνωρίζονται πολύ περισσότεροι επίτοποι (Scott 2010). Αντιγόνα που συνδέονται με την εμφάνιση της αρθρίτιδας παρουσιάζονται από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, όπως δενδριτικά κύτταρα, μακροφάγα ή 18

ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα σε ειδικά Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία ενεργοποιούνται. Η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων από το ειδικό γι αυτά αντιγόνο απαιτεί και ένα δεύτερο ερέθισμα, το οποίο παρέχεται σε αυτά με τα συνδιεγερτικά μόρια CD80 και CD86 που βρίσκονται στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων. Τα μόρια αυτά συνδέονται με το μόριο CD28 στην επιφάνεια των Τ κυττάρων και οδηγούν στην πλήρη ενεργοποίησή τους. Tα διεγερμένα Τ λεμφοκύτταρα παράγουν τις φλεγμονώδεις κυτταροκίνες TNFα, και IFN-γ και ΙL-17, οι οποίες ενεργοποιούν τα μακροφάγα να εκκρίνουν άλλες φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως TNF-α, IL-1 και IL-6. H IL-6 είναι αυξητικός παράγοντας των Τ και κυρίως των Β λεμφοκυττάρων. Οι κυτταροκίνες αυτές επάγουν την παραγωγή πρωτεϊνών οξείας φάσης από τα ηπατοκύτταρα, ενεργοποιούν τους ινοβλάστες και τα χονδροκύτταρα να παράγουν μεταλλοπρωτεάσες με αποτέλεσμα την καταστροφή του χόνδρου της άρθρωσης και προκαλούν απόπτωση των οστεοβλαστών και διαφοροποίηση των οστεοκλαστών μέσω της αλληλεπίδρασης RANK-RANKL (ReceptorforActivatedNuclearfactor κ - LigandofReceptorforActivatedNuclearfactor κ). Έτσι τα Τ λεμφοκύτταρα μέσω του συστήματος RANKL-RANK, ενεργοποιούν τους οστεοκλάστες και οι διεργασίες αυτές οδηγούν στην οστική απορρόφηση και στις οστικές διαβρώσεις. Στη συνέχεια τα διεγερμένα Τ λεμφοκύτταρα που εκφράζουν στην επιφάνεια τους το μόριο CTLA4, με πολύ μεγαλύτερη συγγένεια σύνδεσης με το CD80/86 σε σχέση με το CD28, αναστέλλουν την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων (εικόνα 4). Οι ινοβλάστες του αρθρικού υμένα πολλαπλασιάζονται και παράγουν κυτταροκίνες, προσταγλανδίνες και πρωτεολυτικά ένζυμα, όπως διάφορες μεταλλοπρωτεϊνάσες (matrix metalloproteinases, MMPs), που οδηγούν σε καταστροφή του χόνδρου και εισβολή του νεοσχηματιζόμενου φλεγμονώδους ιστού στο υποκείμενο οστό. Οι διαβρώσεις που σχηματίζονται στο υποκείμενο οστό οφείλονται στη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση των οστεοκλαστών μέσω της παραγωγής ενζύμων, όπως η καθεψίνη Κ, που αποδομεί τον οστίτη ιστό. Οιοστεοκλάστες είναι κύτταρα που προέρχονται από μακροφάγα κύτταρα, τα οποία διαφοροποιούνται σε οστεοκλάστες στον αρθρικό υμένα (Scott 1987,Nishimoto 2006). Τα Β λεμφοκύτταρα διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα, τα οποία εκκρίνουν αυτοαντισώματα έναντι ανοσοσφαιρίνης γ (IgG) (ρευματοειδής παράγοντας), κιτρουλινοποιημένων πεπτιδίων (anti-ccp), ινωδογόνου, βιμεντίνης ή 19

του αντιγόνου της ρευματοειδούς αρθρίτιδας 33kDa (RA33). Τα αυτοαντισώματα αυτά μετά την αναγνώριση και πρόσδεση του ειδικού αντιγόνου σχηματίζουν ανοσοσυμπλέγματα, τα οποία με τη σειρά τους ενισχύουν την παραγωγή φλεγμονωδών κυτταροκινών, όπως ο TNFa, μέσω της ενεργοποίησης του συμπληρώματος και των υποδοχέων της ανοσοσφαιρίνης Fc (FcγR). Τα ενεργοποιημένα Β λεμφοκύτταρα αποκτούν και ρόλο αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων ενεργοποιώντας έτσι και άλλα Τ λεμφοκύτταρα που εισέρχονται στον αρθρικό υμένα. Με αυτόν το μηχανισμό δημιουργείται ένας φαύλος κύκλος ενίσχυσης της αυτοάνοσης αντίδρασης στη ΡΑ. Στον αρθρικό υμένα των ασθενών με ΡΑ, εκτός από τα κύτταρα της ειδικής (Τ και Β λεμφοκύτταρα) και μη ειδικής ανοσίας (δενδριτικά, μακροφάγα, πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα κύτταρα), ενεργοποιούνται και άλλοι κυτταρικοί πληθυσμοί, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων, ινοβλάστες του αρθρικού υμένα και οστεοκλάστες. Πολλές κυτταροκίνες ενεργοποιούνται στον αρθρικό υμένα και εκκρίνονται από τα φλεγμονώδη κύτταρα που συσσωρεύονται σ αυτόν. Κεντρικό ρόλο κατέχουν οι κυτταροκίνες TNFa, IL-1 και IL-6, οι οποίες εκκρίνονται κυρίως από ενεργοποιημένα μακροφάγα και έχουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονώδους αντίδρασης στον αρθρικό υμένα. Η εξουδετέρωση της δράσης τους με ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα ή διαλυτούς υποδοχείς οδηγεί σε αποτελεσματικό έλεγχο της φλεγμονώδους αντίδρασης, υποστροφή της υπερπλασίας του αρθρικού υμένα και πρόληψη των οστικών διαβρώσεων στην πλειονότητα των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα. Από τα ανωτέρω γίνεται εύκολα αντιληπτή η πολυπλοκότητα της παθογένειας της ρευματοειδούς αρθρίτιδας (Glynn 1972, Houssiau 1995, Kotake 2001, Boyle -Goldring 2003, Agarwal 2005, Deng 2006, McInnes 2007, Herman 2008, Klareskog-Tanida 2009, Tassioulas 2010). 5. Ο ρόλος γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων στην παθογένεια της ΡΑ Αν και το αίτιο της Ρ.Α. δεν είναι γνωστό, η σύγχρονη αντίληψη είναι ότι αποτελεί μία πολύπλοκη, γενετικά καθοριζόμενη νόσο. Αυτό σημαίνει ότι ένας συνδυασμός γονιδίων οδηγεί στην εμφάνιση της χαρακτηριστικής παθολογίας 20

αυτής.επιπρόσθετα, δεδομένου ότι η γενετική προδιάθεση ευθύνεται μόνο για το 30%περίπου του κινδύνου, πρέπει να υπάρχουν άλλοι σημαντικοί περιβαλλοντικοί παράγοντες που περιλαμβάνουν ένα λοιμώδες αίτιο. Μελέτες σε διδύμους έχουν δείξει ότι η συμμετοχή γενετικών παραγόντων ευθύνεται για το 50% του κινδύνου στην ανάπτυξη του συνδρόμου της ΡΑ, ενώ ανάλυση οικογενειών με περισσότερα από ένα προσβεβλημένα μέλη υποδηλώνει ότι η ΡΑ είναι πολυγενική. Γονίδια που συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο εκδήλωσης της ΡΑείναι ορισμένα αλληλόμορφα γονίδια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας, όπως το HLA-DRB1, τα οποία παίζουν κεντρικό ρόλο στην παρουσίαση αντιγονικών πεπτιδίων στα Τ λεμφοκύτταρα, καθώς και γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες με κεντρικό ρόλο στη λειτουργία και ρύθμιση του ανοσολογικού συστήματος, όπως τα PTPN22, TRAF1, C5, STAT4, IRF5 (Klareskog 2009, Tassioulas 2010). Το 80% σχεδόν των ασθενών με οροθετική ΡΑ φέρει ειδικά αντιγόνα τάξεως ΙΙ του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας, είτε ΗLA-DR1 ή HLA-DR4 (Dw4, Dw14, Dw15 απλότυποι). Τα γονίδια για την υποπεριοχή HLA-DR κωδικοποιούν όχι μόνο για μια αλυσίδα α, αλλά για αρκετές πολυμορφικές HLA-DR β αλυσίδες. Οι β αλυσίδες περιέχουν περιοχές αυξημένης μεταβλητότητας, ιδιαίτερα στις αλληλουχίες αμινοξέων που περιβάλλουν τη θέση 70 της πρώτης περιοχής της αλυσίδας HLA-DR β1 (αντίστοιχη με την τρίτη της υπερμεταβλητής περιοχής, HVR). Κάθε ένας από τους απλότυπους που σχετίζονται με την ευυπάθεια στην ΡΑ έχει τα ίδια αμινοξέα στις θέσεις 70-74 στην υπερμεταβλητή περιοχή. Αυτοί οι κοινοί αντιγονικοί επίτοποι υποδηλώνουν μια γενετική προδιάθεση για τη νόσο σχετιζόμενη με το μείζον σύστημα ιστοσυμβατότητας. Άλλες γονιδιακές θέσεις, μεταξύ των οποίων το PTPN22 (πρωτεϊνική φωσφατάση της τυροσίνης, μη ειδικός υποδοχέας τύπου 22), PADΙ4 (απαμινάση πεπτιδυλ-αργινίνης τύπου IV), CTLA4 (κυτοτοξικό Τ λεμφοκυτταρικό αντιγόνο 4), STAT4 (μεταγωγέας σήματος και ενεργοποιητής μεταγραφής 4), FcγRs (Fc υποδοχείς της IgG) και διάφορες γονιδιακές θέσεις κυτταροκινών και υποδοχέων κυτταροκινών, όπως αυτές που κωδικοποιούν τον ογκονεκρωτικό παράγοντα (TNFα) και τις ιντερλευκίνες IL-1, IL-10 και IL-18, έχουν ενοχοποιηθεί με διάφορους βαθμούς συσχέτισης σε συγκεκριμένους πληθυσμούς. Πολλά γονίδια είναι σημαντικά στην ανοσολογική ρύθμιση. Τα PTPN22, STAT4, CTLA4 και IL2, συμμετέχουν στην ενεργοποίηση των Τ-κυττάρων και σε σηματοδοτικά μονοπάτια. 21

Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες έχουν επίσης επίδραση στην έναρξη, τη βαρύτητα και το ρυθμό εξέλιξης της νόσου. Πολυάριθμοι λοιμογόνοι οργανισμοί έχουν ενοχοποιηθεί, αλλά πρόσφατα στοιχεία εμπλέκουν πιο έντονα το κάπνισμα ως σημαντικό περιβαλλοντικό παράγοντα κινδύνου για την εξέλιξη της νόσου σε HLA- DR4 θετικά άτομα. Είναι χαρακτηριστικό ότι το κάπνισμα αποτελεί παράγοντα κινδύνου για τη ΡΑ που χαρακτηρίζεται από θετικό ρευματοειδή παράγοντα και anti- CCP αντισώματα. Άλλοι περιβαλλοντικοί παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη ΡΑ είναι τα μεταλλικά έλαια και οι ίνες πυριτίου (McInnes 2007, Moutsopoulos-Onozaki 2009). 6. Παθολογική ανατομική της ΡΑ Η παθογένεση και παθολογική ανατομική της ρευματοειδούς αρθρίτιδας μπορεί να διακριθούν σε τρία ξεχωριστά στάδια: 1. Την έναρξη της υμενίτιδας από τον πρωταρχικό αιτιολογικό παράγοντα 2. Τους επακόλουθους ανοσολογικούς μηχανισμούς που διαιωνίζουν την αρχική φλεγμονώδη αντίδραση, και 3. Τη μετάπτωση της φλεγμονώδους αλλεργικής αντίδρασης στον αρθρικό υμένα σε έναν υπερπλαστικό καταστροφικό κοκκιωματώδη ιστό (πάννος). Παρόλο που οι πρώτες αλλοιώσεις της ΡΑ είναι δύσκολο να αποδειχθούν, υπάρχουν ενδείξεις που υποδηλώνουν ότι αυτές είναι βλάβες των μικροσκοπικών αγγείων και μικρού βαθμού υπερπλασία των κυττάρων του αρθρικού υμένα. Ο ρευματοειδής αρθρικός υμένας περιέχει μεγάλα ποσά ανοσοσφαιρίνης κατά την εξέταση με τεχνική ανοσοφθορισμού. Συγκεκριμένα διαπιστώνονται εναποθέσεις των IgG και IgM μόνων τους ή σε συνδυασμό στα επενδυτικά κύτταρα του αρθρικού υμένα, στα αγγεία και στους διάμεσους συνδετικούς ιστούς. Ένας σημαντικός αριθμός πλασματοκυττάρων στο ρευματοειδή αρθρικό υμένα σχηματίζει ένα IgG ρευματοειδή παράγοντα που συνδυάζεται στο κυτταρόπλασμα με παρόμοια μόρια IgG. 7. Διάγνωση Η ΡΑ στην τυπική της μορφή συνήθως δεν είναι δύσκολο να διαγνωσθεί, η δε διάγνωσή της είναι πρωταρχικής σημασίας να γίνεται έγκαιρα. Η ΡΑ 22

προσβάλλειποσοστό 0,67% των Ελλήνων, κυρίως στην παραγωγική φάση της ζωής τους. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι η έγκαιρη διάγνωση και θεραπευτική παρέμβαση είναι οι πιο σημαντικοί παράγοντες για την αποτελεσματική αντιμετώπισή της και την πρόληψη μεταγενέστερων επιπλοκών. Η διάγνωση της ΡΑ είναι κλινική, με κύρια χαρακτηριστικά τη συμμετρική πολυαρθρίτιδα (πάνω από 5 αρθρώσεις) κυρίως των καρπών και των μικρών αρθρώσεων στα χέρια και στα πόδια, τη δυσκαμψία που διαρκεί για διάστημα μεγαλύτερο της μιας ώρας έπειτα από ύπνο ή παρατεταμένη ακινησία, σε συνδυασμό με εργαστηριακά ευρήματα ενδεικτικά φλεγμονής, όπως αυξημένη CRP ή/και ΤΚΕ, αναιμία χρόνιας νόσου και θρομβοκυττάρωση. Ο ρευματοειδής παράγοντας είναι θετικός στο 60% - 70% των ασθενών με ΡΑ, αλλά στερείται ειδικότητα για τη νόσο. Η ανίχνευση των αντισωμάτων έναντι κυκλικών κιτρουλινοποιημένων πεπτιδίων (anti-ccp) και η εισαγωγή τους στην κλινική πράξη είναι μία σημαντική εξέλιξη της τελευταίας δεκαετίας, μιας και αυτά τα αυτοαντισώματα έχουν την ίδια ευαισθησία με το ρευματοειδή παράγοντα, αλλά έχουν πολύ μεγάλη ειδικότητα για τη ΡΑ (93% - 97%). Ας σημειωθεί ότι ποσοστό 10% - 20% των ασθενών με ΡΑ έχει θετικά (συνήθως σε χαμηλό τίτλο) αντιπυρηνικά αντισώματα. Μία σημαντική πρόοδος που έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια είναι η ταυτοποίηση ειδικών για τη νόσο αυτοαντισωμάτων έναντι κυκλικού κιτρουλινοποιημένου πεπτιδίου (anti-ccp) ως διαγνωστικών αλλά και προγνωστικών δεικτών. Τα αντισώματα αυτά έχουν ευαισθησία για τη ΡΑ παρόμοια με αυτήν του ρευματοειδούς παράγοντα (65% - 75%), αλλά πολύ μεγάλη ειδικότητα (96% - 98%) για τη νόσο. Η αρχική εκτίμηση του ασθενή με ΡΑ περιλαμβάνει επίσης έλεγχο για την εντόπιση πιθανών οστικών αλλοιώσεων και αυτό γίνεται με απλές ακτινογραφίες καρπού, χειρόςκαι ποδιών. Οι υπέρηχοι και η μαγνητική τομογραφία είναι πιο ευαίσθητες μέθοδοι για την αναγνώριση φλεγμονωδών αλλοιώσεων του περιαρθρικού οστού και του αρθρικού χόνδρου (Khosla 2004, Ger 2005, Niewold 2007, Feldmann 2009). 23

8. Συμπτώματα και κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου Η έναρξη της ρευματοειδούς αρθρίτιδας μπορεί να είναι βαθμιαία ή οξεία. Στη βαθμιαία έναρξη εμφανίζονται συνήθως γενικά συμπτώματα, όπως ανορεξία,απώλεια βάρους, αδυναμία, δεκατική πυρετική κίνηση, αρθραλγίες και τελικά η αρθρίτιδα με όλα τα φαινόμενα της φλεγμονής. Η οξεία έναρξη της νόσου χαρακτηρίζεται από αιφνίδιαεγκατάσταση αρθρίτιδας, δηλαδή φλεγμονής στις αρθρώσεις, που μπορεί μερικές φορές να συνοδεύεται από πυρετό. Τα κύρια κλινικά χαρακτηριστικά της αρθρίτιδας είναι: Ο πόνος στην άρθρωση Η διόγκωση της άρθρωσης Η αύξηση της τοπικής θερμοκρασίας της άρθρωσης Η ευαισθησία στην πίεση της άρθρωσης Η πρωινή δυσκαμψία, δηλαδή η δυσκολία στις κινήσεις, της άρθρωσης. Η αρθρίτιδα συνήθως αφορά πολλές αρθρώσεις, είναι δηλαδή πολυαρθρίτιδα, και είναι συμμετρική, δηλαδή εντοπίζεται στις ίδιες αρθρώσεις στις δύο πλευρές του σώματος (εικόνα 5). Λιγότερο συχνά η ρευματοειδής αρθρίτιδα μπορεί να αρχίσει με ασύμμετρη προσβολή λίγων αρθρώσεων, μέχρι τεσσάρων (ολιγοαρθρίτιδα), ή σπανιότερα με προσβολή μιας άρθρωσης (μονοαρθρίτιδα). Στην πλειονότητα των ασθενών με ολιγοαρθρίτιδα ή μονοαρθρίτιδα η νόσος εξελίσσεται τελικά σε συμμετρική πολυαρθρίτιδα, αλλά σε ένα μικρό ποσοστό παραμένει περιορισμένη σε 1-2 αρθρώσεις, συνήθως στα γόνατα ή στις πηχεοκαρπικές, για πολλούς μήνες ή χρόνια (Grassi 1998). Εικόνα 5.Κλινική (Α) και ακτινογραφική (Β) εικόνα συμμετρικής διαβρωτικής παραμορφωτικής αρθροπάθειας (6). 24

Οποιαδήποτε άρθρωση των άνω και κάτω άκρων μπορεί να προσβληθεί από τη ρευματοειδή αρθρίτιδα, αλλά πιο συχνά προσβάλλονται οι πηχεοκαρπικέςαρθρώσεις, οι αρθρώσεις των δακτύλων των χεριών και οι αρθρώσεις των ποδιών και τωνγονάτων. Επιπλέον, οι αρθρώσεις της αυχενικής μοίρας της σπονδυλικής στήλης καθώς και οι κροταφογναθικές αρθρώσεις μπορεί να προσβληθούν από τη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Η διάρκεια της πρωινής δυσκαμψίας, ο αριθμός των διογκωμένων αρθρώσεων και ο αριθμός των αρθρώσεων που παρουσιάζουν ευαισθησία αποτελούν χρήσιμους κλινικούς δείκτες για την εκτίμηση του βαθμού ενεργότητας της νόσου και την παρακολούθηση της πορείας της καθώς και για την εκτίμηση του θεραπευτικού αποτελέσματος και τη ρύθμιση της θεραπευτικής αγωγής. Η προσβολή των αρθρώσεων των χεριών συνοδεύεται συχνά από δυσκολία σχηματισμού γροθιάς και από ελάττωση της δύναμης σύσφιξης. Σε ορισμένες αρθρώσεις, όπως π.χ. εκείνες των ισχίων, λόγω της ανατομικής τους θέσης, τα κλινικά σημεία της φλεγμονής δεν είναι εμφανή. Στις περιπτώσεις αυτές ο περιορισμός των κινήσεων των αρθρώσεων και η εμφάνιση πόνου στις παθητικές κινήσεις κατά την κλινική εξέταση από το γιατρό αποτελούν τα μόνα αντικειμενικά σημεία της αρθρικής φλεγμονής (Brooks 2002). Τα εργαστηριακά ευρήματα περιλαμβάνουν αναιμία χρόνιου τύπου και αυξημένους δείκτες φλεγμονής στην ενεργό νόσο: αυτοαντισώματα κατά του τμήματος Fc της IgG (του αποκαλούμενου ρευματοειδή παράγοντα) και κατά των κιτρουλλιωμένων πεπτιδίων που έχουν ενσωματωμένο το αμινοξύ κιτρουλλίνη ανιχνεύονται με ποικίλου βαθμού ευαισθησία και ειδικότητα. Αν δεν υπάρξει θεραπευτική αναστολή της εξέλιξης της νόσου αναπτύσσονται σοβαρότερες ακτινολογικές βλάβες, όπως είναι η φθορά του αρθρικού χόνδρου και οι διαβρώσεις. Καθώς περνάει ο καιρός, αν δεν γίνει έγκαιρη διάγνωση και σωστή θεραπευτική παρέμβαση, η νόσος εξελίσσεται και αναπτύσσονται οι καταστροφικές συνέπειες της χρόνιας φλεγμονής. Στις συνέπειες αυτές περιλαμβάνονται: Αρθρικές παραμορφώσεις, όπως ωλένια απόκλιση των δακτύλων των χεριών και υπεξαρθρήματα σε διάφορες αρθρώσεις και κυρίως στις αρθρώσεις της βάσης των δακτύλων των χεριών (μετακαρπιοφαλαγγικές αρθρώσεις) (Εικόνα 26-Β) ή των ποδιών, βλαισότητα των γονάτων, δηλ. κύρτωση προς τα έσω με ανοιχτή γωνία προς τα έξω, ή των ποδιών. 25

Διαταραχές στις κινήσεις των αρθρώσεων με αποτέλεσμα μακροχρόνια λειτουργική ανικανότητα και αναπηρία. Ακτινολογικές βλάβες. Η πρώτη ακτινολογική βλάβη της ρευματοειδούς αρθρίτιδας είναι η απώλεια οστικής μάζας στα τμήματα των οστών που είναι οστάκοντά στην άρθρωση, δηλαδή η περιαρθρική οστεοπόρωση. Με την πάροδο όμως του χρόνου και εφόσον δεν υπάρξει θεραπευτική αναστολή της εξέλιξης της νόσου, αναπτύσσονται σοβαρότερες ακτινολογικές βλάβες, όπως είναι η φθορά του αρθρικού χόνδρου και οι διαβρώσεις στα τμήματα των οστών που είναι μέσα στην άρθρωση. Επειδή όλες αυτές οι παραμορφωτικές, λειτουργικές και ακτινολογικές καταστροφικές συνέπειες της χρόνιας φλεγμονής της ρευματοειδούς αρθρίτιδας είναι μη αναστρέψιμες, στόχος της σύγχρονης θεραπευτικής παρέμβασης είναι η πρόληψή τους. Και αυτό είναι σήμερα εφικτό (Sherine 2001, McInnes 2007, Lipsky 2008). 9. Εξωαρθρικές εκδηλώσεις της ρευματοειδούς αρθρίτιδας Εκτός από τις αρθρώσεις, η ρευματοειδής αρθρίτιδα μπορεί να προσβάλλει και άλλα όργανα και να παρουσιάσει διάφορες εξωαρθρικές εκδηλώσεις. Οι συνηθέστερες κατά σειρά συχνότητας εξωαρθρικές εκδηλώσεις είναι: Αναιμία. Πρόκειται συνήθως για τη λεγόμενη αναιμία χρόνιας πάθησης. Υποδόρια ρευματοειδή οζίδια. Πρόκειται για μικρά υποδόρια οζίδια μεγέθους μέχρι 2 εκατοστών ή και μεγαλύτερα που είναι μαλακά, ανώδυνα, δεν συμφύονται με το δέρμα ούτε με τα υποκείμενα μόρια και εντοπίζονται συνήθως σε θέσεις που ασκείται πίεση, όπως οι αγκώνες. Σύνδρομο καρπιαίου σωλήνα. Οφείλεται σε συμπίεση του μέσου νεύρου μέσα στον καρπιαίο σωλήνα λόγω τενοντοελυτρίτιδας των μυών που κάμπτουν τα δάκτυλα των χεριών. Τα κύρια συμπτώματα αυτού του συνδρόμου είναι τα μουδιάσματα, το κάψιμο και ο πόνος που εντοπίζονται στην κερκιδική πλευρά της παλάμης και στην παλαμιαία επιφάνεια του αντίχειρα, του δείκτη, του μέσου δακτύλου και του τέταρτου δακτύλου κατά το ήμισυ προς την κερκιδική πλευρά. Σύνδρομο Sjögren. 26

Χαρακτηρίζεται κυρίως από ξηροφθαλμία και ξηροστομία. Σκληρίτιδα Δηλαδή φλεγμονή στο σκληρό χιτώνα του ματιού. Διάμεση πνευμονική ίνωση. Κύρια αρχική κλινική εκδήλωση είναι ο βήχας και αργότερα η δύσπνοια στην κόπωση. Πλευρίτιδα Δηλαδή συλλογή υγρού μέσα στη θωρακική κοιλότητα. Αγγειίτιδα Δηλαδή φλεγμονή στο τοίχωμα των αγγείων. Συνήθως πρόκειται για ελαφρά αγγειίτιδα και συγκεκριμένα για τη λεγόμενη δερματική λευκοκυτταροκλαστική αγγειίτιδα και πολύ σπάνια για σοβαρή αγγειίτιδα τύπου οζώδους πολυαρτηρίτιδας. Η δερματική λευκοκυτταροκλαστική αγγειίτιδα χαρακτηρίζεται από φλεγμονή στο τοίχωμα μικρών αγγείων (αρτηριδίων, τριχοειδών και φλεβιδίων) και εκδηλώνεται με δερματικές βλάβες που έχουν ποικίλη μορφή και μπορεί να συνοδεύονται από κνησμό ή πόνο. Αντίθετα η αγγειίτιδα τύπου οζώδους πολυαρτηρίτιδας προσβάλλει μικρού και μεσαίου μεγέθους αρτηρίες οποιουδήποτε οργάνου και έτσι εκδηλώνεται με διάφορες δερματικές βλάβες, περιφερική νευρίτιδα, αιματουρία, διαταραχή της νεφρικής λειτουργίας, κοιλιακούς πόνους, υπέρταση κ.ά. Περικαρδίτιδα Δηλαδή συλλογή υγρού μέσα στην περικαρδιακή κοιλότητα (Brooks 2002, Turesson 2003, Young 2007). 10. Φάρμακα 10.1 Τα μη στεροειδή αντι-φλεγμονώδη φάρμακα Τα φάρμακα αυτά περιλαμβάνουν την ασπιρίνη, το ibuprofen και το diclofenac που είναι μεταξύ αυτών που χρησιμοποιούνται συχνότερα. Μειώνουν το οίδημα των προσβεβλημένων αρθρώσεων και ανακουφίζουν τον πόνο. Τα φάρμακα αυτά και ιδιαίτερα η ασπιρίνη μπορεί να προκαλέσουν επιπλοκές στο στομάχι. Υπάρχει κίνδυνος δημιουργίας αιμορραγίας και έλκους στο στομάχι. Η λήψη των φάρμακων αυτών μαζί με το φαγητό είναι δυνατόν να περιορίσει τον κίνδυνο των γαστρενετερικών διαταραχών χωρίς όμως να τον απομακρύνει εντελώς. Η αίσθηση 27

θορύβων στα αυτιά είναι ένα σημείο τοξικότητας της ασπιρίνης που δείχνει ότι ο ασθενής παίρνει υπερβολικά ψηλές δόσεις ασπιρίνης. Οι πονοκέφαλοι, η σύγχυση, η αύξηση της αρτηριακής πίεσης και η προσβολή της νεφρικής λειτουργίας περιλαμβάνονται μέσα στις ανεπιθύμητες επιδράσεις που μπορούν να προκληθούν από τα φάρμακα αυτά. 10.2 Τα φάρμακα αργής δράσης Τα φάρμακα αυτά έχουν την δυνατότητα να τροποποιήσουν την πορεία της νόσου αλλά χρειάζονται πολλούς μήνες για να το επιτύχουν. Χρησιμοποιούνται σε περίπτωση που η πρώτη κατηγορία των φαρμάκων δεν είναι αποτελεσματική μετά από 2 έως 3 μήνες θεραπείας. Τα φάρμακα της κατηγορίας αυτής περιλαμβάνουν τα άλατα του χρυσού, την πενικιλλαμίνη, την υδροξυχλωροκίνη και τη σουλφασαλαζίνη. Τα φάρμακα αυτά πρέπει να δίνονται κάτω από στενή ιατρική επίβλεψη. Μπορούν να προκαλέσουν επιπλοκές στο γαστρενετερικό σύστημα, στο συκώτι, δερματικά εξανθήματα, φαγούρα, μείωση των στοιχείων του αίματος με ανεπάρκεια του μυελού των οστών και νεφρικά προβλήματα. Η υδροξυχλωροκίνη είναι ανθελονοσιακό φάρμακο, κατάλληλο για την αντιμετώπιση πρώιμης ρευματοειδούς αρθρίτιδας με ήπια ενεργότητα, ειδικά όταν απουσιάζουν δυσμενείς προγνωστικοί παράγοντες (Davis 1991). Η σουλφασαλαζίνη είναι φάρμακο με αντιφλεγμονώδεις και αντιμικροβιακές ιδιότητες και χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα με καλά αποτελέσματα (Jansen 2004). 10.3 Τα κορτικοειδή Τα κορτικοειδή έχουν τη δυνατότητα να μειώσουν ουσιαστικά τη φλεγμονή στον οργανισμό. Είναι αποτελεσματικά μετά την αρχική χορήγησή τους για μικρά χρονικά διαστήματα. Με τη πάροδο του χρόνου η αποτελεσματικότητά τους μειώνεται. Παράλληλα τα κορτικοειδή έχουν πολλές ανεπιθύμητες δράσεις, ιδιαίτερα κατά τη μακροχρόνια χρήση τους. Το δέρμα λεπτύνεται και προκαλούνται χαρακτηριστικές μόνιμες ραβδώσεις. Ο ασθενής αρχίζει να παίρνει βάρος λόγω υπερφαγίας. Υπάρχει κίνδυνος οστεοπόρωσης, υψηλής πίεσης και υψηλής γλυκόζης στο αίμα με πιθανότητα εκδήλωσης διαβήτη. Τα φάρμακα αυτά μπορεί να χρησιμοποιηθούν για μικρά χρονικά διαστήματα, σε περιπτώσεις έξαρσης της ασθένειας. 28

Λόγω των γνωστών επιπλοκών των κορτικοειδών γίνεται προσπάθεια να χρησιμοποιούνται στην ελάχιστη αναγκαία δόση. Επιπρόσθετα τα κορτικοειδή μπορούν να χρησιμοποιηθούν για ένεση μέσα στην άρθρωση που πάσχει. Βραχυπρόθεσμα οι ενέσεις αυτές ανακουφίζουν. Όμως μακροπρόθεσμα συντείνουν στην καταστροφή της άρθρωσης, ιδιαίτερα στα άτομα που λαμβάνουν συχνά τέτοιες ενέσεις. 10.4 Ανοσοκατασταλτικά φάρμακα Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει τη μεθοτρεξάτη, την αζαθειοπρίνη, την κυκλοφοσφαμίδη και την κυκλοσπορίνη. Καταστέλλουν τη φλεγμονή και μειώνουν την ανάγκη για τα κορτικοειδή φάρμακα. Τα φάρμακα αυτά έχουν υψηλή τοξικότητα. Μπορούν να επηρεάσουν το συκώτι, το μυελό των οστών και να προκαλέσουν μείωση της παραγωγής των στοιχείων του αίματος όπως τα λευκά αιμοσφαίρια, τα ερυθρά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια. Ταυτόχρονα δημιουργείται και αυξημένος κίνδυνος μολύνσεων. Η κυκλοφοσφαμίδη και η αζαθειοπρίνη αυξάνουν τον κίνδυνο εκδήλωσης καρκίνου. Η κυκλοφοσφαμίδη μπορεί να προκαλέσει αιμορραγία από την ουροδόχο κύστη. Από τα φάρμακα αυτά, η μεθοτρεξάτη είναι αυτή που χρησιμοποιείται περισσότερο και με καλά αποτελέσματα. Λαμβάνεται μία φορά την εβδομάδα από το στόμα και μπορεί να επιτύχει βελτίωση σχετικά γρήγορα (μέσα σε μερικές εβδομάδες). Οι ασθενείς ανέχονται καλά τη θεραπεία με τη μεθοτρεξάτη. Χρειάζεται τακτική παρακολούθηση των ασθενών με έλεγχο της γενικής αίματος και των ηπατικών δοκιμασιών. Πρέπει να αποφεύγουν το αλκοόλ για να μην επιδεινώνουν την τοξικότητα στο συκώτι που έχει η μεθοτρεξάτη. Η κυκλοσπορίνη, η οποία είναι ένα πολύ ισχυρό ανοσοκατασταλτικό φάρμακο με δράση εναντίον των λεμφοκυττάρων, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε σοβαρές περιπτώσεις που τα άλλα φάρμακα είναι ανεπαρκή. Έχει ανοσοκατασταλτική δράση μέσω πολλών μηχανισμών, ιδιαίτερα μέσω αναστολής πολλών φλεγμονωδών κυτταροκινών. Χρησιμοποιείται στη ρευματοειδή αρθρίτιδα σε συνδυασμό με μεθοτρεξάτη και βελτιώνει τη δράση της τελευταίας (Gerards 2003). Η μεθοτρεξάτη θεωρείται το πιο σημαντικό και χρήσιμο DMARD και λόγω αποτελεσματικότητας και λόγω λιγότερων ανεπιθύμητων ενεργειών. Προτιμάται επειδή αν δεν ελέγχει την αρθρίτιδα μόνη της έχει καλά αποτελέσματα σε συνδυασμό με πολλά άλλα φάρμακα και ειδικά με τους βιολογικούς παράγοντες (Visser 2009). 29

10.5 Χειρουργική επέμβαση Σε σοβαρές περιπτώσεις που όλα τα άλλα μέτρα δεν μπόρεσαν να βοηθήσουν είναι δυνατόν να χρειάζεται να γίνει μια χειρουργική επέμβαση. Υπάρχουν διάφορες χειρουργικές τεχνικές που μπορούν να εφαρμοστούν ανάλογα με την άρθρωση πουέχει επηρεαστεί.μπορεί να γίνει υμενεκτομή (αφαίρεση αρθρικού υμένα), χειρουργική αντικατάσταση μιας άρθρωσης ή διόρθωση μιας παραμόρφωσης. Επίσης υπάρχουν ειδικά ορθοπεδικά βοηθήματα που μπορούν να εφαρμοστούν σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα για να βοηθούνται στην καθημερινή τους ζωή. 10.6 Βιολογικοί παράγοντες. Την τελευταία δεκαετία έχει σημειωθεί αξιοσημείωτη πρόοδος στην ανάπτυξη στοχευμένων βιολογικών θεραπειών, όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα και οι πρωτεΐνες σύντηξης. Η τεχνολογία των μονοκλωνικών αντισωμάτων επινοήθηκε εδώ και τρεις δεκαετίες και σύντομα έφερε επανάσταση στη θεραπεία κακοηθειών, στη μεταμόσχευση οργάνων και βλαστοκυττάρων, στις ρευματικές διαταραχές, στα αυτοάνοσα νοσήματα, στη φλεγμονώδη νόσο του εντέρου, σε λοιμώξεις και αντιδράσεις υπερευαισθησίας. Οι βιολογικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται συχνότερα παρεμβαίνουν στη δράση των κυτταροκινών που είναι διαλυτοί φλεγμονώδεις μεσολαβητές. Οι κυτταροκίνες ασκούν τη δράση τους με σύνδεση σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (πίνακας 1). Η δράση των κυτταροκινών μπορεί να εμποδιστεί είτε δεσμεύοντας τη διαλυτή κυτταροκίνη, είτε παρεμποδίζοντας τη σύνδεση με το σύστοιχο υποδοχέα. Τα παραπάνω μπορούν να πραγματοποιηθούν με χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων κατά των κυτταροκινών ή με ένα διαλυτό παραπλανητικό υποδοχέα που συνδέεται με τις κυτταροκίνες παρόμοια με τους μεμβρανικούς υποδοχείς, μειώνοντας έτσι τα επίπεδα των ελεύθερων, βιολογικά ενεργών κυτταροκινών (Köhler 1975, Shirota 2008, Feldmann -Vollenhoven 2009). 30

Πίνακας 1.Εγκεκριμένες και υπό εξέταση αντι-κυτταροκινικές βιολογικές θεραπείες για τη Ρευματοειδή Αρθρίτιδα. Όλες αυτές οι επιλογές έχουν ήδη αξιοποιηθεί στη θεραπεία της ΡΑ. Από τους τρεις αντι-τνfα παράγοντες που είναι εγκεκριμένοι στις ΗΠΑ, οι δύο (ινφλιξιμάμπη και ανταλιμουμάμπη) είναι μονοκλωνικά αντισώματα, ενώ η ετανερσέπτη είναι διαλυτός υποδοχέας-πρωτεΐνη σύντηξης. Έχει αποδειχτεί ότι ο αποκλεισμός του TNFα μειώνει τα κλινικά συμπτώματα της φλεγμονής και περιορίζει την επέκταση της φλεγμονώδους οστικής καταστροφής (Keystone-Scott 2006). Η ινφλιξιμάμπη είναι ένα χιμαιρικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του TNF-a (Lipsky 2000). Δεσμεύει σταθερά όλες τις δομές του TNF-a, το διαλυτό, το διαμεμβρανικό και το δεσμευμένο στον υποδοχέα του και εξουδετερώνει τη δράση του. Χρησιμοποιείται με καλά αποτελέσματα για την αντιμετώπιση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Χορηγείται ενδοφλεβίως σε εγχύσεις ανά 6-8 εβδομάδες και μετά 2 εγχύσεις ανά 2 εβδομάδες (εικόνα 6). Η ανταλιμουμάμπη είναι αναστολέας του TNF-a, ένα πλήρως ανθρώπινο IgG1 μονοκλωνικό αντίσωμα με χρόνο ημίσειας ζωής 12 ημέρες. Χορηγούμενη σε ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα ασκεί θεραπευτική δράση δεσμεύοντας με υψηλό 31

βαθμό συγγένειας και ειδικότητας τον TNF-a και εξουδετερώνοντας έτσι την αλληλεπίδραση και τη σύνδεσή του με τους υποδοχείς p55 και p75. Χορηγείται υποδόρια ανά 2 εβδομάδες (Weinblatt 2003). Η ετανερσέπτη είναι αναστολέας του TNF-a, ένας πλήρως ανθρώπινος διαλυτός υποδοχέας του TNF-a. Είναι προϊόν σύντηξης του ανασυνδυασμένου εξωκυττάριου τμήματος του ανθρώπινου υποδοχέα p75 του TNF-a με το Fc τμήμα της ανθρώπινης IgG1. Δρά όπως οι φυσικοί ελεύθεροι υποδοχείς του TNF-a, δηλαδή ως ανταγωνιστικός αναστολέας της σύνδεσης του TNF-a με τους υποδοχείς του στην επιφάνεια των κυττάρων και με τον τρόπο αυτό αναστέλλει τις βιολογικές δράσειςτου TNF-a. χρησιμοποιείται με καλά αποτελέσματα για την αντιμετώπιση της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Χορηγείται υποδόρια ανά εβδομάδα (Genovese 2002). 32

Εικόνα 6. Κυτταροκίνες και άλλοι μεσολαβητές στην παθογένεια της ΡΑ και βιολογικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία της ΡΑ. Ο ΤΝF-a αποτελεί σημαντικό συστατικό του καταράκτη παραγωγής κυτταροκινών, διεγείροντας την παραγωγή επιπλέον φλεγμονωδών μεσολαβητών και την περαιτέρω στρατολόγηση φλεγμονωδών κυττάρων στην άρθρωση. Η ινφλιξιμάμπη και η ανταλιμουμάμπη είναι μονοκλωνικά anti-tnfa αντισώματα, τα οποία προσδένονται στον TNFa με μεγάλη συγγένεια και τον εμποδίζουν να προσδεθεί με τους υποδοχείς του. Η χιμαιρική πρωτεϊνη ετανερσέπτη, η οποία αποτελείται από δύο p75 TNF υποδοχείς και ένα Fc τμήμα της ανθρώπινης IgG1, ενώνεται με τον TNF-a, εμποδίζοντάς τον να αλληλεπιδράσει με τους υποδοχείς του στην επιφάνεια των κυττάρων (Scott 2006). 33

Η έρευνα έχει επισημάνει πολυάριθμους παθογενετικούς μηχανισμούς της ΡΑ που αποτελούν πιθανούς στόχους της βιολογικής θεραπείας, πέρα από τους ήδη επιτυχημένους αντι-tnfa αναστολείς. Επιπρόσθετα μέλη του συστήματος των προφλεγμονωδών κυτοκινών, όπως η IL-6, IL-15, IL-17 και ο RANKL, διαφαίνονται ως πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι για την αποτελεσματική υποχώρηση τόσο της φλεγμονής όσο και της οστικής καταστροφής (Keystone-Scott 2006). Η τοσιλιζουμάμπη είναι αντίσωμα έναντι του υποδοχέα της IL-6. Δεσμεύεται στο διαλυτό και μεμβρανικό υποδοχέα της IL-6, αναστέλλοντας τη δέσμευση της κυτταροκίνης στον υποδοχέα της και παρεμβαίνοντας στη δράση της (Nakashima 2010). Παρόλα αυτά, παρά την αποτελεσματικότητα στην πλειψηφία των περιπτώσεων υπάρχει ένα σημαντικό ποσοστών ασθενών με ΡΑ (περίπου 30%) δεν αναταποκρίνεται στη θεραπεία των anti-tnfa. Για το λόγο αυτό θεωρείται σκόπιμο να διερευνηθεί περαιτέρω ο ρόλος που διαδραματίζουν άλλες κυτταροκίνες και άλλοι διαμεσολαβητές στην παθογένεια της ΡΑ. Στην παρούσα μελέτη θελήσαμε να ασχοληθούμε με το μόριο της λεπτίνης και την πιθανή εμπλοκή της στην παθογένεια της ΡΑ, καθώς φαίνεται ότι είναι ένα μόριο με πλειοτροπική δράση, το οποίο μεταξύ άλλων εμπλέκεται στη διεξαγωγή των ανοσολογικών αποκρίσεων, ενώ παράλληλα έχει ενοχοποιηθεί και σε αυτοάνοσες καταστάσεις (Gabay 2009). 34

Β. TΟ ΜΟΡΙΟ ΤΗΣ ΛΕΠΤΙΝΗΣ 1. Δομή του μορίου της λεπτίνης Στα τέλη της δεκαετίας του 1950 εντοπίστηκε ένα μεταλλαγμένο γονίδιο στα ποντίκια που προκαλούσε παχυσαρκία, λόγω υπρβολικής πρόσληψης τροφής και μειωμένης δαπάνης ενέργειας. Το γονίδιο αυτό ονομάζεται ob και τα ποντίκια με το μεταλλαγμένο γονίδιο ob/ob. Το 1994 προσδιορίστηκε ότι το μόριο που κωδικοποιείται από το ob γονίδιο είναι μια πρωτεϊνη 16-kDA που λέγεται λεπτίνη, από την ελληνική λέξη λεπτός(fantuzzi 2000). Η πρωτοταγής αμινοξική ακολουθία του μορίου, δείχνει ότι η λεπτίνη έχει ελικοειδή δομή, παρόμοια με αυτή της IL-2. Ο υποδοχέας της έχει αλληλουχία παρόμοια με αυτή της οικογένειας των κυτταροκινών τύπου Ι, που περιλαμβάνει μεταξύ άλλων, τον υποδοχέα της IL-2, της IFN-γ και της αυξητικής ορμόνης (GH).Ακόμη φαίνεται ότι το μόριο σχετίζεται δομικά και λειτουργικά με την IL-6 οικογένεια των κυτταροκινών (Mouzaki 2004). Η λεπτίνη είναι ένα επίμηκες μόριο με κατά προσέγγιση διαστάσεις 20 x 25x 45A αποτελoύμενο από τέσσερις αντιπαράλληλες α έλικες, οι οποίες δίνουν στο μόριο τη χαρακτηριστική διαμόρφωση των κυτταροκινών (εικόνα 7). Στο μόριο της λεπτίνης, συμπεριλαμβάνεται και ένας δισουλφιδικός δεσμός ανάμεσα στο αμινοξύ της θέσης 96 και το αμινοξύ της θέσης 146 του καρβοξυτελικού άκρου (Matarese- Zhang 2005). Η δομή της λεπτίνης αποκαλύπτει πολλά εκτεθιμένα υδρόφοβα κατάλοιπα, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη δέσμευση με τον υποδοχέα της, ενώ ακόμη επιτρέπουν στο μόριο να αναδιπλώνεται. Επιλεγμένες μεταλλάξεις σε μερικά από τα κατάλοιπα αυτά μπορούν να δώσουν περισσότερο διαλυτά μόρια,με υψηλή δραστικότητα αλλά με μειωμένη δράση ορμόνης. Η δομή της λεπτίνης δείχνει ότι η Glu 100 βρίσκεται στην επιφάνεια του μορίου, με την πλευρά της αλυσίδας να βρίσκεται προς το διαλύτη. Ως εκ τούτου, υποκατάσταση της εκτεθιμένης Trp με Glu στη θέση αυτή μειώνει τις διαμοριακές υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και βελτιώνει τη διαλυτότητα της πρωτεΐνης. 35

Εικόνα 7.Κρυσταλλική δομή της λεπτίνης. (α) Σχηματικό διάγραμμα των 4 ελικοειδών διαμορφώσεων. Οι 4 έλικες σχηματίζουν ελικοειδή διευθέτηση με μια μικρή Ε έλικα στο βρόχο CD. Η θέση 100 τρυπτοφάνης απεικονίζεται με κόκκινο χρώμα και βρίσκεται στην επιφάνεια του μορίου. (β) Χημική δομή επιφανείας της λεπτίνης. Με μπλέ απεικονίζονται τα άτομα αζώτου (Ν), με κόκκινο τα άτομα οξυγόνου (Ο) και άσπρο τα άτομα άνθρακα (C). (Zhang 2005) 2. Λειτουργία του μορίου της λεπτίνης Το μόριο της λεπτίνης είναι ένα μη γλυκοζυλιωμένο πεπτίδιο αποτελούμενο από 146 αμινοξέα και ρυθμίζει πρωτίστως την πρόσληψη τροφής, την κατανάλωση ενέργειας και το μεταβολισμό, ενώ φαίνεται να συμμετέχει στη ρύθμιση της ενδοκρινικής λειτουργίας, την αναπαραγωγή και την ανοσία (Palmer 2003). Η λεπτίνη παράγεται κυρίως από τον λιπώδη ιστό, ο οποίος εντοπίζεται ακόμα στα πρωτογενή και δευτερογενή λεμφικά όργανα. Η λεπτίνη δρά στον υποθάλαμο ρυθμίζοντας την πρόσληψη τροφής και το σωματικό βάρος.παρόλα αυτά το m-rna της εντοπίζεται και σε άλλους ιστούς όπως ο πλακούντας, τα αμνιακά κύτταρα, στην ανθρώπινη χοριοκαρκινική σειρά BeWo, σε ιστούς εμβρύων ποντικών όπως τα οστά και ο χόνδρος των αρθρώσεων, καθώς επίσης στον εγκέφαλο και στο γαστρικό επιθήλιο σε ενήλικα ποντίκια. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι διάφορες ανωμαλίες που παρατηρούνται κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου σε ob/ob ποντίκια, οφείλονται στην έλλειψη λεπτίνης, η έκφραση της οποίας είναι απαραίτητη για την 36

ωρίμανση των νευρώνων και νευρογλοιακών κυττάρων του εγκεφάλου (Otero 2006).Ταεπίπεδα λεπτίνης στον ορό είναι υψηλότερα σε παχύσαρκα άτομα από ότι στα λεπτά και σχετίζονται με τα αποθέματα λιπώδους ιστού, ενώ αυξάνονται κατά τη διάρκεια πρόσληψης τροφής και συσσώρευση λίπους και μειώνονται κατά τη διάρκεια της νηστείας σε ανθρώπους και τρωκτικά (Matarese 2002). Τα επίπεδα της λεπτίνης που βρίσκονται στην κυκλοφορία, πληροφορούν τον εγκέφαλο για την έκταση του λιπώδους ιστού στο σώμα, μέσω ενός σήματος που μεταφέρεται στον υποθάλαμο, δημιουργώντας ένα κύκλωμα αρνητικής ανάδρασης (εικόνα 8). Με αυτό τον τρόπο, η λεπτίνη προκαλεί ελάττωση της μάζας του λίπους μέσω καταστολής της όρεξης, διέγερσης του μεταβολισμού και αύξησης του ενεργειακού ρυθμού.η ρύθμιση της μάζας του λίπους του σώματος μέσω της λεπτίνης, επιτυγχάνεται κυρίως μέσω της αλληλεπίδρασής της με το νευροπεπτίδιο Υ του υποθαλάμου, που είναι διεγέρτης της όρεξης, και της CRH ορμόνης καταστολέα της όρεξης. Η δράση της στο ενεργειακό ισοζύγιο, πιθανόν να συνδέεται με τη διέγερση λειτουργιών στο συμπαθητικό νευρικό σύστημα. Η λεπτίνη αλληλεπιδρά και με την αυξητική ορμόνη GH, της οποίας η έκκριση αυξάνεται όταν μειωθούν τα επίπεδα λεπτίνης στο αίμα (Wilson 1997, Dötsch 1999). Η κυκλοφορούσα λεπτίνη προσδένεται σε ειδικές πρωτεϊνες του ορού, οι οποίες φαίνεται να ρυθμίζουν το χρόνο ημιζωής της καθώς και τη βιολογική της δράση. Η δράση της λεπτίνης στην περιφέρεια φαίνεται να σχετίζεται με τη ρύθμιση έκκρισης ινσουλίνης από τα β κύτταρα του παγκρέατος και το μεταβολισμό ενέργειας στους σκελετικούς μύες και τα λιποκκύταρα. Η έλλειψη ή αντίσταση αυτής μπορεί να οδηγήσει σε παχυσαρκία, εμφάνιση διαβήτη και στειρότητα στον άνθρωπο (Houseknecht 1998, Zhang 2005). Η έκφραση της λεπτίνης διεγείρεται παρουσία κορτιζόλης, ινσουλίνης, προσταγλαδίνης Ε2 και αραχιδονικού οξέος, μέσω του COX2 μονοπατιού, ενώ αναστέλλεται από τους β-αδρενεργικούς αγωνιστές, το camp, και τις θειαζολιδινεδιόνες. Ακόμη τα γλυκοκορτικοειδή, τα οποία δρούν άμεσα στο λιπώδη ιστό φαίνεται να έχουν τα πιο διεγερτικά αποτελέσματα όσον αφορά την σύνθεση και την έκκριση λεπτίνης. 37

Εικόνα 8. Η λεπτίνη σηματοδοτεί την ενεργειακή κατάσταση του σώματος προς τον υποθάλαμο και το νευροενδοκρινικό σύστημα. Η παραγωγή λεπτίνης στα λιποκύτταρα ρυθμίζεται από τους δείκτες της οξείας διατροφικής κατάστασης, όπως η ινσουλίνη και ρυθμιστικές ορμόνες, καθώς και από την περιεκτικότητα λιπαρών (ενδεχομένως μέσω σηματοδότησης αυτοκρινούς/παρακρινούς παραγωγής γλυκοκορτικοειδών) (Martin 2004). Η έκφραση της λεπτίνης ρυθμίζεται πρωτίστως από την πρόσληψη τροφήςόπως αναφέρθηκε, καθώς και από ορμόνες και παράγοντες φλεγμονής. Έτσι τα επίπεδα αυτής αυξάνονται σε περιπτώσεις σηψαιμίας καικατά την οξεία φλεγμονή, η οποία επάγεται από την επίδραση προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών. Αντίθετα κατά τη χρόνια φλεγμονή αναστέλλεται η έκφρασης αυτής. Το μόριο της λεπτίνης φαίνεται να παρουσιάζει φυλετικό διμορφισμό, με τα επίπεδα αυτής να είναι υψηλότερα στις γυναίκες από ότι στους άνδρες. Ακόμη η ορμόνη τεστοστερόνη φαίνεται να καταστέλει την έκφραση λεπτίνης σε αντίθεση με τα οιστρογόνα, τα οποία την επάγουν (Huang-Otero 2006, Lago 2007). 38

Εικόνα 9. Πλειοτροπική δράση της λεπτίνης. Η λεπτίνη είναι μια πλειοτροπική αδιπονεκτίνη, η οποία παράγεται κυρίως στο λευκό λιπώδη ιστό, αλλά και σε άλλους ιστούς και ρυθμίζει την πρόσληψη τροφής και το ενεργειακό ισοζύγιο, αλλά φαίνεται να συμμετέχει στην ρύθμιση της φλεγμονώδους αντίδρασης και στο ανοσοποιητικό σύστημα (Lago 2007). Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό ότι η λεπτίνη είναι μια ορμόνη με πλειοτροπική δράση, η οποία εμπλέκεται σε μια πληθώρα βιολογικών λειτουργιών, πέρα από τη δράση της ως αδιποστατίνη, που περιλαμβάνει τον μεταβολισμό της γλυκόζης, τη σύνθεση γλυκοκορτικοειδών, την έκκριση κυτταροκινών, τη φαγοκυττάρωση, την αναπαραγωγή, την αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό των CD4+ T λεμφοκυττάρων (εικόνα 9). 39

3. Υποδοχείς της λεπτίνης Η λεπτίνη ενορχηστρώνει ένα συγκρότημα βιολογικών δράσεων μέσω των υποδοχέων της, οι οποίοι εκφράζονται τόσο στο κεντρικό νευρικό σύστημα όσο και σε μεγάλο φάσμα περιφερικού ιστού, όπως το αιμοποιητικό και ανοσοποιητικό σύστημα. Το γονίδιο του υποδοχέα της λεπτίνης εντοπίστηκε για πρώτη φορά το 1995 στο γονιδιακό τόπο db του χρωμοσώματος 4 του ποντικού. Οι υποδοχείς της λεπτίνης ανήκουν στην κλάση Ι της υπεροικογένειας των υποδοχέων των κυτταροκινών, που περιλαμβάνει και τους υποδοχείς της IL-6, του καταστολέα της λευχαιμίας (LIF), του ακτινωτού νευροτροφικού παράγοντα(cntf),της ογκοστατίνης M (OSM), τον παράγοντα επαγωγής των κοκκιοκυττάρων(g-csf) και της gp130 (εικόνα 11). Όλοι αυτοί οι υποδοχείς μεταξύ αυτών και οι υποδοχείς της λεπτίνης, περιέχουν περιοχές φιμπρονεκτίνης τύπου ΙΙΙ και δύο εξωκυτταρικές περιοχές δέσμευσης των κυτταροκινών (εικόνα 10).Οι υποδοχείς της λεπτίνης έχουν δυνατότητα μεταγωγής σήματος τύπου IL-6 υποδοχέων, μέσω ενεργοποίησης τωνjak-stat, PI3K και MAPK μονοπατιών (Fantuzzi 2000, Riejos 2010). Οι υποδοχείς της λεπτίνης σχηματίζουν ομοδιμερή παρουσία ή απουσία ενός συνδέτη. Πιο συγκεκριμένα κάθε μόριο υποδοχέα συνδέεται με ένα μόριο λεπτίνης, σχηματίζοντας έτσι ένα τετραμερές, αποτελούμενο από δύο μόρια υποδοχέα και δύο μόρια λεπτίνης. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα επιτυγχάνεται από τη δράση ενός συνδέτη που προκαλεί αναδιαμόρφωση στο μόριο του υποδοχέα (Fantuzzi 2000). 40

Εικόνα 10.Δομή του ανθρώπινου υποδοχέα της λεπτίνης (LR). Ο υποδοχέας της λεπτίνης διαθέτει εξωκκυττάρια και ενδοκυυτάρια περιοχή. Στην εξωκυττάρια περιοχή εδράζονται περιοχές φιμπρονεκτίνης τύπου ΙΙΙ και δύο περιοχές δέσμευσης των κυτταροκινών (CRH). Στην εξωκκυτάρια περιοχή έχουν βρεθεί 4 σημειακές μεταλλάξεις, οι οποίες καταδεικνύονταιμε την αρίθμιση των αμινοξέων στις αντίστοιχες πριοχές δέσμευσης των κυτταροκινών (Kimber 2008). Υπάρχουν τουλάχιστον έξι ισομορφές του υποδοχέα της λεπτίνης, οι οποίοι προκύπτουν από εναλακτικό μάτισμα (OBRa, OBRb, OBRc, OBRd, OBRe και OBRf). Οι ισομορφές αυτές διαθέτουν κυτταροπλασματικές περιοχές ποικίλου μεγέθους, περιλαμβάνοντας μια διαλυτή μορφή (OBRe), τέσσερεις μικρότερες ισομορφές (OBRa, OBRc, OBRd και OBRf) και μια μεγαλύτερη ισομορφή (OBRb), η οποία είναι και ο κύριος μεσολαβητής της δράσης της λεπτίνης (Otero 2006,Mouzaki 2009). 41

Εικόνα 11. Δομικές ομοιότητες μεταξύ OB-R και των gp130 υποδοχέων των κυτταροκινών. Ένα μόριο λεπτίνης προσδένεται σε ένα μόριο υποδοχέα (OB-R). Ο σχηματισμός ενός τετραμερούς συμπλόκου, αποτελούμενοαπό δύο μόρια υποδοχέα και δύο μόρια λεπτίνης είναι απαραίτητο για τη σηματοδότηση. Τα γεμάτα κουτιά αντιπροσωπεύουν συντηρημένες περιοχές των υποδοχέων των κυτταροκινών τύπου 1, οι οποίες βρίσκονται σε όλα τα μέλη της οικογένειας υποδοχέων των κυτταροκινών gp130. Με μόνη εξαίρεση τη μικρή ισομορφή του OB-R, έχουν την ικανότητα επαγωγής σήματος μέσω JAK/STAT μονοπατιού (Fantuzzi 2000). Όλοι οι υποδοχείς της λεπτίνης μοιράζονται την ίδια αμινοτελική περιοχή δέσμευσης αλλά διαφέρουν στο καρβοξυτελικό άκρο (εικόνα 12). Οι ισομορφές OBRa, OBRb, OBRc, και OBRd διαθέτουν μια απλή διαμεμβρανική περιοχή, ενώ η ισομορφή OBRe δεν διαθέτει το διαμεμβρανικό τμήμα. Οι ισομορφές OBRa, OBRc και OBRd, οι οποίες διαθέτουν μικρές κυτταροπλασματικές περιοχές εκφράζονται στους περισσότερους ιστούς και φαίνεται να διευκολύνουν τη μεταφορά της λεπτίνης στα διάφορα κεντρικά διαμερίσματα, καθώς και την αποικοδόμησή της στα λυσοσώματα. Η ισομορφή OBRb εκφράζεται στον υποθάλαμο ρυθμίζοντας το ενεργειακό ισοζύγιο, καθώς και σε όλα τα κύτταρα της έμφυτης και προσαρμοζόμενης ανοσίας. Η ισομορφή αυτή η οποία είναι κ η μεγαλύτερη, περιέχει μια κυτταροπλασματική περιοχή 302 αμινοξέων με την οποία προσδένει ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μόρια και είναι ικανή για πλήρη επαγωγή σήματος μέσω κυρίως του JAK-STAT μονοπατιού (Tartaglia 1995). 42

Εικόνα 12. Δομή μεγάλης και μικρών ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης (Ob-R). Η ενδοκυτταρική περιοχή του Ob-Rb περιλαμβάνει περιοχή σηματοδότησης JAK-STAT μονοπατιού, όπως και η πλειοψηφία των κυτταροκινών. Οι μικρότερες ισομορφές (ObRa, c, d, e) δεν διαθέτουν ικανότητα μεταγωγής σήματος και λειτουργούν σαν μεταφορείς, ενώ ακόμη συμμετέχουν στον καταβολισμό της λεπτίνης (Matarese 2002). Μεταξύ των διαφόρων ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης, η ισομορφή OBRa φαίνεται να εμφανίζεται με τη μεγαλύτερη συχνότητα και ανιχνεύεται σε μια πληθώρα ιστών και οργάνων, όπως τους νεφρούς, τους πνεύμονες, το ήπαρ, το σπλήνα, και τα μακροφάγα. Η ισομορφή αυτή δρά είτε σαν σηματοδοτικός υποδοχέας είτε σαν υποδοχέας IL-1 τύπου ΙΙ και φαίνεται να διευκολύνει τη μεταφορά του μορίου της λεπτίνης διαμέσου του αιμοτοαιγκεφαλικού φραγμού, δεδομένου ότι εκφράζεται σε μεγάλες ποσότητες στο χοριοειδές πλέγμα. Η ισομορφή OBRe είναι ένας διαλυτός υποδοχέας τύπου IL-6, ο οποίος δρά σαν πρωτεϊνη-μεταφορέας, μεταφέροντας το μόριο της λεπτίνης στους μεμβρανικούς σηματοδοτικούς υποδοχείς. Ακόμη φαίνεται να δρά και σαν αναστολέας της λεπτίνης, 43

με λειτουργία παρόμοια με τον παράγοντα νέκρωσης όγκων (TNFa) και του διαλυτού υποδοχέα της IL-1 (Fantuzzi 2000). Οι μικρότερες ισομορφές επιτρέπουν τη δέσμευση της λεπτίνης με πρωτεϊνες καθώς επίσης διευκολύνουν την ενδοκυτταρια μεταφορά του μορίου και την αποικοδόμησή της στα λυσοσώματα (Zhang 2005). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι ποντίκια με έλλειψη λεπτίνης ή του υποδοχέα της δεν εμφανίζουν μόνο παχύσαρκο φαινότυπο αλλά και ένα σύνθετο σύνδρομο, το οποίο χαρακτηρίζεται από ορμονικές ανισορροπίες, θερμορυθμιστική δυσλειτουργία, στειρότητα και δυσλειτουργία του αιμοποιητικού και ανοσοποιητικού συστήματος κάτι το οποίο έχει παρατηρηθεί και στον άνθρωπο όπως έχει ήδη αναφερθεί. Πρόσφατες μελέτες σεknock-in ποντίκια κατέδειξαν τις θέσεις, Y985, Y1077 και Y1138 (πλούσιες σε κατάλοιπα τυροσίνης) στην κυτταροπλασματική πλευρά του OBRb ιδιαίτερα σημαντικές για τη δέσμευση του STAT3, αφού μεταλλάξεις στις περιοχές αυτές οδηγούν σε υπερφαγία και διαταραχή της θερμορύθμισης (Palmer 2003, Kimber 2008). Πρόσφατα βρέθηκε ότι τα κύτταρα του αίματος στα οποία εκφράζεται ο υποδοχέας της λεπτίνης είναι τα CD34+ αιμοποιητικά κύτταρα, τα μονοκύτταρα/μακροφάγα, καθώς και τα Β και Τ λεμφοκύτταρα, κάτι που δείχνει την άμεση εμπλοκή της λεπτίνης στο ανοσοποιητικό σύστημα (Martin 2004). 4. Ο ρόλος της λεπτίνης στην αιμοποίηση και λεμφοποίηση Όπως έχει γίνει κατανοητό από τα παραπάνω το μόριο της λεπτίνης είναι ένα μόριο με ποικίλες δράσεις, το οποίο εμπλέκεται σε πολλές σημαντικές βιολογικές λειτουργίες λόγω της φύσης του μεταξύ αυτών στην αιμοποίησηκαι λεμφοποίηση. Η εμπλοκή της λεπτίνης στην παραγωγή κυττάρων του αίματος υποστηρίζεται από μελέτες σε καλλιέργειες προγονικών κύττάρων, τα οποία παρουσία λεπτίνης διαφοροποιήθηκαν σε λεμφοειδείς, μυελοειδείς και ερυθροειδείς σειρές. Η εμπλοκή της λεπτίνης στην αιμοποίηση ενισχύεται από το γεγονός ότι προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα (ανθρώπου και ποντικού) καθώς και προγονικά Β κύτταρα (ανθρώπου) εκφράζουν τον υποδοχέα OBRb. Η έκφραση της λεπτίνης από τα στρωματικάκύτταρα του μυελού των οστών είναι πιθανό να ασκεί άμεση δράση στη διαφοροποίηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. 44

Άλλα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η λεπτίνη εμπλέκεται στην αιμοποίηση και λεμφοποίηση μέσω του μικροπεριβάλλοντος, καταδυκνύοντας έτσι έναν έμμεσο τρόπο δράσης. Η ανάπτυξη και διαφοροποίηση διαφόρων κυτταρικών σειρών στον μυελό των οστών φαίνεται να ελέγχεται τόσο από αυτόνομους κυτταρικούς μηχανισμούς όσο και από σήματα του περιβάλλοντος. Στις απαραίτητες κυτταροκίνες που παράγονται από το στρώμα του μυελού των οστών και συμβάλλουν στη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων περιλαμβάνονται οι IL-7,IL-6, IL-15, Flt3L, GM-CSF και SCF. Εκτός από τα μόρια αυτά απαραίτητα για τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων είναι και μόρια του περιβάλλοντος, όπως οι ιντεργκρίνες β1 και β2 τα CD44, τα οποία αλληλεπιδρούν με τα στρωματικά κύτταρα και τα ωθούν να διαφοροποιηθούν, φέρνοντας σε επαφή τους συνδιεγρτικούς αυτούς παράγοντες με τις κυτταροκίνες που εκκρίνουν. Ο έμμεσος ρόλος της λεπτίνης έγκειται στο γεγονός ότι από μόνη της είναι ικανή να προκαλέσει την παραγωγή του απαραίτητου κυτταροκινικού προφίλ που απαιτείται για τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων όπως οι ιντερλευκίνες IL-12 και IL-6 (Juge-Aubry 2002, Margalet 2003, Kwan 2007, Riejos 2008). 5. Ο ρόλος της λεπτίνης στην έμφυτη ανοσία Η λεπτίνη φαίνεται να είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες του ανοσοενδοκρινικού σεναρίου, βάση του οποίου υπάρχει συσχέτιση μεταξύ διατροφικής κατάστασης, βασικού μεταβολισμού και ανοσοποιητικής λειτουργίας. Η συμετοχή της λεπτίνης στην έμφυτη ανοσία καταδυκνύεται από ένα ευρή φάσμα δράσεων αυτής στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs), τα ΝΚ κύτταρα και τα ουδετερόφιλα. Το γεγονός ότι η έκφραση λεπτίνης επάγεται ραγδαία από φλεγμονώδη ερεθίσματα όπως τα LPS, IL-1 και TNF-α κατά την οξεία φάση της ανοσολογικής απόκρισης, δείχνει ότι η λεπτίνη δρά σαν μεσολαβητής των φλεγμονωδών καταστάσεων και η έκφρασή της ρυθμίζεται ανάλογα με τις παραγόμενες κυτταροκίνες. Ακόμη ο υποδοχέας της λεπτίνης εκφράζεται στα ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα (Matarese 2002, Riejos 2010). Συγκεκριμένα έχει βρεθεί ότι η λεπτίνη προωθεί την ωρίμανση και επιβίωση των δενδριτικών κυττάρων(dc). Τα DC κύτταρα απουσία λεπτίνης τείνουν προς ένα Th2 κυτταροκινικό προφίλ, το οποίο επιδρά στην ανοσοδιεγερτική λειτουργία των Τ κυττάρων (εικόνα 13). Παρουσία λεπτίνης παρουσιάζουν σχετικά χαμηλά ποσοστά 45

απόπτωσης, υψηλά ποσοστά ωρίμανσης μετά από έκθεση σε LPS, παράγουν χαμηλά επίπεδα IL-10 και υψηλά επίπεδα IL-12 και TNF-α και εκφράζουν υψηλά επίπεδα συνδιεγερτικών μορίων που επάγουν τον πολλαπλασιασμό των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων (Mattioli 2005, Lago 2007). Εικόνα 13. Επιδράσεις της λεπτίνης στο ανοσοποιητικό σύστημα. Η λεπτίνη κατέχει άμεσο ρόλο στην ανάπτυξη καιδιαφοροποίηση των Β λεμφοκυττάρων, καθώς και σε κύτταρα της έμφυτης και προσαρμοζόμενης ανοσίαςη λεπτίνη επάγει τον πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων. Ακόμη επάγει τη διαφοροποίηση των αιμοποιητικών κυττάρων προς λεμφοειδή, ερυθροειδή και μυελοειδή κύτταρα (Kwan2007). 46

Στα μονοκύτταρα και μακροφάγα η λεπτίνη διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και την φαγοκυττάρωση με την παραγωγή προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών. Στα μακροφάγα προάγει την παραγωγήδιαφόρων παραγόντων που συμμετέχουν στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης, όπως το μονοξείδιο του αζώτου, του λευκοτριενίου B4 (LTB4), την ακυλοτρανσφεράση της χοληστερόλης 1 (ACAT-1) και την κυκλοξυγενάση2 (COX-2). Ακόμα μελέτες σε ποντίκια έχουν δείξει ότι τα μακροφάγα παρουσία υψηλών δόσεων λεπτίνης εκφράζουν TNFα, IL-12 και IL-6, δείχνοντας ότι η λεπτίνη από μόνη της κατέχει προ-φλεγμονώδεις ιδιότητες. Έχει βρεθεί ότι σε ob/ob ποντίκια παρατηρείεται αύξηση του αριθμού των μονοκυττάρων κατά 4 φορές.στα μονοκύτταρα ακόμα επάγεται η έκφραση των δεικτών ενεργοποίησης CD25 και CD71. Στα ποντίκια η λεπτίνη φαίνεται να ενεργοποιεί τα ουδετερόφιλα άμεσα ενώ στον άνθρωπο η δράση της λεπτίνης είναι έμμεση μέσω του TNFα που εκκρίνεται από τα μονοκύτταρα.ενεργοποιεί τα μονοκύτταρα να παράγουν προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, καθώς και τον ανταγωνιστή του υποδοχέα της IL-1, ο οποίος έχει αντιφλεγμονώδη δράση (Lago - Kwan 2007). Στα ουδετερόφιλα έχει ως αποτέλεσμα την υπερέκφραση των δεικτών ενεργοποίησης CD25 και CD71, την ενεργοποίηση της χημειοταξίας και την απελευθέρωση υπεροξειδίου του υδρογόνου. Στα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος η λεπτίνη επάγει την παραγωγή της αυξητικής ορμόνης μέσω μονοπατιών πρωτεϊνικής κινάσης C και μονοξειδίου του αζώτου. Η αντιγλεφμονώδης δράση της λεπτίνης καταδυκνύεται σε invitro πειράματα όπου φαίνεται να επάγει την παραγωγή IL1Ra από μονοκύτταρα (Faggioni 2001). Ακόμη έχει βρεθεί ότι η λεπτίνη προωθεί τον πολλαπλασιασμό, την ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των ΝΚ κυττάρων, ενώ παράλληλα ενισχύει την κυτταροτοξικότητά τους, λόγω υπερέκφρασης σε αυτά IL-2 και περφορινών. Όλα αυτά τα στοιχεία υποστηρίζουν την πλειοτροπική δράση της λεπτίνης που αφορά την ομοιόσταση του ανοσοποιητικού συστήματος καθώς το μόριο αυτό φαίνεται να ελέγχει άμεσα την επιβίωση και δράση των κυττάρων που το απαρτίζουν αλλά και την επιτυχή έμφυτη απόκρισή του. 47

6. Ο ρόλος της λεπτίνης στην προσαρμοζόμενη ανοσία Παρότι όπως αναφέρθηκε η λεπτίνη κατέχει πρωταρχικό ρόλο στην έμφυτη ανοσία, το ίδιο φαίνεται να συμβαίνει και στην προσαρμοζόμενη, λόγω του γεγονότος ότι η ισομορφή OB-Rb του υποδοχέα της εκφράζεται σε διάφορους υποπληθυσμούς Β και Τ κυττάρων, μέσω του οποίου η λεπτίνη εκδηλώνει τη δράση της. Οι σημαντικές επιπτώσεις της λεπτίνης στην ρύθμιση της προσαρμοζόμενης ανοσολογικής απόκρισης έχει δειχθεί σε οb/ob ποντίκια και σε ανθρώπους με εκ γενετής ανεπάρκεια λεπτίνης, οι οποίοι παρουσιάζουν μεταβολικές δυσλειτουργίες σε συνδυασμό με ανοσολογικές ανωμαλίες, οι οποίες αντιστρέφονται δραματικά μετά από χορήγηση λεπτίνης. Η λεπτίνη φαίνεται να έχει πρστατευτικό ρόλο ενισχύοντας τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη των Β και Τ κυττάρων. Ακόμη συμβάλλει στην επιβίωση των Β και Τ κυττάρων καταστέλοντας την αποπτωτική πρωτεϊνη Fas και επάγει τις αποπτωτικές πρωτεϊνες Bcl-2 and Bcl-XL. Επιπλέον επάγει την παραγωγή προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών από τα Τ κύτταρα και ρυθμίζει την ανοσολογική απόκριση προς ένα Th1 φαινότυπο. Στα Th1 κύτταρα αυξάνεται η παραγωγήtnf-α and IFN-γ, καθώς και IgG2a από τα Β κύτταρα. Αντίθετα η λεπτίνη ασκεί ανασταλτικές επιδράσεις στα Th2 κύτταρα μειώνοντας την παραγωγή των IgG1. Το αντίθετο συμβαίνει βέβαια κατά τη χρόνια φλεγμονή, όπου παρατηρείται μειωμένη παραγωγή λεπτίνης και επαγωγή του Th2 κυτταροκινικού προφίλ.επιπλέον η λεπτίνη φαίνεται να ελέγχει τη διαφοροποίση και ενεργοποίηση των Τ κυττάρων έμμεσα, μέσω αντίδρασης με συνδιεγερτικά αντιγόνα, όπως το CTLA-4 (εικόνα13). Η λεπτίνη μπορεί να ρυθμίσει τη λειτουργία των διαφόρων υποπληθυσμών των Τ κύττάρων με διαφορικό τρόπο. Για παράδειγμα μπορεί να επάγει τον πολλαπλασιασμό των CD4+CD45RA+ παρθένων T κυττάρων, ενώ ανίθετα να αναστείλλει την ανάπτυξη των CD4+CD45RO+ μνημονικών Τ κυττάρων (εικόνα 14). 48

Εικόνα 14.Επίδραση της λεπτίνης στους υποπληθυσμούς CD4+ T λεμφοκυττάρων. Η λεπτίνη επιρεάζει τη λειτουργία του θύμου και τη διαφοροποίηση των παρθένων Τ λεμφοκυττάρων. Στην περιφέρεια η λεπτίνη προωθεί τις Th1 αποκρίσεις κατόπιν ενεργοποίησης των CD4+ T λεμφοκυττάρων από αντιγόνο, ενώ αναστέλλει την έκκριση Th2 κυτταροκινών (Matarese 2002). Έχει βρεθεί ακομα ότι η λεπτίνη είναι ικανή να αποτρέψει την ατροφία του θύμου σε καταστάσεις πείνας καθώς και την απόπτωση των θυμοκυττάρων, ενώ ακομα επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό των CD4+CD8+ T κυττάρων μέσω ενεργοποίησης του STAT3. Επιπλέον η λεπτίνη επηρρεάζει τον αριθμό των κυκλοφορούντων CD4+ T κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Ποντίκια με έλλειψη λεπτίνης ή του υποδοχέα της πάσχουν από μειωμένη ανοσία των Τ κυττάρων. Απομόνωση και καλλιέργεια αυτών των κυττάρων invitro δείχνει μια αυξημένη συγκέντρωση λεπτίνης, η οποία συνδέεται με αυξημένα επίπεδα Th1 κυτταροκινών, κάτι το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη ευαισθησία σε μολύνσεις σε ποντίκια με ανεπάρκεια λεπτίνης (Loffreda-Lord 1998, Romero 2000, Matarese-Busso 2002, Harle 2006, Lago-Matarese 2007). 49

7. Λεπτίνηκαιαυτοανοσία Παρόλο όπως αναφέρθηκε μειωμένα επίπεδα λεπτίνης οδηγούν σε ανεπιτυχή ανοσολογική άμυνα, αυξημένα επίπεδα αυτής μπορεί να οδηγήσουν σε μια έντονη, μη φυσιολογική αντίδραση, η οποία προδιαθέτει την εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων. Νοσήματα όπως η πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα στα ποντίκια (ΕΑΕ), ο διαβήτης τύπου 1 (T1D), η αρθρίτιδα προκαλούμενη από αντιγόνο (AIA) και άλλα, φαίνεται να προωθούνται από την παραγωγή παθογόνων Th1 κυτταροκινών, οι οποίες επάγονται παρουσία λεπτίνης όπως αναφέρθηκε. Η εμφάνιση αυτοάνοσων καταστάσεων είναι πιο συχνή στις γυναίκες, οι οποίες είναι υπερλεπτιμικές, από ότι στους άνδρες, οι οποίοι είναι υπολεπτιμικοί, όπως έχει ήδη αναφερθεί.οι λόγοι για αυτό το φυλετικό διμορφισμό δεν είναι πλήρως ξεκάθαροι, αλλά ενδεχομένως να εμπλέκονται παράγοντες όπως διαφορές ανοσιακής απάντησης, ορμόνες και γενετικοί παράγοντες που σχετίζονται με το φύλο. Έχει βρεθεί ότι τα θυληκά ποντίκια παρουσιάζουν πιο έντονη απόκριση Τ κυττάρων και παραγωγή αντισωμάτων από ότι τα αρσενικά, παράγουν υψηλότερα επίπεδα Th1 κυτταροκινών (λόγω της παρουσίας οιστρογόνων) και εκκρίνουν μεγαλύτερες ποσότητες IFN-γ και IL-1in vitro. Αντίθετα τα ανδρογόνα και η τεστοστερόνη επάγουν την παραγωγή IL-4 και IL-5 και παρατηρείται μια μεταστροφή προς τις «προστατευτικές» Th2 αποκρίσεις. Τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό παρουσιάζουν και αυτά με τη σειρά τους διμορφισμό ως προς τα δύο φύλα και φαίνεται να είναι υψηλότερα στις γυναίκες από ότι στους άνδρες (Matarese 2002, Matarese 2007). Επιπλέον τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs) των θυληκών ατόμων παράγουν υψηλότερα επίπεδα IL-12 από τα αρσενικά. Όλοι αυτοί οι παράγοντες ενδεχομένως συμβάλλουν στην αυξημένη ικανότητα των θυληκών ατόμων να παράγουν Th-1 προφλεγμονώδεις ανοσιακές αποκρίσεις και έτσι να έχουν αυξημένη ευαισθησία στην εμφάνιση αυτοάνοσων ασθενειών (εικόνα 15). Αντίθετα τα αρσενικά άτομα έχουν χαμηλότερα επίπεδα λεπτίνης λόγω ότι η τεστοστερόνη είναι ικανή να μειώσει τα επίπεδα αυτής.αντίθετα έχει βρεθεί ότι η αντίσταση στην ΕΑΕ σε αρσενικά ποντίκια μπορεί να αντιστραφεί μετά από χορήγηση λεπτίνης. 50

Εικόνα 15. Επίδραση της λεπτίνης και των ορμονών του φύλου στη λειτουργία των Τ λεμφοκυττάρων σε θυληκά και αρσενικά ποντίκια. Τα θυληκά ποντίκια παράγουν υψηλότερα επίπεδα λεπτίνης λόγω επίδρασης οιστρογόνων. Αντίθετα τα αρσενικά ποντίκια έχουν χαμηλότερα επίπεδα λεπτίνης λόγω απουσίας οιστρογόνων και υψηλών επιπέδων τεστοστερόνης, ικανών να μειώνουν τα επίπεδα λεπτίνης (Matarese 2002). Πρόσφατα δείχτηκε μια αρνητική δράση της λεπτίνης στην αυτοανοσία, σταπλαίσια πειραμάτων σε ζωικά μοντέλα. Συγκεκριμένα, δείχτηκε ότι συνθήκες ασιτίας,που εμποδίζουν την αύξηση των επιπέδων της λεπτίνης στον ορό, επιβραδύνουν τηνέναρξη της ΕΑΕ σε ποντίκια και ενισχύουν τη μεταστροφή του κυτταροκινικούπροτύπου έκκρισης προς τις Th2 τύπου, αντιφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, μεαποτέλεσμα την υποχώρηση των κλινικών συμπτωμάτων. Ακόμα, βρέθηκεενισχυμένη έκκριση λεπτίνης στις περιοχές των φλεγμονών και των νευρώνων κατάτην οξεία φάση της ασθένειας, και ότι τα αντι-ob-r αντισώματα αναστέλλουν τονπολλαπλασιασμό αυτοαντιδρώντων Τ κυττάρων in vitro.ακόμη τα ob/ob ποντίκια φαίνεται να είναι ανθεκτικά έναντι της ΕΑΕ, κάτι το οποίο αντιστρέφεται με τη χορήγηση λεπτίνης σε αυτά και παρατηρείται μεταστροφή κυτταροκινικού προτύπου από Th2 σε Th1 (Matarese 2001). Ακόμη η λεπτίνη φαίνεται να προωθεί την έναρξη του διαβήτη τύπου 1 σε ποντίκια μέσω Th1 αποκρίσεων. Έχει βρεθεί ότι αυξημένα επίπεδα λεπτίνης προηγούνται της εμφάνισης της ασθένειας, ενώ ένεση λεπτίνης σε NOD (nonobesediabetic) ποντίκια επιταχύνει την εκδήλωση της ασθένειας και προκαλεί 51

καταστροφήτων παγκρεατικών β-κυττάρων και αύξηση παραγωγής IFN-γ από τα περιφερικά Τ κύτταραβ (Miguel 2005). Η ΑΙΑ είναι ένα ζωϊκό μοντέλο φλεγμονής των αρθρώσεων, προκαλούμενη από χορήγηση μεθυλιωμένου ορού βοειδούς αλβουμίνης (mbsa) στα γόνατα των ανοσοποιημένων ποντικών και αποτελεί ένα πειραματικό μοντέλο της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Απουσία λεπτίνης ή του υποδοχέα της παρατηρείται μείωση της οξύτητας της ασθένειας σε αυτό το μοντέλο. Η ηπιότερη μορφή της ασθένειας παρατηρείται σε ob/ob και db/db ποντίκια, η οποία συνοδεύεται από μείωση των επιπέδων IL1β και TNFa στις αρθρώσεις, μειωμένη παραγωγή κυττάρων λεμφαδένων in vitro παρουσία αντιγόνου και μεταστροφή προς Th2 προφίλ κυτταροκινών. Ακόμη σε πειράματα exvivo σε ob/ob και db/db ποντίκια παρατηρείται μείωση των επιπέδων IFN-γ κατόπιν της διέγερσης των κυττάρων των λεμφαδένων από mbsa, ενώ φαίνεται τα επίπεδα IL-10 να είναι αυξημένα. Πιστεύεται ότι στο μοντέλο της ΑΙΑ η λεπτίνη συμβάλλει στη φλεγμονή των αρθρώσεων με τη ρύθμιση τόσο της χυμικής όσο και της κυτταρικής απόκρισης (Palmer 2003). Ο πιθανός ρόλος της λεπτίνης στην οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) έχει υποστηριχθεί από τη σχέση μεταξύ παχυσαρκίας και αυξημένου κινδύνου ανπαπτυξης ΟΑ. Αυτή η θετική σχέση έχει παρατηρηθεί όχι μόνο για τις φέρουσες βάρος αρθρώσεις, όπως τα γόνατα, αλλά και για τις μη φέρουσες βάρος αρθρώσεις, όπως τα χέρια. Περαιτέρω στοιχεία για τη συμμετοχή της λεπτίνης στην ΟΑ προέρχονται από την παρατήρηση ότι η λεπτίνη έχει βρεθεί στο αρθρικό υγρό (SF) των ασθενών με ΟΑ και η συγκέντρωσή της έχει συσχετιστεί με το δείκτη μάζας σώματος (BMI). Επιπλέον, η λειτουργική ισομορφή του υποδοχέα της λεπτίνης (Οb-Rb) έχει ανιχνευθεί σε ανθρώπινα ενήλικα αρθρικά χονδροκύτταρα και η επεξεργασία των απομονωμένων κυττάρων με λεπτίνη in vitro έχει αποδειχθεί ότι υποκινεί τη σύνθεση θεμέλιας ουσίας (Brooks 2002). Έχει προταθεί ότι η λεπτίνη έχει μια τοπική επίδραση στο χόνδρο της OA, δεδομένου ότι τα επίπεδά του στο SF έχει βρεθεί ότι είναι υψηλότερα από εκείνα στον ορό (Simopoulou 2007). Πρόσφατα βρέθηκε ότι η λεπτίνη συμμετέχει αρνητικά στην αυτοανοσία με την καταστολή των CD4+CD25+ ρυθμιστικών T κυττάρων. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότιασθενείς με πολλαπλή σκλήρωση έχουν αυξημένα επίπεδα λεπτίνης, τα οποία συνοδεύονται με μεωμένα επίπεδα Τ ρυθμιστικών κυττάρων. Ο ρόλος της λεπτίνης ως διαμεσολαβητή τύπου 1 ανοσιακής απάντησης, ενισχύεται από το γεγονός ότι ποντίκια με έλλειψη λεπτίνης έχουν ελάχιστη 52

παραγωγή IFN-γ και μέτρια παραγωγή IL-4 και είναι ανίκανα να εγείρουν μια Th1 τύπου ανοσιακή απάντηση. Αυτά τα πειραματικά δεδομένα, σε συνδυασμό με παρατηρήσεις,που δείχνουν ότι οι γυναίκες έχουν υψηλότερα επίπεδα λεπτίνης από τους άνδρες με ίδιο δείκτη σωματικής μάζας, (Body Mass Index, BMI=βάρος(kgr)/ύψος(m)2), και λαμβάνοντας υπ όψη το αυξημένο ποσοστό εμφάνισης αυτοάνοσων νοσημάτων στις γυναίκες, δίνουν μια άλλη διάσταση στο μόριο της λεπτίνης(auwex 1998, Fantuzzi 2000, Matarese 2007). 8. Εμπλοκή της λεπτίνης στη ρευματοειδή αρθρίτιδα Όπως έγινε σαφές από τα παραπάνω η λεπτίνη συμβάλλει στην εμφάνιση ασθενειών μέσω προσαρμοζόμενων ανοσολογικών αποκρίσεωνσε διάφορα μοντέλα τρωκτικών. Ο ρόλος της λεπτίνης στη ΡΑ, η οποία αποτελεί μια από τις πιο συχνές φλεγμονώδεις νόσους, έχει γίνει αντικείμενο μελέτης και σε μια ποικιλία ερευνώνστον άνθρωπο. Ωστόσο, τα αποτελέσματα των μελετών αυτών φαίνεται να είναι αμφιλεγόμενα. Συγκεκριμένα καποιες από αυτές τις μελέτες δείχνουν αυξημένα επίπεδα λεπτίνης στο πλάσμα ασθενών με ΡΑ σε σχέση με τους υγειής που συνδέονται με σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα λεπτίνης στο αρθρικό υγρό. Σε μια άλλη μελέτη τα επίπεδα λεπτίνης φαίνεται να διαφέρουν μεταξύ των δύο φύλων, τα οποία είναι υψηλότερα στις γυναίκες από ότι στους άνδρες, με αναλογία 9:22 μεταξύ ασθενών και 8:10 υγειών.ακόμη τα επίπεδα λεπτίνης του πλάσματος είναι περίπου δύο φορές πιο υψηλά σε υγιείς γυναίκες από ότι στους άνδρες με αντίστοιχη κατάσταση βάρους (Chow 2003, Bernotiene-Otero 2006). Σε αντίθεση με τα παραπάνω άλλες μελέτες έδειξαν ότι τα επίπεδα ορού λεπτίνης δεν φαίνεται να είναι αυξημένα σε ασθενείς με ΡΑ σε σύγκριση με τα controls και οι μόνες συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν ήταν μεταξύ λεπτίνης και BMI ή του ποσοστού σωματικού λίπους. Ακόμα μια άλλη μελέτη έδειξε ακόμη χαμηλότερα επίπεδα λεπτίνης στο πλάσμα σεασθενείς με ΡΑ σε σχέση με τα controls και δε βρέθηκε καμία συσχέτιση λεπτίνης με το BMI, τη CRP, τη συνολική λιπώδη μάζα ή το στάδιο της ασθένειας.τέλος, έχει βρεθεί μια σημαντικά αρνητική συσχέτιση μεταξύ λεπτίνης και φλεγμονής σε ασθενείς με ενεργό ρευματοειδή αρθρίτιδα, αν και οι συγκεντρώσεις λεπτίνης στο πλάσμα δεν διαφέραν σημαντικά από εκείνες των υγιών ατόμων. Παρόλα αυτά θεραπεία με αντι-tnfa δεν φαίνεται να 53

μεταβάλλει σημαντικά τη συγκέντωση λεπτίνης παρά τη σημαντική μειώση της CRP και IL-6. Έχει αναφερθεί ότι η νηστεία οδηγεί σε βελτίωση της κλινικής εικόνας σε ασθενείς με RA που συνδέεται με μια σημαντική μείωση λεπτίνης στον ορό και μεταστροφή προς την παραγωγή Th2κυτταροκινών.Ωστόσο, μετά απόεπτά ημέρες δίαιτας σε ασθενείς με ΡΑ, δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή στην κλινική εικόνα ή στις βιολογικές μετρήσεις της δραστηριότητας της νόσου, παρά τη σημαντική μείωση της συγκεντρώσης λεπτίνης στουν ορό (Anders-Fraser 1999,Nishiyaκαι Tokarczyk-Knapik 2002, Popa 2005,Hizmetli 2007). Εν κατακλείδι, υπό το πρίσμα των παρόντων αμφιλεγόμενων δεδομένων, φαίνεται δύσκολο να βγεί ένα ξεκάθαρο συμπέρασμα για τον πιθανό ρόλο της λεπτίνης στην παθογένεια της ΡΑ και για αυτό το λόγο θεωρείται απαραίτητο να γίνουν περαιτέρω μελέτες προκειμένου να έχουμε μια πιο σαφή εικόνα των μοριακών γεγονότων που διαδραματίζονται στην παθογένεση της ασθένειας. Στην παρούσα μελέτη θελήσαμε να διερευνήσουμε τον ρόλο της λεπτίνης στην παθογένεια της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Για το σκοπό αυτό μετρήσαμε τα επίπεδα λεπτίνης και του υποδοχέα της σε ασθενείς με ΡΑ και τα συγκρίναμε με αυτά των υγιών προκειμένου να δούμε εαν αυτά επηρεάζονται από το στάδιο της νόσου ή τον τύπο θεραπείας. Επιπλέον ελέγξαμε εάν η λεπτίνη επηρεάζει την έκφραση προφλεγμονωδών και αντιφλεγμοννδών κυτταροκινών στον ορό υγιών και ασθενών ατόμων. 54

Υλικά και Μέθοδοι 55

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Ασθενείς Μέσα σε χρονικό διάστημα ενός έτους μελετήθηκαν 103 ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, σύμφωνα με τα ACR κριτήρια ταξινόμησης της νόσου. Όλα τα δείγματα προέρχονταν από τα ρευματολογικά ιατρεία του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Πάτρας (ΠΠΝΠ). Τα κριτήρια επιλογής περιλαμβάνουν σταθερό σωματικό βάρος (με αλλαγή λιγότερο του 1 kg στις τελευταίες 4 εβδομάδες), απουσία του σακχαρώδους διαβήτη και μη χορήγηση φαρμάκων που επηρεάζουν το μεταβολισμό των λιπων. Η διάρκεια ή το στάδιο της νόσου δεν επηρέασε την επιλογή των ασθενών. Οι ασθενείς χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, αυτοί με ενεργό νόσο και αυτοί με μη ενεργό νόσο, σύμφωνα με τα κριτήρια ARA 1981 της νόσου. Επιπλέον οι ασθενείς χωρίστηκαν σε 3 κατηγορίες ανάλογα με τη χορηγούμενη θεραπεία δηλαδή, χωρίς θεραπεία, ήπια θεραπεία και ισχυρή θεραπεία. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 100 δείγματα υγιών ενηλίκων με φυσιολογικό δείκτη μάζας σώματος (BMI). Από τους ασθενείς συλλέχθηκε περιφερικό αίμα (5 ml) τουλάχιστον μία φορά, και από τους μάρτυρες μόνο μία φορά. Τόσο από ασθενείς όσο και από μάρτυρες ζητήθηκε η έγγραφη συγκατάθεσή τους προκειμένου να συμμετάσχουν στη μελέτη. Το πρωτόκολλο συλλογής των δειγμάτων εγκρίθηκε από επιστημονική συμβουλευτική επιτροπή του ΠΠΝΠ, σύμφωνα με τις ηθικές αρχές που ισχύουν κατά τη συνθήκη του Ελσίνκι για έρευνα που αφορά ανθρώπινο υλικό. 2. Φαινοτύπιση κυττάρων Τα ποσοστά των περιφερικών υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων του αίματος (PBL) καθορίστηκαν από μια άμεση διπλού-χρώματος τεχνική ανοσοφθορισμού. Περιφερικό ηπαρινισμένο αίμα τελικού όγκου 100 μl επωάστηκε για 30 λεπτά στους 4 0 C με τα ακόλουθα μονοκλωνικά φθορίζοντα αντισώματα: CD2-FITC, CD3-FITC, CD3-PE, CD5-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD20-PE, CD45RA-PE, CD45RO-PE, CD56-PE,CD25-PE και anti-hla-dr-pe. Όλα τα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συνθήκες κορεσμού, όπως υποδεικνύεται από τους κατασκευαστες. Τα μονοκλωνικά αντισώματα 56

αγοράστηκαν από την Immunotech (Marseille, France),εκτός από τα CD25-PE και anti-hla-dr-pe μονοκλωνικά αντισώματα που αγοράστηκαν από την Becton Dickinson Immunocytometry Systems (BD)San Jose, CA. Ακολούθως, μετά από 30 λεπτά επώασης στους 4 0 C βαθμούς τα ερυθρά κύτταρα λύονται και τα λευκά κύτταρα καθορίζονται χρησιμοποιώντας το σύστημα διαλυμάτων Immunoprep του Coulter EPICS και το αυτόματο CoulterQ- PrepEPICSImmunologyWorkstation (MaiamiFL). Αρνητικά κοντρόλ των αντίστοιχων επωάσεων χρησιμοποιήθηκαν, υποκαθιστώντας τα ειδικά αντισώματα με ισοτυπικά μη σχετιζόμενα κοντρόλ σε αντίστοιχες συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα αναλύθηκαν, χρησιμοποιώντας το Coulter EPICS XL-MCL. Τουλάχιστον 10.000 κύτταρα από κάθε δείγμα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής από τον κυτταρομετρητή Coulter EPICS-XL-MCL. Τα κυτταρικά υπολείματαθραύσματα αποκλείστηκαν από την ανάλυση. Για κάθε 5000 βιώσιμα κύτταρα πέρασαν στην επεξεργασία του αναλυτή και επεξεργάστηκαν με το EPICS-XL2 software. Όλα τα θετικά αποτελέσματα συλλέχθηκαν μετά από αφαίρεση των αρνητικών κοντρόλ. 3. Απομόνωση εμπύρηνων κυττάρων από αίμα και καλλιέργειες Αρχικά συλλέχτηκε ηπαρινισμένο φλεβικό αίμα από ασθενείς χωρίς θεραπεία, ασθενείς οι οποίοι είχαν λάβει θεραπευτική αγωγή με anti-tnfα/μεθοτρεξάτη/χαμηλή δόση στεροειδών και μαρτύρων. Στην συνέχεια από το ηπαρινισμένο αυτό αίμα απομονώθηκαν τα μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) με φυγοκέντρηση σε κλίση φυκόλης. Ο ορός συλλέχτηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 oc. Αφού φυγοκεντρήσουμε το αίμα, προσθέτουμε RPMI ή PBS μέχρι τελικού όγκου 6 ml. Στη συνέχεια βάζουμε 3 ml φυκόλης σε ένα falcon (ο όγκος φυκόλης πρέπει να είναι το 1/3 του συνολικού όγκου). Με πιπέτα μιας χρήσης προσθέτουμε το αίμα πάνω από τη φυκόλη σταγόνα-σταγόνα, ώστε να μην ανακατευτούν οι δύο φάσεις. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 24 0 C, 2500 rpm για 35 λεπτά. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης προκύπτουν τρεις στιβάδες, η πάνω στιβάδα που περιέχει τις πρωτεΐνες του αίματος (ορός), η ενδιάμεση στιβάδα περιέχει τα λεμφοκύτταρα και υποκείμενη στιβάδα στην οποία βρίσκονται τα ερυθροκύτταρα διαλυμένα στη φυκόλη. Παίρνουμε με προσοχή τη φάση των λεμφοκυττάρων, αποφεύγοντας την 57

ανάδευση με τη φυκόλη και την προσθέτουμε σε falcon με PBS, μέχρι τελικού όγκου 15 ml. Στη συνέχεια φυγοκεντρούμε στους 4 0 C,1800 rpm για 10 λεπτά. Αναδυαλύουμε το ίζημα σεrpmi PBS ή CM, σε τέτοιο όγκο ώστε η συγκέντρωση των κυττάρων να είναι 1-2x10 6 κύτταρα/ml και τα βάζουμε σε καλλλιέργεια ή φυλάσονται στους -80 0 C. Τα κύτταρα αυτά (106 PBMC/ομάδα) είτε συλλέχτηκαν άμεσα υπό μορφή ιζήματος και φυλάχτηκαν στους -80 oc, είτε επωάσθηκαν για 8 ώρες σε καλλιεργητικό υλικό RPMI 1640 παρουσία ή απουσία 5ng/ml phorbol myristate acetate (PMA), και 1 Mm ιονομυκίνη (P/I, Sigma), ή παρουσία ανασυνδυασμένης λεπτίνης σε συγκεντρώσεις 10, 20, 100, 500 ή 1000ng/ml. Η καταμέτρηση των κυττάρων γίνεται αφού βαφούν με διάλυμα trypan blue με αιμοκυτταρόμετρο Sysmex NE-8000. To trypan blue δεν διαπερνά την μεμβράνη των ζωντανών κυττάρων και έτσι με την χρώση αυτή μπορούμε να υπολογίσουμε την βιωσιμότητα των κυττάρων. 4. Απομόνωση RNA από κύτταρα Προκειμένου να μελετήσουμε την επίδραση της ανασυνδυασμένης λεπτίνης (rleptin) στην έκφραση των κυτταροκινών IL-2, IFN-γ, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, IL-1 και TNF-a, απομονώθηκε ολικό RNA από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος που που είχαν καλλιεργηθεί παρουσία ή απουσία ανασυνδυασμένης λεπτίνης (με ή χωρίς μιτογονική διέγερση) με την χρήση τριζόλης (Τrizole, GibcOBRL). Με την ίδια διαδικασία απομονώθηκε ολικό RNA από Τ και Β λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα ασθενών και μαρτύρων καθώς και από τις κυτταρικές σειρές Raji, Jurkat και U937 για να δούμε τα επίπεδα έκφρασης των ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης. Η διαδικασία απομόνωσης RNA έχει ως εξής: Προσθέτουμε 1ml τριζόλης για 5-10x10 6 κύτταρα περίπου. Η τριζόλη προκαλεί την διάρρηξη της μεμβράνης των κυττάρων ώστε να εκχειλιστούν τα κυτταροπλασματικά υλικά μέσα στα οποία βρίσκεται και το RNA. Ο διαχωρισμός του RNA από τα άλλα κυτταροπλασματικά και πυρηνικά υλικά (DNA, πρωτεΐνες κ.α.)γίνεται μέσω του διαλύματος χλωροφορμίου:ισοαμηλικής αλκοόλης (49:1). Μετά την προσθήκη του διαλύματος αυτού και μικρής επώασης σε συνθήκες RT,που ακολουθεί, φυγοκεντρούμε τα δείγματα σε 12000rpm για 15min στους 40C.Ύστερα από την φυγοκέντρηση έχουν σχηματιστεί τρεις στιβάδες. Στην υπερκείμενη υδάτινη φάση περιέχεται το RNA των κυττάρων. Στην ενδιάμεση φάση λαμβάνονται οι 58

πρωτεΐνες και στην υποκείμενη οργανική φάση οι πρωτεΐνες οι οποίες έχουν συνδεθεί με CHCl 3 και φαινόλη της τριζόλης. Εμείς λαμβάνουμε την υδατική φάση στην οποία προσθέτουμε συγκεκριμένη ποσότητα ισοπροπυλικής αλκοόλης ανά ml τριζόλης (500μl/ml). Μετά την προσθήκη της αλκοόλης το δείγμα μας μεταφέρεται στους 80 0 C για 15min. Σε αυτή την θερμοκρασία το RNA θα κρυσταλλοποιηθεί και θα καθιζάνει λόγω της αλκοόλης και του άλατος. Για την πλήρη καθίζηση του RNA φυγοκεντρούμε στους 40 0 C για 30min στα 10000rpm. Το RNA το λαμβάνουμε σε μορφή ιζήματος, απομακρύνουμε το υπερκείμενο και γίνεται καθαρισμός του δείγματος με 75% παγωμένη αιθανόλη και φυγοκέντρηση στις 10000rpm για 10min στους 40 0 C. Μετά τον καθαρισμό του δείγματος κρατάμε το ίζημα, απομακρύνοντας το υπερκείμενο, και το στεγνώνουμε υπό κενό. Επειδή το δείγμα μας περιέχει RNA που είναι πολύ ευαίσθητο στις RNAάσες, που το πέπτουν, διαλύουμε το ίζημα σε depc νερό το οποίο είναι απαλλαγμένο από αυτές. Το ολικό RNA που απομονώσαμε θα το χρησιμοποιήσουμε για την κατασκευή cdna του γονιδιώματος των T λεμφοκυττάρων από το οποίο μπορούμε να επιλέξουμε το γονίδιο που μας ενδιαφέρει. 5. Κατασκευή cdna, RT-PCR H κατασκευή του cdna προϋποθέτει την μετατροπή του ολικού RNA σε DNA με την χρήση της αντίστροφης μεταγραφάσης (reverse transcriptase). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν μέσα σε πάγο και σε σωληνάρια eppendorf των 200μl. Για κάθε αντίδραση αναμιγνύονται τα εξής: 5x ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφάσης........8.0μl 0.1M DTT (Dithiothreitol)...........................5.0μl 25mm μίγμα δεοξυνουκλεοτιδίων.................... 1.0μl Μίγμα τυχαίων εξανουκλεοτιδίων (3μg/μl)...............0.25μl (Random Primers, GIBCO-BRL) Ένζυμο αναστολέας των ριβονουκλεασών (30U/μl)........ 0.25μl (RNAse inhibitor, PROMEGA) DEPC d.d. H2O έωςολικόόγκο.......................40μl Ακολουθεί προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας RNA και επώαση στους 70 C για 3 λεπτά. Κατόπιν το μίγμα της αντίδρασης σύνθεσης του cdna τοποθετείται σε παγόλουτρο και προστίθενται τα εξής: 59

5x ρυθμιστικό διάλυμα αντίστροφης μεταγραφάσης......... 2.0μl Ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (200U/μl)..............1.0μl ( Superscript Reverse Transcriptase, GIBCO-BRL) DEPC d.d. H2O έως ολικό όγκο........................ 50μl Ακολουθεί επώαση στους 37 C για 60 λεπτά και στη συνέχεια η αντίστροφη μεταγραφάση αδρανοποιείται με θέρμανση στους 70 C για 10 λεπτά. Τα δείγματα cdna αποθηκεύονται στους -20 C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. 6. PCR (Polymerase Chain Reaction) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης είναι μια ενζυμική μέθοδος που επιτρέπει την in vitro ενίσχυση συγκεκριμένης αλληλουχίας του DNA. Μέσω της PCR καθίσταται δυνατή η παραγωγή τεράστιου αριθμού πιστών αντιγράφων μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας του DNA, χρησιμοποιώντας μικρές ποσότητες (0.1-1μg) DNA. Η αντίδραση PCR εκμεταλλεύεται ορισμένα χαρακτηριστικά του in vivo μηχανισμού αντιγραφής του DNA με σκοπό την in vitro ενίσχυση συγκεκριμένης αλληλουχίας του DNA. Η PCR βασίζεται στη δράση του ενζύμου DNA πολυμεράση I. Η αντίδραση μιμείται τον τρόπο με τον οποίο ειδικά ένζυμα στον κυτταρικό πυρήνα αντιγράφουν το DNA για να το διορθώσουν, όταν αυτό έχει υποστεί βλάβες, ή κυρίως για να το διπλασιάσουν προκειμένου το κύτταρο να προχωρήσει στη μίτωση. Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί μονόκλωνα μόρια DNA ως εκμαγεία για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων με κατεύθυνση 5'-3'. Τα μονόκλωνα μόρια μπορούν να παραχθούν με απλό τρόπο από δίκλωνα μόρια DNA, όταν αυτά θερμαίνονται σε υψηλές θερμοκρασίες οπότε και αποχωρίζονται. Η DNA πολυμεράση απαιτεί επίσης την παρουσία ενός μικρού τμήματος δίκλωνου DNA για την έναρξη της σύνθεσης. Επομένως, το σημείο έναρξης της σύνθεσης του DNA μπορεί να καθοριστεί με τη χρήση ενός ολιγονουκλεοτιδικού εναρκτήριου μορίου (εκκινητής, primer) που συνδέεται με τη μήτρα ακριβώς στο σημείο έναρξης. Το σημαντικότερο χαρακτηριστικό της PCR είναι ότι μπορούμε μέσω του κατάλληλου ζεύγους εκκινητών να κατευθύνουμε την DNA πολυμεράση να συνθέσει συγκεκριμένη περιοχή του DNA. Και οι δύο κλώνοι του DNA χρησιμοποιούνται ως εκμαγεία για τη σύνθεση του DNA, εφ όσον υπάρχει εκκινητής για κάθε έναν. 60

Για κάθε αντίδραση PCR επιλέγεται ζεύγος εκκινητών παρακειμένων στην περιοχή του DNA που θέλουμε να ενισχύσουμε έτσι ώστε οι καινούργιοι κλώνοι του DNA, που ξεκινούν από κάθε εκκινητή, να προεκτείνονται πέρα από τη θέση του εκκινητή με κατεύθυνση 5' προς 3' στην αντίθετη αλυσίδα. Κάθε επανάληψη της σύνθεσης νέου κλώνου αποτελεί ένα κύκλο ενίσχυσης, ενώ κάθε νεοσυντιθέμενος κλώνος DNA αποτελεί εκμαγείο για τον επόμενο κύκλο ενίσχυσης. Επομένως, στους νεοσυντιθέμενους κλώνους υπάρχουν πάντα θέσεις πρόσδεσης των εκκινητών. Το μίγμα της αντίδρασης θερμαίνεται ξανά για να αποχωριστούν οι παλιοί και οι νέοι κλώνοι του DNA και επαναλαμβάνεται ο κύκλος της πρόσδεσης των εκκινητών, της σύνθεσης του DNA και τέλος του αποχωρισμού των κλώνων. Είναι χαρακτηριστικό ότι τα πρώτα προϊόντα προέκτασης προέρχονται από το αρχικό DNA και δεν χαρακτηρίζονται από σταθερό μήκος, ενώ στους επόμενους κύκλους σχηματίζεται σε πολλή μεγάλη περίσσεια το ειδικό προϊόν. Ένα ακόμα σημαντικό χαρακτηριστικό της αντίδρασης PCR είναι η εκθετική ενίσχυση (amplification) της συγκεκριμένης περιοχής του DNA στόχου. Το τελικό αποτέλεσμα της αντίδρασης PCR μετά από n κύκλους είναι η παραγωγή, θεωρητικά, 2n δίκλωνων μορίων DNA, που είναι πιστά αντίγραφα της αλληλουχίας του DNA που περικλείεται μεταξύ των εκκινητών. Το υλικό που χρησιμοποιείται σαν μήτρα σε μια αντίδραση PCR είναι πάντοτε δίκλωνο DNA, το οποίο περιέχει την αλληλουχία-στόχο. Η αλληλουχία του DNA που πρόκειται να ενισχυθεί καθορίζεται από το ζεύγος των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση. Η αντίδραση της PCR συνήθως επαναλαμβάνεται για 25-30 κύκλους, καθένας από τους οποίους περιλαμβάνει τα ακόλουθα βήματα: 1. Αποδιάταξη (denaturation) στους 95 C : Σε αυτή τη θερμοκρασία τα δίκλωνα μόρια DNA αποχωρίζονται πλήρως με αποτέλεσμα να παράγονται μονόκλωνες αλυσίδες που στη συνέχεια θα χρησιμοποιηθούν ως μήτρες για τους εκκινητές και την DNA πολυμεράση. 2. Επανασύνδεση (annealing): Η θερμοκρασία μειώνεται έτσι ώστε οι εκκινητές να προσδεθούν με τις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στα μονόκλωναμόρια του DNA. Η θερμοκρασία εξειδίκευσης της αντίδρασης της PCR καθορίζεται από την σχέση Tm=2(A+T)+4(C+G). 3. Σύνθεση (extension): Στο βήμα αυτό η θερμοκρασία αυξάνεται στους 72 C, που είναι η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της θερμοανθεκτικής Taq (η οποία απομονώθηκε από το θερμοανθεκτικό βακτήριο Thermus aquaticus) DNA πολυμεράσης, ώστε να εκτελέσει τη σύνθεση των συμπληρωματικών αλυσίδων. Ο 61

χρόνος επώασης στους 72 C ποικίλει ανάλογα με το μέγεθος του DNA στόχου που πρόκειται να ενισχυθεί. Εικόνα 16. Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου PCR Οι συνθήκες των αντιδράσεων αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης που πραγματοποιήθηκαν έχουν ως ακολούθως: αρχική αποδιάταξη της 95 C για 3 λεπτά και κατόπιν 35 κύκλοι με: Αποδιάταξη: 95 C.................................. 1 λεπτό Ανασύνδεση: 56-64 C............................... 1 λεπτό Επιμήκυνση: 72 C.................................. 1 λεπτό Τέλος γίνεται επώαση στη θερμοκρασία επιμήκυνσης για 10 λεπτά. Οι αλληλουχίες των υποκινητών που χρησιμοποιηθήκαν για τα γονίδια πουμελετήθηκαν καθώς και οι αντίστοιχες θερμοκρασίες ανασύνδεσής της φαίνονται στον πίνακα 1. 62

Γονίδιο Αλληλουχία (5 ->3 ) T ( 0 C) Προϊόν (bp) IL-2 IFN-γ IL-3 IL-4 IL-6 IL-10 IL-13 IL-1 β TNF-α GCAACTCCTGTCTTGCATTG AATGTGAGCATCCTGGTGAG AGCTCTGCATCGTTTTGGGTTC CAAATATTGCAGGCAGGACAACC GCTCCCATGACCCAGACAACGTCC CTAAAAGATCGCGAGGCTCAAAGTCG T CTGTGCTCCGGCAGTTCTAC ACGTACTCTGGTTGGCTTCC GCCAGAGCTGTGCAGATGAAG AGGAACTCCTTAAAGCTGCG ACCCAGTCTGAGAACAGCTGC GTTCACATGCGCCTTGATGTCT GACCACGGTCATTGCTCTCACT TCTGGGTCTTCTCGATGGCACT CTGCGTGTTGAAAGATGATAA CCACATTCAGCACAGGACTC GAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTG CAGATAGATGGGCTCATACCAGGG 59 173 64 492 61 400 58 176 58 187 61 260 61 234 58 290 64 237 β2m CCCCCACTGAAAAAGATGAG TCACTCAATCCAAATGCGGC 56 150 OB-R total 5 -GACTCATTGTGCAGTGTTCAG-3 5 -TGCTCATAGGCCATGAAAAGG-3 52 198 63

OB-R short OB-R long 5 -AAACACCAGAGTGATGCAGG-3 5 -GTTGGCACATTGGGTTCATC-3 5 -AAACACCAGAGTGATGCAGG-3 5 -GAGGACCACATGTCACTGAT-3 50 230 50 229 Πίνακας1.Αλληλουχίες υποκινητών που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν. 7. Ενδοκυττάρια χρώση κυτταροκινών Η έκφραση της IL-10 μελετήθηκε CD3+ and CD14+ κύτταρα. Για τον ενδοκυττάριο προσδιορισμό της ΙL-10 σε CD3 και CD14 κύτταρα ακολουθείται η ακόλουθη διαδικασία: Για κάθε έναν ασθενή προετοιμάζουμε δύο επιμέρους σωληνάρια (falcon) για το μη ενεργοποιημένο (a) και το ενεργοποιημένο (b) δείγμα τα οποία σημαίνουμε ως «Control» και «Activated» αντίστοιχα (εικ.17). Στο σωληνάριο του μη ενεργοποιημένου δείγματος προσθέτουμε 0,5ml ολικού αίματος, 0,5ml RPMI-1640/Glu και 2μl Brefeldin A (Sigma) Στο σωληνάριο του ενεργοποιημένου δείγματος προσθέτουμε 0,5ml ολικού αίματος και 0,5ml RPMI-1640/Glu με 200ng/ml, 500ng/ml, 800ng/ml ανασυνδιασμένης λεπτίνης καθώς και 2μl Brefeldin A (Sigma) Ελαφριά ανάδευση σε αναδευτήρα (vortex) και των δύο σωληναρίων Τόσο το σωληνάριο με το μη ενεργοποιημένο όσο και το σωληνάριο με το ενεργοποιημένο δείγμα τοποθετούνται για 5 ώρες σε επωαστικό θάλαμο της 37 0C, 5% CO2. Το αντιβιοτικό Brefeldin A χρησιμοποιείται για να εμποδίσει την έκκριση των κυτταροκινών «φυλακίζοντας» αυτές στο ενδοπλασματικό δίκτυο καθιστώντας έτσι δυνατό τον ενδοκυττάριο προσδιορισμό της. 64

Εικόνα 17: Για κάθε ένα ασθενή ετοιμάζουμε δύο σωληνάρια το ένα με απλό καλλιεργητικό μέσο και το άλλο με ανασυνδιασμένη λεπτίνη. 100 μl από την κάθε καλλιέργεια επωάζονται με τα μονοκλωνικά αντισώματαanti- CD3-FITC και anti-cd14 FITC. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου. Mετά την ολοκλήρωση της επιφανειακής χρώσης σε καθένα από τα σωληνάρια προσθέτουμε 2ml Pharmalyse Solution (PharMLyse,PharMingen,San Diego, CA USA) γιαλύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και ακολουθεί επώαση για 15 λεπτά. Τα δείγματα ξεπλένονται με 2ml PBS εμπλουτισμένο με 1% Fetal Calf Serum και 0,09% Sodium Azide. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά της 1500 rpm απόχυση υπερκείμενου Προσθήκη 250μl Cytofix/Cytoperm Buffer (BD- Pharmigen) σε καθένα από τα σωληνάρια. Το διάλυμα αυτό περιέχει παραφορμαλδεϋδη που επιτυγχάνει τη μονιμοποίηση των κυττάρων και σαπωνίνη που προκαλεί αναστρέψιμη αύξηση της διαπερατότητας της πλασματικής μεμβράνης Ελαφριά ανάδευση σε αναδευτήρα (vortex) Επώαση για 20 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου Προσθήκη 2ml 1x Perm Wash Buffer (BD- Pharmigen) σε καθένα από τα σωληνάρια. Αυτό το διάλυμα περιέχει FBS και σαπωνίνη. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά της 1500 rpm απόχυση υπερκείμενου- Προσθήκη του μονοκλωνικού αντισώματος anti-human IL-10-PE (PharMingen) και επώαση στο σκοτάδι για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί ανάλυση με κυτταρομετρία ροής κατά την οποία αφήνουμε να περάσουν τουλάχιστον 100.000 κύτταρα σε κυτταρομετρητή Coulter Epics XL-MCL. 65

8. Κυτταρικές σειρές Οι κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν για την έκφραση των ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης (OB-R) είναι οι εξής: Raji (# G ) : Αυτή η κυτταρική σειρά δημιουργήθηκε το 1963 από ένα 12χονο αγόρι από την Αφρική με λέμφωμα Burkitt s. Είναι η πρώτη συνεχόμενη ανθρώπινη αιμοποιητική κυτταρική σειρά. Έχει πλέον μετατραπεί σε ένα αναπόσπαστο εργαλείο στην αιμοποιητική έρευνα και σε μελέτες λευχαιμίας και λεμφώματος. Jurkat (# J ): Τα κύτταρα Jurkat είναι μία αθάνατη σειρά λεμφοκυττάρων που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη της οξείας κυτταρικής λευχαιμίας, της μεταγωγής σήματος και για την μελέτη έκφρασης διαφόρων υποδοχέων επιρρεπών στην είσοδο ιών, και κυρίως του HIV. Τα κύτταρα Jurkat είναι της χρήσιμα στην επιστήμη εξαιτίας της ικανότητάς της να παράγουν IL-2. Η κυτταρική σειρά Jurkat (που καλείται και JM) δημιουργήθηκε στα τέλη της δεκαετίας του 1970 από το περιφερικό αίμα της 14χρονου αγοριού με Της κυτταρική οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία. U937 (# H): (AmericanTypeCultureCollection, Manassas, VA, USA): Η κυτταρική σειρά U937 είναι μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά που δημιουργήθηκε από ένα ιστιοκυτταρικό λέμφωμα και φέρει πολλά μονοκυτταρικά χαρακτηριστικά. Χρησιμεύει ως ένα in vitro μοντέλο για την διαφοροποίηση μονοκυττάρων/ μακροφάγων, για αντικαρκινικά τεστ, ή για την ογκογένεση. Τα U937 κύτταρα κυρίως εκφράζουν της 44-46 kda μορφές παξιλίνης, ενώ ενεργοποίηση με IFN-β και IFN-γ οδηγεί στη συσσώρευση των 66-70 kda μορφών παξιλίνης. 9. Διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών και καλλιέργειες Από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC), που αναπτύχθηκαν σε απλό καλλιεργητικό μέσο (CM) για 8 ώρες, απουσία δηλαδή ορού από έμβρυα βοοειδούς απομονώθηκαν τα CD3 κύτταρα με την χρήση nylon wool (Combed, Scrubbed Nylon Wool) σε σύριγγα των 20ml. Για τον διαχωρισμό των CD14 κυττάρων από τα PBMC χρησιμοποιήθηκαν ανοσομαγνητικά σφαιρίδια (Dynabeads, Dynal Biotech) σε συγκέντρωση 3 σφαιρίδια/pbmc για αρνητική επιλογή. Χρησιμοποιήθηκαν σφαιρίδια anti-cd3 και anti-cd19. Η καθαρότητα των πληθυσμών επιβεβαιώθηκε με την χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων anti-cd3-fitc και anti-cd14-fitc (Ιmmunotech, Marseille, France) και κυτταρομετρία ροής. 66

10. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Με την ηλεκτροφόρηση γίνεται διαχωρισμός των τμημάτων DNA που παίρνουμε όταν αυτό κόβεται με ένζυμα περιορισμού, καθώς της μπορούμε να δούμε και τα αποτελέσματα των προϊόντων της PCR. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε οριζόντια συσκευή. Μαζί με τα της ανάλυση δείγματα προσθέτουμε σε μια ή δύο θέσεις δείκτη, δηλαδή, γνωστού μεγέθους τμήματα DNA. Ο δείκτης της είναι συνήθως DNA κατατμημένο με ένζυμο περιορισμού και άλλοι δείκτες μεγεθών DNA, ανάλογα με το μέγεθος των τμημάτων που θα ανιχνευθούν. Έτσι θα είναι δυνατή η εκτίμηση αφενός της καλής ανάλυσης του DNA κατά την ηλεκτροφόρηση, αφετέρου του μεγέθους (σε χιλιοβάσεις, kb) των διαφόρων τμημάτων των DNA που αναλύονται. Συνήθως, η διακοπή της ηλεκτροφόρησης γίνεται όταν η χρωστική έχει διανύσει τα 4/5 του μήκους του πηκτώματος της αγαρόζης. Η φωτογράφηση των πηκτωμάτων γίνεται με το σύστημα Kodak 2000 σε υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με ειδικό απαγωγό με ακτινοβολία UV. Τα προιόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης 2%. Για πήκτωμα με συγκέντρωση αγαρόζης 2% προστίθεται σε κωνική φιάλη με διάλυμα όγκου 100 ml (20 ml TBE 5X και 80 ml H2O), 2 gr αγαρόζης ζυγισμένο σε ζυγό. Το διάλυμα ζεσταίνεται και κατόπιν προστίθεται EtBr σε τελική συγκέντρωση 0,25 μg\ml. Για το running buffer αντίστοιχα φτιάχνεται διάλυμα με τελική συγκέντρωση TBE 1X. Για το ρυθμιστικό διάλυμα αλάτων ΤΒΕ συγκέντρωσης 5Χ (όγκος llt) προσθέτουμε τα εξής: 54 gr Tris base, 27,5 gr βορικό οξύ, 20 m1 διαλύματος 0,5Μ EDTA ρη 8.0. Ανακατεύουμε τα υλικά σε νερό τελικου όγκου 1 lt. 67

Εικόνα 18 : ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζής Για την ποσοτική αξιολόγηση των ζωνών ηλεκτροφόρησης ακολουθεί σάρωση και τα δεδομένα αναλύονται με το ImageTool V1.28 λογισμικό (University of Texas Health Science Center, San Antonio, TX). Ως γονίδιο αναφοράς επιλέξαμε τη β2 μικροσφαιρίνη (β2m), προκειμένου να εκτιμήσουμε τα ποσά cdna που προέρχονται από διαφορετικά δείγματα κυττάρων. 11. Elisa Τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών (με ή χωρίς θεραπεία, ενεργό ή νόσο σε ύφεση) και μαρτύρωνπροσδιορίστηκαν με ELISA (enzyme-linked immunoassay) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών (R&D System Quantikine TM, Minneapolis,USA). Επίσης με τη μέθοδο ELISA μετρήθηκαν και τα επίπεδα του διαλυτού υποδοχέα της λεπτίνης. 68

Εικόνα 19. Σχηματική αναπαράσταση της μεθόδου Elisa. 12. Στατιστική ανάλυση Tα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση και διάμεση τιμή. Τόσο παραμετρικά (ttest), όσο και μη παραμετρικά (Mann-Whitney-U test) τεστ χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο των υποθέσεών μας, καθώς τα δεδομένα ακολουθούν κανονικές και μη κατανομές, αντίστοιχα. Σο p 0.05 δηλώνει τη στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων που μελετώνται. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα στατιστικής επεξεργασίας δεδομένων SPSS 16.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Το Man-Whitney U-test χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των επιπέδων λεπτίνης ασθενών και μαρτύρων καθώς και των ομάδων ασθενών με ενεργό νόσο και ασθενών σε ύφεση. Για τη σύγκριση επιπέδων λεπτίνης μεταξύ ανδρών και γυναικών ασθενών, καθώς και μεταξύ ασθενών που έλαβαν διαφορετικά θεραπευτικά σχήματα χρησιμοποιήθηκε το Two-way ANOVA. Τέλος για τη σύγκριση των ποσοστιαίων τιμών των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών που βρίκαμε από την φαινοτυπική ανάλυση μεταξύ ασθενών και μαρτύρων χρησιμοποιήσαμε το Students t-test. 69

Αποτελέσματα 70

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Ασθενείς Ο πίνακας 2 δείχνει την ηλικία, το φύλο και το δείκτη σωματικής μάζας (BMI) ασθενών και μαρτύρων καθώς και τη διάρκεια και το στάδιο της νόσου των ασθενών, τη χρονική στιγμή που πάρθηκε το δείγμα αίματος. Όλοι οι ασθενείς που μελετήθηκαν είχαν BMI >24 και οι γυναίκες ασθενείς είχαν συνολικά χαμηλές τιμές BMI. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ασθενών με ενεργό νόσο και ασθενών σε ύφεση όσον αφορά την ηλικία, τη διάρκεια της ασθένειας και το δείκτη μάζας. Πίνακας 2.Δημογραφικά και κλινικά δεδομένα των συμμετεχόντων ατόμων στη μελέτη. n= μέγεθος δείγματος,, ηλικία σε έτη (μέση ηλικία με εύρος στην παρένθεση), BMI= Body Mass Index (δείκτης σωματικής μάζας) δίνεται μέσο BMI με έυρος στην παρένθεση, Δ.Α.= διάρκεια ασθένεας σε χρόνια, Σ.Ν.= στάδιο νόσου, Ε.Ν.= ενεργός νόσος, Υ= ύφεση, Γ.= γυναίκες, Α.= άνδρες, Φυσιολογικό έυρος ΒΜΙ :18.5-24.9. Στον πίνακα 3 συνοψίζονται τα θεραπευτικά σχήματα των ασθενών, τα οποία ομαδοποιούνται σε 3 κατηγορίες : έλλειψη θεραπευτικής αγωγής (Χ.Θ.), ήπια θεραπευτική αγωγή (Η.Θ.) και ισχυρή θεραπεία (Ι.Θ.), ο αριθμός των ασθενών που έλαβαν κάθε ένα από τους 3 τύπους θεραπείας καθώς και ο τύπος και η συγκέντρωση του κάθε φαρμάκου. 71

Πίνακας 3.Θεραπευτικά σχήματα των ασθενών με ΡΑ. n= αριθμός ασθενών, Χ.Θ. = χωρίς θεραπεία, Η.Θ. = ήπια θεαπεία, Ι.Θ. = ισχυρή θεραπεία, HCQ= υδροξυχλωροκίνη (200mg/μέρα), χαμηλή δόση στεροειδών: (πρεδνιζολόνη, 5-7.5mg/μέρα), MTX= μεθοτρεξάτη (7.5-15mg/βδομάδα), CsA= κυκλοσπορίνη Α (3-5mg/kg/μέρα), Leflunomide= λεφλουνομίδη (20mg/μέρα, Aventis), Infliximab= ινφλιξιμπάμπη (anti-tnf-α αντίσωμα, 3mg/kg/bimonthly) 2. Κύτταρα Στον πίνακα 4 φαίνονται τα ποσοστά λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών περιφερεικού αίματος ασθενών και μαρτύρων. Από τα δεδομένα του πίνακα συμπεραίνουμε ότι τα ποσοστά των κυτταρικών υποπληθυσμών CD3+CD4+, CD4+CD25+ και CD20, καθώς και η αναλογία CD4/CD8 των ασθενών με ενεργό νόσο παρουσιάζονται σημαντικώς χαμηλότερα από αυτά των υγιών ατόμων. Αντίθετα τα ποσοστά των κυτταρικών υποπληθυσμών CD3+CD8+, CD8+CD45RA+, CD8+CD45RO+ καθώς και ο λόγος CD8CD45RA/RO είναι πολύ υψηλότερα από ότι τα αντίστοιχα controls. Ακόμη σε ασθενείς που δεν έλαβαν φαρμακευτική αγωγή δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα ποσοστά των κυτταρικών υποπληθυσμών CD3+CD8+, CD45RA+, CD45RO+ CD8, CD20+, σε αντίθεση με τους ασθενείς που έλαβαν θεραπεία, και αυτό ενδεχομένως είναι αποτέλεσμα της χορηγούμενης θεραπείας. Τα ποσοστά των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα σε ύφεση 72

φαίνεται να είναι παρόμοια με αυτά των μαρτύρων, με εξαίρεση τα CD20+ κύτταρα, το ποσοστό των οποίων είναι σημαντικά χαμηλότερο από το ποσοστό των μαρτύρων. Ασθενείς με ΡΑ (n=16) Controls (n=32) Κυτταρικός τύπος Ενεργός νόσος (%) Νόσος σε ύφεση(%) total no-rx post-rx Λεμφοκύτταρα 100%=1,790±580 ceus/μl 100%=1,500± 720 cells/μl CD2+ 87±5 88±6 81±4 CD3+ 78+7 72+18 75+5 CD3+CD4+ 40±8 39±6 42±10 48±17 47±6 CD3+CD8+ 32±11 31±14 34±4 31±18 24±7 (%) 100%=2,190±5 80 cells/μl CD4/CD8 1.25±0.31 1.28±0.51 1.2±0.42 1.51+0.79 1.92±0.63 CD4+CD45RA+ 16±7 20±21 20±7 CD4+CD45RO+ 28±6 35±4 29±7 CD4CD45RA/RO 0.61±0.31 0.54±0.5 0.78±0.42 CD4+CD25+ 0.5±0.2 0.5±0.2 0.5±0.2 0.9±0.7 1.1±0.7 CD8+CD45RA+ 23±6 20.5±5 26±7 29±15 18±5 CD8+CD45R0+ 18±11 17±14 18±7 11±3 10±4 CD8CD45RA/RO 1.66±0.85 2.61±1.31 2.2±1.03 CD3-CD56+ 10±5 18±14 9±3 CD20+ 8.5±6.2 11±7 5±1 5.3±2.9 13±3 CD20+CD5+ 0.8±0.4 0.4+0.3 0.6±0.4 Πίνακας 4.Φαινοτυπική ανάλυση των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών περιφερικού αίματος ασθενών με ΡΑ και μαρτύρων. Τα δεδομένα του πίνακα μας δείχνουν τα 73

ποσοστά των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών των ασθενών με ΡΑ με ενεργό νόσο και ασθενών σε ύφεση της νόσου. 3. Eπίπεδα λεπτίνης στον ορό Η εικόνα 1 δείχνει τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών με ΡΑ και υγιών ατόμων, καθώς και τα επίπεδα αυτής ανδρών και γυναικών τόσο ασθενών όσο και υγιών. Στην εικόνα 1 παρατηρούμε ότι τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών (μέσο όρο 30.78ng/ml) είναι σημαντικά υψηλότερα από αυτά των μαρτύρων (μέσο όρο 8.16ng/ml), ενώ επίσης τα επίπεδα λεπτίνης παρουσιάζονται υψηλότερα στις γυναίκες (μέσο όρο 38.89ng/ml) από ότι στους άνδρες με ΡΑ (μέσο όρο 17.01ng/ml), (Mann- Whitney U-test, p<0.05). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τη διαθέσιμη βιβλιογραφία αφού όπως είναι γνωστό τα επίπεδα λεπτίνης αυξάνονται από παράγοντες φλεγμονής και από την επίδραση προφλεγμονωδών κυτταροκινών καθώς επίσης παρουσιάζουν και φυλετικό διμορφισμό αφού είναι υψηλότερα στις γυναίκες από ότι στους άνδρες. Εικόνα 1. Επίπεδα λεπτίνης στον ορό υγιών και ασθενών με ΡΑ. 74

Στην εικόνα 2 παρουσιάζονται τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών με ενεργό νόσο και ασθενών σε ύφεση. Όπως βλέπουμε δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές των επιπέδων λεπτίνης ορού μεταξύ ασθενών με ενεργό νόσο (μέσος όρος λεπτίνης 31.93ng/ml) και ασθενών που βρίσκονται σε ύφεση (μέσος όρος λεπτίνης 28.27ng/ml). Στο ίδιο συμπέρασμα καταλήξαμε και από τη σύγκριση ανδρών και γυναικών ξεχωριστά. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα επίπεδα λεπτίνης δεν φαίνεται να σχετίζονται με το στάδιο της νόσου. Εικόνα 2. Επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών με ενεργό νόσο και ασθενών σε ύφεση. 75

Στην εικόνα 3 παρουσιάζονται τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών με ή χωρίς θεραπεία (ήπια ή ισχυρή). Εδώ βλέπουμε ότι δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ασθενών του ιδίου φύλου, οι οποίοι έλαβαν ήπια ή ισχυρή θεραπεία, κάτι το οποίο δείχνει ότι τα επίπεδα λεπτίνης δεν σχετίζονται από τον τύπο θεραπείας. Αντιθέτως παρατηρήσαμε στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ ανδρών και γυναικών στους οποίους δεν χορηγήθηκε φαρμακευτική αγωγή. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της εικόνας 1, σύμφωνα με τα οποία οι γυναίκες ασθενείς τείνουν να εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα λεπτίνης από ότι οι άνδρες. Εικόνα 3. Επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών με ή χωρίς θεραπεία (ήπια ή ισχυρή) 76

Στην εικόνα 4 παρουσιάζονται τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών οι οποίοι έλαβαν ισχυρή θεραπεία παρουσία και απουσία anti-tnfa. Όπως γνωρίζουμε το μόριο του TNFa, το οποίο παράγεται από ενεργοποιημένα μακροφάγα διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονώδους αντίδρασης στον αρθρικό υμένα με τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή του χόνδρου. Το μονοκλωνικό αντίσωμα που χορηγήθηκε είναι η ινφλιξιμπάμπη, το οποίο όπως έχει ήδη αναφερθείεξουδετερώνει τη δράση του TNFa δεσμεύοντας σταθερά όλες τις δομές του (το διαλυτό, το διαμεμβρανικό και το δεσμευμένο στον υποδοχέα του), μειώνοντας έτσι τα επίπεδα των ελεύθερων, βιολογικά ενεργών μορίωνtnfa. Έτσι ο αποκλεισμός του TNFα μειώνει τα κλινικά συμπτώματα της φλεγμονής και περιορίζει την επέκταση της φλεγμονώδους οστικής καταστροφής. Εικόνα 4. Επίπεδα λεπτίνης στον ορό ασθενών που ελαβαν ισχυρή θεραπεία παρουσία και απουσία anti-tnfa Όπως παρατηρούμε τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό αυξάνονται παρουσία anti- TNFa. Ακόμη τα επίπεδα αυτής δεν παρουσιάζουν μεγάλες αποκλίσεις μεταξύ ανδρών και γυναικών με λίγο υψηλότερα επίπεδα παρουσία anti-tnfa.από τα 77

αποτελέσματα αυτά συμπεραίνουμε ότι παρά τη στοχευμένη μείωση των επιπέδων του TNFa το μόριο της λεπτίνης παραμένει σε υψηλά επίπεδα, κάτι που ενδεχομένως δείχνει την πιθανή άμεση ή έμεση εμπλοκή της στην παθογένεια τηςρευματοειδούς αρθρίτιδας. Ακόμη αξίζει να αναφερθεί ότι ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών (περίπου 30%) δεν ανταποκρίνεται στη θεραπεία των anti-tnfa και εδεχομένως αυτή η παρατήρηση να συνεπάγεται την ύπαρξη άλλου ή αλλών μορίων που κατευθύνουν την εξέλιξη της νόσου. 4. Έκφραση των γονιδίων των Τh1/Th2 τύπου κυτταροκινών σε ασθενείς με PA. Οι παρακάτω εικόνες δείχνουν την έκφραση των γονιδίων των κυτταροκινών σε controls και σε ασθενείς με PA. Για την μελέτη της πιθανής άμεσης δράσης της λεπτίνης στην έκφραση των γονιδίων κυτταροκινών τύπου Ι (IL-2, IFN-γ, IL-1β, IL-6 και TNF-α), καθώς και κυτταροκινών τύπου ΙΙ (IL-4, IL-10, IL-3 και IL-13), απομονώσαμε PBMC από 10 πρόσφατα διαγνωσμένους ασθενείς με ΡΑ, οι οποίοι δεν έλαβαν καμία θεραπεία, 4 ασθενείς με ΡΑ, στους οποίους χορηγήθηκε θεραπευτική αγωγή anti-tnf-α, μεθοξετράτη και χαμηλές δόσεις στεροειδών φαρμάκων καθώς και 10 μαρτύρων. Το PBMC καλλιεργήθηκε σε απλό καλλιεργητικό υλικό (CM) ή παρουσία μιτογόνων (PMA, ιονομυκίνη) ή παρουσία ανασυνδυασμένης λεπτίνης σε διάφορες συγκεντρώσεις για 8 ώρες.στις καλλιέργειες η λεπτίνη χρησιμοποιείται σε πέντε διαφορετικές συγκεντρώσεις (10, 20, 100, 500 ή 1000ng/ml).Τα μιτογόνα PMA και ιονομυκίνη επιλέχτηκαν επειδή μπορούν να επάγουν την έκφραση όλων των γονιδίων των κυτταροκινών που μελετήθηκαν και αυτό επειδή μιμούνται το TCR/CD3 μονοπάτι ενεργοποίησης των Τ-κυττάρων. Στη συνέχεια ακολούθησε απομόνωση RNA και RT-PCR προκειμένου να μελετήσουμε την επίδραση της λεπτίνης στην έκφραση των γονιδίων των κυτταροκινών που αναφέρθηκαν προηγουμένως. Τα αποτελέσματα φαίνονται στην εικόνα 5. Σε συνθήκες απλού καλλιεργητικού υλικού (CM) παρατηρούμε ότι στο PBMC τόσο ασθενών όσο και μαρτύρων εκφράζονται τα γονίδια των κυτταροκινών IL-1β, IL-6, TNF-α και IL-10, ενώ από τις κυτταροκίνες τύπου Ι δεν φαίνεται να εκφράζονται οι IL-2 και IFN-γ και από τις κυτταροκίνες τύπου ΙΙ οι IL-4, IL-3 και IL- 13. Επιπλέονπαρατηρούμε ότι οι ιντελευκίνες IL-1β, IL-6 και TNF-α 78

εμφανίζουνπαρόμοια πρότυπα έκφρασης όσον αφορά τις εντάσεις της έκφρασης και τον αριθμό των θετικών δειγμάτων στο PBMC ασθενών και μαρτύρων. Εξαίρεση φαίνεται να αποτελεί η IL-10, η οποία εκφράζεται σε 6 από τους 10 ασθενείς σε σύγκριση με τα controls, η οποία εκφράζεται σε 3 από τα 10. Η παρουσία μιτογόνων στο PBMC ασθενών και μαρτύρων επάγει την έκφραση των γονιδίων των όλων των κυτταροκινών που μελετήθηκαν. Παρ 'όλα αυτά βλέπουμε ότι σε PBMC ασθενών η έκφραση των γονιδίων των κυτταροκινών IL-10, IL-1β, IL-6 και TNF-α είναι πολύ υψηλότερες σε ένταση από ότι των υπολοίπων κυτταροκινών που μελετήθηκαν. Ακόμη για να δούμε την πιθανή άμεση επίδραση της λεπτίνης στην έκφραση των Th1 και Th2 κυτταροκινών προσθέσαμε ανασυνδυασμένη λεπτίνη σε PBMC σε απλό καλλιεργητικό υλικό. Τα αποτελέσμα δείχνουν ότι δεν υπήρξε καμία αισθητή επίδραση της λεπτίνης στην έκφραση των IL-1β, IL-6 και TNF-α γονιδίων σε PBMC ασθενών και μαρτύρων. Αξίζει να αναφερθεί ότι σε PBMC μαρτύρων η ανασυνδυασμένη λεπτίνη επάγει μείωση των επιπέδων έκφρασης των IL-2 (σε 2 από 10 δείγματα), IFN-γ (3/10), IL-4 (2/10) και IL-13 (2/10), αντίθετα προκαλέι αύξηση των επιπέδων της IL-10 (5/10), ενώ δεν έχει καμία επίδραση στην έκφραση της IL-3. Σε αντίθεση με τα controls η ανασυνδυασμένη λεπτίνη δεν προκαλεί καμία αλλαγή στην έκφραση των κυτταροκινών που αναφέρθηκαν με την εντυπωσιακή εξαίρεση της IL-10, η έκφραση της οποίας επάγεται σε PBMC 9/10 ασθενών σε υψηλότερα επίπεδα από των αντίστοιχων μαρτύρων. 79

Εικόνα 5. Έκφραση των γονιδίων των Th1/Th2 κυτταροκινών σε PBMC μετά από την καλλιέργειά του σε απλό καλλιεργητικό μέσο, μετά από μιτογονική διέγερση και μετά από καλλιέργειά παρουσία ανασυνδιασμένης λεπτίνης. Τα αποτελέσματα αφού ποσοτικοποιήθηκαν δίνονται σαν pixels. 80

5. Ενδοκυττάριος προσδιορισμός της ΙL-10 Στην εικόνα 6 φαίνεται κατά πόσο η παρουσία της ανασυνδιασμένης λεπτίνης επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου της ΙL-10 σε διαφορετικές ομάδες κυττάρων ασθενών με ΡΑ. Όπως είναι γνωστό η IL-10 παράγεται πρωτίστως από τα μονοκύτταρα καθώς και από ενεργοποιημένα Th2 T κύτταρα. Προκειμένου λοιπόν να ταυτοποιήσουμε τον κυτταρικό στόχο δράσης της λεπτίνης επωάστηκε ολικό αίμα 5 ασθενών παρουσία και απουσία ανασυνδυασμένης λεπτίνης. Τα κύτταρα επιλέχθησαν με αντιγόνα CD3 και CD14 και διαχωρίζονται με κυτταρομετρία ροής. Έτσι παρατηρούμε ότι η παρουσία της ανασυνδιασμένης λεπτίνης προκαλεί αύξηση της IL-10, η οποία οφείλεται αποκλειστικά στη δράση των μονοκυττάρων ενώ δεν τροποποιείται το πρότυπο έκκρισης των Τ- λεμφοκυττάρων. Ακόμη παρατηρούμε ότι παρουσία λεπτίνης τα επίπεδα της IL-10 στα μονοκύτταρα ασθενών αυξάνονται κατά 10 φορές, ενώ στα μονοκύτταρα μαρτύρων κατά 2 φορές. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν έναν σημαντικό ανοσοτροποποιητικό ρόλο της λεπτίνης στη ΡΑ. Εικόνα 6. : Eπίδραση της ανασυνδιασμένης λεπτίνης στην έκφραση του γονιδίου της IL- 10 σε CD3 και CD14 κύτταρα ασθενών με ΡΑ. Tα αποτελέσματα δίνονται σε pixels. 81