ΕΛΕΥΘΕΡΙΑΣ Θ. ΜΑΛΛΙΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Α.Π.Θ

ΕΛΕΥΘΕΡΙΑΣ Θ. ΜΑΛΛΙΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΥ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Α.Π.Θ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΒΗΧΙΚΩΝ-ΑΠΟΧΡΕΜΠΤΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΓΡΑ ΜΕ ΥΧΥΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2002

«Το αληθινό βασίλειο της ελευθερίας αρχίζει εκεί που σταματά η αναγκαιότητα, εκεί που η εργασία δεν μετατρέπεται σε εμπόρευμα, αλλά αποτελεί αυτοσκοπό και μέσο για να εκφράσει ο άνθρωπος τις πλούσιες δημιουργικές του ικανότητες».

Στη μνήμη της μητέρας μου Μαριάνθης

ΜΕΛΗ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Ν. ΒΟΥΛΓΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Α.Π.Θ. 2. ΣΤΑΥΡΟΣ Χ. ΜΑΛΑΜΑΤΑΡΗΣ Καθηγητής Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. 3. ΙΩΑΝΝΗΣ Α. ΣΤΡΑΤΗΣ Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Α.Π.Θ. 4. ΜΑΥΡΟΥΔΗΣ Α. ΔΕΜΕΡΤΖΗΣ Επίκουρος Καθηγητής Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Πανεπιστημίου Ιωαννίνων 5. ΘΕΟΔΩΡΑ Α. ΜΠΡΟΥΣΑΛΗ Μόνιμη Λέκτορας Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, Τμήμα Φαρμακευτικής Α.Π.Θ. 6. ΓΕΩΡΓΙΟΣ Α. ΖΑΧΑΡΙΑΔΗΣ Μόνιμος Λέκτορας Αναλυτικής Χημείας, Τμήμα Χημείας Α.Π.Θ. 7. ΙΩΑΝΝΗΣ Ε. ΚΟΥΝΤΟΥΡΕΛΛΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακευτικής Ανάλυσης, Τμήμα Φαρμακευτικής Α.Π.Θ.

I ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, υπό την άμεση επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ιωάννη Ε. Κουντουρέλλη, τον οποίο ευχαριστώ θερμά για την υπόδειξη του θέματος, τη συνεχή επιστημονική καθοδήγηση και το αμείωτο ενδιαφέρον του κατά τη διάρκεια της έρευνας. Μέσα από τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις και συζητήσεις μας κατόρθωσε να μου διδάξει μέρος από την «τέχνη» της ερευνητικής μεθοδολογίας, που τόσο καλά γνωρίζει ο ίδιος. Οφείλω να τονίσω ότι δε διαμόρφωσε μόνο τον τρόπο σκέψης ενός νέου επιστήμονα, αλλά πολύ περισσότερο επηρέασε σημαντικά τη στάση ενός ανθρώπου απέναντι στη ζωή. Θερμές ευχαριστίες εκφράζω επίσης στον κ. Ιωάννη Α. Στράτη Καθηγητή Αναλυτικής Χημείας και κ. Θεοδώρα Α. Μπρούσαλη, Μόνιμη Λέκτορα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, μέλη της Τριμελούς Εισηγητικής Επιτροπής, για τις εποικοδομητικές παρατηρήσεις και συμβουλές σε όλη τη διάρκεια των πειραμάτων και των δημοσίων παρουσιάσεων που πραγματοποιήθηκαν στο τέλος κάθε ακαδημαїκού έτους καθώς και για τη μελέτη και κριτική του τελικού κειμένου. Αισθάνομαι ακόμη την ανάγκη να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της Εξεταστικής Επιτροπής για τις πολύτιμες υποδείξεις τους πριν την τελική ολοκλήρωση της Διατριβής. Επίσης ευχαριστώ τα μέλη της Γ. Σ του Τμήματος για τη χρηματική βοήθεια που μου πρόσφεραν μέσω της Επιτροπής Ερευνών και ιδιαίτερα τον Διευθυντή

II του Τομέα Τεχνολογίας κ. Σταύρο Χ. Μαλαματάρη καθώς και τα υπόλοιπα μέλη του Τομέα για τη φιλική ατμόσφαιρα συνεργασίας που μου πρόσφεραν. Οφείλω, τέλος την ευγνωμοσύνη μου στην οικογένειά μου για την αγάπη και την ανεκτίμητη συμπαράστασή της σε όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Τον λατρευτό μου πατέρα για την ενθάρρυνση στην έναρξη της Διατριβής και τις αγαπημένες μου αδερφές για την πολύτιμη βοήθειά τους και στην άρτια εμφάνιση των κειμένων. Ελευθερία Θ. Μάλλιου Θεσσαλονίκη, Μάιος 2002

III ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ..I-II ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ..III-VII Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ..1-34 1.1 ΓΕΝΙΚΑ 1-2 1.2 ΕΙΔΗ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 3-7 i) Χρωματογραφία Προσρόφησης.3 ii) Χρωματογραφία Κατανομής 3-4 iii) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής..4-5 iv) Χρωματογραφία Συγγένειας 5 v) Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους ή Διαπερατότητας Πηκτής.6-7 1.3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ..8-34 1.3.1 Αντλίες Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης...9-11 i) Αντλίες σταθερής ροής...9-11 ii) Αντλίες σταθερής πίεσης...11 1.3.2 Μονάδα εισαγωγής δείγματος στη στήλη....12-13 1.3.3 Στήλες Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης.14-21 i) Προστήλη..14 ii) Aναλυτική στήλη.14-21 iii) Ημιπαρασκευαστικές στήλες..21 iv) Παρασκευαστικές στήλες...21 1.3.4 Ανιχνευτές Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης...22-29 i) Ανιχνευτής ορατού - υπεριώδους UV-Vis...24 ii) Ανιχνευτής παράταξης φωτοδιόδων...25 iii) Φθορισμομετρικός ανιχνευτής...26 iv) Ηλεκτροχημικός Ανιχνευτής..26-28 v) Ανιχνευτής δείκτη διάθλασης...28-29 vi) Ανιχνευτής σκεδασμού φωτός...29

IV 1.3.5 Σύστημα καταγραφής αποτελεσμάτων...30-31 1.3.6 Διαλύτες Φιάλες αποθήκευσης...32-34 1.3.6.1 Αποθήκευση - Απαέρωση διαλυτών...32-33 1.3.6.2 Επιλογή κινητής φάσης...33-34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2...35-50 2.1 ΕΠΙΛΟΓΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ...35-43 2.2 ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ......44-46 2.3 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΓΡΑΜΜΙΚΗΣ ΠΑΛΙΝΔΡΟΜΗΣΗΣ...47-50 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3...51-55 3.2 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...51-52 3.3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ...52-55 3.3.1 Όργανα και σκεύη...52-54 3.3.2 Διαλύτες και αντιδραστήρια...54-55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΜΒΡΟΞΟΛΗ...56-96 4.1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ...56-64 4.1.1 Φαρμακολογική δράση.....56 4.1.2 Φαρμακοκινητική......57 4.1.3 Φυσικοχημικές ιδιότητες...57-58 4.1.4 Θεραπευτικές εφαρμογές.....58 4.1.5 Ανεπιθύμητες ενέργειες......59 4.1.6 Αλληλεπιδράσεις....59 4.1.7 Μέθοδοι προσδιορισμού......60-64 4.2 MΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΑΜΒΡΟΞΟΛΗΣ...65-68 4.2.1 Μελέτη της επίδρασης του pη και της εκατοστιαίας περιεκτικότητας της κινητής φάσης σε μεθανόλη στην αμβροξόλη........69-74 4.2.2 Χάραξη καμπύλης αναφοράς αμβροξόλης...75-78

V 4.3 ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΟΥΣΙΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΥΠΑΡΧΟΥΝ ΜΕ ΤΗΝ ΑΜΒΡΟΞΟΛΗ ΣΤΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ...79-81 4.2.2 Μελέτη της επίδρασης του ph και της εκατοστιαίας περιεκτικότητας της κινητής φάσης σε μεθανόλη στα συντηρητικά....82-87 4.3.2 Χάραξη καμπυλών αναφοράς συντηρητικών...88-94 4.4 ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΚΑΙ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ ΜΕΘΟΔΟΥ.....95-96 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΒΡΩΜΕΞΙΝΗ...97-118 5.1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ.........97-104 5.1.1 Φαρμακολογική δράση....97 5.1.2 Φαρμακοκινητική....97 5.1.3 Φυσικοχημικές ιδιότητες.......97-98 5.1.4 Θεραπευτικές εφαρμογές....99 5.1.5 Ανεπιθύμητες ενέργειες......99 5.1.6 Αλληλεπιδράσεις Τοξικότητα... 100 5.1.7 Μέθοδοι προσδιορισμού...100-104 5.2 ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΒΡΩΜΕΞΙΝΗΣ...105 5.2.1 Μελέτη της επίδρασης του ph και της αναλογίας σε CH 3 OH της κινητής φάσης στη συμπεριφορά της βρωμεξίνης.....105-108 5.2.2 Χάραξη καμπύλης αναφοράς βρωμεξίνης....109-112 5.2.3 Προσδιορισμός ελάχιστης ανιχνεύσιμης ποσότητας βρωμεξίνης με μεταβολή της ευαισθησίας του ανιχνευτή....113-116 5.3 ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΡΩΜΕΞΙΝΗΣ ΚΑΙ ΣΥΝΤΗΡΗΤΙΚΩΝ ΠΟΥ ΣΥΝΥΠΑΡΧΟΥΝ ΣΤΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ.....117-118 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 - ΑΝΤΙΒΗΧΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΛΟΥΒΙΤΙΝΟΛΗ ΒΟΥΤΑΜΥΡΑΤΗ ΠΕΝΤΟΞΥΒΕΡΙΝΗ...119-180 6.1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΚΛΟΒΟΥΤΙΝΟΛΗΣ...119-123 6.1.1 Φαρμακολογική δράση....119 6.1.2 Φαρμακοκινητική...119 6.1.3 Φυσικοχημικές ιδιότητες...120

VI 6.1.4 Θεραπευτικές εφαρμογές.....121 6.1.5 Ανεπιθύμητες Ενέργειες Αλληλεπιδράσεις........121 6.1.6 Τοξικότητα Υπερδοσολογία.....121-122 6.1.7 Μέθοδοι προσδιορισμού....121-123 6.2 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΟΥΤΑΜΥΡΑΤΗΣ...124-127 6.2.1 ΙΦαρμακολογική δράση.......124 6.2.2 ΙΦυσικοχημικές ιδιότητες.......124-125 6.2.3 ΙΘεραπευτικές εφαρμογές.......126 6.2.4 ΙΑνεπιθύμητες Ενέργειες Αλληλεπιδράσεις....126 6.2.5 ΙΤοξικότητα Υπερδοσολογία.......126-127 6.2.6 ΙΜέθοδοι προσδιορισμού........127 6.3 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΠΕΝΤΟΞΥΒΕΡΙΝΗΣ....128-132 6.3.1 Φαρμακολογική δράση......128 6.3.2 Φυσικοχημικές ιδιότητες....128-129 6.3.3 Θεραπευτικές εφαρμογές....129 6.3.4 Ανεπιθύμητες ενέργειες...129-130 6.3.5 Αντενδείξεις Αλληλεπιδράσεις......130 6.3.6 Τοξικότητα Υπερδοσολογία.....131 6.3.7 Μέθοδοι προσδιορισμού.....131-132 6.4 ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΑΝΤΙΒΗΧΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΒΟΥΤΑΜΥΡΑΤΗΣ ΚΛΟΒΟΥΤΙΝΟΛΗΣ ΠΕΝΤΟΞΥΒΕΡΙΝΗΣ...133-136 6.4.1 Α Μελέτη της επίδρασης της συγκέντρωσης τών αλάτων της υδατικής κινητής φάσης και του ph στα αντιβηχικά......137-148 6.5 ΠΟΣΟΤΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΑΝΤΙΒΗΧΙΚΩΝ.......149-168 6.5.1 Χάραξη καμπύλης αναφοράς κλοβουτινόλης........149-156 6.5.2 Χάραξη καμπύλης αναφοράς βουταμυράτης........157-162 6.5.3ΑΧάραξη καμπύλης αναφοράς πεντοξυβερίνης.....163-168 6.6 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΙ ΚΛΟΒΟΥΤΙΝΟΛΗΣ ΑΠΟ ΟΡΙΣΜΕΝΑ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΦΑΡΜΑΚΑ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ.....169-180 6.6.1 Γενικά για τα αντιφλεγμονώδη.......169-171 6.6.2 Καμπύλες αναφοράς κλοβουτινόλης - αντιφλεγμονωδών φαρμάκων....172-180

VII ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΑΠΟΧΡΕΜΠΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΑΝΤΙΒΗΧΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΤΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΥΓΡΑ ΜΕ ΥΧΥΑ....181-208 7.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ.....181-185 7.2 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ.....186-187 7.3 ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΥΧΥΑ...188-189 7.4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ......190-203 7.5 ΑΚΡΙΒΕΙΑ ΚΑΙ ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ ΤΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΥΓΡΟΥ-ΥΓΡΟΥ......204-208 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ..209-211 ΠΕΡΙΛΗΨΗ..212-216 SUMMARY.. 217-220 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.....221-234

1 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 1.1 ΓΕΝΙΚΑ Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (ΥΧΥΑ) 1,2 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) είναι μια διαχωριστική τεχνική με πολλαπλές εφαρμογές τα τελευταία χρόνια, καθώς θεωρείται η πλέον κατάλληλη για τον ακριβή και επαναλήψιμο προσδιορισμό ενός μεγάλου αριθμού οργανικών και ανόργανων χημικών ενώσεων στις οποίες συμπεριλαμβάνονται πολλές φαρμακευτικές ουσίες. 3 Η τεχνική της ΥΧΥΑ αποτελεί εξέλιξη της κλασικής χρωματογραφίας ανοιχτής στήλης και η ανάπτυξή της οφείλεται στη βελτίωση της τεχνολογίας. Συγκεκριμένα κατασκευάστηκαν στήλες ανθεκτικές στις μεγάλες πιέσεις, ομοιόμορφης κατανομής της στατικής φάσης και αναπτύχθηκαν διάφοροι τύποι ανιχνευτών όπως ανιχνευτές υπεριώδους ορατού, αγωγιμομετρικοί και φθορισμομετρικοί, δείκτη διάθλασης κ.λ.π. Καθώς οι εφαρμογές της χρωματογραφίας όλο και διευρύνονται, οι απαιτήσεις για βελτιώσεις στην οργανολογία αυξάνονται. Έτσι για παράδειγμα οι ωστικές αντλίες υψηλής πίεσης παρέχουν σταθερή, ακριβή και επαναλήψιμη ροή κινητής φάσης. Επιπλέον και τα υλικά πλήρωσης των στηλών βελτιώθηκαν με την ανάπτυξη της χημικής τεχνολογίας κι έγιναν πιο αποτελεσματικά για τους διάφορους διαχωρισμούς. Συγκριτικά με την κλασική χρωματογραφία ανοιχτής στήλης διαφέρει γιατί στην ΥΧΥΑ χρησιμοποιούνται υλικά πλήρωσης με τεμαχίδια μικρού

2 μεγέθους και κατά συνέπεια εφαρμόζονται μεγάλες πιέσεις. Υπερτερεί γιατί με ΥΧΥΑ επιτυγχάνονται ταχύτεροι και καλύτερης απόδοσης διαχωρισμοί μιγμάτων. 4 Η ΥΧΥΑ ανήκει στη χρωματογραφία στήλης που βεβαίως ο διαχωρισμός είναι αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης μιας στατικής και μιας κινητής φάσης. 5 Το δείγμα εφαρμόζεται στην κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια της κινητής φάσης τα συστατικά του μετακινούνται με τη μορφή ζωνών κατά μήκος της στήλης και τελικά εκλούονται διαδοχικά. Οι υπό ανάλυση ουσίες κατανέμονται ή προσροφώνται μεταξύ της στατικής και κινητής φάσης κι αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες κατά μήκος της στήλης. Στην ΥΧΥΑ συνήθως χρησιμοποιείται μίγμα διαλυτών ή και βαθμιαία μεταβολή της σύστασης της κινητής φάσης. Ο χρόνος ανάλυσης είναι της τάξης των μερικών λεπτών ενώ η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα είναι πολύ καλές. 6 Γενικά η ΥΧΥΑ είναι μια ευαίσθητη χρωματογραφική τεχνική που παρέχει αποδεκτά αποτελέσματα 7 κυρίως στην Ποσοτική Ανάλυση και παρουσιάζει σαφή και ευκρινή πλεονεκτήματα συγκριτικά με τις υπόλοιπες χρωματογραφικές τεχνικές.

3 1.2 ΕΙΔΗ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Στην ΥΧΥΑ μπορούν να εφαρμοστούν όλα τα είδη των φυσικοχημικών μηχανισμών που λαμβάνουν χώρα στους χρωματογραφικούς διαχωρισμούς, 8 με την κατάλληλη χρήση υλικού πλήρωσης της στήλης δηλαδή της στατικής φάσης και του διαλύτη έκλουσης της λεγόμενης κινητής φάσης. Έτσι λοιπόν με βάση το υλικό πλήρωσης της στήλης και κατά συνέπεια το μηχανισμό διαχωρισμού των υπό ανάλυση ουσιών (φαρμάκων), 9 η ΥΧΥΑ διακρίνεται σε : i) Χρωματογραφία Προσρόφησης 10 : είναι η παλαιότερη χρωματογραφική τεχνική στην οποία τα συστατικά του μίγματος αλληλεπιδρούν (προσροφούνται) στην επιφάνεια ή σε ορισμένες θέσεις της επιφάνειας στερεής, συνήθως, στατικής φάσης. Η ισορροπία που αποκαθίσταται μεταξύ των προσροφημένων σωματιδίων και των σωματιδίων στην κινητή φάση, η οποία μπορεί να είναι υγρή ή αέρια, πετυχαίνει το διαχωρισμό. Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης, διπόλου-διπόλου, δυνάμεις London, ή συνδυασμός των δυνάμεων αυτών. Κατατάσσεται στη χρωματογραφία κανονικής φάσης όπου η στατική φάση (διοξείδιο του πυριτίου SiO 2 ή αλουμίνα Al 2 O 3 ) είναι πολικότερη από την κινητή φάση που αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο κ.α. ii) Χρωματογραφία Κατανομής 11 : εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων μη ιονικών ενώσεων. Η υγρή στατική φάση σχηματίζει λεπτό υμένιο στην επιφάνεια στερεού υποστρώματος. Ο διαχωρισμός βασίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ της υγρής κινητής και της

4 υγρής στατικής φάσης. Κατατάσσεται στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης όπου η στατική φάση που είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) συζευγμένο με ομοιοπολικό δεσμό με αλκύλια, φαινύλια, αμινοομάδες, διόλες κ.α ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μίγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό. Τα υλικά της συζευγμένης φάσης πλεονεκτούν ως προς τη σταθερότητα αλλά και τη συμβατότητα με μεγάλη ποικιλία εκλουστικών συστημάτων. Είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική ΥΧΥΑ και χρησιμοποιείται στο 80% περίπου των αναλυτικών εφαρμογών. iii) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής 12 : ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Έτσι στην περίπτωση της κατιοανταλλαγής λαμβάνει χώρα η ισορροπία : RSO 3 - X + + Y + RSO 3 - Y + + X + όπου RSO - 3 X + είναι η δραστική ομάδα της στατικής φάσης και Y + το αναλυόμενο κατιόν. Ανάλογη ισορροπία ισχύει και στην περίπτωση της ανιοντοανταλλαγής. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το ph, o τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία.

5 Ως υλικά πλήρωσης χρησιμοποιούνται διάφορες ρητίνες που αποτελούν συμπολυμερή στυρενίου διβινυλοβενζολίου, στα οποία έχουν εισαχθεί σουλφονικές ή καρβοξυλικές ομάδες, τριτοταγείς ή τεταρτοταγείς αμίνες. iv) Χρωματογραφία Συγγένειας (Affinity Chromatography) 13 : για να επιτευχθεί διαχωρισμός οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες (ligand) οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι με ομοιοπολικούς δεσμούς στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Για παράδειγμα ο υποκαταστάτης μπορεί να είναι ένα είδος αντισώματος σε μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Κατά τη διέλευση μέσα από τη στήλη μίγματος μεγάλου αριθμού πρωτεïνών μόνο μία πρωτεΐνη αντιδρά με το συγκεκριμένο αντίσωμα. Μετά την έκπλυση των υπολοίπων συστατικών από τη στήλη η επιθυμητή πρωτεΐνη αποδεσμεύεται από το αντίσωμα με μεταβολή της τιμής ph ή της ιονικής ισχύος. Αποτελεί την πιο σύγχρονη και πιο εκλεκτική χρωματογραφική τεχνική. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωματογραφία Εναντιομερών με την οποία διαχωρίζονται εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία (Chiral Chromatography). 14 Για μερικά φάρμακα που παρουσιάζουν χειρομορφία, η επιθυμητή φαρμακολογική δράση οφείλεται εξ ολοκλήρου στο ένα εναντιομερές ενώ ο αντίποδας είναι υπεύθυνος για σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Η Χρωματογραφία Εναντιομερών είναι αποτελεσματική μέθοδος για το διαχωρισμό των ρακεμικών μιγμάτων.

6 v) Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους (Size exclusion) ή Διαπερατότητας Πηκτής (Gel permeation Chromatography) : Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των υπό ανάλυση ενώσεων. Τα μεγαλύτερα μόρια προχωρούν με μεγαλύτερη ταχύτητα. Σ αντίθεση με τα άλλα είδη χρωματογραφίας, δεν υπάρχει αλληλεπίδραση ανάμεσα στη στατική φάση και τα διαχωριζόμενα συστατικά. Η υγρή ή η αέρια κινητή φάση διαπερνά μέσα από πορώδη πηκτή. Το μέγεθος των πόρων είναι μικρό και αποκλείονται τα μεγάλα μόρια του προσδιοριζόμενου συστατικού που προχωρούν χωρίς να εισέλθουν στην πηκτή ενώ τα μικρά μόρια εξέρχονται από τη στήλη σε μεγαλύτερο χρόνο. Η Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους βρίσκει εφαρμογές στους προσδιορισμούς και το χαρακτηρισμό των πολυμερών.

7 Σχήμα 1.1 : Κυριότερα είδη Χρωματογραφίας 13 με βάση το μηχανισμό διαχωρισμού α) Χρωματογραφία Προσρόφησης β) Χρωματογραφία Κατανομής γ) Χρωματογραφία Ιοντοανταλλαγής δ) Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγέθους και ε) Χρωματογραφία Συγγένειας

8 1.3 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Ένα σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης περιλαμβάνει : 15,16 i) Αντλία 17 ii) iii) Μονάδα εισαγωγής του δείγματος στη στήλη Χρωματογραφική στήλη iv) Ανιχνευτή 18 v) Σύστημα συλλογής και καταγραφής των αποτελεσμάτων vi) Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών Σχήμα 1.2 : Σχηματική παράσταση συσκευής Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης

9 1.3.1 Αντλίες Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης Ο ρόλος των αντλιών είναι η άντληση της κινητής φάσης και η ώθησή της στη στήλη. Πρέπει να είναι ικανές να λαμβάνουν ακριβή όγκο διαλύτη, χωρίς παλμούς και με επαναλαμβανόμενη σταθερή ταχύτητα ροής και πίεση. Οι ταχύτητες ροής που μπορούν να επιτευχθούν χρησιμοποιώντας τέτοιου είδους αντλίες είναι 0,01 10 ml/min ενώ μπορούν να λειτουργήσουν σε πιέσεις 5-40 MPα. Οι αντλίες ΥΧΥΑ είναι δύο τύπων : i) Αντλίες σταθερής ροής ii) Αντλίες σταθερής πίεσης Τα σημαντικότερα κριτήρια για την επιλογή της κατάλληλης αντλίας είναι να είναι κατασκευασμένη από αδρανές υλικό ως προς όλα τα είδη των διαλυτών που θα χρησιμοποιηθούν και να μπορεί να παρέχει σταθερή ροή με ακρίβεια και χωρίς διακυμάνσεις, ώστε να μη συνεισφέρει στο θόρυβο του ανιχνευτή. Είναι επίσης σημαντικό η κεφαλή της αντλίας να έχει μικρό όγκο για να διευκολύνονται οι ταχύτατες μεταβολές του εκλουστικού όπως και να επιτυγχάνονται παροχές σε υψηλές πιέσεις. i) Αντλίες σταθερής ροής Διακρίνονται σε α) αντλίες παλινδρόμησης με ένα, δύο ή περισσότερα πιστόνια. Η χρήση περισσότερων πιστονιών εξασφαλίζει ελάττωση παλμών και σταθερή ταχύτητα ροής. Τα δύο ή τρία πιστόνια κινούνται με διαφορά φάσης 180 ή 120 αντίστοιχα ώστε όταν το ένα αντλεί το άλλο γεμίζει. β) αντλίες τύπου σύριγγας οι οποίες παρέχουν σταθερή ροή χωρίς παλμούς και μεγάλο εύρος πιέσεων αλλά το μειονέκτημά τους είναι η περιορισμένη

10 χωρητικότητα του διαλύτη, η μικρή ταχύτητα ροής και το μεγάλο κόστος και γ) αντλίες διαφράγματος στις οποίες η προώθηση της κινητής φάσης γίνεται μέσω διαφράγματος. Σχήμα 1.3 : Είδη αντλιών 15 σταθερής ροής α) αντλία παλινδρόμησης β) αντλία τύπου σύριγγα γ) αντλία διαφράγματος

11 Βασικό πλεονέκτημα των αντλιών σταθερής ροής είναι ότι εξασφαλίζουν επαναλήψιμο όγκο έκλουσης και σταθερό εμβαδόν χρωματογραφικής κορυφής, ανεξάρτητα από τις μεταβολές στο ιξώδες της κινητής φάσης ή από τυχόν απόφραξη της αναλυτικής στήλης. ii) Αντλίες σταθερής πίεσης Το πλεονέκτημα των αντλιών αυτών είναι η απλότητα στην κατασκευή και η απουσία παλμών που έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του θορύβου της βασικής γραμμής στο χρωματογράφημα. Επιπλέον έχουν χαμηλό κόστος και χαρακτηρίζονται από ευκολία στη χρήση και στη συντήρηση. Ωστόσο παρουσιάζουν και προβλήματα κυρίως στη διακύμανση της ταχύτητας ροής που οφείλεται είτε σε μεταβολές στο ιξώδες και στη θερμοκρασία είτε σε μεταβολές της σύστασης της κινητής φάσης. Οι μεταβολές της ταχύτητας ροής έχουν αρνητική επίδραση στον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισμό των υπό ανάλυση φαρμάκων εξαιτίας των διακυμάνσεων που παρατηρούνται στο εμβαδόν ή στο ύψος των κορυφών και στο χρόνο κατακράτησης αντίστοιχα. 19 Σχήμα 1.4 : Αντλία 15 σταθερής πίεσης

12 1.3.2 Μονάδα εισαγωγής δείγματος στη στήλη Η μονάδα εισαγωγής του δείγματος παρεμβάλλεται μεταξύ της αντλίας και της χρωματογραφικής στήλης και πρέπει να εξασφαλίζει την εισαγωγή του χωρίς αραίωση ενώ ταυτόχρονα ο διαχωρισμός να επιτυγχάνεται χωρίς διάχυση. 20 Η εισαγωγή του δείγματος μπορεί να επιτευχθεί : α) με μικροσύριγγα β) με ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος και γ) με αυτόματο δειγματολήπτη. Η μικροσύριγγα παρουσιάζει ορισμένα μειονεκτήματα γι αυτό χρησιμοποιείται ελάχιστα. Είναι δυνατόν να παρατηρηθεί αστάθεια στη βασική γραμμή γιατί καθώς εισάγεται το δείγμα διακόπτεται η ροή του εκλουστικού καθώς επίσης και απόφραξη της βελόνας από μικρά σωματίδια. Η ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος 21 είναι μια περιστρεφόμενη βαλβίδα υψηλής πίεσης με βρόγχο δείγματος. Αποτελείται από ένα ακίνητο χαλύβδινο κύλινδρο με 6 διαύλους από τους οποίους ο ένας οδηγεί στη στήλη. Μέσα στο χαλύβδινο κύλινδρο υπάρχει ένας κινητός κύλινδρος από Teflon, ο οποίος διαθέτει τρεις αύλακες ο καθένας από τους οποίους συνδέει ένα ζευγάρι διαύλων. Στη θέση «φόρτωσης» η κινητή φάση προωθείται προς τη στήλη, ενώ με τη βοήθεια σύριγγας πληρώνεται ο βρόχος δείγματος με το προς ανάλυση διάλυμα του δείγματος. Ακολούθως στρέφεται ο δακτύλιος του Teflon κατά 30, «θέση εισαγωγής», οπότε η κινητή φάση παρασύρει ποσοτικά τον όγκο του δείγματος και τον προωθεί προς τη στήλη (Σχήμα 1.5). Ο όγκος δείγματος που εισάγεται κάθε φορά είναι σταθερός, σε πιέσεις

μέχρι και 41 MPa κι αυτό στην πράξη συμβάλλει σημαντικά στην ποιότητα των χρωματογραφικών διαχωρισμών. 13 Σχήμα 1.5 : Σύστημα εισαγωγής 21 δείγματος α) θέση «φόρτωσης» β) θέση εισαγωγής Οι αυτόματοι δειγματολήπτες αποτελούνται από ένα περιστρεφόμενο δίσκο όπου τοποθετούνται τα δείγματα, τα φιαλίδια με τα δείγματα, τη βαλβίδα εισαγωγής, το βρόχο δείγματος και τη σύριγγα. Όταν το δείγμα εισάγεται, ο δίσκος περιστρέφεται μέχρις ότου το προγραμματισμένο φιαλίδιο να βρεθεί κάτω από τη μικροσύριγγα. Η τελευταία λαμβάνει μια ορισμένη ποσότητα δείγματος που στη συνέχεια διοχετεύεται στο βρόχο της βαλβίδας.

14 1.3.3 Στήλες Υγρής Χρωματογραφίας Yψηλής Aπόδοσης Οι στήλες Υγρής Χρωματογραφίας ανάλογα με τις διαστάσεις τους και την χρησιμότητά τους κατατάσσονται στις α) Προστήλες β) Αναλυτικές στήλες γ) Ημιπαρασκευαστικές και δ) Παρασκευαστικές i) Η προστήλη έχει σκοπό την προστασία της αναλυτικής στήλης κατά την εφαρμογή ακατέργαστων ή μερικώς ακατέργαστων δειγμάτων όπως δειγμάτων με αιωρούμενα σωματίδια, έκδοχα, βιολογικά μόρια 22 όπως πρωτεΐνες, σάκχαρα ή δείγματα που περιέχουν γενικά ενώσεις που προσροφώνται πολύ ισχυρά από τις διάφορες αναλυτικές στήλες. Με την προστήλη παρατείνεται κυρίως η απόδοση και η ζωή της αναλυτικής στήλης. Είναι σαφώς μικρότερου μεγέθους (μήκους) από την αναλυτική στήλη για να μην παρατηρείται διεύρυνση των χρωματογραφικών κορυφών αλλά περιέχει το ίδιο υλικό πλήρωσης με την αναλυτική στήλη και το μέγεθος των τεμαχιδίων πλήρωσής της είναι πιο μικρό. Το τέλος της διάρκειας των στηλών αυτών γίνεται αντιληπτό από την αυξημένη πίεση που δημιουργείται και από την κακή επαναληψιμότητα των αναλύσεων που πραγματοποιούνται. ii) Η αναλυτική στήλη πρέπει να είναι υψηλής αξιοπιστίας για να δίνει ακριβή και επαναλαμβανόμενα αποτελέσματα. Οι στήλες αποτελούνται από

15 τον εξωτερικό σωλήνα που είναι κατασκευασμένος από μέταλλο ή ανοξείδωτο ατσάλι ή γυαλί ή πολυμερές. Στο εσωτερικό του σωλήνα υπάρχει το υλικό πλήρωσης, η λεγόμενη στατική φάση, και η επιλογή του γίνεται ανάλογα με τις ενώσεις που πρόκειται να διαχωριστούν. 23 Οι στήλες που χρησιμοποιούνται συνήθως έχουν μήκος 15-25 cm και εσωτερική διάμετρο 2,1-4,6 mm. Τα περισσότερα υλικά πλήρωσης έχουν ως βάση την πηκτή διοξειδίου του πυριτίου (silica gel) γιατί έχει χαμηλό κόστος και δεν καταστρέφεται εύκολα. Οι ενεργές θέσεις στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου (SiO 2 ) 24 είναι σιλανολικές (-Si-OH) ομάδες ελεύθερες ή ενωμένες ανά δύο με δεσμούς υδρογόνου και σιλοξανικές (-Si-O-Si-) ομάδες με μικρή δραστικότητα ώστε να μη θεωρούνται ιδιαίτερα σημαντικές. Σχήμα 1.6 : Η χημική δομή και διάταξη της πηκτής διοξειδίου του πυριτίου (SiO 2 )

16 Η επιλογή της στατικής φάσης που συνεπάγεται επιλογή κατάλληλης αναλυτικής στήλης είναι καθοριστική για την ανάπτυξη μιας αναλυτικής μεθόδου. Παράμετροι όπως το μέγεθος των σωματιδίων του υλικού πλήρωσης και οι διαστάσεις της στήλης όπως μήκος αυτής και διάμετρος, επηρεάζουν την εκλεκτικότητα και τον αριθμό των θεωρητικών πλακών. Γενικά υπάρχουν τρεις τύποι σωματιδίων 25 που χρησιμοποιούνται ως πληρωτικά υλικά στην ΥΧΥΑ : α) Τα μικροπορώδη σωματίδια, με διάμετρο 5-10 μm και σχετικά μικρούς μοριακούς πόρους, που επιτρέπουν τη δίοδο και επομένως την αλληλεπίδραση με τη στατική φάση μόνο μικρού μεγέθους συστατικών β) Τα μακροπορώδη σωματίδια τα οποία διαθέτουν εκτός από τους μικρούς μοριακούς πόρους και μεγάλους πόρους - διαμέτρου >60 μm -, που επιτρέπουν τη δίοδο τόσο των μικρών όσο και των μεγάλων συστατικών και γ) Υμενοειδή σωματίδια που διαθέτουν έναν αδρανή πυρήνα καλυμμένο από έναν υμένα υγρής στατικής φάσης. Τα υμενοειδή σωματίδια πετυχαίνουν υψηλή διαχωριστικότητα των υπό ανάλυση φαρμάκων. Η διάμετρος των πόρων του υλικού πλήρωσης είναι σημαντική παράμετρος αφού υλικά πλήρωσης διαφορετικών διαμέτρων παρέχουν διαφορετικής απόδοσης διαχωρισμούς. Υλικά πλήρωσης με μικρή διάμετρο σωματιδίων, 5-10 μm παρέχουν γρήγορους και καλύτερους διαχωρισμούς αλλά παρουσιάζεται πιθανόν απόφραξη της στήλης. Για το διαχωρισμό ενώσεων μοριακού βάρους 100-2000 dalton επιλέγονται υλικά πλήρωσης με διάμετρο πόρων 6 10 nm ενώ με μεγαλύτερη διάμετρο πόρων χρησιμοποιούνται στους διαχωρισμούς μακρομορίων.

17 Σχήμα 1.7 : Τύποι πληρωτικών υλικών 13 της ΥΧΥΑ α) μικροπορώδη β) μακροπορώδη και γ) υμενοειδή σωματίδια

18 Την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης καθορίζει και η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα και πιο συγκεκριμένα το μήκος της αλυσίδας, ο υδρόφοβος χαρακτήρας, η δημιουργία ή όχι διαφόρων δεσμών κ.λ.π.. Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια καθορίζει την πολικότητα της στήλης. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό των σιλανολικών υδροξυλίων τόσο πιο πολική είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων και το αντίθετο. Ο τύπος του υποστρώματος 26 διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ), αλουμίνα (Al 2 0 3 ), πυριτικό μαγνήσιο, γη διατόμων ή πολυμερές, που πρέπει να είναι χημικά σταθερό, παίζει καθοριστικό ρόλο στους διαχωρισμούς. Για παράδειγμα η όξινη αλουμίνα Al 2 Ο 3 (Η 2 Ο 10% w/v ph = 4) χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό κυρίως κετοστεροειδών και γλυκοσιδών. Το διοξείδιο του πυριτίου αν κι έχει μεγάλη επιφάνεια 500 m 2 /g η προσροφητική του ικανότητα είναι ελαττωμένη σε σχέση με το Al 2 Ο 3 και στερείται καταλυτικών ιδιοτήτων γι αυτό είναι κατάλληλο προσροφητικό μέσο για ουσίες που παρουσιάζουν ευαισθησία κατά τη χρωματογράφηση. Το πυριτικό μαγνήσιο δεν έχει ευρεία πρακτική εφαρμογή επειδή σε μερικές περιπτώσεις αντιδρά χημικά με τις υπό διαχωρισμό ουσίες. Τέλος στην επιφάνεια της γης διατόμων συγκρατούνται εύκολα νερό και άλλοι πολικοί διαλύτες γι αυτό κατά τους διαχωρισμούς μαζί με φαινόμενα προσρόφησης λαμβάνουν χώρα και φαινόμενα κατανομής. Ως υλικά πλήρωσης μπορεί να χρησιμοποιηθούν και πολυμερή. Έτσι σε υδατικά διαλύματα και τιμές ρη κάτω από 3 και πάνω από 10 που το διοξείδιο του πυριτίου παρουσιάζει χημική αστάθεια μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως υποστρώματα συνθετικά οργανικά πολυμερή π.χ. πολυστυρένιο.

19 Η υψηλή πίεση, που εμφανίζεται συνήθως με τις σχετικά μεγάλες ταχύτητες ροής, προκαλούν μερικές φορές μηχανική απομάκρυνση μέρους της υγρής στατικής φάσης από το υλικό στήριξης. Για την αντιμετώπιση του συγκεκριμένου προβλήματος αναπτύχθηκαν υλικά πλήρωσης με χημικά συνδεδεμένες στατικές φάσεις. Οι σιλανόλες όταν αντιδρούν με χλωροαλκυλο-σιλάνια σχηματίζουν ομοιοπολικούς δεσμούς, δεσμούς σιλυλαιθέρων, οι οποίοι συγκρατούν ισχυρά τις δεσμευμένες φάσεις στο υπόστρωμα. Στο ενεργό σιλάνιο π.χ. χλωροδιμεθυλαλκυλοσιλάνιο, είναι παρούσα μόνο μία ομάδα, η οποία μπορεί να αντικατασταθεί και η σύνδεση είναι δυνατή μόνο σε μία θέση της επιφάνειας του SiO 2. Έτσι δημιουργείται μία μόνο στιβάδα επικάλυψης εύκολα επαναλήψιμη. 27 Είναι δυνατόν όμως να είναι παρούσες δύο ή και τρεις ομάδες που μπορούν να αντικατασταθούν στο σιλάνιο όπως συμβαίνει στο τριχλωροαλκυλοσιλάνιο. Οι ομάδες αυτές (-Cl) παρουσία νερού, καθώς υδρολύονται, δίνουν ελεύθερες υδροξυλομάδες ικανές να αντιδράσουν με ένα σιλάνιο. Η διαδικασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα μία μη επαναλήψιμη επικάλυψη της επιφάνειας, αφού διαφορετικά σιλάνια είναι δυνατόν να ακινητοποιηθούν στην επιφάνεια ή και σε άλλα σιλάνια σε κάποια απόσταση σπό την επιφάνεια.

20 Η επιλογή του αλκυλίου R- καθορίζει την αλληλεπίδραση που λαμβάνει χώρα στην επιφάνεια κατά το διαχωρισμό. Γενικά έχουν δοκιμαστεί και προταθεί διάφορες αλκυλομάδες αλλά πολύ λίγες είναι εμπορικά διαθέσιμες. Τα πιο γνωστά είναι τα υλικά αντίστροφης φάσης, στα οποία η ομάδα R- είναι συνήθως μία αλυσίδα κορεσμένου υδρογονάνθρακα με 8 ή 18 άτομα άνθρακα (C 8 ή C 18 ). Πολικές φάσεις Μη πολικές φάσεις R = (CH 2 ) 3 NH 2 Αμινο- R = (CH 2 ) 17 CH 3 Οκταδεκυλ- R = (CH 2 ) 3 CN Κυανο- R = (CH 2 ) 7 CH 3 Όκτυλ- R = (CH 2 ) 2 Ο CH 2 CH(OH) CH 2 OH Διολ- R = (CH 2 ) 3 C 6 H 5 Φαινυλ- Η πυκνότητα των σιλανολών στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου είναι πολύ μεγαλύτερη από τη μέγιστη δυνατή συγκέντρωση των αλκυλομάδων σε μία δεσμευμένη φάση, λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης. Για το λόγο αυτό μετά την τροποποίηση της στατικής φάσης οι ελαφρώς όξινες σιλανολικές ομάδες που δεν αντέδρασαν, αλληλεπιδρούν με τα πολικά συστατικά μέσω ισχυρών δεσμών υδρογόνου και διπόλου. Η ετερογενής επιφάνεια που σχηματίζεται οδηγεί σε μικτούς μηχανισμούς διαχωρισμού των ουσιών με συνέπεια τη διεύρυνση των κορυφών και ελάττωση της διαχωριστικής ικανότητας, ιδιαίτερα στην περίπτωση των βασικών ενώσεων. Μπορεί όμως σε ορισμένες περιπτώσεις (η ετερογενής επιφάνεια) να συνεισφέρει στην εκλεκτικότητα της στατικής φάσης. Η αντιμετώπιση των φαινομένων δευτερογενούς συγκράτησης μπορεί να γίνει με δύο τρόπους είτε

21 α) με δέσμευση των σιλανολικών υδροξυλίων με ειδικό αντιδραστήριο είτε β) με την παρουσία ιονικού τροποποιητή στην κινητή φάση που έχει ως αποτέλεσμα την κάλυψη των ελευθέρων υδροξυλίων από τα αντίθετα φορτισμένα ιόντα του τροποποιητή και γ) δέσμευση των ελευθέρων ΟΗ επιτυγχάνεται και με προσθήκη στην κινητή φάση οργανικής βάσης π.χ. τριαιθυλαμίνη ή εξανολαμίνη. iii) Ημιπαρασκευαστικές στήλες : έχουν εσωτερική διάμετρο 10 25 mm, μήκος 125-250 mm και χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό ενώσεων ενός μίγματος σε ποσότητα της τάξης των 1-25 mg. iv) Παρασκευαστικές στήλες : είναι μεγάλων διαστάσεων, έχουν εσωτερική διάμετρο 20 100 mm, μήκος 250-500 mm και χρησιμοποιούνται για το διαχωρισμό και την παραλαβή των ενώσεων ενός μίγματος σε ποσότητα της τάξης των 5-500 mg.