ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ

Transcript

1 ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΣΤΙΣ ΛΟΙΜΩΞΕΙΣ: ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΡΑΝΙΩΤΑΚΗ ΕΛΕΝΑ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Γ.Ν.Α. «ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ»

2 ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ ΡΟΥΤΙΝΑΣ ΕΝΟΣ ΚΛΙΝΙΚΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Ταχεία και αξιόπιστη ταυτοποίηση του λοιμογόνου παράγοντα ΣΤΟΧΟΙ τέλος της εμπειρικής θεραπείας περιορισμός της διασποράς του λοιμογόνου παράγοντα

3 ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ Άμεση εξέταση (Μικροσκόπιο) Απομόνωση αιτιολογικού παράγοντα (Καλλιέργεια) Ταυτοποίηση με φαινοτυπικούς και βιοχημικούς χαρακτήρες Ανίχνευση αντιγόνου, αντισώματος (Ορολογικές εξετάσεις) Ανίχνευση γενετικού υλικού DNA, RNA (Mοριακές εξετάσεις)

4 ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Αντιγόνα (Ag): πρωτεΐνες ή πολυσακχαρίτες ανοσολογικής απόκρισης πρόκληση Οι μικροοργανισμοί είναι αντιγόνα: έλυτρα, κυτταρικό τοίχωμα, μαστίγια, ινίδια, τοξίνες μικροβίων Ανοσοσφαιρίνες ή αντισώματα (Abs): γλυκοπρωτεΐνες που κυκλοφορούν στο αίμα και ενώνονται εξειδικευμένα με τα μικρόβια που προκάλεσαν την παραγωγή τους Διαλύματα Abs (αντιοροί): ταυτοποίηση μικροβίων και ανίχνευση αντιγόνων Γνωστά μικροβιακά αντιγόνα: ανίχνευση αντισωμάτων

5 ΠΟΤΕ ΕΦΑΡΜΟΖΟΝΤΑΙ ΟΙ ΟΡΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Διάγνωση λοιμώξεων στις οποίες η απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα είναι δύσκολη ή πρακτικά αδύνατη (ιοί, παράσιτα) Διάγνωση πρόσφατης λοίμωξης Διάγνωση παρελθούσας λοίμωξης Παρακολούθηση ανοσολογικής απόκρισης σε εμβολιασμό Παρακολούθηση του θεραπευτικού αποτελέσματος Διάγνωση αναζωπύρωσης μιας νόσου Προσδιορισμός της χρονικής φάσης της λοίμωξης (έναρξηαποδρομή)

6 ΕΙΔΗ ΟΡΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Ιζηματινοαντιδράσεις Συγκολλητινοαντιδράσεις Άμεσος και έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFA) Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ELISA) Ανοσοχρωματογραφία

7 ΙΖΗΜΑΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Αντίδραση διαλυτών αντιγόνων με αντισώματα Σχηματισμός μεγάλων, μοριακών συσσωματωμάτων Δύο στάδια 1ο στάδιο: Ταχεία ένωση Ag και Ab και σχηματισμός μικρών διαλυτών συμπλεγμάτων Ag-Ab 2ο στάδιο: Σύνδεση διαλυτών συμπλεγμάτων Ag-Ab μεταξύ τους και σχηματισμός αδιάλυτων συμπλεγμάτων, που καθιζάνουν παρουσία ηλεκτρολύτη. Σχηματισμός ορατού ιζήματος (βραδεία αντίδραση) Ιζηματινοαντίδραση σε γέλη (Διπλή ανοσοδιάχυση, Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση, Ανοσοηλεκτροφόρηση, Ανοσοκαθήλωση) Κροκιδωτική ιζηματινοαντίδραση: υγρό μέσο

8 Ανίχνευση μη ειδικών αντισωμάτων έναντι του τρεπονήματος (αντιδρασίνη, reagin) που αντιδρούν με λιποειδικά αντιγόνα (καρδιολιπίνη, λεκιθίνη) που πιθανόν προέρχονται από την αλληλεπίδραση του τρεπονήματος με τους ιστούς του ασθενή VDRL (Venereal Disease Research Lab) RPR (Rapid Protein Reagin) Τροποποίηση της VDRL

9 ΣΥΓΚΟΛΛΗΤΙΝΟΑΝΤΙΔΡΑΣΗ Ένωση ενός σωματιδιακού Ag με το ομόλογο Ab: σχηματισμός κροκίδων Ag στην επιφάνεια κυττάρων (ερυθρά αιμοσφαίρια, μικρόβια) ΑΜΕΣΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ διαλυτά Ag προσροφημένα στην επιφάνεια σωματιδίων (π.χ. Latex) ΕΜΜΕΣΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ Δύο στάδια 1ο στάδιο: αναγνώριση του Ag από το Ab, ένωση του Ab με τις καθοριστικές αντιγονικές ομάδες (επίτοποι) πάνω στην επιφάνεια του κυττάρου (ή σωματιδίου) 2ο στάδιο: συγκόλληση κυττάρων (ή σωματιδίων) που έχουν ενωθεί με τα Abs. Σχηματισμός κροκίδων (ορατή συγκόλληση)

10 Αντίδραση Widal: Ανίχνευση Abs έναντι του σωματικού Ο και του βλεφαριδικού Η της Salmonella στον ορό του ασθενούς Αντίδραση Wright: Ανίχνευση Abs έναντι Brucella στον ορό του αίματος ασθενών που πάσχουν από μελιταίο πυρετό Αντίδραση Weil-Felix: Rickettsia

11 Συγκόλληση latex Πρωτεϊνικά ή πολυσακχαριδικά αντιγόνα Προσρόφηση αντιγόνων βακτηρίων, ιών, μυκήτων, παρασίτων: Ανίχνευση αντίστοιχων αντισωμάτων Ag Cryptococcus Τίτλος αντιστρεπτολυσίνης AST0

12 ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ Είναι η ανίχνευση Ag ή Ab με ειδικό Ab σημασμένο με φθοριόχρωμα Φθοριοχρώματα: χημικές ουσίες που έχουν την ιδιότητα να φθορίζουν και χρησιμοποιούνται για σήμανση Abs Ισοθειοκυανική φλουορεσκεϊνη (FITC) Ισοθειοκυανική τετραμεθυλοροδαμίνη (TMRITC) Φυκοερυθρίνη (RE) Υποστρώματα για εφαρμογή IFA τομές ιστών μονόστιβες κυτταροκαλλιέργειες εναιωρήματα ζωντανών κυττάρων επιχρίσματα κυττάρων ή μικροοργανισμών Μικροσκόπηση σε μικροσκόπιο φθορισμού Η τεχνική του ανοσοφθορισμού εφαρμόζεται με 2 μεθόδους: άμεσο και έμμεσο

13 ΑΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ (DIRECT IMMUNOFLUORESCENCE) Tο σημασμένο ειδικό Ab τοποθετείται πάνω στο παρασκεύασμα που περιέχει το ομόλογο Ag Δημιουργείται φθορίζον σύμπλεγμα Αναζήτηση ή ταυτοποίηση των μικροβίων στο κλινικό δείγμα Pneumocystis jirovecii σε BAL Chlamydia trachomatis σε ουρηθρικό/ενδοτραχηλικό δείγμα ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Σύντομος χρόνος εκτέλεσης Απλή διαδικασία Χρήση πολλαπλών Abs: ανίχνευση 2 ή περισσότερων Ag στο ίδιο υπόστρωμα ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Ασθενέστερο σήμα Υψηλότερο κόστος Μικρότερη ευελιξία

14 ΕΜΜΕΣΟΣ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ (INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE) Το μη σεσημασμένο Ab (εξεταστέος ορός) τοποθετείται επί του Ag του υποστρώματος Η σύνδεση Ag-Ab (που δεν είναι φθορίζον σύμπλεγμα) αποδεικνύεται με την προσθήκη σεσημασμένης με φθοριόχρωμα αντισφαιρίνης (δεύτερο αντίσωμα - φθορίζον σύμπλεγμα) Χρησιμοποιείται Ab ειδικό για το Ag που θέλουμε να αναγνωρίσουμε Εφαρμογές: ορολογική διάγνωση της συφιλίδος (FTA και FTA Abs), Ab έναντι των ιών, των ρικετσιών, της Leishmania, του Εχινοκόκκου, του Τοξοπλάσματος και άλλων μικροοργανισμών ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι του άμεσου Ενίσχυση του σήματος Εμπορικώς διαθέσιμα δευτερογενή Abs ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Πιθανά διασταυρούμενη αντίδραση Ανάγκη εύρεσης πρωτογενών Abs που έχουν αναπτυχθεί σε διαφορετικά είδη Μη ειδικός φθορισμός

15 ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) Αναζητούμε είτε άγνωστο Ag είτε άγνωστο Ab Χρησιμοποιείται στηn ταχεία εργαστηριακή διάγνωση για την αναζήτηση μικροβιακών αντιγόνων (Ag) στα κλινικά δείγματα (αίμα, ENY, υγρά και εκκρίματα των ασθενών) και στην αναζήτηση στον ορό του ασθενούς αντισωμάτων (Abs) έναντι βακτηρίων, ιών, μυκήτων ή παρασίτων Υψηλή ευαισθησία και επαναληψιμότητα Πολλαπλές παραλλαγές ΑΡΧΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Πρόσδεση και ακινητοποίηση Ag ή Ab σε στερεή επιφάνεια (ImmunoSorbent) Χρήση Ab συζευγμένου με ένζυμο (Enzyme-Linked) Χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων (ενζυμική αντίδραση έγχρωμο προϊόν): ποσοτικοποίηση αλληλεπίδρασης Ag-Ab διαλυτό

16 ΠΑΡΑΛΛΑΓΕΣ ELISA Για την ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένου αντιγόνου σε βιολογικά υγρά εφαρμόζεται η παραλλαγή της έμμεσης ELISA Για την ποσοτικοποίηση συγκεκριμένου αντιγόνου σε βιολογικά υγρά εφαρμόζεται η παραλλαγή της ELISA τύπου Sandwich Αν είναι απαραίτητη η ποσοτική μέτρηση του αντιγόνου αλλά διαθέτουμε μόνο ένα αντίσωμα ή το αντιγόνο δεν διαθέτει περισσότερους από ένα επίτοπους τότε εφαρμόζουμε την ανταγωνιστική τύπου ELISA

17 ΜΕΤΡΗΣΗ ΟΠΤΙΚΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ Η μέτρηση του τελικού προϊόντος μπορεί να πραγματοποιηθεί με: Φωταύγεια Φθορισμομετρία Χρωματομετρία (πιο διαδεδομένη) γρήγορη οπτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων σταθερότητα του έγχρωμου προϊόντος για αρκετό χρόνο μετά την ολοκλήρωση της ενζυμικής αντίδρασης απλή και οικονομική μέτρηση μέσω φωτομέτρησης

18 ΑΝΟΣΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Βάση συσκευής (υπόστρωμα): Κομμάτια πορώδους χαρτιού, νιτροκυτταρίνης ή ειδικού πολυμερούς Μεταφορά βιολογικού υγρού (διάχυση) Α. Υπόστρωμα: παρακράτηση υγρού του υπό εξέταση δείγματος Β. Αντιδραστήριο με Abs συζευγμένα με χρωμοφόρο (συνήθως μόρια χρυσού σε μέταλλο ή μικροσφαιρίδια latex), ειδικά για το υπό ανίχνευση Ag Γ. Το σύμπλεγμα Ab-Ag ρέει στην υπόλοιπη επιφάνεια του υποστρώματος Legionella pneumonophila Streptococcus pneumoniae Clostridium difficile toxins A and B

19 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΟΡΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ IgG (+) και IgM (-): Ενδειξη παλαιάς λοίμωξης Αν ο τίτλος IgG είναι ιδιαίτερα χαμηλός, επανάληψη μετά από 2-4 εβδομάδες Χωρίς μεταβολή: Απόδειξη παλαιάς λοίμωξης Αύξηση IgG: Δευτεροπαθής λοίμωξη IgG (-) και IgM (+): Ένδειξη πρόσφατης λοίμωξης Επανάληψη σε 2 εβδομάδες Εμφάνιση IgG Abs: Απόδειξη πρόσφατης λοίμωξης

20 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΟΡΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ IgG (+) και IgM (+): Πιθανή πρόσφατη λοίμωξη Επανάληψη μετά από 2-4 εβδομάδες Αύξηση Abs: Ένδειξη δευτεροπαθούς λοίμωξης Χωρίς μεταβολή: Ένδειξη παλαιάς λοίμωξης IgG (-) και IgM (-): Απουσία προηγούμενης λοίμωξης Επανάληψη μετά από 2-4 εβδομάδες Αύξηση Abs: Πρόσφατη λοίμωξη Χωρίς μεταβολή: Χωρίς λοίμωξη

21 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΟΡΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ Απουσία αντισωμάτων στην έναρξη της νόσου Απαραίτητη η λήψη δύο δειγμάτων με διαφορά 2 εβδομάδων Αδυναμία παραγωγής αντισωμάτων σε άτομα με ανοσοανεπάρκεια Διασταυρούμενες αντιδράσεις

22 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Η εισαγωγή των μοριακών μεθόδων έγινε με κύριο σκοπό να επιλυθούν οι αδυναμίες των κλασσικών μεθόδων Η ανάπτυξη της μοριακής βιολογίας και η εισαγωγή των μοριακών τεχνικών στη μελέτη των μικροοργανισμών μετέβαλλε ριζικά τις τεχνικές διάγνωσης των λοιμώξεων Σύγχρονο Μικροβιολογικό Εργαστήριο εξοικείωση με τη χρήση των μοριακών τεχνικών επιλογή και σχεδιασμός καταλληλότερης μεθοδολογίας, η οποία κατά κύριο λόγο εξαρτάται από το κλινικό δείγμα, αλλά και από τις ανάγκες του εργαστηρίου περιορισμός του κόστους, ασφάλεια

23 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ Οι σύγχρονες μοριακές τεχνικές εστιάζουν σε τρείς κύριους τομείς: Ανίχνευση και ταυτοποίηση παθογόνων Ανίχνευση αντοχής στις αντιμικροβιακές ουσίες Επιδημιολογική διερεύνηση και έλεγχος λοιμώξεων Δύο κύριες κατηγορίες 1. Μέθοδοι υβριδισμού 2. Μέθοδοι πολλαπλασιασμού

24 ΜΗ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΕΣ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ) Ομοιότητα του DNA με την αλληλουχία του ιχνηθέτη (probes) που έχουμε επιλέξει Η πρόσδεση του μικροβιακού DNA με τον ιχνηθέτη ανιχνεύεται με διάφορους τρόπους Εμπορικά kits για ανίχνευση των παθογόνων μετά από απομόνωση σε καλλιέργεια ή απευθείας ανίχνευση στο κλινικό δείγμα Απλή και γρήγορη διαδικασία με εξαιρετική ειδικότητα, αλλά χαμηλή ευαισθησία. Τα περισσότερα τεστ απαιτούν τουλάχιστον 10 4 copies DNA/μl κλινικού δείγματος Ο συνδυασμός PCR με υβριδισμό βελτιώνει την ευαισθησία στα 500 copies DNA/μl. Ο υβριδισμός είναι ιδιαίτερα χρήσιμος στην ανίχνευση και ταυτοποίηση αργά αναπτυσσόμενων οργανισμών μετά από απομόνωση σε καλλιέργεια είτε υγρών είτε στερεών θρεπτικών υλικών (π.χ. μυκοβακτηρίδια, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis)

25 PNA-FISH (PEPTIDE NUCLEIC ACID FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) ΣΕ ΘΕΤΙΚΉ ΑΙΜΟΚΑΛΛΙΈΡΓΕΙΑ Στόχος rrna Συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μονής έλικας (probes) σημασμένα με φθοριόχρωμα (fluorescein ή rhodamine) ουδέτερης φόρτισης μικρό μέγεθος και υδροφοβικότητα διέλευση μέσω κυτταρικής μεμβράνης δεν απαιτείται κυτταρική λύση, ούτε απομόνωση γενετικού υλικού Μετά τον υβριδισμό, ανίχνευση με μικροσκόπιο φθορισμού Υψηλές ευαισθησία (98.7%) και ειδικότητα (99%) Γρήγορη ταυτοποίηση: 90 min

26 ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΕΣ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ, PCR) Πολλαπλασιασμός ενός επιλεγμένου τμήματος DNA ή RNA που υπάρχει σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση στο κλινικό δείγμα, ώστε να γίνει ανιχνεύσιμο. Θεωρητικά από 1 αντίγραφο DNA μπορεί να παραχθούν εκατομμύρια αντίγραφα!!! Βασικές αρχές της PCR Χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών (primers) που αντιστοιχούν στα άκρα του DNA στόχου. Το ένα ολιγονουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό του 3 άκρου του ενός κλώνου DNA και το άλλο ολιγονουκλεοτίδιο είναι συμπληρωματικό του 3 άκρου του άλλου κλώνου DNA Ο κάθε κύκλος της PCR περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: 1. Αποδιάταξη του DNA στόχου (θέρμανση C) 2. Σύνδεση των εκκινητών στα άκρα του DNA-στόχου 3. Επέκταση των συμπληρωματικών αλυσίδων, με τη βοήθεια του ενζύμου Taq-πολυμεράση (κατεύθυνση 5-3 )

27

28 ΠΟΤΕ ΕΦΑΡΜΟΖΕΤΑΙ Η PCR ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Αδυναμία καλλιέργειας του μικροοργανισμού Βραδεία ανάπτυξη Απαίτηση για πολύ εμπλουτισμένα ή ειδικά υλικά καλλιέργειας Μικρός αριθμός παθογόνων στο κλινικό υλικό Ανεπαρκείς ορολογικές τεχνικές ή χαμηλός τίτλος Abs Ανίχνευση γονιδίων τοξινών και αντοχής σε αντιμικροβιακά

29 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ PCR Ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης και χρώση με ethidium bromide Ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα [restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis] Υβριδισμός των προϊόντων PCR μικροπλάκες μεμβράνες (linear probe assay ή line probe assay) μικροσυστοιχίες (microarrays) Πλήρης χαρακτηρισμός του προϊόντος με sequencing Dideoxy chain terminating sequencing Pyrosequencing Next generation sequencing

30 ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΑΝΤΟΧΗΣ ΜΕ IN-HOUSE ΠΡΩΤOKOΛΛΑ ΣΥΜΒΑΤΙΚΗΣ PCR ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Γ.Ν.Α. «ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ» Παράλληλα με αυτοματοποιημένες και φαινοτυπικές μεθόδους Για διερεύνηση του τρόπου διασποράς της αντοχής Για διερεύνηση νοσοκομειακών επιδημιών Για έλεγχο φορείας Για έλεγχο λοιμογόνων παραγόντων

31 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΟΛΛΑΠΛΩΝ ΚΑΡΒΑΠΕΜΕΝΑΣΩΝ ΣΕ ΚΛΙΝΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Klebsiella pneumoniae

32 ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ PCR ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ Dendis et al. PCR-RFLP detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia Clinical Microbiology and Infection (12) :

33 DNA MICROARRAYS Microarray: συλλογή από DNA ιχνηθέτες (probes) πάνω σε στερεό υπόστρωμα (γυαλί, πλαστικό ή σιλικόνη) Η ένταση του σήματος εκφράζεται από το χρώμα

34 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ DNA MICROARRAYS Τροποποίηση της έκφρασης των γονιδίων σε σχέση με το χρόνο, τους διαφορετικούς ιστούς και τα νοσήματα Ταυτοποίηση πολύπλοκων γενετικών νοσημάτων Φαρμακολογία και Τοξικολογία Μοριακή Μικροβιολογία Ταυτοποίηση στελεχών Μελέτη αντοχής Ανίχνευση παθογόνων, κυρίως ιών Τυποποιηση στελεχων

35 ΠΑΡΑΛΛΑΓΕΣ PCR Πολυπλεκτική (Multiplex) Εμφωλιασμένη (Nested) RT-PCR (Reverse Transcriptase) PCR Πραγματικού Χρόνου (Real-Time PCR)

36 MULTIPLEX PCR Χρησιμοποιούμε πολλαπλά ζεύγη εκκινητών για την ταυτόχρονη ανίχνευση περισσοτέρων του ενός παθογόνου Απαιτείται βελτιστοποίηση των συνθηκών Δύσκολη η ανάπτυξή τους Έχουν μικρότερη ευαισθησία

37 ΝΕΣΤΕD-PCR («ΦΩΛΙΑΣΜΕΝΗ» Η ΔYΟ ΣΤΑΔΙΩΝ) Nested-PCR («φωλιασμένη» ή δύο σταδίων) για την αύξηση ευαισθησίας και ειδικότητας της κλασικής PCR Χρησιμοποίηση 2 ζευγών εκκινητών για τον πολλαπλασιασμό και 2 κύκλους PCR Το πρώτο primer set χρησιμοποιείται στο 1ο κύκλο πολλαπλασιασμού και στη συνέχεια Το προϊόν πολλαπλασιασμού χρησιμοποιείται σε 2ο κύκλο πολλαπλασιασμού με το 2ο set primers Υψηλά ποσοστά επιμολύνσεων!!

38 RT-PCR Ο στόχος είναι το mrna του κυττάρου Το RNA μεταγράφεται σε DNA με τη χρήση της αντίστροφης μεταγραφάσης, η οποία απομονώνεται από ρετροϊούς Προηγείται ένα στάδιο μεταγραφής του RNA σε DNA (cdna) πριν από τα στάδια της PCR

39 REAL-TIME PCR Συνδυασμός PCR και υβριδισμού Παρακολούθηση του νεοσυντιθέμενου προϊόντος κατά τη διάρκεια της PCR με τη χρήση ανιχνευτών σημασμένων με φθορίζουσες χρωστικές Δεν απαιτείται επιπλέον στάδιο ανίχνευσης του προϊόντος της αντίδρασης ταυτόχρονος πολλαπλασιασμός και ανίχνευση του προϊόντος Ανίχνευση DNA και RNA Ποσοτικός προσδιορισμός των πυρηνικών οξέων (Η ένταση του σήματος που λαμβάνεται σε κάθε κύκλο της αντίδρασης είναι ευθέως ανάλογη της ποσότητας του προϊόντος)

40 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΣΤΗ REAL-TIME PCR Στο μίγμα των αντιδραστηρίων περιλαμβάνονται και τα ειδικά probes (Syber Green, Hybridization probes, TaqMan probes, Molecular Beacons) Η αντίδραση γίνεται σε ειδικά μηχανήματα και όχι σε κοινούς θερμοκυκλοποιητές Το μηχάνημα είναι συνδεδεμένο με ηλεκτρονικό υπολογιστή και μέσω του κατάλληλου λογισμικού γίνεται η παρακολούθηση και επεξεργασία των αποτελεσμάτων Cycle threshold CT είναι ο αριθμός κύκλων που αρχίζει η αύξηση του φθορισμού

41 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ LEISHMANIA ME REAL-TIME PCR

42 Πρότυπα γνωστής συγκέντρωσης

43 MΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΚΑΜΠΥΛΗΣ ΑΠΟΔΙΑΤΑΞΗΣ ΤΟΥ DNA (MELTING CURVE ANALYSIS) Τm: η θερμοκρασία στην οποία το 50% του DNA είναι αποδιεταγμένο (melting point) εξαρτάται απόλυτα από τις G & C βάσεις ακόμα και μια μοναδική αλλαγή σε μια βάση, δηλαδή μια σημειακή μετάλλαξη ή η διαφορετική αλληλουχία μεταξύ διαφορετικών ειδών, θα δώσει προϊόντα PCR με διαφορετική Tm

44 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΤΟΞΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ME REAL-TIME PCR

45 ΠΛΕΟΝΕΚΤΉΜΑΤΑ REAL-TIME PCR Ταχεία Μειωμένος κίνδυνος επιμολύνσεων Υψηλή ευαισθησία Υψηλή επαναληψιμότητα Παρακολούθηση της πορείας της νόσου

46 ΑΜΕΣΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΥ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ Η άμεση ανίχνευση και ταυτοποίηση των μικροοργανισμών στα κλινικά δείγματα είναι η μεγαλύτερη πρόκληση στον τομέα της μοριακής διαγνωστικής, στοχεύοντας στην γρήγορη έναρξη κατάλληλης αντιμικροβιακής θεραπείας και την επακόλουθη αύξηση του προσδόκιμου της επιβίωσης του ασθενούς και την μείωση του συνολικού κόστους νοσηλείας Εφαρμόζεται κυρίως: ανίχνευση-ταυτοποίηση του μικροοργανισμού σε σοβαρή λοίμωξη (σηψαιμία, μηνιγγίτιδα κλπ) απάντηση σε συντομότερο διάστημα (π.χ. Mycobacterium tuberculosis)

47 Διαγνωστική τεχνική για τη σήψη (από θετική αιμοκαλλιέργεια) PNA-FISH, Fluorescence-based hybridization ACCU-PROBE Chemiluminescent DNA probes (rrna) HYPLEX Multiplex PCR plus hybridization (ELISA) PLEX-ID BAC Broad-range PCR plus electrospray ionisation mass spectrometry StaphPlex Multiplex PCR plus microarray Staph SR Multiplex PCR assay MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry Prove-it sepsis Multiplex PCR and microarray Verigene Nucleic-acid-based microarray Filmarray Multiplex nested PCR assay No. παθογόνων που ανιχνεύονται Ευαισθησία % Ειδικότητα % και meca γονίδιο >300 different pathogens και meca γονίδιο Εκατοντάδες και meca γονίδιο n.d. n.d. 13 Gram (+) και 9 Gram (-) βακτήρια, 8 γόνοι αντοχής 24 και meca, vana/b, KPC γόνοι αντοχής n.d Τροποποιήθηκε από: Molecular diagnosis of sepsis: new aspects and recent developments. Liesenfeld et al EuJMI. 4(1): 1 25.

48 Διαγνωστική τεχνική για τη σήψη (από ολικό αίμα) VYOO Multiplex PCR with gel electrophoresis SeptiFast Multiplex real time PCR assay Xpert MRSA/SA Real-time PCR assay SepsiTest Broad-range PCR with sequencing No. παθογόνων που ανιχνεύονται 34 και meca, vana/b/c, SHV, CTX-M γονίδια Ευαισθησία % n.d. 25 και meca γονίδιο Ειδικότητα % > Τροποποιήθηκε από: Molecular diagnosis of sepsis: new aspects and recent developments. Liesenfeld et al EuJMI. 4(1): 1 25.

49 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΚΑΙ ΕΛΕΓΧΟΣ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ Μοριακές μέθοδοι τυποποίησης: σύγκριση του γενετικού υλικού των μικροβιακών στελεχών που εμπλέκονται σε μια επιδημία Μικροβιακό χρωμόσωμα: αλληλουχίες αρκετά συντηρημένες ώστε να χαρακτηρίζουν ένα μικροβιακό γένος ή και είδος, αλλά και αλληλουχίες που παρουσιάζουν αρκετά μεγάλη ποικιλομορφία Επομένως οι μοριακές μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων αλλά και για το διαχωρισμό του είδους σε κλώνους με επιδημιολογική σημασία Τα δεδομένα των αναλύσεων συλλέγονται σε ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων, προσβάσιμες στη διεθνή κοινότητα για σύγκριση αποτελεσμάτων μεταξύ εργαστηρίων Δεν υπάρχει ιδανική μέθοδος: η επιλογή εξαρτάται από τις τοπικές, εθνικές ή διεθνείς συνθήκες και τα επιδημιολογικά ερωτήματα που τίθενται. Σε αρκετές περιπτώσεις ο συνδυασμός διαφορετικών μεθόδων αυξάνει την διακριτική ικανότητα

50 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗΣ Επιδημίες κοινότητας Νοσοκομειακές επιδημίες Διερεύνηση εργαστηριακής επιμόλυνσης Διαλεύκανση ψευδο-επιδημιών Εξατομικευμένη παρακολούθηση ασθενών - διάκριση υποτροπής από επαναλοίμωξη - ανάδειξη επιμένουσας λοίμωξης - διάκριση μεταξύ επιμόλυνσης και λοίμωξης

51 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΒΑΣΊΖΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΠΕΨΗ ΤΟΥ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΟΣ ΜΕ ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP) PULSE FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)

52 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE) Το gold standard των μοριακών τεχνικών για μεγάλη ποικιλία κλινικά σημαντικών μικροοργανισμών Αναλύει μεγάλο ποσοστό του γονιδιώματος (>90%) Εξαιρετική διακριτική ικανότητα και υψηλή επιδημιολογική αντιστοιχία Σχετικά χαμηλό κόστος, εξαιρετική τυποποιητική ικανότητα και ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα Υψηλή προτύπωση της τεχνικής, δημιουργία βάσεων δεδομένων που βασίζονται στην σύγκριση εικόνων ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων DNA (Pulse-NET, Harmony), για δια-εργαστηριακή σύγκριση και παρακολούθηση της διασποράς παθογόνων μικροοργανισμών σε διαφορετικές περιοχές ή χώρες

53 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE) Μόρια DNA >30 kb δεν διαχωρίζονται με την συμβατική ηλεκτροφόρηση, οπότε το 1984, οι Schwartz και Cantor ανακάλυψαν ότι εναλλάσσοντας τα ηλεκτρικά πεδία, τα μεγάλα μόρια DNA μπορούν να διαχωριστούν ανάλογα με το μέγεθος τους Βασίζεται στην πέψη του χρωμοσώματος με περιοριστικές ενδονουκλεάσες που αναγνωρίζουν σπάνιες θέσεις του γονιδιώματος Τα μεγάλα θραύσματα DNA που προκύπτουν διαχωρίζονται σε πήκτωμα αγαρόζης με ηλεκτροφόρηση σε «παλλόμενο πεδίο» (περιοδική αλλαγή του προσανατολισμού του ηλεκτρικού πεδίου) Τα θραύσματα DNA φαίνονται σαν «μπάντες», σχηματίζοντας ένα συγκεκριμένο αποτύπωμα (PFGE pattern)

54

55

56

57 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE) Κριτήρια του Tenover για την ερμηνεία της PFGE Καμία διαφορά στις μπάντες: πανομοιότυπα στελέχη 1-3 διαφορές: υποτύποι του στελέχους 4-6 διαφορές: πιθανή γενετική συνάφεια των στελεχών >6 διαφορές: καμία γενετική συνάφεια Tenover FC et. al. J Clin Microbiol 33:2233, 1995

58 Acinetobacter baumannii, ApaI Providencia stuartii, NotI Staphylococcus aureus, SmaI

59 Corynobacterium striatum, SwaI Serratia marcescens, SpeI Klebsiella pneumoniae, XbaI

60 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΣΕ ΠΑΛΛΟΜΕΝΟ ΠΕΔΙΟ (PFGE) ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ PFGE Χρονοβόρα διαδικασία Απαιτεί εξειδικευμένο προσωπικό Μερικά στελέχη δεν μπορούν να τυποποιηθούν Μπάντες ίδιου μεγέθους δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα το ίδιο κομμάτι DNA Μεταβολή σε μία θέση πρόσδεσης ενζύμου μπορεί να σημαίνει αλλαγή σε πάνω από δύο μπάντες Η ομοιότητα των προφίλ της πέψης υποδεικνύει κλωνικότητα και δεν υποδηλώνει φυλογενετική συγγένεια

61 ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΒΑΣΙΖΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (AFLP) RANDOM AMPLIFIED POLYMORFIC DNA (RAPD) ARBITRARILY PRIMED POLYMERASE CHAIN REACTION (AP-PCR) REPETITIVE-ELEMENT POLYMERASE CHAIN REACTION (REP-PCR)

62 REPETITIVE-ELEMENT POLYMERASE CHAIN REACTION (REP-PCR) Χρησιμοποιεί εκκινητές που υβριδίζουν σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (EPIC, REP, BOX sequences) παρούσες στο χρωμόσωμα ορισμένων βακτηριακών ειδών, πολλαπλασιάζοντας τα τμήματα του DNA που βρίσκονται μεταξύ τους Τμήματα διαφορετικών μεγεθών σε διαφορετικά στελέχη, οπότε διαφορετικά ηλεκτροφορητικά πρότυπα Γρήγορη, φτηνή, υψηλή διακριτική ικανότητα για πολλούς μικροοργανισμούς Χαμηλή αναπαραγωγιμότητα λόγω διαφορετικών αντιδραστηρίων και ηλεκτροφορητικών συστημάτων DiversiLab system (biomerieux): ημιαυτόματη μέθοδος για REP-PCR, αυξάνει αναπαραγωγιμότητα, αναλύει αποτελέσματα μέσω λογισμικού, χαμηλό κόστος

63 Τροποποιήθηκε από staff-

64

65 MΕΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΒΑΣΙΖΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟ DNA MICROARRAYS

66 DNA MICROARRAYS Τεχνολογία ικανή για ταυτόχρονη ανάλυση χιλιάδων γενετικών χαρακτήρων στον μικροοργανισμό-στόχο με χαμηλό ποσοστό ψευδών θετικών και αρνητικών Δυνατότητα για ανάλυση αποτελεσμάτων μέσω λογισμικού Υψηλή διακριτική ικανότητα Χρονοβόρα Απαγορευτικό κόστος για ρουτίνα Διασταυρούμενες αντιδράσεις υβριδισμού Χαμηλή αναπαραγωγιμότητα λόγω τεχνικών δυσκολιών της μεθόδου Έλλειψη μελετών για σύγκριση της microarrays τεχνικής με άλλες μεθόδους τυποποίησης

67 MΕΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΒΑΣΙΖΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ SINGLE LOCUS SEQUENCE TYPING (SLST): προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός γονιδίου ή μιας περιοχής του γονιδιώματος, που παρουσιάζει ποικιλομορφία μεταξύ διαφορετικών στελεχών ενός είδους MULTILOCUS SEQUENCE TYPING (MLST): συγκρίνει τις αλληλουχίες τμημάτων επτά ή περισσοτέρων γονιδίων του βασικού μεταβολισμού (housekeeping genes) WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS): είναι ο προσδιορισμός της αλληλουχίας του συνολικού DNA ενός μικροβίου με την πραγματοποίηση ταυτόχρονα εκατομμυρίων αντιδράσεων αλληλούχισης μικρών τμημάτων DNA ( bp)

68 Τα αποτελέσματα της μοριακής τυποποίησης θα πρέπει ΠΑΝΤΑ να συσχετίζονται με τα δεδομένα του έλεγχου λοιμώξεων για την σωστή ερμηνεία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα της τυποποίησης στελεχών που δεν συνδέονται μεταξύ τους επιδημιολογικά είναι εξαιρετικά δύσκολο αλλά συχνά και επικίνδυνο να ερμηνευθούν

69 ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ Μεγάλη ειδικότητα/ευαισθησία Έγκαιρη διάγνωση λοιμώξεων πριν από την έναρξη των συμπτωμάτων (παρακάμπτουν τα ανοσολογικά «παράθυρα» λοιμώξεων πχ. HIV) σημαντική συμβολή στη θεραπεία Προσδιορισμός μεταλλάξεων που σχετίζονται με αντοχή σε φάρμακα Ευελιξία μεθόδου Ανίχνευση μικροοργανισμών και μετά την έναρξη θεραπείας Αντοχή στις συνθήκες μεταφοράς

70 ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα: Παρουσία ανασταλτικών παραγόντων Ψευδώς θετικά αποτελέσματα: Επιμολύνσεις Εξειδικευμένο εργαστήριο/ Κατάλληλος εξοπλισμός Υψηλό κόστος Εξειδικευμένο προσωπικό Δεν προσδιορίζουν αν το γενετικό υλικό προέρχεται από ζώντα ή νεκρά μικροβιακά κύτταρα Δεν προσδιορίζουν αν το μικρόβιο που ανιχνεύθηκε αποτελεί το αίτιο της λοίμωξης

71 Οι μοριακές τεχνικές απαιτούν υποδομή, εργαστηριακή εμπειρία και ικανότητα, πολύ μεγαλύτερη από αυτή του συνηθισμένου κλινικού διαγνωστικού εργαστηρίου Για να υπάρχει όφελος από την εφαρμογή τους: επιλογή των δειγμάτων προσεκτική μελέτη των εξελίξεων των μεθόδων αυτών, σε πρακτικό και θεωρητικό επίπεδο, σε συνάρτηση με τα μειονεκτήματα των κλασικών προσεγγίσεων στη διάγνωση και αντιμετώπιση των λοιμώξεων

72 WHOLE GENOME SEQUENCING (WGS) Έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές μεγάλες επιδημίες στην Ευρώπη Αναμένεται να αντικαταστήσει στο μέλλον τις σημερινές μεθόδους τυποποίησης λόγω της εξαιρετικής αναλυτικής ικανότητας που διαθέτει και να χρησιμοποιηθεί ως τυποποιητική μέθοδος πρώτης γραμμής Απόλυτη ακρίβεια: η τεχνολογία της έχει τη δυνατότητα να διακρίνει διαφορές σε επίπεδο βάσεων μεταξύ δύο στελεχών Επίπονη και χρονοβόρα μέθοδος για την απόκτηση πληροφοριών στην επιδημιολογική επιτήρηση ρουτίνας. Μέσω της βιοπληροφορικής θα πρέπει να βρεθούν λύσεις για την γρήγορη εξαγωγή πληροφοριών χρήσιμων για την κλινική μικροβιολογία, τον έλεγχο λοιμώξεων και την δημόσια υγεία Πολύ υψηλό κόστος