ΕΙΔΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Δρ. Aντώνιος Στυλιανάκης Ιατρός Βιοπαθολόγος, Επιμ. Α ΕΣΥ Μικροβιολογικό Τμήμα & Εργαστήριο Λοιμώξεων από Εμφυτεύματα Γ.Ν.Α. ΚΑΤ
Ορισμοί Ι Καλλιέργειες Ενοφθαλμισμός του κλινικού δείγματος στα κατάλληλα θρεπτικά υλικά Απομόνωση των μικροοργανισμών Ταυτοποίηση & αξιολόγηση ποια είναι παθογόνα Έλεγχος ευαισθησίας
Ορισμοί ΙΙ Ειδικές καλλιέργειες Απομόνωση ιδιαίτερου παθογόνου Εκτέλεση για συγκεκριμένο σκοπό (π.χ. επιδημιολογική επιτήρηση, φορεία κλπ) Ιδιαίτερο-ξεχωριστό τρόπο εκτέλεσης ή/και ερμηνείας των αποτελεσμάτων της κ/ας
Κόπρανα Κ/α για ανίχνευση Clostridium dificille
Ιστική κ/α τοξίνης B του C. difficile Υλικό φιλτραρίσματος κοπράνων που αποτελείται από βακτηριακά κύτταρα που περιέχουν τοξίνη Β όταν συνκαλλιεργηθεί με την ευαίσθητη κυτταρική σειρά CHO-k1 σε πλάκα μικρoτιτλοποίησης προκαλεί κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις Σε παρουσία αντιτοξίνης του C. difficile δεν παρατηρούνται κυτταροπαθολογικές αλλοιώσεις (εξουδετερωτική δοκιμασία) Clinical Microbiology Procedures Handbook 2012
Ανίχνευση αντιγόνου & τοξινών του C. difficile με ανοσοχρωματογραφία
Κ/α κοπράνων για έλεγχο φορείας ασθενών ΜΕΘ - επιδημιολογικό έλεγχο σε ΜΕΘ Vancomycin Resistant Enterococci (VRE) Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Aπομόνωση και ταυτοποίηση του παθογόνου Προσδιορισμό του φαινοτύπου αντοχής Προσδιορισμός του/ων μηχανισμού/ων αντοχής
VRE για έλεγχο φορείας ασθενών ΜΕΘ E. faecalis, E. faecium VRE: vana, vanb, vanc, vand και vane γενότυποι E. faecalis: vanb και vand E. faecium: vana και vand Vancomycin MICs > 32mg/L
Καλλιέργεια κοπράνων για έλεγχο φορείας VRE BEA (bile-esculin-azide) άγαρ με βανκομυκίνη 6-10 mg/l BEA (bile-esculin-azide) ζωμό με βανκομυκίνη Ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους
Αξιολόγηση θετικής κ/ας κοπράνων για VRE Η παρουσία VRE σε δείγμα κοπράνων είναι ένδειξη φορείας ή αποικισμού με τον μικροοργανισμό και όχι ένδειξη λοίμωξης επειδή οι εντερόκοκκοι αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου Επιβεβαίωση με μέτρηση της MIC της βανκομυκίνης με μέθοδο αναφοράς εάν ο ασθενής δεν είχε προηγουμένως βρεθεί θετικός για VRE Τα VRE στελέχη E. faecium και E. faecalis ελέγχονται με μοριακές τεχνικές για την ύπαρξη των γονιδίων αντοχής (vana και vanb)
Περιορισμοί της μεθόδου ελέγχου φορείας για VRE Μικροοργανισμοί εκτός των εντεροκόκκων (Pediococcus, Leuconostoc,Weissella) μπορούν να αναπτυχθούν στα θρεπτικά υλικά και να δώσουν θετική την αντίδραση στην εσκουλίνη Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα μπορεί να ληφθούν εξαιτίας μικρού μικροβιακού φορτίου VRE ή προηγούμενης χορήγησης αντιμικροβιακής αγωγής
Καλλιέργεια κοπράνων για έλεγχο φορείας πολυανθεκτικών Gram (-) βακτηρίων Για την απομόνωση K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa γίνεται κ/α σε τρυβλία με ΜacConkey άγαρ (ή ειδικό χρωμογόνο άγαρ) Το δείγμα ενοφθαλμίζεται με την τεχνική των διαδοχικών αραιώσεων με κρίκο και στο τέλος της δεύτερης αραίωσης τοποθετείται δίσκος μεροπενέμης.
Αξιολόγηση καλλιέργειας για φορεία Οι αποικίες που αναπτύσσονται μέσα στη διάμετρο ευαισθησίας του δίσκου μεροπενέμης: <22 mm για την K. pneumoniae <16 mm για το A. baumannii και <16 mm για την P. aeruginosa, είναι ανθεκτικές στη μεροπενέμη και το πολυανθεκτικό βακτηρίδιο πρέπει να ελεγχθεί για μηχανισμoύς αντοχής στις καρβαπενέμες
Έλεγχος μηχανισμών αντοχής στις καρβαπενέμες Τα στελέχη Pseudomonas aeruginosa ελέγχονται: με δοκιμασία συνέργειας δίσκου καρβαπενέμης με δίσκο που περιέχει EDTA για την παραγωγή μεταλλο-β-λακταμάσης Τα στελέχη Klebsiella pneumoniae ελέγχονται για τον έλεγχο παραγωγής καρβαπενεμάσης KPC: α) modified Hodge test (MHT) β) με τη δοκιμασία διπλού συνδυασμού των δίσκων καρβαπενεμών:. με τον αναστολέα boronic acid και με EDTA για τον έλεγχο παραγωγής VIM μεταλλο-β-λακταμάσης
modified Hodge test (MHT)
Representative results of the three combined-disc tests using discs of meropenem (MEM) alone and with EDTA, phenylboronic acid, or EDTA plus phenylboronic acid for a KPC/VIM/ESBLpossessing isolate (a), a KPC/ESBL-possessing isolate (b), a VIM-possessing isolate (c) and an AmpC/ESBL-possessing isolate (d). Tsakris A et al. J. Antimicrob. Chemother. 2010;65:1664-1671 The Author 2010. Published by Oxford University Press on behalf of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. All rights reserved. For Permissions, please e-mail: journals.permissions@oxfordjournals.org
Τελικός έλεγχος φορείας Σε ασθενείς με λοίμωξη ή αποικισμό από πολυανθεκτικούς μικροοργανισμούς συστήνεται εκτός του αρχικού έλεγχου αποικισμού, έλεγχος της φορείας σε δείγματα από το ορθό ή κοπράνων και κατά την έξοδό τους από το νοσοκομείο
ENY ύποπτο για βακτηριακή μηνιγγίτιδα Επείγον δείγμα Απαιτεί ταχείς χειρισμούς για την ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα
ENY Gram χρώση: διακριτική ικανότητα > 1000 cfu/ml Κυτταροφυγοκέντρηση (cytospin): αυξάνει την ευαισθησία της χρώσης > 100 φορές vs της μη ή συμβατικής φυγοκέντρησης Καλλιέργεια: δεν απαιτεί εμπλουτισμό με φυγοκέντρηση
ENY Εμφυτεύματα (π.χ. metal cranial plates), παροχετεύσεις (shunt drains): αναερόβια Clinical Microbiology Procedures Handbook 2012
Θρεπτικά υλικά για κ/α του ENY Αερόβια κ/α: αιματούχο άγαρ (ΒAP) Μικροαερόφιλη κ/α: σοκολατόχρωμο άγαρ (CHOC) Ενοφθαλισμός σε ζωμό: ΒΗΙ, TSB (απαιτητικά αερόβια και αναερόβια μικρόβια) ΤΗΙΟ: ενισχύει την ανάπτυξη αναεροβίων αλλά όχι όλων των κοινών παθογόνων στο ΕΝΥ Μύκητες του γένους Candida: Sabouraud agar
Ερμηνεία αποτελεσμάτων 1. Γενικά η θετική κ/α δεικνύει βακτηριακή μηνιγγίτιδα και τον αιτιολογικό παράγοντα 2. Το συχνότερο παθογόνο βακτηριακής μηνιγγίτιδας της κοινότητας είναι ο S. pneumoniae 3. Απουσία ή μικρός αριθμός λευκοκυττάρων δεν αποκλείει τη λοίμωξη (ειδικά τη λιστερίωση) 4. Απομόνωση εντεροκόκκων από κ/α ΕΝΥ αιτία σοβαρού προβληματισμού (ένδειξη πιθανής στρογγυλοειδίασης)
Περιορισμοί της κ/ας ΕΝΥ Ι Εάν το δείγμα ΕΝΥ δεν μεταφερθεί στο Εργαστήριο άμεσα, πρέπει να φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου Όχι > 4 ώρες η εκτέλεση της καλλιέργειας του δείγματος εξαιτίας χαμηλής επιβίωσης μικροργανισμών που προκαλούν μηνιγγίτιδα (H. influenzae & N. meningitidis) Ψευδώς θετικά αποτελέσματα: επιμόλυνση του δείγματος ή της καλλιέργειας από τη φυσιολογική χλωρίδα του δέρματος Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα: μικρό μικροβιακό φορτίο, προηγούμενη λήψη αντιβιοτικών, απαιτητικοί λοιμογόνοι μικροοργανισμοί
Περιορισμοί της κ/ας ΕΝΥ ΙΙ Ανίχνευση παθογόνων του ENY μη καλλιεργητικά Ορολογικές μέθοδοι: Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum Μοριακές τεχνικές: Μycobacterium tuberculosis
Διάγνωση των λοιμώξεων από εμφυτεύματα με τη νέα διαγνωστική μέθοδο των υπερήχων
N Engl J Med. 2007 Aug 16;357(7):705-6. Ultrasound--now also for microbiologists? Waldvogel FA. Comment on Sonication of removed hip and knee prostheses for diagnosis of infection. [N Engl J Med. 2007]
Η βιονική κοινωνία της εποχής μας
ανά 10,000 άτομα Συνεχής αύξηση του αριθμού των εμφυτευμάτων Υψηλότερος χρόνος παραμονής των προθέσεων χάριν και του υψηλότερου προσδόκιμου επιβίωσης 80 Ολικές αρθροπλαστικές γόνατος 70 60 50 40 Γυναίκες Άνδρες 30 20 10 0 National Center for Health Statistics. http://www.cdc.gov
Κίνδυνος πρόκλησης λοίμωξης από εμφυτεύματα Device No. inserted in the US per year Rate of infection, % Fracture fixation devices 2,000,000 5 10 Dental implants 1,000,000 5 10 Joint prostheses 600,000 1 3 Vascular grafts 450,000 1 5 Cardiac pacemakers 300,000 1 7 Mammary implants 130,000 1 2 Mechanical heart valves 85,000 1 3 Darouiche RO. Clin Infect Dis 2001;33:1567 1572
Ο ρόλος της βιομεμβράνης Planktonic mode Biofilm mode
Ποιος ο ρόλος της βιομεμβράνης? Βασικός μηχανισμός επιβίωσης των μικροβίων σε αφιλόξενα και εχθρικά περιβάλλοντα Δομικές και λειτουργικές ομοιότητες με πολυκυττάριους οργανισμούς (κυκλοφορία, κυτταροκυτταρική επικοινωνία) Costerton JW et al. Science 1999;284:1318 1322
Χρονική ανάπτυξη της βιομεμβράνης 1 min 3 h 12 h 1 ημέρα 3 ημέρες Illustration by Keith Kasnot, Scientific American 2001
Βασικές αρχές στη χρήση των υπερήχων
Υπέρηχοι Μηχανικές δονήσεις >20 khz Μικροφυσαλίδες (cavitation)
Ασυμμετρική σπηλαίωση (Asymmetric cavitation) Anna de Regt. Bacterial Biofilms: Evaluating Destruction Swarthmore College, Department of Engineering
Επίδραση των υψηλής συχνότητας (>100 KHZ) & έντασης υπερήχων στους μικροοργανισμούς Η υψηλή ακουστική ένταση των υπερήχων σκοτώνει τους μικροοργανισμούς, ευκολότερα τα Gram (-) βακτήρια.
Επίδραση των χαμηλής συχνότητας & έντασης υπερήχων στη βιωσιμότητα κλινικά σημαντικών μικροβίων Monsen et al. In vitro effect of ultrasound on bacteria and suggested protocol for sonication and diagnosis of prosthetic infections J Clin Microbiol. 2009 Aug;2496-2501.
Είδη εμφυτευμάτων που μπορούν να εφαρμοσθούν οι υπέρηχοι Εσωτερικές νευροχειρουργικές αναστομώσεις Εμφυτεύματα της Πλαστικής Χειρουργικής Καρδιολογικές ηλεκτροφυσιολογικές συσκευές (βηματοδότες, εμφυτευμένοι καρδιακοί απινιδωτές) Εμφυτεύματα τα οποία άσηπτα απομακρύνονται από το σώμα
Υλικά που μπορούν να ελεγχθούν με τη χρήση υπερήχων υπό περιορισμούς Υλικά προερχόμενα από μη στείρες περιοχές του σώματος: σπόγγοι συστημάτων αναρρόφησης υπό αρνητική πίεση αγγειακοί καθετήρες εξωτερικές παροχετεύσεις ΕΝΥ
Χρήση αεροστεγώς κλεισμένων αποστειρωμένων δοχείων μεταφοράς Trampuz et al. Sonication of explanted prosthetic components in bags for diagnosis of prosthetic joint infections is associated with risk of contamination. J Clin Microbiol. 2006 Feb;44(2):628-31.
Διατήρηση δείγματος για 3 ημέρες σε RT
Κάλυψη 85-90% του εμφυτεύματος με RINGER solution ή 0,9% NaCl
Εφαρμογή υπερήχων
ΝΕΟ ΔΕΙΓΜΑ ΥΓΡΟ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΕΝΟ ΜΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΤΗΣ ΒΙΟΜΕΜΒΡΑΝΗΣ (υγρό υπερήχησης)
Επώαση Blood agar: αερόβια 37 0 C για 5 ημέρες Anaerobic sheep blood agar: αναερόβια 37 0 C για 7 ημέρες Chocolate agar: 5% CO 2 37 0 C για 5 ημέρες Brucella agar: 5% CO 2 37 0 C για 10 ημέρες Thioglycolate broth: 37 0 C για 10 ημέρες (εάν καμία ανάπτυξη στα τρυβλία τότε α/α του THIO σε Blood & Brucella agar)
Έλεγχος καλλιεργειών Τα τρυβλία ελέγχονται καθημερινά για μικροβιακή ανάπτυξη. Εάν παρατηρηθεί ανάπτυξη, αναφέρεται ο αριθμός CFU κάθε διαφορετικής μορφολογίας. Ταυτοποίηση και έλεγχος ευαισθησίας
Πλεονεκτήματα της κ/ας εμπλουτισμένων υγρών με υπερήχους Δειγματισμός από την πηγή της λοίμωξης (επιφάνεια εμφυτεύματος) ανίχνευση μεγαλύτερου αριθμού ζώντων μικροοργανισμών σε υψηλότερη ανάπτυξη (>100 CFU) Ποσοτικοποίηση καλλιέργειας Ευκολότερη διάκριση μεταξύ επιμόλυνσης-λοίμωξης Γρήγορα αποτελέσματα Ανίχνευση ευκολότερα πολυμικροβιακών λοιμώξεων, πληθυσμών με ετερογένειας αντοχής Ευκολότερη απομόνωση σχετικά δύσκολα απομονωνώμενων μικροοργανισμών
Ετερογενείς πληθυσμοί S. aureus
S. epidermidis heterogenous resistant population detected by sonication fluid culture of an implant related infection
SeptiFast & υγρό υπερήχησης για διάγνωση προθετικών λοιμώξεων ANIXNEYEI ΔΕΝ ΑΝΙΧΝΕΥΕΙ P. acnes Corynobacterium spp Finegoldia magna Peptostreptococcus spp
Σας ευχαριστώ πολύ