ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΜΠΑΤΖΟΠΟΥΛΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΑΜΠΑΤΖΟΠΟΥΛΟΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Α.Π.Θ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΑΝΤΙΔΙΑΒΗΤΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 i

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ευχαριστώ θερμά την επιβλέπουσα της διπλωματικής, Επίκουρη Καθηγήτρια Αικατερίνη Μαρκοπούλου για την υπόδειξη του θέματος, για την συνεργασία της αλλά και την επιστημονική καθοδήγηση που μου παρείχε κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής τόσο του πειραματικού μέρους όσο και της συγγραφής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Ιωάννη Κουντουρέλλη και τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Ζαχαριάδη που με τίμησαν με τη συμμετοχή τους στην τριμελή εξεταστική επιτροπή. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω σε όλους του διδάσκοντες μου στο ΠΜΣ για τη βοήθεια και το ενδιαφέρον που έδειξαν καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον φίλο και κουμπάρο μου κ. Νίκο Μαργαριτέλη, τελειόφοιτο Μεταπτυχιακού Διπλώματος στον Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, για την πολύτιμη βοήθειά του, ειδικά σε θέματα που αφορούσαν τον πειραματικό σχεδιασμό. Τέλος, οφείλω να ευχαριστήσω τους γονείς μου για τη στήριξη και τη συμπαράσταση τους καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Η συνεισφορά τους σε κάθε μου προσπάθεια είναι ανεκτίμητη. Όπως πολύτιμη και ανεκτίμητη ήταν η συμβολή της συζύγου μου, Ζωής Γουρνάρη, η οποία εκτός από τη συνεχή συμπαράσταση και υποστήριξη κατά τη διάρκεια του ΠΜΣ, μου χάρισε το μεγαλύτερο δώρο, τον γιο μας. ii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ii iii viii ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 : ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΚΑΙ HPLC 1.1 ΓΕΝΙΚΑ 1 1.1.1 Ορισμός Χρωματογραφίας 1 1.1.2 Ιστορική Αναδρομή 1 1.1.3 Αρχή Λειτουργίας 2 1.1.3.1 Βασική αρχή και ορολογία χρωματογραφίας εκλούσεως 2 1.1.4 Εφαρμογές 4 1.2 ΕΙΔΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ 4 1.3 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) 6 1.3.1 Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και σύγκριση με την κλασική χρωματογραφία στήλης 6 1.3.2 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα μεθόδου- Κριτήρια επιλογής της. 6 1.3.3 Είδη HPLC 8 1.3.4 Οργανολογία HPLC 11 1.3.4.1 Σύστημα παροχής κινητής φάσης (Αντλίες) 13 1.3.4.2 Διαλύτες 13 1.3.4.2.1 Επιλογή κινητής φάσης 14 1.3.4.3 Σύστημα εισαγωγής δείγματος 15 1.3.4.4 Στήλες 16 1.3.4.4.1 Θερμοστάτες στήλης 17 1.3.4.4.2 Προστήλη 17 1.3.4.4.3 Επιλογή στατικής φάσης 17 1.3.4.4.4 Μερικές συνήθως χρησιμοποιούμενες στατικές φάσεις HPLC 18 1.3.4.5 Ανιχνευτές 20 1.3.4.5.1 Τύποι ανιχνευτών 21 1.3.4.6 Σύστημα καταγραφής αποτελεσμάτων 24 iii

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ HPLC 2.1 ΒΑΣΙΚΕΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ 26 2.1.1 Χρόνος κατακράτησης ή συγκράτησης 26 2.1.2 Συντελεστής κατακράτησης 26 2.1.3 Παράγοντας διαχωρισμού ή εκλεκτικότητας 27 2.1.4 Διαχωριστική ικανότητα 28 2.1.5 Αριθμός θεωρητικών πλακών 29 2.1.6 Παράγοντας ασυμμετρίας 31 2.1.7 Επίδραση της κατακράτησης, του παράγοντα εκλεκτικότητας και του αριθμού των θεωρητικών πλακών στη διαχωριστική ικανότητα 31 2.1.8 Η εξίσωση του Van Deemter 33 2.2 ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 34 2.2.1 Ισχύς 34 2.2.2 Αξιοπιστία 34 2.2.3 Ευαισθησία 35 2.2.4 Όριο ανίχνευσης (LOD) 35 2.2.5 Όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) 35 2.2.6 Χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων 36 2.2.7 Εκλεκτικότητα 36 2.3 ΜΕΤΡΑ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 36 2.3.1 Απόλυτο σφάλμα 36 2.3.2 Σχετικό σφάλμα 37 2.3.3 Εκατοστιαίο ποσοστό ανάκτησης 37 2.3.4 Εύρος 37 2.3.5 Τυπική απόκλιση και διασπορά 37 2.3.6 Σχετική τυπική απόκλιση 39 2.3.7 Συντελεστής μεταβλητότητας 39 2.4 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΙΚΩΝ ΠΑΡΑΣΤΑΣΕΩΝ- ΜΕΘΟΔΟΣ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΤΕΤΡΑΓΩΝΩΝ 40 2.5 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ 42 2.5.1 Γενικά 42 2.5.2 Στόχοι πειραματικού σχεδιασμού 44 2.5.3 Βασικές αρχές πειραματικού σχεδιασμού 45 2.5.4 Προσεγγίσεις πειράματος 47 2.5.5 Είδη Πειραματικών Σχεδιασμών 49 2.5.5.1 Πλήρη παραγοντικά πειράματα 49 2.5.5.2 Κλασματικά παραγοντικά πειράματα 52 2.5.5.3 Σχεδιασμοί Simplex 53 2.5.5.4 Πειράματα με μίγματα 53 2.5.5.4.1 Μίγμα με 2 συστατικά 54 2.5.5.4.2 Μίγμα με 3 συστατικά 55 2.5.5.5 Βέλτιστοι σχεδιασμοί 56 iv

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 : Η ΝΟΣΟΣ. ΣΑΚΧΑΡΩΔΗΣ ΔΙΑΒΗΤΗΣ 3.1 ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 57 3.2 Η ΦΥΣΗ ΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΑΣ 57 3.3 Ο ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΣΑΚΧΑΡΟΥ 57 3.4 ΤΥΠΟΙ ΔΙΑΒΗΤΗ 58 3.4.1 Διαβήτης τύπου Ι 59 3.4.1.1 Τι προκαλεί τον διαβήτη τύπου Ι; 59 3.4.2 Διαβήτης τύπου ΙΙ 60 3.4.2.1 Τι προκαλεί τον διαβήτη τύπου ΙΙ; 60 3.4.3 Άλλοι τύποι διαβήτη 61 3.5 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ 61 3.6 ΔΙΑΓΝΩΣΗ 61 3.7 ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΤΟΥ ΔΙΑΒΗΤΗ ΤΥΠΟΥ ΙΙ 62 3.7.1. Διατροφή και άσκηση 62 3.7.2. Φάρμακα από το στόμα 62 3.7.2.1 Σουλφονυλουρίες 62 3.7.2.2 Διγουανίδια 63 3.7.2.3 Αναστολείς της άλφα- γλυκοσιδάσης 63 3.7.2.4 Θειαζολιδινεδιόνες 64 3.7.2.5 Μεγλιτινίδες 64 3.7.3. Ινσουλίνη 64 3.7.4. Συνδυασμός θεραπειών 65 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 : ΑΝΤΙΔΙΑΒΗΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ ΠΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΤΗΚΑΝ ΜΕ HPLC, UV (DERIVATIVE) ΚΑΙ PLS ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 4.1 ΣΟΥΛΦΟΝΥΛΟΥΡΙΕΣ 66 4.1.1. Πρώτης Γενιάς 66 4.1.1.1 Τολβουταμίδη 66 4.1.1.2 Χλωροπροπαμίδη 69 4.1.2. Δεύτερης Γενιάς 70 4.1.2.1 Γλιβενκλαμίδη 70 4.1.2.2 Γλιπιζίδη 71 4.2. ΔΙΓΟΥΑΝΙΔΙΑ 73 4.2.1 Μετφορμίνη 73 4.2.2 Φαινφορμίνη 75 4.3. ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟ ΥΠΟΓΛΥΚΑΙΜΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ 76 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 : ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 78 2.1 ΟΡΓΑΝΑ ΚΑΙ ΣΚΕΥΗ 78 2.2 ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 78 v

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 : ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 3.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΗΤΡΙΚΩΝ,ΕΝΔΙΑΜΕΣΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ 79 3.2 ΜΕΛΕΤΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΟΥΣΙΩΝ 81 3.2.1 Ο ρόλος του ρυθμιστικού άλατος 81 3.2.2 Ο ρόλος του ph 84 3.2.3 O ρόλος της αναλογίας διαλυτών στην κινητή φάση 86 3.2.4 Εντοπισμός προβλημάτων διαχωρισμού 90 3.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ 96 3.3.1 Ανάπτυξη και βελτιστοποίηση χρωματογραφήματος 96 3.3.2 Αξιολόγηση στατιστικού πειραματικού σχεδιασμού 107 3.3.3 Αξιολόγηση μεθόδου 108 3.3.3.1 Έλεγχος γραμμικότητας και εύρους 108 3.3.3.2 Έλεγχος επαναληψιμότητας, ενδιάμεσης επαναληπτικότητας και ακρίβειας 115 3.4 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟΥ ΑΛΑΤΟΣ ΣΤΟ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑ ΤΗΣ ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ 116 ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 : ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ- ΟΡΑΤΟΥ 119 1.1 ΝΟΜΟΣ BEER 119 1.2 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 120 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ 122 2.1 ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ DERIVATIVE RATIO ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΟΥ 122 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 : ΜΕΘΟΔΟΣ «ΠΡΟΒΟΛΕΣ ΜΕΡΙΚΩΝ ΕΛΑΧΙΣΤΩΝ ΤΕΤΡΑΓΩΝΩΝ ΣΕ ΛΑΝΘΑΝΟΥΣΕΣ ΔΟΜΕΣ» (PLS) 123 3.1 ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ 124 3.2 ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ 126 3.3 ΠΡΟΒΛΕΨΗ 126 B. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 : ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 128 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 : ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ-ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 129 2.1 ΟΡΓΑΝΑ 129 vi

2.2 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ-ΔΙΑΛΥΤΕΣ 129 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 : ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΑΝΤΙΔΙΑΒΗΤΙΚΩΝ ΣΕ ΦΑΣΜΑΤΑ UV ΜΗΔΕΝΙΚΗΣ ΤΑΞΗΣ 131 3.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΜΗΤΡΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΝΔΙΑΜΕΣΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ 131 3.2 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΔΙΑΛΥΜΑΤΩΝ 132 3.3 ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑ ΟΥΣΙΩΝ 133 3.4 ΚΑΜΠΥΛΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥΣ 136 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 : ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΔΥΑΔΙΚΩΝ ΜΙΓΜΑΤΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ «ΠΑΡΑΓΩΓΙΣΗ ΦΑΣΜΑΤΙΚΩΝ ΛΟΓΩΝ» 142 4.1 ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΙΒΕΝΚΛΑΜΙΔΗΣ-ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ 142 4.1.1 Ανάπτυξη μεθόδου 142 4.1.2 Έλεγχος αξιοπιστίας μεθόδου 147 4.2 ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΙΠΙΖΙΔΗΣ-ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ 150 4.2.1 Ανάπτυξη μεθόδου 150 4.2.2 Έλεγχος αξιοπιστίας μεθόδου 155 4.3 ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΧΛΩΡΟΠΡΟΠΑΜΙΔΗΣ-ΦΑΙΝΦΟΡΜΙΝΗΣ 4.3.1 Ανάπτυξη μεθόδου 158 4.3.2 Έλεγχος αξιοπιστίας μεθόδου 162 4.4 ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΟΛΒΟΥΤΑΜΙΔΗΣ-ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗΣ 165 4.4.1 Ανάπτυξη μεθόδου 165 4.4.2 Έλεγχος αξιοπιστίας μεθόδου 170 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 : ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ PLS ΣΤΟΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΑΝΤΙΔΙΑΒΗΤΙΚΩΝ 174 ΜΕΡΟΣ ΤΡΙΤΟ Συμπεράσματα-Συζήτηση 176 Βιβλιογραφία 181 vii

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων για τον προσδιορισμό αντιδιαβητικών ουσιών σε φαρμακευτικά σκευάσματα με ταυτόχρονη συγκριτική μελέτη των αποτελεσμάτων τους. Συγκεκριμένα εξετάστηκαν οι δραστικές ουσίες μετφορμίνη, φαινφορμίνη, χλωροπροπαμίδη, γλιπιζίδη, τολβουταμίδη, γλιβενκλαμίδη, με εφαρμογή: i) Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (ΥΧΥΑ, HPLC) αντίστροφης φάσης (RP) ii) Φασματοφωτομετρίας παραγώγων υπεριώδους-ορατού iii) Ανάλυσης μερικών ελαχίστων τετραγώνων σε λανθάνουσες δομές (PLS) Στη μελέτη με ΥΧΥΑ αρχικά διερευνήθηκε η χρωματογραφική συμπεριφορά των 6 ουσιών. Σε ένα πρώτο στάδιο εξετάστηκε η επίδραση της παρουσίας ρυθμιστικού άλατος στο νερό της κινητής φάσης. Διαπιστώθηκε πως η προσθήκη άλατος οξικού αμμωνίου 0.05Μ βελτίωνε το εύρος βάσης των χρωματογραφικών κορυφών και επιτάχυνε ελαφρά το χρόνο έκλουσης των ουσιών, επηρεάζοντας την κατανομή των υπό ανάλυση ουσιών στην υγρή στατική φάση. To φαινόμενο αποδόθηκε πιθανότατα στην ανάπτυξης δεσμών υδρογόνου μεταξύ του αζώτου του αμμωνιακού άλατος και των ελεύθερων υδροξυλικών ομάδων της πηκτής διοξειδίου του πυριτίου. Σε ένα δεύτερο στάδιο εξετάστηκε ο ρόλος του ph. Διαπιστώθηκε πως σε βασικό περιβάλλον ο χρόνος έκλουσης των χλωροπροπαμίδη, γλιπιζίδη, τολβουταμίδη και γλιβενκλαμίδη μειωνόταν με μια ταυτόχρονη βελτίωση του εύρους των κορυφών τους. Το γεγονός αυτό οφείλεται στο ότι οι συγκεκριμένες ουσίες συμπεριφέρονται ως οξέα, λόγω της σουλφονικής τους ομάδας, με αποτέλεσμα να ιονίζονται σε βασικό περιβάλλον, να αυξάνει η πολικότητά τους και να παρασύρονται πιο εύκολα από μία πολική κινητή φάση. Το αντίθετο συμβαίνει με την μετφορμίνη και την φαινφορμίνη που συμπεριφέρονται ως βάσεις. Σε ένα τρίτο στάδιο μελετήθηκε ο ρόλος της αναλογίας διαλυτών στην κινητή φάση. Χρησιμοποιήθηκαν τόσο δυαδικά όσο και τριαδικά χρωματογραφικά συστήματα (MeOH-H 2 O, ACN-H 2 O, MeOH-ACN-H 2 O). Διαπιστώθηκε πως η αυξημένη παρουσία υδατικού διαλύματος οξικού αμμωνίου αυξάνει το χρόνο έκλουσης των ουσιών και βοηθάει στον καλύτερο διαχωρισμό των ουσιών. Σε πολύ μεγάλο όμως ποσοστό οδηγεί σε χρόνους απαγορευτικούς για τις σύγχρονες φαρμακευτικές αναλύσεις. Η παρουσία ακετονιτριλίου μειώνει τους χρόνους έκλουσης και βελτιώνει την εικόνα των κορυφών ως προς το εύρος τους. viii

Τα προβλήματα που εντοπίστηκαν κατά τη διεξαγωγή των αρχικών πειραμάτων και αφορούσαν το διαχωρισμό των 6 ουσιών ήταν: 1. Δυσκολία διαχωρισμού τολβουταμίδης και γλιπιζίδης λόγω παραπλήσιων χρόνων έκλουσης. Ανάλογα μάλιστα με τις εκάστοτε συνθήκες άλλοτε έβγαινε πρώτη η τολβουταμίδη και άλλοτε η γλιπιζίδη. 2. Μεγάλος χρόνος έκλουσης της γλιβενκλαμίδης σε αρκετές περιπτώσεις. 3. Επίδραση κορυφής διαλύτη (μεθανόλης) στα χρωματογραφήματα της μετφορμίνης και της φαινφορμίνης. 4. Δυσκολία απόλυτου διαχωρισμού μετφορμίνης και φαινφορμίνης, λόγω κοντινών χρόνων έκλουσης των 2 ουσιών. Οι αναλύσεις όλων των ουσιών επιτεύχθηκαν σε στήλη HS C 18 (250x4,6mm) με μέγεθος σωματιδίων 5μm και η ανίχνευσή τους πραγματοποιήθηκε με ανιχνευτή UV παράταξης φωτοδιόδων. Στον ταυτόχρονο προσδιορισμό των έξι αντιδιαβητικών ουσιών εφαρμόστηκε μια μεθοδολογία διεξαγωγής πειραμάτων, γνωστή ως «Διασταυρούμενος D-optimal» πειραματικός σχεδιασμός, με σκοπό τη βελτιστοποίηση του χρωματογραφικού διαχωρισμού τους. Με βάση τον «D-optimal» αλγόριθμο μελετήθηκε η συμμετοχή τριών διαλυτών (MeOH H 2 O ACN) στην κινητή φάση, καθώς τα δυαδικά μίγματα παρουσίαζαν φτωχό χρωματογραφικό διαχωρισμό. Επιπλέον μέσω του πειραματικού σχεδιασμού εξετάστηκε η επίδραση του ph, η οποία ήταν σημαντική για την επίτευξη των βέλτιστων συνθηκών. Προκαθορίστηκε ως μοντέλο του πειραματικού σχεδιασμού το quadratic x quadratic. O D-optimal αλγόριθμος πρότεινε 23 πειράματα τα οποία διεξήχθησαν. Ως παράγοντες εισόδου (factors) καθορίστηκαν η αναλογία των διαλυτών και το ph. Ως αποκρίσεις ζητήθηκαν η διαχωριστική ικανότητα μετφορμίνης-φαινφορμίνης, η διαχωριστική ικανότητα τολβουταμίδης-γλιπιζίδης, ο χρόνος κατακράτησης της γλιβενκλαμίδης, ο χρόνος κατακράτησης της μετφορμίνης και ο χρόνος κατακράτησης της φαινφορμίνης. Ακολούθησε η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με τη χρήση του D-Optimal αλγόριθμου. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν ώστε να επιλεγεί το βέλτιστο μοντέλο για κάθε απόκριση. Κύριο ρόλο στην επιλογή του βέλτιστου μοντέλου έπαιξε η σημαντικότητά του (p-value<0.05). Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται τα βέλτιστα μοντέλα προσαρμογής που επιλέχτηκαν. Μοντέλο (Συστατικά x παράγοντας) Rs MET-PHEN Rs TOL-GLIP tr GLB tr MET tr RHEN Linear Mean Linear x Linear Quadratic x Linear Linear x Qubic Special Cubic x Mean F p F p F p F p F p 21,19 <0,0001 24,56 <0,0001 99,74 <0,0001 11,74 0,0001 45,18 <0,0001 Τυπική απόκλιση 0,27 0,37 8,15 0,012 0,070 PRESS 1,95 4,99 7756,26 0,15 R-τετράγωνο 0,6794 0,8784 0,9901 0,9215 0,9443 ix

Προσαρμ. R-τετράγωνο 0,6473 0,8426 0,9801 0,8430 0,9234 Adeq Precision 13,048 20,208 44,275 12,28 22,875 Ακολούθως εντοπίστηκαν βάσει σημαντικότητας οι παράγοντες που επηρεάζουν περισσότερο κάθε απόκριση και διαμορφώθηκαν οι μαθηματικές σχέσεις με τη μορφή πολυωνυμικών εξισώσεων για τις επιλεγμένες αποκρίσεις. Ο διαχωρισμός μετφορμίνης-φαινφορμίνης φαίνεται να επηρεάζεται κυρίως από το ποσοστό ACN αλλά και το ποσοστό του H 2 O, ενώ ο διαχωρισμός τολβουταμίδης-γλιπιζίδης από την αλληλεπίδραση και των τριών διαλυτών της κινητής φάσης και κυρίως από την αλληλεπίδραση H 2 O και ph. Ομοίως ο χρόνος κατακράτησης της γλιβενκλαμίδης εξαρτάται περισσότερο από το συνδυασμό ACN/H 2 O, από το συνδυασμό MeOH/ H 2 O και από τον συνδυασμό Η 2 Ο και ph. H τιμή t rmet της μετφορμίνης κυρίως από το συνδυασμό Η 2 Ο και ph 3. Τέλος η τιμή t rphen από την αλληλεπίδραση ACN και Η 2 Ο. Η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των συστατικών-παραγόντων έγινε μεγαλύτερη με τη βοήθεια των ισομετρικών καμπυλών. Εν συνεχεία ετέθησαν τα κριτήρια που θέλαμε να πληρούν οι αποκρίσεις. Απόκριση Χαμηλό όριο Υψηλό όριο Στόχος Συντελεστής Βάρους Rs ΜΕΤ-PHEN 1 2,553 Μέγιστο 1 Rs TOL-GLIP 1 1,37 Μέγιστο 1 tr PHEN 2,983 3,9 Μέγιστο 1 tr GLB 10,32 19,43 Ελάχιστο 1 tr MET 2,117 2,417 Μέγιστο 1 Τελικά, ως κινητή φάση προτάθηκε μίγμα αποτελούμενο από ρυθμιστικό διάλυμα οξικού αμμωνίου 0.05Μ σε ph 4.02, ακετονιτρίλιο και μεθανόλη (41.58:38,42:20 v/v/v), με ρυθμό ροής 1ml min -1. Το σύστημα παρείχε καλές, για ποσοτικό προσδιορισμό, κορυφές για όλες τις ουσίες με τους χρόνους κατακράτησης τους να κυμαίνονται από 2.505 ως 18.123 λεπτά. Σε μία επιπλέον έρευνα διαπιστώθηκε πως η μειωμένη συγκέντρωση του ρυθμιστικού άλατος (μετάβαση από αλκαλικό ύδωρ σε καθαρό ύδωρ) οδηγεί σε μεγαλύτερους χρόνους έκλουσης της μετφορμίνης και βοηθάει έτσι στο να αντιμετωπιστεί το πρόβλημα του κακού διαχωρισμού του μετώπου του διαλύτη από την κορυφή της μετφορμίνης. Η μειωμένη όμως παρουσία του ρυθμιστικού είχε επίδραση στην εικόνα του χρωματογραφήματος τόσο της μετφορμίνης όσο και των άλλων 5 ουσιών (διεύρυνση κορυφών) που θέλουμε να διαχωρίσουμε. Γενικότερα, διαπιστώθηκε ότι η χρήση μεθοδολογίας πειραματικού σχεδιασμού για την εύρεση και βελτιστοποίηση των συνθηκών χρωματογραφικής ανάλυσης, x

μπόρεσε να εξοικονομήσει χρόνο και χρήμα, ενώ η ικανότητα πρόβλεψης του ήταν καλή με τις απόλυτες τιμές των σφαλμάτων πρόβλεψης να είναι σχετικά χαμηλές. Τιμές Αποκρίσεων Πειραματικές μετρήσεις 0.975 1.011 Υπολογισμένες τιμές 1.026 1.063 Σφάλμα πρόβλεψης (%) 4,97 4.89 Rs MET-PHEN Rs TOL-GLIP t RPHEN t R GLB t R MET (min) 2.983 18.123 2.505 3.048 18 2.235 2.13 0.68 12.08 Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για τις καμπύλες αναφοράς όλων των ουσιών έδειξε καλή συσχέτιση, με συντελεστή προσδιορισμού R 2 κοντά στο 0,999. Τέλος, η μέθοδος αξιολογήθηκε ως προς την επαναληψιμότητα, την ενδιάμεση επαναληπτικότητα και την ακρίβεια intra-day και inter-day. Στους πίνακες που ακολουθούν εμφανίζονται τα χαρακτηριστικά των καμπυλών βαθμονόμησης των ουσιών που προσδιορίστηκαν με HPLC και τα αποτελέσματα ακρίβειας, επαναληψιμότητας και ενδιάμεσης επαναληπτικότητας. UV ανιχνευτής Ουσία C (μg/ml) R 2 Κλίση Τομή LOD LOQ Μετφορμίνη 11.62-38.72 0.9981 77205-11721 1.74 5.26 Φαινφορμίνη 11.18 37.28 0.9975 55270 24207 1.92 5.81 Χλωροπροπαμίδη 16.73 55.78 0.9988 45703 7996.6 2.01 6.10 Γλιπιζίδη 15.82 52.74 0.9988 47172 5520.1 1.86 5.64 Τολβουταμίδη 16.36 54.53 0.9989 43783 15447 1.86 5.64 Γλιβενκλαμίδη 16.36 53.50 0.9987 50255-26395 1.99 6.05 Ουσία Μετφορμίνη Φαινφορμίνη Χλωροπροπαμίδη Γλιπιζίδη Τολβουταμίδη Intra-day Inter-day Συγκέντρωση UV UV (μg/ml) Ακρίβεια % RSD % Ακρίβεια % RSD % 11,62 102,56 1,37 101,67 2,17 27,10 97,44 1,99 98,33 1,81 38,72 101,02 0,46 100,67 0,80 11,18 102,89 0,89 101,38 0,73 26,10 97,11 1,07 98,62 1,92 37,28 101,16 1,23 100,55 1,85 16,73 101,98 0,16 101,00 1,30 39,04 98,02 0,23 99,00 1,68 55,78 100,79 1,32 100,40 1,52 15,82 102,02 0,26 100,95 1,37 36,91 97,98 0,26 99,05 1,64 52,74 100,81 1,78 100,38 1,60 16,36 101,88 0,18 100,92 1,31 38,17 98,12 0,22 99,08 1,61 xi

54,53 100,75 1,40 100,37 1,47 Γλιβενκλαμίδη 16,05 102,05 0,34 100,97 1,48 37,45 97,96 0,18 99,03 1,62 53,50 100,82 1,95 100,39 1,72 Η επαναληψιμότητα και η ενδιάμεση επαναληπτικότητα ήταν μικρότερη από 5% σε όλες τις περιπτώσεις. Αντίστοιχα και η ακρίβεια intra-day και inter-day κυμάνθηκε μεταξύ 95% και 105%. Κατά συνέπεια η προτεινόμενη μέθοδος αποδείχθηκε ακριβής (εντός της ημέρας και σε διάστημα τριών ημερών) εμφανίζοντας ταυτόχρονα καλή επαναληψιμότητα και ενδιάμεση επαναληπτικότητα για όλες τις εξεταζόμενες ουσίες. Στη συνέχεια της εργασίας αναπτύχθηκαν δύο διαφορετικές τεχνικές φασματοφωτομετρίας υπεριώδους. Η μέθοδος «Παραγώγισης Φασματικών Λόγων» και η πολυπαραμετρική στατιστική μέθοδος «Προβολές Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων σε Λανθάνουσες Δομές» PLS για τον προσδιορισμό υπογλυκαιμικών φαρμάκων. Αρχικά έγινε μεμονωμένος προσδιορισμός των ουσιών για σκευάσματα που περιέχουν μόνο μία δραστική και των οποίων τα έκδοχα δεν απορροφούν στα ίδια μήκη κύματος με τη δραστική. Η ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης για τις καμπύλες αναφοράς όλων των ουσιών έδειξε καλή συσχέτιση, με συντελεστή προσδιορισμού R 2 στο 0.999. Ακολούθησε ο ταυτόχρονος προσδιορισμός 2 δραστικών ουσιών για σκευάσματα στα οποία περιέχονται και των οποίων τα έκδοχα, δεν απορροφούν στα ίδια μήκη κύματος με αυτές. Τα δυαδικά μίγματα που εξετάστηκαν ήταν: γλιβενκλαμίδη-μετφορμίνη, γλιπιζίδη-μετφορμίνη, χλωροπροπαμίδη-φαινφορμίνη και τολβουταμίδη-μετφορμίνη. Τα χαρακτηριστικά των καμπυλών βαθμονόμησης των ουσιών που προσδιορίστηκαν με φασματοφωτομετρία υπεριώδους και τεχνικές παραγώγισης, ήταν τα εξής: Μίγμα Γλιβενκλαμίδη Μετφορμίνη Γλιπιζίδη - Μετφορμίνη Χλωροπροπαμίδη Φαινφορμίνη Προσδιοριζόμενο συστατικό C (μg/ml) R 2 Κλίση Τομή LOD LOQ Γλιβενκλαμίδη (229.1nm) 8.19 40.96 0.9995 0.0041 0.0038 1.13 3.44 Μετφορμίνη (252.9 nm) 3.26 19.58 0.9998 0.0120 0.0016 0.36 1.09 Γλιπιζίδη (227.8nm) 7.97 39.84 0.9983 0.0035-0.0005 2.09 6.34 Μετφορμίνη (250.7nm) 3.26 19.58 0.9996 0.0287 0.0040 0.47 1.43 Χλωροπροπαμίδη (279.6nm) 8.42-42.08 0.9997 0.0662-0.0608 0,94 2.84 xii

Τολβουταμίδη Μετφορμίνη Φαινφορμίνη (215.9nm) 6.83 27.34 0.9993 0.0113 0.0027 0.79 2.39 Τολβουταμίδη (230.7nm) 8.13 40.64 0.9997 0.0053-0.0023 0.85 2.57 Μετφορμίνη (252.4nm) 3.26 19.58 0,9999 0,0657 0,0077 0.25 0.75 Τέλος, αναπτύχθηκε η χημειομετρική μέθοδος «Προβολές Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων σε Λανθάνουσες Δομές» με τη βοήθεια του υπολογιστικού προγράμματος Simca-P. Με τη μέθοδο της διασταυρούμενης αξιολόγησης (cross validation) καθορίστηκε ο αριθμός των συνιστωσών (components) που δίνει την ελάχιστη τιμή PRESS (Predicted-Residual-Sum-Of-Squares) για τη βέλτιστη πρόβλεψη του μοντέλου και υπολογίστηκαν οι τιμές r 2, Q 2, RMSEP (Root Mean Square Error of Prediction) και RMSEE (Root Mean Square Error of Estimation), ώστε να προσδιοριστούν τελικά οι % τιμές ανάκτησης των δραστικών ουσιών. Στον ακόλουθο πίνακα παρουσιάζονται τα στατιστικά αποτελέσματα της επεξεργασίας με την τεχνική PLS. Μίγμα Προσδιοριζόμενο συστατικό C (μg/ml) Συνιστώσες Q 2 r 2 RMSEE RMSEP Γλιβενκλαμίδη 8.19-40.96 2 0.999 1 0.357 0.828 Γλιβενκλαμίδη Μετφορμίνη Μετφορμίνη 3.26-19.58 2 0.999 1 0.146 0.123 Γλιπιζίδη 7.97-39.84 2 0.891 0.993 1.436 1.681 Γλιπιζίδη - Μετφορμίνη Μετφορμίνη 3.26-19.58 2 0.984 0.994 0.633 0.835 Χλωροπροπαμίδη 8.42-42.08 2 0.698 0.983 2.277 4.522 Χλωροπροπαμίδη Φαινφορμίνη Φαινφορμίνη 6.83-27.34 2 0.954 0.998 0.453 0.505 Τολβουταμίδη 8.13-40.64 2 0.919 0.996 1.086 1.727 Τολβουταμίδη Μετφορμίνη Μετφορμίνη 3.26-19.58 2 0.979 0.998 0.402 0.773 Για όλες τις μεθόδους πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αξιοπιστίας τους, ο οποίος περιλάμβανε την παρασκευή μια σειράς μικτών δειγμάτων, με διαφορετικές συγκεντρώσεις ως προς τη δραστική ουσία και στη συνέχεια τον επαναπροσδιορισμό τους ως άγνωστα. Τα αποτελέσματα των ανακτήσεων ήταν ικανοποιητικά στο πλείστον των περιπτώσεων. xiii

Ουσία Μετφορμίνη Ακολούθησε μια συγκριτική μελέτη των % τιμών ανάκτησης των ουσιών όπως αυτές προέκυψαν από τις διάφορες μεθόδους ανάλυσης. HPLC UV % Ανάκτηση UV -Derivative (238.4nm. μίγμα με γλιβενκλαμίδη) % Ανάκτηση UV- Derivative (252.9 nmμίγμα με γλιβενκλαμί δη) % Ανάκτηση Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 100.34 99.94 99.89 RSD% 2.62 1.04 0.74 LOD 1.74 0.58 0.36 LOQ 5.26 1.76 1.09 UV -Derivative (238.2nm. μίγμα με γλιπιζίδη) UV -Derivative (250.7nm. μίγμα με γλιπιζίδη) % Ανάκτηση % Ανάκτηση 101.93 100.35 5,07 1.86 0.61 1.86 0.47-1.43- Ουσία Μετφορμίνη UV -Derivative (243.4nm. μίγμα με τολβουταμίδη) % Ανάκτηση UV -Derivative (252.4nm. μίγμα με τολβουταμίδη) % Ανάκτηση PLS (μίγμα με γλιβενκλαμί δη) % Ανάκτηση Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 101.22 99.88 99.87 RSD% 4.43 1.50 0.78 PLS (μίγμα με γλιπιζίδη) PLS (μίγμα με τολβουταμίδη) % Ανάκτηση % Ανάκτηση 99.06 95.29 5.95 2.6 LOD 0.60 0.25 - LOQ 1.82 0.75 - Ουσία Τολβουταμίδη HPLC UV % Ανάκτηση UV -Derivative (217.5. nm. μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση UV- Derivative (230.7 nmμίγμα με μετφορμίνη % Ανάκτηση Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 100.25 99.53 100.29 RSD% 1.92 3.56 2.03 LOD 1.86 1.38 0.85 LOQ 5.64 4.2 2.56 PLS (μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση 109.23 9.53 Ουσία Γλιπιζίδη HPLC UV % Ανάκτηση UV -Derivative (227.8nm. μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση PLS (μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση 103.98 Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 100.27 101.95 RSD% 2.07 2.66 8.06 LOD 1.86 1.38 LOQ 5.64 4.2 xiv

Ουσία Γλιβενκλαμίδη HPLC UV % Ανάκτηση UV -Derivative (215.1nm. μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση UV- Derivative (229.1 nmμίγμα με μετφορμίνη % Ανάκτηση Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 100.28 99.61 101.17 RSD% 2.09 3.94 2.11 LOD 1.99 1.38 0.85 LOQ 6.05 4.2 2.56 PLS (μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση 103.74 2.20 Ουσία Χλωροπροπαμίδη HPLC UV % Ανάκτηση UV -Derivative (219.7nm. μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση UV- Derivative (279.6 nmμίγμα με μετφορμίνη % Ανάκτηση PLS (μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση 104.43 Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 100.26 106.09 101.43 RSD% 2.03 8.49 1.92 16.75 LOD 2.01 1.38 0.85 LOQ 6.10 4.2 2.56 Ουσία Φαινφορμίνη HPLC UV % Ανάκτηση UV -Derivative (215.9nm. μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση Συγκέντρωση Μέση % ανάκτηση 100.39 100.12 RSD% 2.95 4.08 LOD 1.92 1.38 LOQ 5.81 4.2 PLS (μίγμα με μετφορμίνη) % Ανάκτηση 101 4.10 Οι τιμές των % ανακτήσεων που προέκυψαν από όλες τις μεθόδους είναι πολύ καλές, γεγονός που επιβεβαιώνει την πολύ καλή ακρίβεια τόσο των χρωματογραφικών, όσο και των φασματοφωτομετρικών μεθόδων. Μικρότερη ακρίβεια παρατηρήθηκε στα αποτελέσματα της μεθόδου PLS όπου παρατηρήθηκαν τιμές μέσης ανάκτησης από 95 έως 110 περίπου της εκατό. Καλύτερη επαναληψιμότητα παρουσίασε η μέθοδος HPLC με τιμές RSD% να κυμαίνονται μεταξύ 1.92 και 2.95. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου UV derivative παρουσίασε διακυμάνσεις ανάλογα και με το μήκος κύματος που χρησιμοποιήθηκε. Σε άλλες περιπτώσεις υπήρξε ιδιαίτερα ικανοποιητική (π.χ RSD%=1.04) και σε άλλες κακή (π.χ RSD%=8.49). Tέλος η μέθοδος PLS δεν παρουσίασε ιδιαίτερα xv

ικανοποιητική επαναληψιμότητα καθώς σε πολλές περιπτώσεις το RSD% ήταν αρκετά υψηλό (π.χ 16.75 και 9.53) Όσον αφορά τα LOD και LOQ, η μέθοδος PLS δεν παρείχε αντίστοιχες τιμές, ενώ για τις υπόλοιπες μεθόδους προκύπτει ότι η UV-Derivative είναι ελαφρά πιο ευαίσθητη μέθοδος από την HPLC-UV. xvi

ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΚΑΙ HPLC 1.1 ΓΕΝΙΚΑ 1.1.1 Ορισμός Χρωματογραφίας Η χρωματογραφική ανάλυση, γνωστή συνήθως ως χρωματογραφία, περιλαμβάνει σειρά τεχνικών φυσικού διαχωρισμού και προσδιορισμού των συστατικών μίγματος ανόργανων ή οργανικών ουσιών {1}. 1.1.2 Ιστορική Αναδρομή Η χρωματογραφία ανακαλύφθηκε και χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Ρώσο βοτανολόγο Tswett (1903), στην προσπάθειά του να διαχωρίσει τις χρωστικές των φύλλων. Αυτός εκχύλισε τα πράσινα μέρη των φύλλων σε πετρελαϊκό αιθέρα και διαβίβασε το εκχύλισμα μέσα από στήλη από κονιοποιημένο CaCO 3, οπότε τα συστατικά (χλωροφύλλες) διαχωρίσθηκαν σε διακριτές έγχρωμες ζώνες (χρωματογραφία προσρόφησης). Εξαιτίας αυτού του γεγονότος, η τεχνική ονομάσθηκε διεθνώς χρωματογραφία, από τις ελληνικές λέξεις χρώμα και γράφω, αν και τα χρώματα είναι συμπτωματικά και καμία σχέση δεν έχουν με τις αρχές της τεχνικής. Από τότε η τεχνική βελτιώθηκε και διαμορφώθηκαν και άλλες τεχνικές, ώστε σήμερα η χρωματογραφία να αποτελεί την καλύτερη τεχνική διαχωρισμού και αναλύσεως πολύπλοκων μιγμάτων και απομονώσεως ευπαθών ουσιών, έγχρωμων και άχρωμων {1}. Το 1941 οι Martin και Synge ανακάλυψαν την χρωματογραφία κατανομής. Το 1944 οι Consden, Gordon και Martin ανακάλυψαν την χρωματογραφία χάρτου. Το 1952 οι Martin και James ανακάλυψαν την αέριο χρωματογραφία. Το 1967 οι Huber και Hulsman ανακάλυψαν την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) {2}. 1

1.1.3 Αρχή Λειτουργίας Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με κατανομή των συστατικών μεταξύ δύο μη μιγνυόμενων φάσεων, μιας στατικής και μιας κινητής. Ο διαχωρισμός βασίζεται στις διαφορές, που υπάρχουν σε ορισμένες ιδιότητες των συστατικών ενός μίγματος, όπως είναι το σημείο ζέσεως, η πολικότητα, τα ηλεκτρικά φορτία (για ιονικές ενώσεις), το μέγεθος των μορίων κ.α. Οι διαφορές αυτές διαφοροποιούν τη σχετική φυσικοχημική συγγένεια κάθε συστατικού προς τις δύο φάσεις {1}. 1.1.3.1 Βασική αρχή και ορολογία χρωματογραφίας εκλούσεως {1} Ορισμένη ποσότητα δείγματος δύο συστατικών, Α και Β, προστίθεται στην κινητή φάση στην κορυφή ή αρχή της στήλης. Καθώς το δείγμα μετακινείται στη στήλη, τα συστατικά του κατανέμονται, με κάποιο μηχανισμό, μεταξύ της στατικής και κινητής φάσεως. Τα κλάσμα κάθε συστατικού που βρίσκεται στην κινητή φάση, μετακινείται στη στήλη, ερχόμενο σε επαφή με το νέο τμήμα της στατικής φάσεως, οπότε συμβαίνει νέα κατανομή. Κατά τον ίδιο χρόνο, το κλάσμα του συστατικού, που βρισκόταν στη στατική φάση, έρχεται σε επαφή με νέο τμήμα της κινητής φάσεως, οπότε υφίσταται περαιτέρω κατανομή. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές, καθώς διαβιβάζεται συνεχώς, και συνήθως με σταθερή παροχή, νέα κινητή φάση στη στήλη. Τα συστατικά μετακινούνται μέσα από τη στήλη, μόνο όταν βρίσκονται στην κινητή φάση και η ταχύτητα μετακινήσεώς τους εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους σε αυτή, το οποίο είναι συνάρτηση του συντελεστή κατανομής τους στις δύο φάσεις. Έτσι, συστατικά με διαφορετικούς συντελεστές κατανομής θα μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες μέσα από τη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες. Στο τέλος τα διαχωρισμένα συστατικά εξέρχονται από τη στήλη, όπου μπορούν να ανιχνευθούν ή και να συλλεγούν. Η κινητή φάση (υγρό ή αέριο) ονομάζεται υγρό (ή αέριο) εκλούσεως, ενώ το διάλυμα, που εξέρχεται από τη στήλη, έκλουσμα. Η διαδικασία αυτή, δηλαδή η διαβίβαση υγρού (ή αέριου) εκλούσεως μέσα από τη χρωματογραφική στήλη, ονομάζεται έκλουση και εάν αυτό γίνεται με σταθερή παροχή, τότε μιλούμε για γραμμική έκλουση. Στο τέλος της στήλης τοποθετείται συνήθως ένας ανιχνευτής, που παρακολουθεί μία αναλυτική ιδιότητα του εκλούσματος και παράγει ένα σήμα, κάθε φορά που εκλούεται ένα συστατικό (χρωματογραφική κορυφή). Το διάγραμμα αυτού του σήματος ως συνάρτηση του όγκου του υγρού (ή αερίου) εκλούσεως ονομάζεται χρωματογράφημα. Στην περίπτωση γραμμικής εκλούσεως, αντί του όγκου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο χρόνος. Τα χρωματογραφήματα εκλούσεως παρέχουν 2

πληροφορίες, χρήσιμες για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση, επειδή ο χρόνος, που χρειάζεται ένα συστατικό για να εκλουσθεί, είναι χαρακτηριστικός για το συστατικό αυτό, ενώ το ύψος ή η ολοκληρωμένη επιφάνεια της κορυφής του σήματος μπορεί να σχετισθεί με τη συγκέντρωση του συστατικού. Η βάση της χρωματογραφίας εκλούσεως είναι η κατανομή των συστατικών ενός δείγματος μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσεως, η οποία είναι μία διαδικασία ισορροπίας, που περιγράφεται με το λόγο ή συντελεστή κατανομής Κ, που ορίζεται με τη σχέση K=C s /C M (1) Όπου C s και C M είναι οι συγκεντρώσεις του συστατικού στη στατική (S) και κινητή φάση (Μ), αντίστοιχα. Σχήμα 1.1: Χρωματογραφική διαδικασία 3

1.1.4 Εφαρμογές Οι χρωματογραφικές τεχνικές βρίσκουν εφαρμογή τόσο στη χημική ανάλυση όσο και στην απομόνωση και παραλαβή των συστατικών που έχουν διαχωριστεί. Η αναλυτική χρωματογραφία βρίσκει εφαρμογές στην έρευνα, στην ανάπτυξη μεθόδων για τον προσδιορισμό των συστατικών που διαχωρίζονται και στον έλεγχο ποιότητας. Η παρασκευαστική χρωματογραφία βρίσκει εφαρμογή στην απομόνωση και παραλαβή μικρών ή μεγάλων ποσοτήτων συστατικών μίγματος σε καθαρή κατάσταση για συγκεκριμένη χρήση {3}. Η χρωματογραφία σήμερα βρίσκει εφαρμογή όχι μόνο στον κλάδο της Χημείας αλλά και σε άλλες επιστήμες, όπως η Βιολογία, η Ιατρική, η Φαρμακευτική, η Βιοχημεία, η επιστήμη περιβάλλοντος, η επιστήμη των τροφίμων, η Γεωπονία, η Τοξικολογία {1} κ.α 1.2 ΕΙΔΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ Η διαφοροποίηση των χρωματογραφικών τεχνικών καθιστά δύσκολη την ταξινόμησή τους με ένα μόνο κριτήριο. Οι τεχνικές αυτές διαφέρουν ως προς τη φύση της κινητής φάσεως, ως προς το μηχανισμό, στον οποίο οφείλεται ο διαχωρισμός και ως προς τον τρόπο εισαγωγής του δείγματος στη στατική φάση και κινήσεώς του μέσα απ αυτή. Έτσι η ταξινόμηση μπορεί να γίνει: 1) Με βάση τη φύση της κινητής και στατικής φάσεως: Ταξινομούνται σε υγρή χρωματογραφία (LC) και αέρια χρωματογραφία (GC), αναλόγως του εάν η κινητή φάση είναι υγρή ή αέρια. Οι δύο αυτές τάξεις υποδιαιρούνται παραπέρα ανάλογα με τη φύση της στατικής φάσεως, που μπορεί να είναι στερεή ή υγρή επάνω σε στερεό αδρανή φορέα. Έτσι, διακρίνονται σε υγρήστερεή χρωματογραφία (LSC), υγρή-υγρή χρωματογραφία (LLC), αέρια-στερεή χρωματογραφία (GSC), και αέρια-υγρή χρωματογραφία (GLC). 2) Με βάση το μηχανισμό διαχωρισμού: Ταξινομούνται στις ακόλουθες πέντε τάξεις, ανάλογα με το μηχανισμό, με τον οποίο τα συστατικά του μίγματος κατακρατούνται από τη στατική φάση και γίνεται έτσι δυνατός ο διαχωρισμός: 4

α) Χρωματογραφία προσροφήσεως β) Χρωματογραφία ιονανταλλαγής γ) Χρωματογραφία κατανομής δ) Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού ε) Χρωματογραφία συγγενείας 3) Με βάση τη φυσική μορφή της στατικής φάσεως: α) χρωματογραφία στήλης: i) χρωματογραφία πληρωμένων στηλών ii) χρωματογραφία ανοικτών τριχοειδών στηλών β) επίπεδη χρωματογραφία: i) χρωματογραφία χάρτου ii) χρωματογραφία λεπτής στιβάδας 4) Με βάση τον τρόπο εισαγωγής και κινήσεως του δείγματος α) μετωπική χρωματογραφία ( το διάλυμα του δείγματος εισάγεται στη στήλη συνεχώς και ο διαλύτης δρα και ως κινητή φάση. Τα συστατικά του δείγματος εξέρχονται από τη στήλη με τη μορφή μετώπων) β) χρωματογραφία εκτοπίσεως (χρησιμοποιείται κινητή φάση που συγκρατείται ισχυρώς από τη στατική φάση, εκτοπίζοντας έτσι σε διάφορο βαθμό τα συστατικά του δείγματος μέσα από τη στήλη) γ) χρωματογραφία εκλούσεως (τα συστατικά του δείγματος μεταφέρονται από την κινητή φάση με διαφορετική ταχύτητα κατά μήκος της στατικής φάσης, οπότε εξέρχονται από τη στήλη σε διαφορετικούς χρόνους) {1} 5

1.3 ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ (HPLC) 1.3.1 Ιδιαίτερα χαρακτηριστικά και σύγκριση με την κλασική χρωματογραφία στήλης Η τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αποτελεί επέκταση της κλασικής χρωματογραφίας ανοιχτής στήλης και η ανάπτυξή της οφείλεται στη βελτίωση της τεχνολογίας (χρήση Η/Υ, κατασκευή ανθεκτικών στηλών, χρήση νέων ανιχνευτών) και στις βελτιωμένες δυνατότητες που παρέχει έναντι των άλλων αναλυτικών μεθόδων. Η κλασική υγρή χρωματογραφία στήλης χρησιμοποιεί στήλες σχετικά μεγάλης διαμέτρου, πληρωμένες με μεγάλης διαμέτρου σωματίδια πληρωτικού υλικού και μικρές ταχύτητες ροής της κινητής φάσεως, που πετυχαίνονται λόγω βαρύτητας ή με τη χρησιμοποίηση αντλιών χαμηλής πιέσεως. Ως εκ τούτου, ο χρόνος που απαιτείται για ένα διαχωρισμό είναι συχνά της τάξεως των μερικών ωρών και τα συλλεγόμενα κλάσματα πρέπει συνήθως να αναλυθούν ξεχωριστά, αυξάνοντας σημαντικά το συνολικό χρόνο αναλύσεως {1}. Αντίθετα στην HPLC χρησιμοποιούνται μοντέρνες αναλυτικές στήλες μικρότερης διαμέτρου που περιέχουν κόκκους μεγέθους 3-10 μm. H προκύπτουσα έτσι, πυκνή συσκευασία της στήλης παράγει μια υψηλή αντίσταση ροής, ώστε η κινητή υγρή φάση να περάσει με πίεση από την στήλη {4}. Με την HPLC επιτυγχάνονται ταχύτεροι και καλύτερης απόδοσης διαχωρισμοί μιγμάτων. 1.3.2 Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα μεθόδου- Κριτήρια επιλογής της. Βασικά κριτήρια για την επιλογή της Υγρής Χρωματογραφίας και ιδιαίτερα της HPLC ως μεθόδου ελέγχου ποιότητας φαρμάκων είναι: Η αναγκαιότητα υψηλής ικανότητας διαχωρισμού και εκλεκτικότητας στον παράλληλο προσδιορισμό περισσότερων δραστικών ουσιών σε ένα φαρμακευτικό σκεύασμα ή στον προσδιορισμό προϊόντων διάσπασης, παράλληλα με τον προσδιορισμό της δραστικής ουσίας (π.χ. έλεγχος καθαρότητας, έλεγχος σταθερότητας). Η διαχωριστική ικανότητα των στηλών της HPLC είναι πολύ μεγαλύτερη από τις κοινές ανοιχτές στήλες. Η απλή προετοιμασία του δείγματος στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, κυρίως στις υγρές φαρμακοτεχνικές μορφές. Τα περισσότερα υδατικά ή αλκοολικά υγρά σκευάσματα, μπορούν να αναλυθούν, είτε απ ευθείας είτε μετά από 6

αραίωση. Η διάλυση της δραστικής ουσίας από στερεές φαρμακοτεχνικές μορφές, μπορεί να επιτευχθεί με τη βοήθεια πολικών διαλυτών, οι οποίοι είναι εν μέρει ακατάλληλοι για την αέριο χρωματογραφία και τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. Όπως και σε όλες τις άλλες χρωματογραφικές μεθόδους, έτσι και στη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας, τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από μία ανάλυση, είναι τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά και επομένως μπορεί να προσδιοριστεί, αφενός μεν η ποιότητα, αφετέρου δε η ποσότητα της δραστικής ουσίας. {4} αναγέννησης. Οι στήλες της HPLC χρησιμοποιούνται πολλές φορές χωρίς την ανάγκη Ο χρόνος ανάλυσης στην HPLC είναι μικρότερος Η οργανολογία της HPLC αυτοματοποιείται εύκολα και επομένως είναι δυνατόν να πραγματοποιηθεί μεγάλος αριθμός ποσοτικών αναλύσεων. Επειδή η όλη διαδικασία της ανάλυσης εξαρτάται από την οργανολογία και λιγότερο από την ικανότητα του χειριστή-αναλυτή, η επαναληψιμότητα είναι καλύτερη. Είναι δυνατή η ταυτόχρονη διεξαγωγή χρωματογραφικών αναλύσεων φαρμάκων διαφορετικής χημικής δομής {5} Ένα μειονέκτημα της μεθόδου της Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης, σε σχέση με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας και σε σχέση με τη μέθοδο της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας, είναι η αναγκαιότητα μεγάλου χρόνου στη ρύθμιση του οργάνου κατά την επεξεργασία διαφόρων δειγμάτων, καθώς επίσης και το μεγάλο κόστος αγοράς του οργάνου και των διαλυτών {4}. 7

1.3.3 Είδη HPLC Η τεχνική HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαχωρισμούς βασισμένους σε προσρόφηση, ιονανταλλαγή, κατανομή, μοριακό αποκλεισμό και συγγένεια. α) Χρωματογραφία προσροφήσεως Είναι η παλαιότερη χρωματογραφική τεχνική στην οποία τα συστατικά του μίγματος αλληλεπιδρούν (προσροφούνται) στην επιφάνεια ή σε ορισμένες θέσεις της επιφάνειας στερεής, συνήθως, στατικής φάσης. Η ισορροπία που αποκαθίσταται μεταξύ των προσροφημένων σωματιδίων και των σωματιδίων στην κινητή φάση, η οποία μπορεί να είναι υγρή ή αέρια, πετυχαίνει το διαχωρισμό. Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι ηλεκτροστατικής φύσης, διπόλου-διπόλου, δυνάμεις London ή συνδυασμός των δυνάμεων αυτών. Κατατάσσεται στη χρωματογραφία κανονικής φάσης όπου η στατική φάση (διοξείδιο του πυριτίου SiO 2 ή αλουμίνα Al 2 O 3 ) είναι πολικότερη από την κινητή φάση που αποτελείται από μη πολικούς διαλύτες όπως εξάνιο, χλωροφόρμιο κ.α. {6} β) Χρωματογραφία ιονανταλλαγής Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμενων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης. Έτσι, στην περίπτωση της κατιοντοανταλλαγής λαμβάνει χώρα η ισορροπία : RSO3 X Y RSO3 Y X Όπου X RSO 3 είναι η δραστική ομάδα της στατικής φάσης και Y + το αναλυόμενο κατιόν. Ανάλογη ισορροπία ισχύει και στην περίπτωση της ανιοντοανταλλαγής. Οι κυριότερες παράμετροι που καθορίζουν τη συγκράτηση στη χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής είναι το αντίθετο ιόν της δραστικής ομάδας της στατικής φάσης, η ιονική ισχύς, το ph, ο τροποποιητής της κινητής φάσης και η θερμοκρασία. Ως υλικά πλήρωσης χρησιμοποιούνται διάφορες ρητίνες που αποτελούν συμπολυμερή στυρενίου-διβινυλοβενζολίου, στα οποία έχουν εισαχθεί σουλφονικές ή καρβοξυλικές ομάδες, τριτοταγείς ή τεταρτοταγείς αμίνες. {7} 8

γ) Χρωματογραφία κατανομής Εφαρμόζεται στην ανάλυση ομόλογων μη ιονικών ενώσεων. Η υγρή στατική φάση σχηματίζει λεπτό υμένιο στην επιφάνεια στερεού υποστρώματος. Ο διαχωρισμός βασίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών του μίγματος μεταξύ της υγρής κινητής και της υγρής στατικής φάσης. Κατατάσσεται στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης όπου η στατική φάση που είναι λιγότερο πολική της κινητής, αποτελείται από διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) συζευγμένο με ομοιοπολικό δεσμό με αλκύλια, φαινύλια, αμινοομάδες, διόλες κ.α ενώ η κινητή φάση αποτελείται από μίγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή νερό. Τα υλικά της συζευγμένης φάσης πλεονεκτούν ως προς τη σταθερότητα αλλά και τη συμβατότητα με μεγάλη ποικιλία εκλουστικών συστημάτων. Είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική HPLC και χρησιμοποιείται στο 80% περίπου των αναλυτικών εφαρμογών. {8} δ) Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βάση το σχήμα και το μέγεθος των μορίων των υπό ανάλυση ενώσεων. Τα μεγαλύτερα μόρια προχωρούν με μεγαλύτερη ταχύτητα. Σε αντίθεση με τα άλλα είδη χρωματογραφίας, δεν υπάρχει αλληλεπίδραση ανάμεσα στη στατική φάση και τα διαχωριζόμενα συστατικά. Η υγρή ή αέρια κινητή φάση διαπερνά μέσα από πορώδη πηκτή. Το μέγεθος των πόρων είναι μικρό και αποκλείονται τα μεγάλα μόρια του προσδιοριζόμενου συστατικού που προχωρούν χωρίς να εισέλθουν στην πηκτή ενώ τα μικρά μόρια εξέρχονται από τη στήλη σε μεγαλύτερο χρόνο. Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού βρίσκει εφαρμογές στους προσδιορισμούς και το χαρακτηρισμό των πολυμερών. {5} ε) Χρωματογραφία συγγενείας Για να επιτευχθεί διαχωρισμός οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες (ligand) οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι με ομοιοπολικούς δεσμούς στην επιφάνεια του διοξειδίου του πυριτίου. Για παράδειγμα ο υποκαταστάτης μπορεί να είναι ένα είδος αντισώματος σε μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη. Κατά τη διέλευση μέσα από τη στήλη μίγματος μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών μόνο μία πρωτεΐνη αντιδρά με το συγκεκριμένο αντίσωμα. Μετά την έκπλυση των υπολοίπων συστατικών από τη στήλη η επιθυμητή πρωτεΐνη αποδεσμεύεται από το αντίσωμα με μεταβολή της τιμής ph ή της ιονικής ισχύος. 9

Αποτελεί την πιο σύγχρονη και την πιο εκλεκτική χρωματογραφική τεχνική. Στην κατηγορία αυτή ανήκει η Χρωματογραφία Εναντιομερών με την οποία διαχωρίζονται εναντιομερείς μορφές ενώσεων που παρουσιάζουν χειρομορφία. Για μερικά φάρμακα που παρουσιάζουν χειρομορφία, η επιθυμητή φαρμακολογική δράση οφείλεται εξ ολοκλήρου στο ένα εναντιομερές ενώ ο αντίποδας είναι υπεύθυνος για σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες. Η Χρωματογραφία Εναντιομερών είναι αποτελεσματική μέθοδος για το διαχωρισμό των ρακεμικών μιγμάτων. {9} 10

Σχήμα 1.2: Είδη HPLC 1.3.4 Οργανολογία HPLC Ένα τυπικό σύστημα οργάνου HPLC για ισοκρατική έκλουση αποτελείται από: i) Δεξαμενή διαλυτών ii) Μία αντλία για την προώθηση διαλύτη με πίεση μέχρι 4000 psi και ροή μέχρι 10 ml/min. iii) Έναν εγχυτήρα βρόχου καθορισμένου όγκου μεταξύ 1 και 200 μl (20μl είναι ο τυπικά χρησιμοποιούμενος). iv) Μια στήλη, που είναι συχνά σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα πληρωμένος συνήθως με πηκτή διοξειδίου του πυριτίου (πυριτία) καλυμμένη με οκταδεκαλοσιλάνιο (ODS) με μέση διάμετρο σωματιδίων 3,5 ή 10 μm. v) Έναν ανιχνευτή, που είναι συνήθως ανιχνευτής υπεριώδους-ορατού (UV/Vis), αν και για εξειδικευμένες εφαρμογές ένα μεγάλο εύρος ανιχνευτών είναι διαθέσιμο. vi) Ένα σύστημα συλλογής δεδομένων, που μπορεί να είναι ένας υπολογιστικός ολοκληρωτής ή ένας υπολογιστής με λογισμικό κατάλληλο για την επεξεργασία των χρωματογραφικών δεδομένων. vii) Η στήλη συνδέεται με τον εγχυτήρα και τον ανιχνευτή με σωληνώσεις στενής εσωτερικής διαμέτρου, περίπου 0,2 mm, προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί ο «νεκρός όγκος», δηλ. ο κενός χώρος στο σύστημα στον οποίο δεν γίνεται χρωματογραφία και μπορεί να προκαλέσει διεύρυνση των ζωνών λόγω της διαμήκους διάχυσης. 11

viii) Περισσότερο προηγμένα όργανα μπορεί να έχουν αυτόματο σύστημα έγχυσης του δείγματος, φούρνο στήλης, και είναι ικανά να αναμιγνύουν δύο ή περισσότερους διαλύτες σε χρονικά μεταβαλλόμενες αναλογίες ώστε να παράγουν μια κινητή φάση βαθμιδωτής έκλουσης {10}. Σχήμα 1.3: Τυπικό σύστημα HPLC 12

1.3.4.1 Σύστημα παροχής κινητής φάσης (Αντλίες) Αποτελείται από μία αντλία υψηλής πιέσεως και συνήθως ένα σύστημα για τη βαθμιαία αλλαγή της συστάσεως της κινητής φάσεως. Σε αντίθεση με την ισοκρατική έκλουση, στην οποία η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση, στη βαθμιδωτή έκλουση η σύσταση της κινητής φάσεως μεταβάλλεται βαθμιαία ή κατά τακτά χρονικά διαστήματα, με βάση διάφορα προγράμματα. Για την επίτευξη της βαθμιδωτής εκλούσεως, απαιτείται μονάδα προγραμματισμού και ελέγχου του συστήματος παροχής, που συνήθως ελέγχεται από ένα μικροϋπολογιστή. Ο ρόλος των αντλιών είναι η άντληση της κινητής φάσης και η ώθησή της στη στήλη. Πρέπει να είναι ικανές να λαμβάνουν ακριβή όγκο διαλύτη και με επαναλαμβανόμενη σταθερή ταχύτητα ροής και πίεση. Οι ταχύτητες ροής που μπορούν να επιτευχθούν χρησιμοποιώντας τέτοιου είδους αντλίες είναι 0,01-10 ml/min ενώ μπορούν να λειτουργήσουν σε πιέσεις 5-40 MPa. Οι αντλίες HPLC είναι δύο τύπων: α) αντλίες σταθερής ροής (που χρησιμοποιούνται ευρέως) β) αντλίες σταθερής πίεσης. Οι αντλίες σταθερής πίεσης είναι πιο απλές στην κατασκευή, έχουν χαμηλότερο κόστος και δεν προκαλούν παλμούς με αποτέλεσμα να μειώνεται ο θόρυβος της βασικής γραμμής στο χρωματογράφημα. Εντούτοις δεν διατηρούν σταθερή την ταχύτητα ροής με συνέπεια να παρατηρούνται μεταβολές στο εμβαδόν των κορυφών και των χρόνων κατακράτησης των ουσιών και ανακρίβειες κατά τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό. Η αντλία πρέπει να είναι κατασκευασμένη από αδρανές υλικό ως προς όλα τα είδη των διαλυτών που θα χρησιμοποιηθούν και να μπορεί να παρέχει σταθερή ροή με ακρίβεια και χωρίς διακυμάνσεις ώστε να μη συνεισφέρει στο θόρυβο του ανιχνευτή {11}. Επειδή κατά τη λειτουργία της αντλίας δημιουργούνται παλμοί ροής, που διαταράσσουν τη σταθερότητα του χρωματογραφήματος, παρεμβάλλεται μία συσκευή αποσβέσεως των παλμών για την εξομάλυνση του καταγραφήματος {1}. 1.3.4.2 Διαλύτες (Κινητή φάση) Τα δοχεία αποθηκεύσεως διαλυτών πληρώνονται με διαλύτες διαφορετικής πολικότητας (με την προϋπόθεση ότι είναι αναμίξιμοι) ή διαλύματα διαφορετικού ph ή διαφορετικής ιονικής ισχύος ή συγκεντρώσεως κάποιου άλατος, ανάλογα με το είδος του επιδιωκόμενου μηχανισμού διαχωρισμού, και αναμιγνύονται στο θάλαμο αναμίξεως πριν την προώθηση τους από την αντλία. Οι διαλύτες πρέπει να είναι καθαροί και να απαερώνονται (διηθούνται από ειδικά φίλτρα υπό κενό) για την 13

αποφυγή δημιουργίας φυσαλίδων στην κυψελίδα και ασταθούς πίεσης στο κύκλωμα ροής. {1}. 1.3.4.2.1 Επιλογή Κινητής Φάσης {12} Η εύρεση της καταλληλότερης κινητής φάσης αποτελεί τη σημαντικότερη παράμετρο στην ανάπτυξη των αναλυτικών μεθόδων. Η επιλογή γίνεται με κριτήριο τον επιτυχή διαχωρισμό των συστατικών του μίγματος σε εύλογο χρονικό διάστημα. Η βελτιστοποίηση της σύστασης της κινητής φάσης αποτελεί επίπονη και χρονοβόρα διαδικασία. Οι παράμετροι που εξετάζονται είναι η πολικότητα, η ελουοτροπική ισχύς, η τοξικότητα των διαλυτών. Επίσης η συμβατότητα με τον χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή και το κόστος. Πολικότητα : η πολικότητα ενός διαλύτη σε συνδυασμό με την πολικότητα των υπό ανάλυση ουσιών καθορίζει το χρόνο συγκράτησής τους στην επιφάνεια της στήλης. Όσο πιο πολικός είναι ένας διαλύτης τόσο πιο γρήγορα εκλούονται οι πολικές ενώσεις και τόσο πιο αργά οι μη πολικές. Ελουοτροπική ισχύς Ε : είναι μία παράμετρος που σχετίζεται με την πολικότητα των διαφόρων διαλυτών και καθορίζεται από τη στατική φάση που χρησιμοποιείται. Τη μικρότερη ελουοτροπική ισχύ στη χρωματογραφία αντίστροφης φάσης την έχει το νερό (Η 2 Ο) που είναι διαλύτης με την μεγαλύτερη πολικότητα ενώ έχει τη μεγαλύτερη ελουοτροπική ισχύ στη χρωματογραφία κανονικής φάσης. Το αντίστροφο συμβαίνει με το εξάνιο, που είναι διαλύτης με την μικρότερη πολικότητα. Τοξικότητα : αποφεύγονται διαλύτες με τοξικές και ερεθιστικές ιδιότητες. Συμβατότητα με τον χρησιμοποιούμενο ανιχνευτή : όταν χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρικός ανιχνευτής UV-Vis θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη τα κατώτερα όρια απορρόφησης (cut off) των διαφόρων διαλυτών στο υπεριώδες. Επίσης ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης θα πρέπει να είναι χημικά αδρανής, απόλυτης καθαρότητας και να μη δημιουργεί καταβυθίσεις των συστατικών του δείγματος στην αναλυτική στήλη. Κόστος : το κόστος των χρησιμοποιούμενων διαλυτών αποτελεί απαγορευτική παράμετρο ειδικά σε αναλύσεις μεγάλου αριθμού δειγμάτων, όπου η κατανάλωση διαλυτών είναι μεγάλη. 14

1.3.4.3 Σύστημα εισαγωγής δείγματος Συχνά, ο περιοριστικός παράγοντας στην επαναληψιμότητα των μετρήσεων στην HPLC είναι ο τρόπος εισαγωγής των δειγμάτων στη στήλη. Το πρόβλημα επιδεινώνεται με τη διεύρυνση των κορυφών, που προκαλεί η υπερφόρτωση των στηλών. Συνεπώς οι όγκοι πρέπει να είναι οι ελάχιστοι δυνατοί, από μερικές δεκάδες ml έως 500 ml. Επιπλέον είναι σημαντικό να εισάγεται το δείγμα χωρίς να προκαλείται αποσυμπίεση του συστήματος {5} Η μονάδα εισαγωγής του δείγματος παρεμβάλλεται μεταξύ της αντλίας και της χρωματογραφικής στήλης και πρέπει να εξασφαλίζει την εισαγωγή του χωρίς αραίωση ενώ ταυτόχρονα ο διαχωρισμός να επιτυγχάνεται χωρίς διάχυση. Η εισαγωγή του δείγματος μπορεί να επιτευχθεί: Α) με μικροσύριγγα Β) με ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος και Γ) με αυτόματο δειγματολήπτη Η μικροσύριγγα παρουσιάζει ορισμένα μειονεκτήματα γι αυτό και χρησιμοποιείται ελάχιστα. Είναι δυνατόν να παρατηρηθεί αστάθεια στη βασική γραμμή γιατί καθώς εισάγεται το δείγμα διακόπτεται η ροή του εκλουστικού καθώς επίσης και απόφραξη της βελόνας από μικρά σωματίδια. {13} Η ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος είναι συνήθως μία περιστρεφόμενη βαλβίδα υψηλής πιέσεως, με βρόχο δείγματος. Αποτελείται από ένα ακίνητο χαλύβδινο κύλινδρο με 6 διαύλους, από τους οποίους ο ένας οδηγεί στη στήλη. Μέσα στο χαλύβδινο κύλινδρο υπάρχει ένας κινητός κύλινδρος από Teflon (με εξωτερικό χαλύβδινο κάλυμμα και μοχλό χειρισμού), ο οποίος διαθέτει τρεις αύλακες, ο καθένας από τους οποίους συνδέει ένα ζευγάρι διαύλων. Δύο δίαυλοι ενώνονται με ένα εξωτερικό χαλύβδινο βρόχο γνωστού πολύ μικρού όγκου. Στη θέση φορτώσεως, η κινητή φάση προωθείται προς τη στήλη, ενώ με τη βοήθεια σύριγγας πληρώνεται ο βρόχος δείγματος με το προς ανάλυση διάλυμα του δείγματος. Ακολούθως στρέφεται ο δακτύλιος του Teflon κατά 30 ο (θέση εισαγωγής ), οπότε η κινητή φάση παρασύρει ποσοτικά τον όγκο του δείγματος και τον προωθεί προς τη στήλη. Με το σύστημα αυτό δείγματα όγκου ολίγων μl εισάγονται με ακρίβεια και επαναληπτικότητα σε πιέσεις μέχρι και 41 MPa. {1} 15

Σχήμα 1.4: Ειδική βαλβίδα εισαγωγής δείγματος Οι αυτόματοι δειγματολήπτες αποτελούνται από ένα περιστρεφόμενο δίσκο όπου τοποθετούνται τα δείγματα, τα φιαλίδια με τα δείγματα, τη βαλβίδα εισαγωγής, το βρόχο δείγματος και τη σύριγγα. Όταν το δείγμα εισάγεται, ο δίσκος περιστρέφεται μέχρι το προγραμματισμένο φιαλίδιο να βρεθεί κάτω από τη μικροσύριγγα. Η τελευταία λαμβάνει μια ορισμένη ποσότητα δείγματος που στη συνέχεια διοχετεύεται στο βρόχο της βαλβίδας. {12} 1.3.4.4 Στήλες Σχήμα 1.5: Χρωματογραφικές στήλες Ευθύγραμμοι σωλήνες από ανοξείδωτο χάλυβα μήκους 10-30 cm και διαμέτρου 1-5 mm (4,6mm) αποτελούν ιδανικές στήλες για την HPLC. Η πλήρωση 16

αυτών των στηλών είναι πολύ δύσκολο να γίνει από τον αναλυτή και γι αυτό οι στήλες συνήθως αγοράζονται έτοιμες από διάφορες παρασκευάστριες εταιρίες. 1.3.4.4.1 Θερμοστάτες στήλης Σε πολλές εφαρμογές ο αυστηρός έλεγχος της θερμοκρασίας της στήλης δεν είναι αναγκαίος και οι στήλες λειτουργούν σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ωστόσο συχνά λαμβάνονται καλύτερα χρωματογραφήματα διατηρώντας τη θερμοκρασία της στήλης σταθερή εντός μερικών δεκάτων του βαθμού Κελσίου. Τα σύγχρονα όργανα είναι σήμερα εφοδιασμένα με θερμοστάτες που ελέγχουν τη θερμοκρασία της στήλης στην περιοχή θερμοκρασιών δωματίου μέχρι 100 ή 150 0 C. {5} 1.3.4.4.2 Προστήλη Συνήθως πριν από την αναλυτική στήλη, παρεμβάλλεται μια μικρή προστατευτική στήλη (προστήλη) για να αυξήσει το χρόνο ζωής της, απομακρύνοντας όχι μόνο τα αιωρούμενα σωματίδια και τις προσμίξεις από το διαλύτη, αλλά και συστατικά του δείγματος που συνδέονται με τη στατική φάση μη αντιστρεπτά. Επιπλέον, στη χρωματογραφία υγρού-υγρού, η προστήλη προκαλεί κορεσμό της κινητής φάσης με τη στατική έτσι ώστε να ελαχιστοποιούνται οι απώλειες του διαλύτη της αναλυτικής στήλης. Η σύσταση του υλικού της προστήλης πρέπει να είναι παρόμοια με αυτό της αναλυτικής στήλης. Ωστόσο, το μέγεθος των σωματιδίων είναι συνήθως μεγαλύτερο για να ελαχιστοποιείται η πτώση πίεσης. Όταν η προστήλη ρυπαίνεται, αναγομώνεται ή απορρίπτεται και αντικαθίσταται με νέα ίδιου τύπου. Επομένως η προστήλη θυσιάζεται για την προστασία της δαπανηρότερης αναλυτικής στήλης. {5} 1.3.4.4.3 Επιλογή Στατικής Φάσης Η επιλογή της στατικής φάσης και της αναλυτικής στήλης είναι σημαντικά για την ανάπτυξη της αναλυτικής μεθόδου και καθορίζεται από τις επιμέρους παραμέτρους : i. Το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως και τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης ii. Η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της στατικής φάσης iii. Η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως 17

iv. Ο τύπος του υποστρώματος το οποίο πρέπει να είναι χημικά αδρανές. v. Η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους, τόσο πιο πολική (όξινη) είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων. {14} 1.3.4.4.4. Μερικές συνήθως χρησιμοποιούμενες στατικές φάσεις HPLC 1) ODS πηκτή πυριτίας Η συνηθέστερα χρησιμοποιημένη φάση, εφαρμόσιμη στα περισσότερα προβλήματα στην ανάλυση φαρμακευτικών σκευασμάτων. Οι πρώτες φάσεις παρουσίασαν προβλήματα με ισχυρές βασικές ενώσεις λόγω της ατελούς επικάλυψης των ομάδων σιλανόλης (Si-OH). Οι αμίνες προσροφώνται ισχυρά στις ελεύθερες ομάδες σιλανόλης που δεν έχουν επικαλυφθεί από τη στατική φάση. Πλήρως επικαλυμμένες φάσεις και φάσεις με χαμηλό περιεχόμενο μετάλλων είναι πλέον διαθέσιμες, που επιτρέπουν την ανάλυση ισχυρά βασικών ενώσεων που έτειναν στο παρελθόν να εμφανίζουν κορυφές με ουρά. Η στατική φάση ODS πηκτής πυριτίας μπορεί ακόμα να εφαρμοστεί σε αναλύσεις πεπτιδίων, όπου χρησιμοποιούνται πληρωτικά υλικά με ευρείς πόρους ώστε να βελτιωθεί η πρόσβαση των ογκωδών αυτών μορίων στην εσωτερική επιφάνεια των πληρωτικών υλικών. Οι ομάδες της μακράς αλυσίδας του υδρογονάνθρακα ευθυγραμμίζονται παράλληλα η μία προς την άλλη και κάθετα προς την επιφάνεια των σωματιδίων της σίλικα δίνοντας τη δομή ψύκτρας. Τα μόρια των αναλυτών στην κινητή φάση «βυθίζονται» μέσα στις λιπόφιλες αλυσίδες των χημικά συνδεδεμένων στατικών φάσεων και «αποβυθίζονται» από αυτές με την κινητή φάση. Σχήμα 1.6: Αλληλεπιδράσεις επιφάνειας ODS με διάφορα μόρια {46} 18