ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΕΘΝΙΚΟΥ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ ΜΟΝΑΔΑ ΕΡΕΥΝΑΣ Β'ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Θ. ΟΙΚΟΝΟΜΟΠΟΥΛΟΣ 1 ΙΕΡΙΛΗΨΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ: ΕΡΙΦΥΛΗ ΚΥΡΙΑΖΗ ΘΕΜΑ: ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΩΝ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ ΤΗΣ ΛΙΠΟΝΕΚΤΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΣΤΕΦΑΝΙΑΙΑΣ ΝΟΣΟΥ ΚΑΙ ΙΝΣΟΥΛΙΝΟΑΝΤΟΧΗΣ ΑΘΗΝΑ 2009
ΠΕΡΙΛΗΨΗ H στεφανιαία νόσος αποτελεί τις τελευταίες δεκαετίες το πρώτο αίτιο θανάτου στις ανεπτυγμένες χώρες (1 στους 5 Θανάτους) και αναμένεται να αποτελέσει τα επόμενα 15 χρόνια την πρώτη αιτία Θανάτου παγκοσμίως. Αυτό οφείλεται στην αυξανόμενη συχνότητα της νόσου λόγω της αυξημένης επίπτωσης της παχυσαρκίας, του μεταβολικού συνδρόμου και του σακχαρώδη διαβήτη τύπον 2. Πλήθος ενδείξεων υποδεικνύουν την ινσουλινοαντίσταση ως μια κεντρική διαταραχή στην ανάπτυξη του καρδιαγγειακού δυσμεταβολικού συνδρόμου που προδιαθέτει σε αθηρωμάτωση. O λιπώδης ιστός έχει πλέον αναγνωριστεί ως σημαντικός ενδοκρινής αδένας ο οποίος παράγει και εκκρίνει πολυάριθμα ενεργά μόρια όπως κυτταροκίνες και ορμόνες οι οποίες εμπλέκονται στην παθογένεση της ινσουλινοαντίστασης, έχουν άμεσες δράσεις στο ενδοθήλιο και ευθύνονται για καρδιαγγειακές επιπλοκές. Η λιπονεκτίνη είναι μια πρωτεΐνη που παράγεται από το λιπώδη ιστό. Τα επίπεδά της στο πλάσμα μειώνονται σε καταστάσεις παχυσαρκίας και ινσουλινοαντίστασης και υπάρχουν ενδείξεις ότι σχετίζεται με την ανάπτυξη μεταβολικού συνδρόμου και αθηροσκλήρωσης. Έρευνες έχουν δείξει ότι η λιπονεκτίνη βελτιώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη και έχει αντιαθηρογόνες ιδιότητες επάγοντας την παραγωγή αντιφλεγμονωδών μεσολαβητών ενώ παράλληλα καταστέλλει την παραγωγή φλεγμονωδών κυτταροκινών. 'Ενας από τους στόχους της λιπονεκτίνης είναι τα περιφερικά μονοκύτταρα και τα προερχόμενα από αυτά μακροφάγα, τα οποία διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην ινσουλινοαντίσταση. τη φλεγμονή και την αθηρωμάτωση. Διάφοροι πολυμορφισμοί του γονιδίού της λιπονεκτίνης έχουν βρεθεί να επηρεάζουν την παραγωγή, έκκριση και δράση της ορμόνης. Οι διαταραχές αυτές είναι πιθανόν
να προκαλούν ινσουλινοαντίσταση, η οποία οδηγεί στην ανάπτυξη σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 και στεφανιαίας νόσού. Σκοπός: H παρούσα μελέτη αφορά τη συσχέτιση των κυκλοφορούντων επιπέδων λιπονεκτίνης και δέκα γνωστών πολυμορφισμών του γονιδίου της με την παρουσία εγκατεστημένης στεφανιαίας νόσου και ινσουλινοαντίστασης στον άνθρωπο. Επεδίωξε επίσης να διερευνήσει την επίδραση των δύο μορφών λιπονεκτίνης (σφαιρική και πλήρους μήκους) στην παραγωγή φλεγμονωδών και αθηρογόνων κυτταροκινών που συμβάλλούν στην διαδικασία της ινσουλινοαντίστασης και της αθηρωμάτωσης, καθώς και τη συμβολή της στην έκφραση των δύο υποδοχέων της. Υλικό-Μέθοδοι: Για το σκοπό αυτό συλλέξαμε 71 άτομα από την Ελλάδα, ένα πληθυσμό για τον οποίο δεν υπάρχουν ως τώρα δεδομένα στη βιβλιογραφία. Μετά από στεφανιογραφία και δοκιμασία κόπωσης, τα άτομα χωρίστηκαν δύο ομάδες: 42 άτομα με στεφανιαία νόσο (ηλικίας 59+8 ετών, ΒΜΙ 28,3+3,2 kg/m2), και 29 άτομα χωρίς στεφανιαία νόσο (ηλικίας 57+8 ετών, ΒΜΙ 28,2+2,7 kg/m 2). Σε όλους τους συμμετέχοντες μετρήθηκαν υπερηχογραφικοί δείκτες περιφερικής αγγειοπάθειας και υποβλήθηκαν σε από τον στόματος δοκιμασία ανοχής στη γλυκόζη. Απομονώθηκε γενωμικό DNA από τα λευκά αιμοσφαίρια όλων των ατόμων, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των πολυμορφισμών του γονιδίού της λιπονεκτίνης με την τεχνική της επιμήκυνσης με ειδικούς εκκινητές αλληλίων (ASPE) στον αναλυτή Luminex. Παράλληλα απομονώθηκαν ανθρώπινα μονοκύτταρα από μια υποομάδα 24 ατόμων (16 άτομα με στεφανιαία νόσο και 8 άτομα χωρίς στεφανιαία νόσο) για τα in vitro πειράματα μελέτης της επίδρασης της λιπονεκτίνης στην παραγωγή των φλεγμονωδών παραγόντων TNF-α και IL-6 και της έκφρασης των υποδοχέων της AdipoRl και AdopοR2 με τη μέθοδο της αλυσιδωτής πολυμεράσης πραγματικού χρόνον (Real-Time PCR).
Αποτελέσματα: Τα επίπεδα λιπονεκτίνης, των μορίων προσκόλλησης svcam, sicam και E-Selectin, τον παράγοντα t-ραι1, ον ενζύμου ΜΡΟ και της μεταλλοπρωτεϊνάσης ΜΜΡ9 στο πλάσμα των ασθενών, δεν είχαν διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες. Όμως, η κυκλοφορούσα λιπονεκτίνη βρέθηκε ότι έχει ισχυρή Θετική συσχέτιση με τα επίπεδα χοληστερόλης HDL και τον δείκτη ινσονλινικής ευαισθησίας MATSUDA. Στο in vivo σκέλος της μελέτης δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά κανενός από τους 10 προς μελέτη πολυμορφισμούς με τη στεφανιαία νόσο. Παρατηρήθηκε όμως ότι ορισμένοι γονότυποι σχετίζονται σημαντικά με δείκτες αθηροσκλήρωσης, ινσουλινοαντίστασης και παχυσαρκίας. "Ετσι διαπιστώθηκε ότι άτομα ομόζυγα για το κανονικό αλλήλιο του πολυμορφισμού T45G είχαν μειωμένα επίπεδα τριγλυκεριδίων και αυξημένο πάχος έσω-μέσου χιτώνα του ενδοθηλιακού τοιχώματος των καρωτίδων (ΙΜΤ) σε σχέση με τους ετεροζυγώτες. Οι ομόζυγοι για το κανονικό αλλήλιο τον πολυμορφισμού G276T βρέθηκε να έχουν αυξημένο λόγο περιμέτρου μέσης προς περίμετρο ισχύων (WHR) σε σχέση με τους ετερόζυγους, ενώ οι ετερόζνγοι είχαν αυξημένα επίπεδα HDL χοληστερόλης και αυξημένα επίπεδα του μορίού προσκόλλησης svcam σε σχέση με τους ομόζυγούς για το μεταλλαγμένο αλλήλιο. Επιπλέον, οι ομόζυγοι για το κανονικό αλλήλιο τον πολυμορφισμού A349G βρέθηκε ότι έχουν αυξημένο πάχος έσω-μέσου χιτώνα του ενδοθηλιακού τοιχώματος των καρωτίδων (ΙΜΤ) και μειωμένα επίπεδα τον μορίου προσκόλλησης svcam σε σχέση με τους ετερόζυγους. Τέλος, άτομα ετερόζυγα για τον πολυμορφισμό C(4034)Α είχαν αυξημένο δείκτη μάζας-σώματος σε σχέση με άτομα ομόζυγα για το κανονικό αλλήλιο. Τα in vitro πειράματα έδειξαν ότι το σφαιρικό τμήμα της λιπονεκτίνης επάγει την έκφραση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών TNF-a και IL-6 και στις δύο ομάδες
των συμμετεχόντων. Όμως, σε συνδυασμό με λιποπολνσακχαρίτη (LPS), τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτταροκινών παραμένουν σταθερά. Αντίθετα, η πλήρους μήκους λιπονεκτίυη φαίνεται να καταστέλλει τη έκφραση των φλεγμονωδών παραγόντων παρουσία LPS. Και οι δύο μορφές λιπονεκτίνης επάγουν την έκφραση του υποδοχέα AdipoRl, ενώ δεν φαίνεται να επηρεάζουν την έκφραση του υποδοχέα AdipοR2. Συμπεράσματα: H πρώτη παρατήρηση σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δοκιμασίας γλυκόζης στην οποία υποβλήθηκαν όλοι οι συμμετέχοντες, ήταν ότι η επίπτωση τον σακχαρώδη διαβήτη τύπον 2, αλλά και της διαταραγμένης ανοχής στη γλυκόζη η οποία αποτελεί Πρώιμο στάδιο της νόσού, ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα των στεφανιαίων ασθενών. Επίσης 38% των ατόμων χωρίς στεφανιαία νόσο παρουσίασαν δυσανοχή στη χρησιμοποίηση γλυκόζης χωρίς να το γνωρίζουν. "Εγινε ιδιαίτερη σύσταση στα άτομα αυτά για την πιθανή επιβάρυνση της κατάστασής τους λόγω της ινσουλινοαντίστασης που βρέθηκε να παρουσιάζουν. Το γεγονός ότι τα επίπεδα λιπονεκτίνης δεν διέφεραν ανάμεσα στις δύο ομάδες είναι σε συμφωνία με τα νεότερα βιβλιογραφικά δεδομένα όπού, στην περίπτωση εγκατεστημένης στεφανιαίας νόσού, τα επίπεδα λιπονεκτίνης αυξάνονται ως αντιρροπιστικός μηχανισμός ενάντια στις μεταβολικές και φλεγμονώδεις διαταραχές που αναπτύσσονται κατά την εκδήλωση της νόσου. H ισχυρή θετική συσχέτιση με το δείκτη MATSUDA καταδεικνύει την συμβολή της λιπονεκτίνης στην βελτίωση της ινσουλινικής ευαισθησίας. Από την ταυτοποίηση των πολυμορφισμών προέκυψε ότι οι γονότυποι TG(45), ΤΤ(276), AG(349)του γονιδίου της λιπονεκτίνης πιθανόν δρουν προστατευτικά ως προς την ανάπτυξη αθηρωμάτωσης και ινσουλινοαντοχής, ενώ οι γονότυποι ΤΤ(45), GG(276), ΑΑ(349) και CA(-4034) φαίνονται να έχουν πιθανή συσχέτιση με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης των παραπάνω διαταραχών.
Τέλος, τα ίη vitro πειράματα έδειξαν ότι η σφαιρική και η πλήρους μήκους λιπονεκτίνη έχουν διαφορετική δράση στα μονοκύτταρα. H σφαιρική λιπονεκτίνη επάγει αρχικά την έκφραση των φλεγμονωδών παραγόντων TNF-α και IL-6 αλλά στη συνέχεια δημιουργεί ένα είδος `ανοχής' η οποία δεν επιτρέπει την περεταίρω αύξηση των επιπέδων τους μετά την επίδραση LPS. Αντίθετα, η λ ιπονεκτίνη πλήρους μήκους, φαίνεται να καταστέλλει την έκφραση της φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-6 μετά από προσθήκη LPS. Συμπερασματικά, ούτε τα επίπεδα λιπονεκτίνης, ούτε κάποιος από τους πολυμορφισμούς τον γονιδίου της βρέθηκαν να σχετίζονται άμεσα με την ινσουλινοαντίσταση και τη στεφανιαία νόσο. Επιπλέον μάλλον φαίνεται ότι η προστατευτική δράση της λιπονεκτίνης επιτυγχάνεται μέσω της βελτίωσης της ευαισθησίας στην ινσουλίνη και της μεταφοράς της χοληστερόλης έξω από τα μακροφάγα. H πλήρους μήκους λιπονεκτίνη μοιάζει να έχει αντιφλεγμονώδεις δράσεις. ενώ το σφαιρικό κομμάτι της φαίνεται να επάγει την έκφραση φλεγμονωδών κuτταpοκινών. Τέλος, η πιθανή συμβολή κάποιων πολυμορφισμών στην ανάπτυξη ινσουλινοαντίστασης και στεφανιαίας νόσου, παραμένει να αξιολογηθεί σε μεγαλύτερο δείγμα ασθενών.