8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 411 Genome resources for the gilthead seabream (Sparus auratα) produced within the EU project BRIDGE-MAP Kotoulas G 1., E. Sarropoulou 1,3., L. Bargelloni 2, D. Power 5, R. Geisler 3, F. Galibert 4, F.Senger 4, T.Patarnello 2, S. Gorshkov 6, G. Gorshkova 6, C. Batargias 7, A. Georgoudis 8, D. Chatziplis 8, B.Ron 6, E. Koubarakis 9, Μ., Franch R 2., M. Tsalavouta 1, B. Louro 5, J. Antonello 2, E. Fritzilas 9, G. Adamopoulou 9, and A. Magoulas 1. 1: HCMR, Greece:, 2: BIOUNIPD, Italy, 3: MPIEB, Germany, 4: CNRS DR17, France, 5: UALG CCMAR, Portugal, 6: NCM, Israel, 7: NIREUS, Greece, 8: AUTh, Greece, 9: TUC, Greece Abstract Genome resources of high impact have been produced by the European project BRIDGE-MAP for the genome of gilthead seabream (Sparus aurata). The results include a linkage map based on about 200 markers, a radiation hybrid panel, a radiation hybrid map with about 1000 molecular markers and genes mapped, Expressed Sequence Tags (ESTs), and protocols for chromosome set manipulation (mitoandrogenesis). Additionally, a breeding and a partial Quantitative Trait Loci (QTL) project for growth at the Nireus Aquaculture sea farm has been established. A considerable achievement has also been the creation of a cdna microarray that allows studying of gene expression for thousands of genes simultaneously, and its application to study early development and stress response. These resources are presented on-line by the BRIDGEMAP database and the web site (http://www. bridgemap.tuc.gr), which reports progress made in this project and will serve as a central depository for genetics and genomics work in seabream. Keywords: Gilthead seabream, Sparus aurata, Radiation Hybrid map, Linkage map, BAC library, microarrays, ESTs, QTL mapping, Breeding, Aquaculture Περιληψη Το Ευρωπαϊκό ερευνητικό πρόγραμμα BRIDGE-MAP παρήγαγε σημαντική γνώση και εργαλεία για το γονιδίωμα της τσιπούρας (Sparus aurata). Τα αποτελέσματα περιλαμβάνουν ένα γενετικό χάρτη με περίπου 200 δείκτες μικροδορυφορικού DNA, ένα σύστημα χαρτογράφησης γονιδίων και κάθε είδους δεικτών DNA βασισμένο στην τεχνολογία υβριδίων κυττάρων (Radiation hybrid panel), ένα χάρτη 1000 μοριακών δεικτών και γονιδίων ο οποίος επέτρεψε τη σύγκριση του γονιδιώματος της τσιπούρας με γονιδιώματα ειδών μοντέλων, ιδιαίτερα ψαριών και θηλαστικών. Επίσης δημιουργήθηκε μια βιβλιοθήκη σε φορείς τεχνητών βακτηριακών χρωμοσωμάτων (BAC clones) και πρωτόκολλα χειρισμού χρωμοσωμάτων. Στα πλαίσια του προγράμματος αυτού, στην εταιρεία υδατοκαλλιεργειών Νηρέας, άρχισε πρόγραμμα επιλεκτικής αναπαραγωγής με στόχο την ταχύτερη αύξηση βάρους της καλλιεργούμενης τσιπούρας. Σε σχέση με την αύξηση βάρους, διεξάγεται επίσης ένα πιλοτικό πρόγραμμα χαρτογράφησης ποσοτικών χαρακτήρων (QTL mapping). Σημαντικό επίτευγμα απετέλεσε επίσης η δημιουργία μια μικροσυστοιχίας cdnas που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση της έκφρασης μερικών χιλιάδων γονιδίων. Τα αποτελέσματα αυτά θα διατίθενται από τη βάση δεδομένων του προγράμματος BRIDGE-MAP που θα αποτελέσει κεντρική παροχή και συντονισμό της γενετικής και γονιδιωματικής έρευνας της τσιπούρας (http://www.bridgemap.tuc.gr).
412 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας ΕΙΣΑΓΩΓΗ Tην τελευταία δεκαετία έχει γίνει μεγάλη προσπάθεια διεθνώς για τη μελέτη των γονιδιωμάτων στο σύνολό τους, γεγονός που εισάγει μια άλλης κλίμακας και απόδοσης προσέγγιση στη βιολογική έρευνα. Συνεχείς τεχνολογικές βελτιώσεις επέτρεψαν ταχεία πρόοδο στη μεταγραφή της πληροφορίας από τις αλληλουχίες DNA, σε πληροφορία για τη λειτουργία των γονιδίων και κατ επέκταση των οργανισμών. Η ανάπτυξη της τεχνολογίας σε είδη-μοντέλα, άνοιξε το δρόμο για μεγάλης κλίμακας μελέτες, στο μοριακό επίπεδο, και σε οργανισμούς που δεν έχουν χαρακτηριστεί σαν πειραματικά μοντέλα. Τέτοιες μελέτες μπορούν να εστιάζουν σε θέματα περιβαλλοντικού ενδιαφέροντος, στην εξέλιξη, αλλά και στη βιοτεχνολογία και άλλες δραστηριότητες άμεσου οικονομικού ενδιαφέροντος. Η τσιπούρα (Sparus aurata) είναι είδος μεγάλου οικονομικού, αλλά και εξελικτικού ενδιαφέροντος. Αποτελεί ένα από τα κύρια είδη για την Ευρωπαϊκή υδατοκαλλιέργεια και μαζί με το λαβράκι συνιστούν το σύνολο σχεδόν της Μεσογειακής υδατοκαλλιέργειας ψαριών. Πέρα από μια αρκετά ικανοποιητική κατανόηση της βιολογίας και αναπαραγωγικής φυσιολογίας του είδους, η τεχνογνωσία και τεχνολογία παραγωγής είναι καλά ανεπτυγμένη. Ως προς τη βιολογία, η τσιπούρα αντιπροσωπεύει τα ερμαφρόδιτα είδη με αναστροφή φύλλου, που χαρακτηρίζει πολλά άλλα είδη ψαριών, όπως άλλα σπαροειδή, αλλά και τους ροφούς. Ως προς την εξελικτική θέση, αντιπροσωπεύει, όπως και το λαβράκι, την τάξη των περκοειδών, η οποία προέκυψε πριν 60 περίπου εκατομμύρια χρόνια μετά από μια ειδογένεση προσαρμοστικής έκρηξης, και η οποία αποτελεί την πολυπληθέστερη σε αριθμό ειδών τάξη μεταξύ των σπονδυλωτών. ΜEΘΟΔΟΙ - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γενετικός Χάρτης Ο Γενετικός χάρτης που δημιουργήθηκε βασίστηκε σε 207 πολυμορφικούς μικροδορυφορικούς δείκτες. Ο χάρτης προέκυψε με ανάλυση δεδομένων που συλλέχθηκαν με γονοτύπηση μιας οικογενείας αποτελούμενης από τους δύο γονείς και 48 απογόνους. Το σύνολο των δεικτών κατανέμεται σε 23 ομάδες σύνδεσης (Lod score >3, εικόνα 1). Η πυκνότητα του χάρτη εξασφαλίζει ανάλυση QTL (συσχέτιση πολυμορφισμών μοριακών δεικτών με τη φαινοτυπική ποικιλότητα) ικανοποιητικής ισχύος, γεγονός που τον καθιστά ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο για την πραγματοποίηση προγραμμάτων επιλογής. Πρόκειται για τον μοναδικό χάρτη που υπάρχει για είδος ψαριού που παρουσιάζει αναστροφή φύλου. Γενικά στα ψάρια υπάρχει διαφορά στο μήκος χάρτη (λόγω διαφορετικού ρυθμού ανασυνδυασμού) μεταξύ θηλυκών και αρσενικών ατόμων με το μήκος του χάρτη να είναι μεγαλύτερο για το θηλυκό (και ο ρυθμός ανασυνδυασμού μικρότερος). Το ίδιο ισχύει και σε άλλα σπονδυλωτά, ακόμη και σε ασπόνδυλα (π.χ. στη δροσόφυλλα). Στην τσιπούρα βρήκαμε πως υπάρχουν διαφορές μήκους χάρτη μεταξύ αρσενικού και θηλυκού γονέα για κάποιες ομάδες σύνδεσης, όμως αντίθετα από ότι συμβαίνει σε μη ερμαφρόδιτα είδη, σε κάποιες ομάδες σύνδεσης είναι μεγαλύτερο το μήκος που εκτιμάται με βάση τον αρσενικό γονέα και σε κάποια με βάση τον θηλυκό. Τα αποτελέσματα αυτά πιστεύουμε πως θα ρίξουν φως στους μηχανισμούς που διαφοροποιούν το ρυθμό ανασυνδυασμού μεταξύ των δύο φύλων στα σπονδυλόζωα. Radiation Hybrid panel: Τεχνολογία ταχείας χαρτογράφησης γονιδίων τσιπούρας μέσω ενσωμάτωσης του γονιδιώματος της τσιπούρας σε κύτταρα hamster Μέρος του γονιδιώματος της τσιπούρας εισήχθηκε σε κύτταρα hamster (το 30% του γονιδιώματος της τσιπούρας, κατά μέσο όρο, σε κάθε ένα από τα υβρίδια κύτταρα). Ένα σύνολο
8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 413 Εικόνα 1. Γενετικός χάρτης της τσιπούρας για 207 μικροδορυφορικούς τόπους βασισμένος στο μειωτικό διαχωρισμό του θηλυκού γονέα. 93 τέτοιων υβριδίων κυττάρων αποτελούν ένα εξαιρετικό εργαλείο για τη γρήγορη χαρτογράφηση χιλιάδων γονιδίων και μοριακών δεικτών 7. Η τσιπούρα αποτελεί το μόνο εμπορικό είδος ψαριού και ένα από τα δεκατρία συνολικά είδη οργανισμών στον κόσμο, για τα οποία έχει παραχθεί ένα τέτοιο σύστημα (μεταξύ των οποίων είναι ο άνθρωπος, ο ποντικός, η αγελάδα, κλπ.). Με βάση το αποτέλεσμα εκτιμούμε ότι δυνητικά το σύνολο των γονιδίων του είδους μπορεί να χαρτογραφηθεί με υψηλή διακριτική ικανότητα. Το ενδιαφέρον ενός τέτοιου συστήματος χαρτογράφησης έγκειται επίσης στο γεγονός πως δεν βασίζεται στην παρουσία πολυμορφισμών, όπως συμβαίνει με τους γενετικούς χάρτες (χάρτες σύνδεσης). Ως γνωστό, είναι πολύ δύσκολο να χαρτογραφήσει κανείς γονίδια σε ένα χάρτη σύνδεσης, καθώς τα γονίδια δεν παρουσιάζουν υψηλό πολυμορφισμό, σε αντίθεση με τους δείκτες μικροδορυφορικού DNA. Επιπλέον, οι σημειακοί πολυμορφισμοί που συναντώνται συνήθως στα γονίδια είναι δυσκολότερο να μελετηθούν από τους πολυμορφισμούς μεγέθους που παρουσιάζουν οι δείκτες μικροδορυφορικού DNA Χάρτης Radiation Hybrid Ο πρώτος χάρτης που έχει παραχθεί από το πρόγραμμα περιλαμβάνει 440 μοριακούς δείκτες, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται 81 γονίδια7. Συγκριτική ανάλυση αυτού του χάρτη σε σχέση με τους χάρτες ειδών-μοντέλων ψαριών (Tetraodon και Fugu) κυρίως, αλλά και με τους χάρτες του ανθρώπου και του ποντικού, έδειξε ότι υπάρχει σημαντική εξελικτική διατήρηση. Η διακριτική ικανότητα της σύγκρισης έχει αυξηθεί σημαντικά με τη χαρτογράφηση 1000 περίπου δεικτών που ολοκληρώθηκε πρόσφατα
414 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας Εικόνα 2. Χάρτης Radiation Hybrid για 1000 περίπου δείκτες, γονίδια στην πλειοψηφία τους
8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 415 στην τσιπούρα (εικόνα 2, 3). Συντήρηση μεταξύ χαρτών, στον πολύ σημαντικό βαθμό που αυτή ισχύει, σημαίνει πως όταν ένας αριθμός γονιδίων βρίσκεται κοντά σε μια χρωμοσωμική περιοχή στο ένα είδος, βρίσκεται κοντά και στα άλλα είδη, και μάλιστα με την ίδια σειρά. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα μεταξύ ψαριών, αλλά και σε σημαντικό βαθμό και μεταξύ ψαριών και ανθρώπου. Έχοντας με αυτόν τον τρόπο εγκαθιδρύσει πλήρη αντιστοίχιση μεταξύ του γονιδιώματος της τσιπούρας και ειδών των οποίων έχει ολοκληρωθεί η αλληλούχηση του γονιδιώματός τους, αποκτούμε δυνάμει πληροφορία για τη χαρτογράφηση του συνόλου του γονιδιώματός της. Έτσι, έχουμε αυξήσει εντυπωσιακά τη δυνατότητα να βρίσκουμε τη σχέση μεταξύ γονιδίων και φαινοτυπικών χαρακτήρων. Η δημιουργία μια γενωμικής βιβλιοθήκης σε φορείς BAC (τεχνητά βακτηριακά χρωμοσώματα Artificial Bacterial Chromosomes) μέσου μεγέθους 120kb με κάλυψη του γονιδιώματος κατά 6 φορές, συμπληρώνει τη δυνατότητα χαρτογράφησης, με τη δυνατότητα πλήρους δομικού χαρακτηρισμού γονιδίων ενδιαφέροντος, και αποτελεί βασικό εργαλείο για προγράμματα αλληλούχησης. Στα μελλοντικά σχέδια, προτείνεται η ανάπτυξη χρωμοσωμικών δεικτών με τη μέθοδο FISH (επιτόπια υβριδοποίηση φθορισμού σε μεταφασικά χρωμοσώματα) με χρήση κλώνων BAC και συγχρόνως με χαρτογράφηση των κλώνων αυτών με το σύστημα RH 1,2,3,4,7. Αυτό θα επιτρέψει την αντιστοίχιση των ομάδων χαρτογράφησης RH με τα φυσικά χρωμοσώματα. Εικόνα 3. Συντενική σχέση μεταξύ της ομάδας RH18 της τσιπούρας και του χρωμοσώματος 5 του Tetraodon (βαθμός διατήρησης της θέσης δεικτών και γονιδίων σε αντίστοιχα χρωμοσώματα των δύο ειδών) Μικροσυστοιχίες (microarrays) cdna Κατασκευάστηκε μικροσυστοιχία 10,000 κλώνων cdna που απομονώθηκαν από εμβρυϊκά στάδια. Η μικροσυστοιχία αυτή χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της πρώιμης ανάπτυξης, αλλά και για τη μελέτη απόκρισης της τσιπούρας στο στρες με πείραμα βραδείας ελευθέρωσης κορτιζόλης σε ενήλικα άτομα 5. Τα εν λόγω πειράματα έδειξαν τις δυνατότητες για τη χρήση της τε-
416 8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας χνολογίας αυτής σε πειράματα φυσιολογίας και ανάπτυξης. Έγινε ταυτοποίηση σειράς γονιδίων που χαρακτηρίζουν συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια. Επίσης, έγινε ταυτοποίηση μεγάλου αριθμού γονιδίων που επηρεάζονται (η έκφρασή τους επάγεται, ή αναστέλλεται) από ένα συμβάν στρες ή που εμπλέκονται σε καταστάσεις στρες. Τέτοιου είδους μελέτες μας κατευθύνουν σε συγκεκριμένα γονίδια, υποψήφια να παίζουν ρόλο σε σύνθετες λειτουργίες ή φαινοτύπους. Ταυτοποίηση γονέων με χρήση μοριακών δεικτών και εύρεση δεικτών συσχετιζόμενων με ποσοτικούς χαρακτήρες Η ταυτοποίηση γονέων διεξάγεται με τη χρήση 7 δεικτών πολυμορφικού μικροδορυφορικού DNA. H ταυτοποίηση μικροδορυφορικών δεικτών που συσχετίζονται με διαφορές των ατόμων ως προς το βάρος, είναι σε εξέλιξη για 2 ομάδες γενετικά συνδεδεμένων δεικτών (αντίστοιχα για 2 χρωμοσώματα). Οι ομάδες αυτές επιλέχθηκαν με βάση την πληροφορία για ενδιαφέροντα για την αύξηση του βάρους γονίδια που υπάρχουν σε αυτές, μεταξύ των 81 γονιδίων που χαρτογραφήθηκαν, αλλά και γονιδίων των οποίων η παρουσία συνάγεται από τη σύγκριση με το χάρτη του Tetraodon. Αυτό έγινε εφικτό χάρη στους μικροδορυφορικούς δείκτες που έχουν χαρτογραφηθεί τόσο στο γενετικό χάρτη (χάρτη σύνδεσης), όσο και στο χάρτη RH. Αναμένεται τα αποτελέσματα να είναι χρήσιμα για ακριβέστερη και άρα αποδοτικότερη επιλογή για καλύτερη αύξηση στην τσιπούρα. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ο χάρτης RH και ο γενετικός χάρτης συγκρίθηκαν με τη γονοτύπηση μικροδορυφορικών δεικτών και με τα δύο συστήματα χαρτογράφησης. Σε αυτή τη φάση της ανάλυσης βρέθηκε πλήρης αντιστοιχία μεταξύ των δύο χαρτών, με άλλα λόγια οι δύο χάρτες αλληλοστηρίζονται. Επιπρόσθετα, η δημιουργία της κατατομής της γονιδιακής έκφρασης με τη χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών που αναπτύξαμε, δίνει πληροφορίες για την έκφραση, επομένως και τη λειτουργία των γονιδίων κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχειών στην τσιπούρα σε συνδυασμό με τη γονιδιακή και τη γενετική χαρτογράφηση, θα επιταχύνει την ταυτοποίηση υποψηφίων γονιδίων που εμπλέκονται στον καθορισμό ποσοτικών χαρακτήρων και σε μονοπάτια γονιδιακής ρύθμισης, και θα φωτίσει τη γενετική βάση των διαφορών στη φυσιολογία και ανάπτυξη σε συνάρτηση με την απόδοση σε συνθήκες εκτροφής. Εν κατακλείδι, η προσέγγιση στην ανάπτυξη γονιδιωματικής στην τσιπούρα με την ανάπτυξη της χαρτογράφησης RH που επιτρέπει τη σύγκριση και μεταφορά πληροφορίας από είδη μοντέλα, γενετικής χαρτογράφησης, χαρτογράφησης QTL, μοριακών εργαλείων και πληροφορίας όπως: βιβλιοθήκες cdnas, βιβλιοθήκες BAC, αλληλουχίες από συλλογή κλώνων cdna (ESTs) 6, αναμένεται να οδηγήσει στην επιτάχυνση της μεταφοράς γενετικής πληροφορίας από την έρευνα στις υδατοκαλλιέργειες. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Vitturi R, Mazzola A, Catalano E et al (1992). Karyotype characterization of four Mediterranean sparid fish (Pisces, Perciformes) using cenventional and banding techniques. Cytobios, 72 :107-115. Garrido-Ramos MA, Jamilena M; Lozano R et al (1994). Cloning and characterization of a fish centromeric satellite DNA. Cytogenet Cell Genet, 65: 233-237. Garrido-Ramos MA, de la Herran R, Rejon CR et al (1998). A satellite DNA of the Sparidae family (Pisces, Perciformes) associated with telomeric sequences. Cytegenet Celle Genet, 83: 3-9. Cumado N, Garrido-Ramos MA, de la Herran R et al (2000). Organization of repetitive DNA sequences at pachytene chromosomes of gilthead seabream Sparus aurata (Pisces, Perciformes). Chromosome Research, 8: 67-72.
8ο Πανελλήνιο Συμποσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 417 Sarropoulou E., G. Kotoulas, D.M. Power, and R. Geisler, 2005. Gene expression profiling of gilthead sea bream during early development and detection of stress related genes by the application of cdna microarray technology. Physiol. Genomics, 23, 182-191. Sarropoulou E., D.M. Power, A.Magoulas, R.Geisler, G. Kotoulas, 2005. Comparative analysis and characterization of expressed sequence tags in gilthead sea bream liver and embryos. Αquaculture, 243, 69-81. Senger F., Priat C., Sarropoulou E., Hitte C.,, Bargelloni L., Power D., Geisler R., Galibert F., υπό δημοσίευση Genomic. The first radiation hybrid map of a perch-like fish and commercially important aquaculture species: sea bream (Sparus aurata).