ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΣΙ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το οστό αποτελεί ένα ιδανικό περιβάλλον για μετάσταση, καθώς η συνεχής και δυναμική ανάπλασή τον παρέχει μια γόνιμη βάση για την παλιννόστηση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Ο μεταβολισμός του οστού αποτελείται από το στάδιο της απορρόφησης (bone resorption), το στάδιο τον σχηματισμού (bone formation) και το στάδιο της ηρεμίας. Το 65-75% των γυναικών με καρκίνο τον μαστού εμφανίζουν οστικές μεταστάσεις, καθώς τα καρκινικά κύτταρα του μαστού εμφανίζουν αυξημένο οστεοτροπισμό. Τα καρκινικά κύτταρα τον μαστού όταν μεταναστεύουν στο οστό εκκρίνούν διάφορους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες, οι οποίοι μέσω των οστεοβλαστών, υπερενεργοποιούν τους οστεοκλάστες με αποτέλεσμα την διατάραξη της φυσιολογικής ομοιοστασίας του οστού. Η αυξημένη οστεολυτική δραστηριότητα έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων που βρίσκονται εγκλωβισμένοι στο οστό, οι οποίοι συμβάλλουν στην επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων στο περιβάλλον τον οστού. 'Ετσι εγκαθιδρύεται ένας `φαύλος κύκλος' μεταξύ την ενεργοποίησης των οστεοκλαστών και την ανάπτυξης του όγκου στο περιβάλλον τον οστού. Η οστική νόσος στον καρκίνο έχει σημαντικές κλινικές εκδηλώσεις που επηρεάζούν την ποιότητα ζωής του ασθενή. Αυτές περιλαμβάνουν πόνο στον σκελετό, εξασθένηση της κινητικότητας, υπερασβεστιαιμία, συχνά κατάγματα, συμπίεση των νευρικών ριζών και τον νωτιαίου μυελού, καθώς και διαταραχές αιμοποίησης. Για την αντιμετώπιση των εκδηλώσεων της οστικής νόσού και γενικότερα των ασθενειών με αυξημένη οστεοκλαστική δραστηριότητα έχει εγκριθεί από τον FDA η χορήγηση διφωσφονικών. Τα διφωσφονικά είναι συνθετικά ανάλογα του πυροφωσφορικού (PPi), όπου οι δύο φωσφονικές ομάδες ενώνονται μέσω φωσφοαιθερικού δεσμού με ένα κεντρικό άτομο άνθρακα (P C P) στο οποίο είναι ομοιοπολικά συνδεδεμένες δύο πλευρικές αλυσίδες. Χωρίζονται σε δύο κατηγορίες τα αμινο-διφωσφονικά και τα μη αμινο-διφωσφονικά με διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης. Το ζολενδρονικό ανήκει στην κατηγορία των αμινο-διφωσφονικών και δρα αναστέλλοντας την συνθάση του πυροφωσφορικού φαρνεσνλίου (FPP) στο μονοπάτι του μεβαλονικού. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της σύνθεσης των ισοπρενοϊδών λιπδίων FPP και πυροφωσφορικό γεραννλγερανύλιο (GGPP). Τα FPP και GGPP είναι απαραίτητα για την πρενυλίωση δηλαδή την λιπιδική τροποποίηση των μικρών GΤΡασων. Η πρενυλίωση είναι απαραίτητη για την
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ - ΠΕΡΙΛΗΨΗ «αγκυροβόληση» τους στην κυτταροπλασματική πλευρά τις κυτταρικής μεμβράνης και ως εκ τούτου στην λειτουργία των σηματοδοτικών αυτών πρωτεϊνών που είναι επίσης απαραίτητη για την λειτουργία των οστεοκλαστών. Αρχικός σκοπός της διατριβής ήταν να εξετάσει την επίδραση τον ζολενδρονικού σε βασικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων, όπως είναι ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός και η διήθηση σε γειτονικούς ιστούς. Για τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιήθηκαν δύο καρκινικές επιθηλιακές κυτταρικές σειρές από ανθρώπινο μαστό, με διαφορετική μεταστατική ικανότητα και διαφορετική έκφραση οιστρογονποδοχέων. Οι πειραματικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε Θρεπτικό υλικό παρουσία ορού, ώστε να υπάρχει διέγερση των κυττάρων από μίγμα αυξητικών παραγόντων που υπάρχει στον ορό, έδειξαν ότι το ζολενδρονικό ανέστειλε στατιστικώς σημαντικά των κυτταρικό πολλαπλασιασμό και των δύο κυτταρικών σειρών. Επίσης αξιοσημείωτο είναι ότι το ζολενδρονικό ανέστειλε σε σημαντικό βαθμό την διήθηση και των δύο καρκινικών σειρών είτε χρησιμοποιήθηκε ως χημειοτακτικό ορός είτε εθισμένο υλικό καλλιέργειας από ινοβλάστες μαστού. Για την περαιτέρω μελέτη της ανασταλτικής δράσης τον ζολενδρονικού στην διηθητική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων, μελετήθηκε η δράση του σε βασικές διεργασίες των καρκινικών κυττάρων που συμβάλλουν στην διηθητική τους ικανότητα, την ικανότητα προσκόλλησης τους στον ECM και την κινητικότητά τους. Η επώαση των καρκινικών κυττάρων με ζολενδρονικό είχε ως αποτέλεσμα την σημαντική αναστολή της ικανότητας προσκόλλησης τους σε όλα τα συστατικά τον ECM για την ΜDΑ-ΜΒ-231 σειρά, ενώ για την MCF-7 παρατηρήθηκε αναστολή της προσκόλλησης σε όλα τα συστατικά τον ECM με μόνη διαφορά ότι η αναστολή αυτή δεν ήταν στατιστικώς σημαντική για τα κολλαγόνα τύπου I και IV. Η μελέτη της κινητικότητας των καρκινικών κυττάρων μελετήθηκε με δύο τρόπους, έτσι ώστε να έχουμε μια πιο ξεκάθαρη εικόνα για την δράση τον ζολενδρονικού. Και από τις δύο πειραματικές τεχνικές παρατηρήθηκε ότι η κυτταρική κινητικότητα αναστέλλεται σημαντικά υπό την επίδραση τον ζολενδρονικού για τα MDΑ-ΜΒ-231 κύτταρα. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η ανασταλτική δράση του ζολενδρονικού στην κυτταρική κινητικότητα παρατηρήθηκε και στην συγκέντρωση των 3μΜ. Ο εξωκνττάριος χώρος δεν είναι ένα απλό νποστηρικτικό σύστημα μορίων τον συνδετικού ιστού, αλλά αποτελεί μια δομική μονάδα η οποία λαμβάνει μέρος σε
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ φυσιολογικές αλλά και παθολογικές διεργασίες. Η σημαντικότητα της δομής και λειτουργικότητας των μορίων τον εξωκυττάριου χώρου στις παθοφυσιολογικές διαδικασίες τον καθιστούν ως ένα από τα σημαντικότερα προς μελέτη πεδία. Είναι ευρέως γνωστό ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ καρκινικών κυττάρων και των συστατικών τον εξωκυττάριου χώρου, εκτός από την επαγωγή τον κυτταρικού πολλαπλασιασμού, είναι σημαντικές για την πρόοδο του καρκίνού, την αγγειογέννεση και τη μετάσταση. Με βάση τη σύγχρονη βιβλιογραφία, αλλά και την μακροχρόνια εμπειρία και το δημοσιευμένο έργο τον εργαστηρίου μας, είναι γνωστό ότι αλλαγές στην έκφραση τριών ο σημαντικών κατηγοριών μορίων του εξωκυττάριου χώρου, των PGs των MMPs και των ιντεγκρινών, μπορεί να έχουν σημαντικές συνέπειες στην ανάπτυξη και την πρόοδο τον καρκίνου του μαστού. Για το σκοπό αυτό έγινε εκτενής μελέτη στο επίπεδο της δράσης του ζολενδρονικού στις κατηγορίες αυτών των μορίων. Η χορήγηση τον ζολενδρονικού στα κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης, ενός σημαντικού για την οστική μετάσταση μορίου, της σννδεκάνης-1 τόσο σε γονιδιακό όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο και στις δύο καρκινικές σειρές. Επίσης ανέστειλε την γονιδιακή έκφραση της συνδεκάνης -2 στην MCF-7 και MDAΜΒ-231 παρατηρήθηκε μια τάση αναστολής της. Για την συνδεκάνη-4 δεν επηρέασε την γονιδιακή της έκφραση στην MDA-ΜΒ-231, ενώ στην MCF-7 την ανέστειλε. Ωστόσο σε πρωτεϊνικό επίπεδο αύξησε την έκφραση της και στις δύο καρκινικές σειρές, γεγονός που υποδεικνύει πως καταστέλλει τον μηχανισμό αποικοδόμησής της. Βάσει πρόσφατων μελετών η αύξηση της έκφρασης της συνδεκάνης-4 έχει ως ~.. αποτέλεσμα την καταστολή της κινητικότητας των κυττάρων, γεγονός που εξηγεί την παρατηρούμενη από το ζολενδρονικό μείωση στην κινητικότητα των κυττάρων. Η μελέτη της δράσης του ζολενδρονικού στην έκφραση των MMPs και των ΤΙΜΡs έδωσε σημαντικά στοιχεία για την παρατηρούμενη αναστολή της διηθητικής ικανότητας των καρκινικών κυττάρων, καθώς η έκφραση της των MMPs που μελετήθηκαν και στις δύο καρκινικές σειρές μειώθηκε σημαντικά, ενώ η έκφραση των TIMPs αυξήθηκε σημαντικά. Όσον αφορά τις ιντεγκρίνες, των οποίων ο ρόλος στην κυτταρική προσκόλληση είναι γνωστός, στα κύτταρα MDA-ΜΒ-231 το ζολενδρονικό προκάλεσε στατιστικά σημαντική αναστολή στην έκφραση των υπομονάδων α1, α4, α5, β1, β2, β6 των ιντεγκρινών, καθώς και στις ιντεγκρίνες ανβ3 και α5β1, προκάλεσε σχεδόν πλήρη αναστολή στην έκφραση των β3 και ανβ5, επαγωγή στις αν και β4 νπομονάδες και δεν επηρέασε την έκφραση των α2 και α3.
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ - ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντίστοιχα, στα ΜCF-7 το ζολενδρονικό προκάλεσε αναστολή στην έκφραση των νπομονάδων α2, α3, α5, αν, ανβ3, β1, β2, β3, β6 και των ιντεγκρινών ανβ5 και α5β1. Προκάλεσε επίσης επαγωγή στην υπομονάδα α1, ενώ δεν επηρέασε την έκφραση των νπομονάδων α4 και β4. Αξιοσημείωτη είναι η αναστολή της ανβ3, καθώς το ετεροδιμερές αυτό παίζει σημαντικό ρόλο στην μετάσταση των καρκινικών κυττάρων στο οστό. Συγκρίνοντας τα πειράματα της κυτταρικής προσκόλλησης και της έκφρασης των ιντεγκρινών παρατηρείται συμφωνία μεταξύ τους. Σημαντική επίσης για την αντικαρκινική και αντιμετασταστική δράση του ζολενδρονικού είναι η παρατηρούμενη αναστολή της έκκρισης του ΗΑ και της έκφρασης του υποδοχέα τον, τον CD44, καθώς το και τα δύο μόρια ξεχωριστά αλλά και ως σύμπλοκο διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόοδο τον καρκίνου και στην μετάσταση του στα οστά. Επόμενος σκοπός της διατριβής ήταν να μελετηθεί η επίδραση τον ζολενδρονικού εκεί που κυρίως δίνει μετάσταση ο καρκίνος του μαστού, δηλαδή στα οστά. Για το λόγο μελετήθηκε η δράση τον στην ενεργοποίηση των πρώιμων οστεοκλαστων σε υπόστρωμα οστού, χρησιμοποιώντας ως δείκτες την TRAP 5b και το ΝΤχ, και διαπιστώθηκε πως το ζολενδρονικό μπορεί να επάγει την αναστολή της οστεοκλαστογένεσης με μηχανισμό ο οποίος δεν βασίζεται στην υπερέκκριση της OPG. Επίσης ανέστειλε την έκφραση της ΜΜΡ-9, η οποία πέρα από την αποικοδομητική της δράση, αποτελεί και δείκτη της οστεοκλαστικής σειράς. Στην συνέχεια μελετήθηκε η ενεργοποίηση των οστεοκλαστών σε ένα πειραματικό μοντέλο που περιλάμβανε την συν-καλλιέργεια πρώιμων οστεοκλαστών και καρκινικών κυττάρων της σειράς ΜDΑ-ΜΒ-231 παρουσία και απουσία αυξητικών παραγόντων που επάγουν την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών. Και στις δύο περιπτώσεις η ωρίμανση των οστεοκλαστών αναστάλθηκε δοσο-εξαρτώμενα. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν από μόνα τους να επάγουν την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών καθώς και ότι ζολενδρονικό αναστέλλει την ενεργοποίηση των οστεοκλαστων στην χαμηλή συγκέντρωση των οστεοκλαστών. Επίσης και στις δύο περιπτώσεις το ζολενδρονικό μείωσε σημαντικά το φορτίο των ζελατινασών στο περιβάλλον τον οστού μειώνοντας έτσι και την λυτική τους δραστηριότητα. Όπως είναι γνωστό όταν τα καρκινικά κύτταρα μεταναστεύουν στο περιβάλλον του οστού ουσιαστικά εκμεταλλεύονται τον μηχανισμούς αποικοδόμησης έτσι ώστε να δημιουργήσουν ένα περιβάλλον ευνοϊκό για την επιβίωσή τους. Για το λόγο αυτό
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ μελετήθηκε η δράση τον ζολενδρονικού στην δραστικότητα ενεργών οστεοκλαστών καθώς και σε μόρια, όπως η TRAP, η β3 ιντεγκρίνη, η καθεψίνη Κ και οι ΜΜΡ-1, -9, -14, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην λειτουργία τους. Τα αποτελέσματα από την μέτρηση τον NTx έδειξαν πως το ζολενδρονικό καταστέλλει την δραστικότητα των οστεοκλαστών. Όσον αφορά τα μόρια που μελετήθηκαν το ζολενδρονικό ανέστειλε την έκφραση τους στην συγκέντρωση των 15 μμ, ενώ στην συγκέντρωση των 3 μμ είτε ανέστειλε την έκφραση τους (ΜΜΡ-1, ΜΤ1-ΜΜΡ, ιντεγκρίνη β3) είτε δεν την επηρέασε (καθεψίνη K, TRAP) είτε την αύξησε (ΜΜΡ-9). Η μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης της ΜΜΡ- 9 εμφάνισε το ίδιο μοτίβο με την γονιδιακή της έκφραση. Όπως είναι γνωστό η χημειοθεραπεία στον καρκίνο δεν έγκειται στην χορηγία ενός μόνο φαρμάκου αλλά σε συνδυασμούς φαρμάκων. Για το λόγο αυτό αξιολογήθηκε η δράση του ζολενδρονικού με άλλα γνωστά αντικαρκινικά μόρια (λετροζόλη και SΤΙ571), των οποίων η δράση τους έχει μελετηθεί και αξιολογηθεί από το εργαστήριο Βιοχημείας. Τα μόρια αυτά είναι η λετροζόλη και ο μοριακός αναστολέας ST1571. Παρουσία των δύο ειδικών αναστολέων παρατηρήθηκε ενίσχυση της ανασταλτικής δράσης του ζολενδρονικού στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χωρίς ωστόσο να παρατηρείται συνεργιστική δράση τους. Συνοψίζοντας το ζολενδρονικό φαίνεται να έχει σημαντική in vitro αντικαρκινική δράση, καθώς εμφανίζει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και στα επιμέρους βήματα της μεταστατικής διαδικασίας. Επιδρά σε μόρια που παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξάπλωση του όγκου και φαίνεται να μπορεί να διακόψει το `φαύλο κύκλο' της οστικής νόσου στον καρκίνο τον μαστού. Η χρησιμοποίηση τον μαζί με άλλα αντικαρκινικά μπορεί να αυξήσει την ανασταλτική του ικανότητα. Περαιτέρω μελέτες θα βοηθήσουν στην in vivo επιβεβαίωση των παραπάνω και συγκεκριμένα ότι το ζολενδρονικό εν δυνάμει Θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως αντικαρκινικός παράγοντας σε γυναίκες με καρκίνο τον μαστού, έτσι ώστε να αποφευχθούν οι πιθανές μεταστάσεις στα οστά.