Immunofluorescence add primary antibody add FITC-conjugated antibody fixed or frozen tissue UV microscope
Ανοσοφθορισμός (DF και IDF) Είναι η εντόπιση Ag ή Ab με ειδικό Ab σημασμένο με φθοριόχρωμα. Φθοριοχρώματα:ουσίες που όταν ακτινοβoλούνται με φως μικρού μήκους κύματος (π.χ. αόρατη υπεριώδης ακτινοβολία) εκπέμπουν ορατό φως μεγαλύτερου μήκους κύματος Φθορίζουσες χρωστικές φλουορεσίνη, η ροδαμίνη κ.α. Η τεχνική του ανοσοφθορισμού εφαρμόζεται με 2 μεθόδους : άμεσο και έμμεσο
Άμεση μέθοδος (Direct Immunoflurorescence) Tο σημασμένο ειδικό Ab τοποθετείται πάνω στο παρασκεύασμα που περιέχει το ομόλογο Ag Δημιουργείται φθορίζον σύμπλεγμα. Αναζήτηση ή ταυτοποίηση των μικροβίων στο κλινικό δείγμα ή στην καλλιέργεια Legionella pneumophila κυρίως σε βρογχικές εκκρίσεις, C.trachomatis, HSV
Rapid diagnosis of Respiratory Syncytial Virus Infection by immunofluorescence of respiratory secretions
Έμμεση μέθοδος (Indirect Immunofluerescence) Το μη σεσημασμένο Ab (εξεταστέος ορός) τοποθετείται επί του Ag του υποστρώματος Η σύνδεση Ag-Ab (που δεν είναι φθορίζον σύμπλεγμα) αποδεικνύεται με την προσθήκη σεσημασμένης με φθοριόχρωμα αντισφαιρίνης (δεύτερο αντίσωμα - φθορίζον σύμπλεγμα). Χρησιμοποιείται Ab ειδικό για το Ag που θέλουμε να αναγνωρίσουμε
Έμμεση μέθοδος (Indirect Immunofluerescence) Η ένωση του Ag με το ομόλογό του Ab που βρίσκεται στον εξεταστέο ορό, γίνεται πάνω στην πλάκα. Αν το παρασκεύασμα εξετασθεί στο μικροσκόπιο φθορισμού, τα μικρόβια θα φανούν φωτεινά, λαμπερά, μέσα σε σκοτεινό οπτικό πεδίο. Το αποτέλεσμα αναλόγα της έντασης του φθορισμού, σαν αρνητικό ή θετικό (από 1 έως ++++).
Έμμεση μέθοδος (Indirect Immunofluerescence) Το κύριο αντιδραστήριο που δείχνει ότι έγινε η σύνδεση, αν δηλαδή στον εξεταστέο ορό υπάρχουν Abs προς το Ag, είναι η σημασμένη αντι-ανθρώπειος γ-σφαιρίνη (Ab προς την γ- σφαιρίνη του ανθρώπου) [παρασκευάζεται σε κόνικλο] Το Ab αυτό θα αναγνωρίσει την γ-σφαιρίνη, δηλ. το μικροβιακό Ab που θα έχει ενωθεί με το Ag, αν στον εξεταστέο ορό υπάρχουν Abs προς το Ag.
Έμμεση μέθοδος (Indirect Immunofluerescence) Η μέθοδος στηρίζεται στο πολυδύναμο του Ag, που παρά την αρχική του ένωση με το Ab έχει ακόμη ελεύθερα σημεία σύνδεσης, με τα οποία συνδέεται με το προστιθέμενο φθορίζον Ab Εφαρμογή: ορολογική διάγνωση της συφιλίδος (FTA και FTA Abs), Ab έναντι Legionella pneumophila, Borrellia burgdorferi, των Ρικετσιών, της Leishmania, του Εχινοκόκκου, του Τοξοπλάσματος και άλλων μικροοργανισμών.
Treponema pallidum με έμμεσο ανοσοφθορισμό
Legionella pneumophila is the causitive agent of Legionaire's disease. Positive indirect FA test for Legionella pneumophila
A: Formalin-fixed Toxoplasma gondii tachyzoites, stained by immunofluorescence (IFA). This is a positive reaction (tachyzoites + human antibodies to Toxoplasma + FITC-labelled antihuman IgG = fluorescence.) B: Negative IFA for antibodies to T. gondii. C: Negative IFA for antibodies to T. gondii, polar stain reaction. Α B C Α
Positive IFA result with Trypanosoma cruzi antigen (magnification 400 ).
ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΙΑ (Enzyme-immuno-assay) ELISA (Enzyme - Linked - Immuno - Sorbent - Assay) Mέθοδοι που εφαρμόζονται ευρέως στην εργαστηριακή διάγνωση των λοιμώξεων. Αναζητούμε είτε άγνωστο Ag είτε άγνωστο Ab. Xρησιμοποιείται στη ταχεία εργαστηριακή διάγνωση για την αναζήτηση μικροβιακών αντιγόνων (Ag) στα κλινικά δείγματα (αίμα, ENY, υγρά και εκκρίματα των ασθενών) και στην αναζήτηση στον ορό του ασθενούς αντισωμάτων (Abs) έναντι βακτηρίων, ιών, μυκήτων ή παρασίτων για διαγνωστικούς ή άλλους λόγους.
Αρχή της μεθόδου 1. Σήμανση του Ag ή Ab γίνεται με ένζυμο 2. Η αντίδραση Ag-Ab διαπιστώνεται με ανίχνευση του ενζύμου, αφού προστεθεί το υπόστρωμα του ενζύμου 3. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι η αλκαλική φωσφατάση και η υπεροξειδάση.
Αναζήτηση IgG αντισωμάτων: Έμμεση ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA). Το Ag είναι καθηλωμένο στην επιφάνεια ενός στερεού υποδοχέα (φρεάτια μικροπλακών ή σφαιρίδια πολυστερίνης - στερεά φάση). Στο καθηλωμένο Ag προστίθεται αραιωμένο δείγμα του εξεταζόμενου ορού.
Αναζήτηση IgG αντισωμάτων: Έμμεση ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA). Μετά από επώαση και έκπλυση προστίθεται αντι-ανθρώπειος αντισφαιρινικός ορός ιχνηθετημένος με ένζυμο. Η σύνδεσή του με το σύμπλεγμα Ag-Ab αποδεικνύεται με την ανάπτυξη χρώματος, όταν προστεθεί το υπόστρωμα του ενζύμου.
Αναζήτηση IgG αντισωμάτων: Έμμεση ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA). Τα αποτελέσματα προσδιορίζονται με τη βοήθεια φωτομέτρου. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη του ποσού του Ab που συνδέθηκε. Ως θετικά αξιολογούνται εκείνα τα δείγματα των ορών, των οποίων η τιμή οπτικής πυκνότητας είναι μεγαλύτερη από την τιμή οπτικής πυκνότητας που έχει ορισθεί ως ουδός.
Schematic diagram of the Amplified IDEIA Astrovirus assay principle
Αναζήτηση IgM αντισωμάτων: Διπλή sandwich ή capture ELISA Είναι περισσότερο ευαίσθητη και ειδική. Στην επιφάνεια των υποδοχέων είναι καθηλωμένο αντι-ανθρώπειο IgM αντίσωμα (στερεή φάση). Προστίθεται ο εξεταζόμενος ορός, σεσημασμένο με ένζυμο αντιγόνο ή μη σεσημασμένο αντιγόνο και σεσημασμένο ειδικό αντίσωμα.
Αναζήτηση IgM αντισωμάτων: Διπλή sandwich ή capture ELISA Προστίθεται το υπόστρωμα του ενζύμου και αναπτύσσεται χρώμα, το οποίο προσδιορίζεται με τη βοήθεια φωτόμετρου. Ως θετικά αξιολογούνται εκείνα τα δείγματα των ορών, των οποίων η τιμή οπτικής πυκνότητας είναι μεγαλύτερη από την τιμή οπτικής πυκνότητας που έχει ορισθεί ως ουδός.
Ανοσοχρωματογραφία Θετικό (+) Αρνητικό (-)
Ανοσοαποτύπωση Western-Blot (WB) Treponema+VDRL ViraBlot IgG
Ανοσοαποτύπωση Western-Blot (WB) Characteristics of Yersinia ViraBlot Bands YopH: 51 kd, protein-tyrocin-phosphatase, involved in signal tranduction, in combination with YopE bloking of phagocytosis-ability of macrophages; cytotoxin YopM: 44 kd, binding to human α-thrombin YopB: 41 kd, transmembrane-protein, pore forming, transportation of YopE and YopH, TNF-α-suppressor LcrV: 37 kd, regulation of yop-genes, important role in transport, active and passive protection by vaccine against infection YopD: 35 kd, transmembrane-protein, transportation of YopE and YopH YopN: 33 kd, Ca2+-sensor, Yop-regulation YopE: 23 kd, inhibition of phagocytosis by polymerisation of actin-filaments
Yersinia ViraBlot IgG, IgA 1,2,3 IgG IgA 1: (-) control 2: cutoff 3: (+) control At least two clear bands from: 51, 44, 41, 37, 35, 33 ή 23 kd Isolated clear band 35 kd or at least two clear bands from: 51, 44, 41, 37, 35, 33 ή 23 kd