EΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ Aνοσολογικά ευρήµατα στα παιδιά µε ιδιοπαθές νεφρωσικό σύνδροµο: Eίναι δυνατό να προβλέψουν την ανταπόκριση στα κορτικοστεροειδή; Ν. Πρίντζα, Φ. Παπαχρήστου, Β. Τζιµούλη, Α. Ταπάρκου, Φ. Κανακούδη-Τσακαλίδου Α Παιδιατρική Κλινική ΑΠΘ, Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο, Θεσσαλονίκη Printza N, Papachristou F, Tzimouli V, Taparkou A, Kanakoudi-Tsakalidou F. Immune findings in children with idiopathic nephrotic syndrome: could they predict the response to steroid therapy? 1 st Dept of Paediatrics, Aristotle Univercity of Thessaloniki, Hippokration General Hospital, Thessalοniki, Greece. Paediatr N Gr 2008, 20: 340-347. Περίληψη. Εισαγωγή:Το νεφρωσικό σύνδροµο (ΝΣ) θεωρείται αποτέλεσµα µίας πρωτοπαθούς ανοσολογικής διαταραχής. Σκοπός: Η προοπτική µελέτη των ανοσολογικών διαταραχών στα παιδιά µε νεφρωσικό σύνδροµο (κορτικοευαίσθητο και κορτικοανθεκτικό) και η διερεύνηση της δυνατότητας οι διαταραχές αυτές να χρησιµεύσουν ως προγνωστικοί δείκτες της απάντησης στα κορτικοστεροειδή. Υλικό-Μέθοδοι: Μελετήθηκαν 30 παιδιά µε κορτικοευαίσθητο (ΚΕΝΣ), 8 παιδιά µε κορτικοανθεκτικό (ΚΑΝΣ), και 20 υγιή παιδιά (µάρτυρες). Προσδιορίστηκαν: ο βασικός ανοσοφαινότυπος Β και Τ κυττάρων, δηλαδή τα ποσοστά των CD19+ Β κυττάρων και των CD3+, CD4+, CD8+ και CD25+ Τ κυττάρων, καθώς και ποσοστά των CD23+, CD3+/ CD69+/IFN-γ+ και CD3+/CD69+/IL-4+ και τα επίπεδα στον ορό των IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-13 και IL-18. Αποτελέσµατα: Στα παιδιά µε ΚΕΝΣ τα ποσοστά των CD19+ και CD23+ Β κυττάρων, των CD3+/CD69+/IL-4+ T κυττάρων καθώς και τα επίπεδα των IL-4, IL-13 και IL-18 ήταν σηµαντικά αυξηµένα στην ενεργό φάση της νόσου συγκριτικά µε τις φάσεις ύφεσης (υπό και χωρίς κορτικοστεροειδή) καθώς και µε τους µάρτυρες (p<0.05). Αντίθετα το ποσοστό των CD3+/ CD69+/INF-γ+ T κυττάρων ήταν σηµαντικά ελαττωµένο στην ενεργό φάση της νόσου σε σχέση µε τις φάσεις ύφεσης (υπό και χωρίς κορτικοστεροειδή) και µε τους µάρτυρες (p<0.05). Στα παιδιά µε ΚΑΝΣ τα ποσοστά των CD23+ Β κυττάρων, των CD3+/CD69+/IL-4+ T κυττάρων καθώς και τα επίπεδα των ΙΝF-γ, IL-2 και IL-4 ήταν συγκρίσιµα µε αυτά των µαρτύρων (p>0.05). Το ποσοστό των CD19+ B (p=0.022) και CD3+/ CD69+/IFN-γ+ T κυττάρων (p=0.04) καθώς και τα επίπεδα των IL-13 και IL-18 (p=0.04) ήταν αυξηµένα σε σχέση µε τους µάρτυρες. εν διαπισώθηκαν διαφορές µεταξύ ασθενών και µαρτύρων όσον αφορά τις µετρήσεις των λοιπών ανοσολογικών παραµέτρων. Συµπεράσµατα: Φαίνεται ότι η σαφής υπεροχή της
τύπου-2 ανοσιακής απάντησης σχετίζεται µε απάντηση του ΝΣ στα κορτικοστεροειδή (κορτικοευαισθησία). Abstract. Introduction: Nephrotic syndrome (NS) is thought to be associated with primary immune disturbances. Aim and Material: The aim of our study was to investigate prospectively the immune disturbances in nephrotic syndrome (steroid sensitive and steroid resistant) and identify whether these immune disturbances may predict the response to steroid therapy. Thirty children with steroid sensitive (SS NS) and eight children with steroid resistant (SR NS), aged 2-14 years, were studied. Data were compared with those obtained from 20 age-matched controls. The following parameters were assessed: Basic B and T cell populations, in details percentages of CD19+ B cells and CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ T cells, and percentages of CD23+, CD3+/CD69+/ IFN-γ+ and CD3+/CD69+/IL-4+ cells as well as serum levels of IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-13 and IL-18. Results: In patients with SS NS percentages of CD23+ and CD19+ B cells, CD3+/ CD69+/ IL-4+ T cells and serum levels of IL-4, IL-13, IL-18 were significantly higher in the active stage οf the disease compared with those in the remission stage, on steroids or off steroids and controls (p<0.05). On the contrary, percentage of CD3+/CD69+/IFN-γ+ T cells was significantly decreased (p<0.05). In patients with SR NS percentage of CD23+B cells, CD3+/CD69+/IL-4+ T cells and serum levels of IL-2, IFN-γ and IL-4 presented no significant difference with the controls. Percentages of CD19+ B cells were eleveted (p=0.022) and percentages of CD3+/ CD69+/IFN-γ+ T cells, serum levels of IL-13 and IL-18 were slightly elevated in active stage compared with the controls (p=0.04). All the other immune parameters presented no significant difference between patients and controls. Conclusions: These findings suggest that a type-2 immune response found in active stage of NS could be predictive of a good response to steroid therapy. Λέξεις-κλειδιά: κορτικοευαίσθητο νεφρωσικό σύνδροµο, κορτικοανθεκτικό νεφρωσικό σύνδροµο, τύπου1/ τύπου 2 κυτταροκίνες.
Key words: steroid sensitive nephrotic syndrome, steroid resistant nephrotic syndrome, Type 1/Type 2 cytokines. Εισαγωγή Με τον όρο νεφρωσικό σύνδροµο (ΝΣ) σήµερα χαρακτηρίζονται σπειραµατοπάθειες µε διαφορετική ιστολογική εικόνα που κλινικά και εργαστηριακά συνδυάζουν γενικευµένο οίδηµα, σηµαντική πρωτεϊνουρία (>50 mg/kg/24ωρο), υποπρωτεϊναιµία (<5 g/dl) µε υπολευκωµατιναιµία (<2,5 g/dl) και υπερχοληστεριναιµία(>200 mg/dl) 1. Η ετήσια επίπτωση του ιδιοπαθούς ΝΣ στα παιδιά ανέρχεται σε 2-7 νέες περιπτώσεις ανά 100.000 άτοµα ηλικίας κάτω των 18 ετών 2. Η συνολική όµως συχνότητα της νόσου, λόγω της χρόνιας διαδροµής της, έχει υπολογιστεί σε 16 περίπου περιπτώσεις ανά 100.000 παιδιά 2. Έτσι το ΝΣ αποτελεί µια σχετικά συχνή χρόνια νεφρική πάθηση και ένα από τα σηµαντικότερα νεφρολογικά αίτια παραποµπής και νοσηλείας των παιδιών. Σύµφωνα µε την αιτιολογία το ΝΣ διακρίνεται σε πρωτοπαθές ή ιδιοπαθές και σε δευτεροπαθές. Στα παιδιά η συχνότερη µορφή είναι το ιδιοπαθές ΝΣ, που καλύπτει το 95% των περιπτώσεων. Το ιδιοπαθές νεφρωσικό σύνδροµο (ΝΣ) ανάλογα µε την αρχική απάντησή του στη θεραπεία µε κορτικοστεροειδή διακρίνεται σε κορτικοευαίσθητο (ΚΕ), που αποτελεί το 35-80% των περιπτώσεων στα παιδιά και σε κορτικοανθεκτικό (ΚΑ) 3,4. Στην κλινική πράξη προηγείται η κλινική ταξινόµηση σε σχέση µε την απάντηση ή όχι του ΝΣ στα κορτικοστεροειδή και έπεται η ιστολογική ταξινόµηση η οποία ενδιαφέρει κυρίως στις περιπτώσεις κορτικοανθεκτικότητας. Το ΚΕΝΣ θεωρείται σήµερα αποτέλεσµα µιας πρωτοπαθούς ανοσολογικής διαταραχής. Παρά το γεγονός ότι η ακριβής παθογένεση του συνδρόµου δεν έχει ακόµη διευκρινιστεί, εδώ και αρκετά χρόνια έχει συσχετιστεί µε ανοσιακή διαταραχή γενικά και ειδικότερα µε διαταραχή της λειτουργίας των Τ κυττάρων 5-9. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων ΚΑΝΣ στα παιδιά, η ιστολογική εξέταση αναδεικνύει ευρήµατα εστιακής τµηµατικής σπειραµατοσκλήρυνσης (ΕΤΣ) 10. Τα τελευταία χρόνια αναγνωρίστηκαν µεταλλάξεις σε µια σειρά από γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες των ποδοκυττάρων του σχισµοειδούς διαφράγµατος, οι οποίες φαίνεται να παίζουν βασικό ρόλο στην παθογένεια της ΕΤΣ. Ειδικότερα, σε παιδιά µε κληρονοµικές µορφές ΝΣ και µε ιστολογική εικόνα ΕΤΣ έχουν προσδιοριστεί µεταλλάξεις σε συγκεκριµένα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες των ποδοκυττάρων, όπως η ποδοκίνη και η α-ακτινίνη-4 11-13. Εκτός όµως από τις γενετικές µορφές της ΕΤΣ φαίνεται ότι υπάρχουν και επίκτητες µορφές τις νόσου που απαντούν πλήρως ή ως ένα βαθµό στη χορήγηση ανοσοκατασταλτικών, όπως η κυκλοσπορίνη ή το µονοκλωνικό αντίσωµα αντί-cd20 (Rituximab). Το γεγονός αυτό θεωρείται από κάποιους ερευνητές ως απόδειξη συµµετοχής ανοσολογικών διαταραχών στην παθογένεια κάποιων µορφών ΚΑΝΣ 14. Σκοπός της παρούσας προοπτικής µελέτης ήταν η διερεύνηση αφενός των ανοσολογικών διαταραχών στα παιδιά µε κορτικοευαίσθητο και κορτικοανθεκτικό νεφρωσικό σύνδροµο και αφετέρου της δυνατότητας οι διαταραχές αυτές να χρησιµεύσουν ως προγνωστικοί δείκτες της απάντησης στα κορτικοστεροειδή. Aσθενείς Μέθοδοι Οµάδα ασθενών: Μελετήθηκαν προοπτικά 30 παιδιά µε ΚΕΝΣ, 16 αγόρια και 14 κορίτσια, ηλικίας 2,5-14 ετών ( ιάµεση:3,32 έτη) και 8 παιδιά µε ΚΑΝΣ, 5 αγόρια και 3 κορίτσια, ηλικίας 7 µηνών - 12 ετών ( ιάµεση:4,2 έτη). Ειδικότερα τα 23/30 παιδιά µε ΚΕΝΣ µελετήθηκαν αφενός σε ενεργό φάση της νόσου, πριν την έναρξη της αγωγής µε κορτικοστεροειδή και αφετέρου σε φάση ύφεσης και ενώ έπαιρναν κορτικοστεροειδή. Και οι 23 ασθενείς, οι οποίοι µελετήθηκαν σε φάση ύφεσης υπό κορτικοστεροειδή, έπαιρναν
την ίδια δόση πρεδνιζόνης (40 mg/m 2 ανά 48ωρο). Από τα 23 αυτά παιδιά 10 µελετήθηκαν και σε φάση ύφεσης χωρίς κορτικοστεροειδή (6 µήνες µετά τη διακοπή). Στα υπόλοιπα 7/30 παιδιά µε ΚΕΝΣ ο έλεγχος έγινε µόνο σε φάση ύφεσης χωρίς κορτικοστεροειδή. Τα 8 παιδιά µε ΚΑΝΣ µελετήθηκαν µόνο σε ενεργό φάση. Η διάγνωση του ΚΕΝΣ και της υποτροπής βασίστηκαν στα διεθνή κριτήρια 6 και ο καθορισµός της κορτικοευαισθησίας έγινε µε βάση την αρχική απάντηση του νεφρωσικού συνδρόµου στην αγωγή µε κορτικοστεροειδή. Σε όλα τα παιδιά µε ΚΑΝΣ έγινε βιοψία νεφρού µετά την αποτυχία της αρχικής θεραπείας µε κορτικοστεροειδή καθώς και γενετικός έλεγχος για µετάλλαξη των γονιδίων NPHS2 και WT1, που συνδέονται µε την εµφάνιση ΚΑΝΣ, µε ιστολογική εικόνα ΕΤΣ. Οµάδα µαρτύρων: Είκοσι υγιή παιδιά ηλικίας 2,5 έως 14 ετών, που προσήλθαν στο Αιµατολογικό Εργαστήριο της Α Παιδιατρικής Κλινικής για έλεγχο συγγενούς αιµολυτικής αναιµίας χρησίµευσαν ως οµάδα υγιών µαρτύρων για τη σύγκριση των αποτελεσµάτων µε εκείνα των ασθενών. Στους µάρτυρες αιµοληψία και έλεγχος των ανοσολογικών παραµέτρων έγιναν µία φορά. Μέθοδος Ανοσολογικός έλεγχος: Από όλους τους ασθενείς καθώς και από την οµάδα των µαρτύρων πάρθηκαν δείγµατα αίµατος σε σωληνάρια µε αντιπηκτικό (ηπαρίνη) και χωρίς αντιπηκτικό. Τα δείγµατα µε ηπαρίνη χρησιµοποιήθηκαν για τον προσδιορισµό επιφανειακών µορίων των λεµφοκυττάρων και για τη µέτρηση της ενδοκυττάριας παραγωγής κυτταροκινών. Από τα δείγµατα χωρίς αντιπηκτικό διαχωρίστηκε ο ορός µε φυγοκέντρηση για 10 min.τα δείγµατα του ορού χωρίστηκαν σε µικρότερες ποσότητες (aliquots), και φυλάσσονταν στους -80 ο C µέχρι τη στιγµή της ανάλυσής τους, ώστε να αποφευχθεί η επανειληµµένη ψύξη-απόψυξή τους και χρησιµοποιήθηκαν για τον προσδιορισµό των κυτταροκινών INF-γ, IL-2, IL-4, IL-13 και IL-18. Η µελέτη όλων των ασθενών και των µαρτύρων περιελάµβανε τις παρακάτω ανοσολογικές παραµέτρους: Βασικός ανοσοσοφαινότυπος, CD25+ T κύτταρα, CD23+ B κύτταρα, ποσοστό CD3+/CD69+/INF-γ+ και CD3+/CD69+/IL-4 + T κυττάρων και συγκεντρώσεις στον ορό των INF-γ, IL-2, IL-4, IL-13 και IL-18. 1) Προσδιορισµός του βασικού ανοσοφαινότυπου Για τον προσδιορισµό των επιφανειακών µορίων των λεµφοκυττάρων (βασικός ανοσοφαινότυπος) εφαρµόστηκε τριπλός άµεσος ανοσοφθορισµός µε τη βοήθεια κατάλληλων µονοκλωνικών αντισωµάτων των εταιρειών COULTER (Miami, Florida) και IMMUNOTECH (Hamburg, Germany) συνδεδεµένων µε φθορίζουσες χρωστικές όπως ισοθειοκυανική φλουοροσκεΐνη (FITC): CD3, CD4, CD8, CD23, φυκοερυθρίνη (PE): CD4, CD19, CD25 και φυκοερυθρίνη-κυανίνη 5(PE-Cy5): CD45 Τα ποσοστά των Β κυττάρων (CD19+), των ενεργοποιηµένων Β κυττάρων που εκφράζουν τον υποδοχέα ΙΙ της IgE (CD23+), των ενεργοποιηµένων Τ κυττάρων που εκφράζουν τον υποδοχέα της IL-2 (CD25+) και οι υποπληθυσµοί των Τ κυττάρων (CD3+/ CD4+ και CD3+/CD8+) προσδιορίστηκαν στον κυτταροµετρητή ροής EPICS-XL της COULTER, µετά από κατάλληλη επεξεργασία για λύση των ερυθρών στη συσκευή multi Q-PREP µε τη βοήθεια του Immunoprep Reagent System. Tα αποτελέσµατα εκφράζονται ως ποσοστό θετικών κυττάρων (ποσοστό % δηλαδή των κυττάρων που εκφράζουν το συγκεκριµένο επιφανειακό δείκτη). 2) Eνδοκυττάριος προσδιορισµός των κυτταροκινών INF-γ και IL-4
Η ενδοκυττάρια παραγωγή των κυτταροκινών ΙΝF-γ και IL-4 µετρήθηκε σε περιφερικό αίµα µε κυτταροµετρία ροής. Χρησιµοποιήθηκαν µονοκλωνικά αντισώµατα σηµασµένα µε τα κατάλληλα φθοριοχρώµατα: CD3(PE-Cy5), CD69 (FITC) (Beckman, COULTER, Miami, Florida) καθώς και αντι-il-4 PE και αντι-inf-γ ΡΕ (R&D Systems, Abingon, United Kingdom). Έγινε µη ειδική ενεργοποίηση των κυττάρων µε εστέρα της φορµπόλης PMA (phorbol- 12-mystrate-13-acetate) και ιονοµυκίνη (iomycin) της εταιρείας SIGMA. H προσθήκη µπρεφελδίνης Α (Brefeldin, BFA) (SIGMA) αναστέλλει την απελευθέρωση των νεοπαραχθεισών κυτταροκινών από το κύτταρο και, παρεµποδίζοντας τη λειτουργία του συστήµατος Golgi, την έξοδο των κυτταροκινών από το κύτταρο. Μετά από µη ειδική ενεργοποίηση των κυττάρων µε PMA και επεξεργασία µε κατάλληλα αντιδραστήρια (intra-prep kit, Beckman, Coulter), µετρήθηκε η ένταση του φθορισµού των κυττάρων που έχουν δεσµεύσει το ειδικό αντίσωµα για την INF-γ και την IL-4 µε τη µέθοδο του τριπλού άµεσου ανοσοφθορισµού στον κυτταροµετρητή ροής Coulter EPIX XL. Η επιλογή του πληθυσµού των Τ κυττάρων έγινε µε το CD3+ PE-Cy5 (Fluorescence channel 3,FL3) και την παράµετρο του πλάγιου σκεδασµού (Sidescatter, SSC). Στη συνέχεια µε τη βοήθεια των παραµέτρων FL1(Fluorescence channel 1) για το CD9 και FL2 (Fluorescence channel 2) για την INF-γ ή IL-4 προσδιορίστηκε το ποσοστό των ενεργοποιηµένων Τ κυττάρων (CD3+CD69+) που παράγουν τις αντίστοιχες κυτταροκίνες. Για την εξαίρεση του µη ειδικού σήµατος από την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ισοτυπικό δείγµα ελέγχου ( stimulated και unstimulated isotype control) καθώς και δείγµα χωρίς την προσθήκη ενεργοποιητή ΡΜΑ. Τα αποτελέσµατα εκφράζονται ως το ποσοστό % των ενεργοποιηµένων κυττάρων CD3+ CD69+ που παράγουν INF-γ ή IL-4. 3) Προσδιορισµός των συγκεντρώσεων στον ορό των κυτταροκινών INF-γ, IL-2, IL-4, IL-13 και IL-18 Τα επίπεδα των κυτταροκινών INF-γ, IL-2, IL-4, IL-13 και IL-18 στον ορό µετρήθηκαν µε ανοσοενζυµική µέθοδο ELISA (R &D Systems, UK) σύµφωνα µε τις οδηγίες της παρασκευάστριας εταιρείας. Τα όρια ευαισθησίας των µετρήσεων των INF-γ, IL-2, IL-4, IL-13 και IL-18 είναι 13,8 pg/ml, 6,2 pg/ml, 6,6 pg/ml, 14,3 pg/ml και 12,5 pg/ml αντίστοιχα. Στατιστική ανάλυση Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS έκδοση 11.5. Για όλες τις παραµέτρους υπολογίστηκε η διάµεση τιµή και η διακύµανση. Για την κατά ζεύγη ανάλυση χρησιµοποιήθηκε η µη παραµετρική δοκιµασία Wilcoxon signed-rank test και για τη σύγκριση των διάµεσων τιµών των παραµέτρων η µη παραµετρική δοκιµασία Mann-Whitney rank test. Η συσχέτιση (r) έγινε µε τη δοκιµασία Spearman s coefficient of correlation. Η στατιστική σηµαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο p<0.05. Aποτελέσµατα Βιοψία νεφρού Σε όλα τα παιδιά µε ΚΑΝΣ (8/8) η βιοψία νεφρού έδειξε ευρήµατα συµβατά µε εστιακή τµηµατική σπειραµατοσκλήρυνση. Επιπλέον κανένα από τα παιδιά αυτά δεν παρουσίαζε µετάλλαξη των γονιδίων NPHS2 και WT1, που συνδέονται µε γενετικές µορφές του ΚΑΝΣ.
Υποπληθυσµοί λεµφοκυττάρων Τα ποσοστά των υποπληθυσµών CD3+ όπως και CD25+, CD4+ και CD8+ Τ κυττάρων, τόσο στα παιδιά µε ΚΕΝΣ κατά την ενεργό φάση της νόσου και κατά τη φάση ύφεσης υπό και χωρίς κορτικοστεροειδή, όσο και στα παιδιά µε ΚΑΝΣ, ήταν συγκρίσιµα µε αυτά των µαρτύρων. Στα παιδιά µε ΚΕΝΣ το ποσοστό των CD19+ Β κυττάρων ήταν σηµαντικά αυξηµένο στην ενεργό φάση της νόσου (διάµεσος:17.12, διακύµανση: 12.22-24.54) σε σχέση µε τη φάση ύφεσης τόσο υπό κορτικοστεροειδή (διάµεσος:14.16, διακύµανση:10.23-18.3 και p<0.0001) όσο και χωρίς κορτικοστεροειδή (διάµεσος:13.92, διακύµανση:10.8-17.4 IU/ml και p= 0.035) καθώς και µε τους µάρτυρες (διάµεσος:13.78 διακύµανση:10.2-16.8 και p=0.022). Στα παιδιά µε ΚΑΝΣ το ποσοστό των CD19+ Β κυττάρων ήταν επίσης σηµαντικά αυξηµένο στην ενεργό φάση της νόσου (διάµεσος: 18.35, διακύµανση: 12.3-29) σε σχέση µε τους µάρτυρες (p=0.022). Το ποσοστό των Β κυττάρων, που εκφράζουν τον υποδοχέα της IgE (CD23+) στα παιδιά µε ΚΕΝΣ ήταν σηµαντικά αυξηµένο στην ενεργό φάση της νόσου (διάµεσος:3.62, διακύµανση:1.80-11) συγκριτικά µε τη φάση ύφεσης υπό κορτικοστεροειδή (διάµεσος:2.02, διακύµανση:1.21-8.53 και p=0.002) και χωρίς κορτικοστεροειδή (διάµεσος:1.43, διακύµανση:0.44-8.06 και p=0.012) καθώς και µε την οµάδα των µαρτύρων (διάµεσος:1.13, διακύµανση: 0.37-6.53 και p<0.001). Στα παιδιά µε ΚΑΝΣ το ποσοστό των CD23+ Β κυττάρων ήταν συγκρίσιµο µε αυτό των µαρτύρων (p>0.05). Eνδοκυττάριος προσδιορισµός των κυτταροκινών INF-γ και IL-4 Ως προς την ενδοκυττάρια παραγωγή κυτταροκινών, το ποσοστό των CD3+/CD69+/INF-γ Τ κυττάρων (τύπου-1 κύτταρα) ήταν πολύ ελαττωµένο στα παιδιά µε ΚΕΝΣ σε ενεργό φάση της νόσου (διάµεσος:10.85, διακύµανση: 8.47-16.49) σε σχέση µε τους µάρτυρες (διάµεσος:23.85, διακύµανση: 13.4-28.7 και p< 0.0001). Αντίθετα το ποσοστό των CD3+/CD69+/ IL4+Τ κυττάρων (τύπου-2 κύτταρα) ήταν σηµαντικά αυξηµένο όχι µόνο κατά την ενεργό φάση της νόσου (διάµεσος:19.59, διακύµανση: 13.68-26.29), αλλά και κατά τη φάση ύφεσης τόσο υπό κορτικοστεροειδή (διάµεσος:15.158, διακύµανση:10.43-19.63 και p=0.015) όσο και χωρίς κορτικοστεροειδή (διάµεσος:11.68, διακύµανση:7.57-14.56 και p=0.004) συγκριτικά µε τους µάρτυρες (διάµεσος:2.14, διακύµανση:1.25-5.63 και p<0.0001). Στα παιδιά µε ΚΑΝΣ το ποσοστό των CD3+/ CD69+/IFN-γ+ T κυττάρων ήταν οριακά αυξηµένο σε σχέση µε τους µάρτυρες (p=0.04), ενώ το ποσοστό των CD3+/CD69+/IL4+Τ κυττάρων ήταν συγκρίσιµο µε αυτό των µαρτύρων (p>0.05). Επίπεδα στον ορό των κυτταροκινών ΙΝF-γ, IL-4, IL-13 και IL-18 Όπως φαίνεται στον πίνακα 1, στα παιδιά µε ΚΕΝΣ, τα επίπεδα της IL-2 στον ορό σε όλες τις φάσεις της νόσου ήταν συγκρίσιµα µε αυτά των µαρτύρων (p>0.05) ενώ τα επίπεδα της INF-γ, σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατα από την ενδοκυττάρια εκτίµηση, ήταν ελαττωµένα σε ενεργό φάση σε σχέση µε τους µάρτυρες. Αντίθετα τα επίπεδα της IL-4 ήταν σηµαντικά αυξηµένα όχι µόνο κατά την ενεργό φάση της νόσου, αλλά και κατά τη φάση ύφεσης τόσο υπό κορτικοστεροειδή, όσο και χωρίς κορτικοστεροειδή συγκριτικά µε τους µάρτυρες. Στα παιδιά µε ΚΑΝΣ τα επίπεδα των ΙΝF-γ, IL-2 και IL-4 ήταν συγκρίσιµα µε αυτά των µαρτύρων (p>0.05). Τα επίπεδα της IL 13 στον ορό των παιδιών µε ΚΕΝΣ ήταν σηµαντικά αυξηµένα στην ενεργό φάση της νόσου συγκριτικά µε τη φάση ύφεσης τόσο υπό κορτικοστεροειδή όσο και χωρίς κορτικοστεροειδή καθώς και µε τους µάρτυρες. Το ίδιο βρέθηκε και για τα επίπεδα της IL 18 που ήταν πολύ αυξηµένα κατά την ενεργό φάση της νόσου συγκριτικά µε τους µάρτυρες. Τα επίπεδα ελαττώνονταν σηµαντικά κατά τη φάση ύφεσης υπό και
χωρίς κορτικοστεροειδή αλλά παρέµεναν σηµαντικά αυξηµένα σε σχέση µε αυτά των µαρτύρων (Πίν. 1). Στα παιδιά µε ΚΑΝΣ τα επίπεδα των IL-13 και IL-18 ήταν οριακά αυξηµένα (p=0.04) σε σχέση µε τους µάρτυρες. Συνοπτικά στα παιδιά µε ΚΕΝΣ υπερτερούσε η τύπου 2 ανοσιακή απάντηση (αύξηση IL-4 και IL-13, ελάττωση IFN-γ) σε σύγκριση µε τους µάρτυρες και τους ασθενείς µε ΚΑΝΣ. Συζήτηση Στη παρούσα προοπτική µελέτη προσπαθήσαµε να διερευνήσουµε αφενός τις ανοσολογικές διαταραχές που παρατηρούνται στα παιδιά µε πρωτοπαθές ΚΕΝΣ και ΚΑΝΣ και αφετέρου τη δυνατότητα οι διαταραχές αυτές να χρησιµεύσουν ως προγνωστικοί δείκτες της απάντησης στα κορτικοστεροειδή. Τα κύρια ευρήµατα της µελέτης µας έδειξαν ότι στα παιδιά µε ΚΕΝΣ κατά την ενεργό φάση της νόσου υπάρχει σαφής υπεροχή της τύπου-2 ανοσιακής απάντησης µε αυξηµένα ποσοστά CD3+/CD69+/IL-4+ Τ κυττάρων (τύπου- 2), µειωµένα ποσοστά CD3+/CD69+/INF-γ Τ κυττάρων (τύπου-1) σε συνδυασµό µε αυξηµένα επίπεδα στον ορό των κυτταροκινών IL-4, IL-13 και IL-18. Αναφορικά µε το βασικό ανοσοφαινότυπο των Τ κυττάρων, το ποσοστό των ενεργοποιηµένων Τ κυττάρων στα παιδιά τόσο µε ενεργό ΚΕΝΣ όσο και µε ΚΑΝΣ στη µελέτη µας βρέθηκε σε φυσιολογικά επίπεδα όπως και στις µελέτες των Frank και συν. 15 και Μathienson και συν 16 στις οποίες δεν παρατηρήθηκε µεταβολή των Τ κυττάρων. Σχετικά µε τον ανοσοφαινότυπο των Β κυττάρων, στα παιδιά µε ΚΕΝΣ και ΚΑΝΣ τα αποτελέσµατα των διαφόρων µελετών είναι αντικρουόµενα. Σε συµφωνία µε τα δικά µας αποτελέσµατα οι Lama και συν 17 και Salsano και συν 18 έδειξαν ότι στα παιδιά µε ενεργό ΚΕΝΣ και ΚΑΝΣ τα επίπεδα των CD19+ Β κυττάρων µπορεί να είναι αυξηµένα. Η σηµασία του ευρήµατος των αυξηµένων CD19+ Β κυττάρων δεν είναι εύκολο να ερµηνευτεί. Η χρήση µε επιτυχία του Rituximab, µονοκλωνικού αντισώµατος έναντι των CD20+ Β κυττάρων (επόµενη βαθµίδα ωρίµανσης των Β κυττάρων), σε µεµονωµένες περιπτώσεις συχνά υποτροπιάζοντος ΚΕΝΣ ή κορτικοεξαρτώµενου ΝΣ καθώς και σε περιπτώσεις ΚΑΝΣ µπορεί να αντικατοπτρίζει την πιθανή εµπλοκή των Β κυττάρων στην ανοσοπαθογένεια του ιδιοπαθούς ΝΣ, άποψη που συµφωνεί και µε τα δικά µας ευρήµατα 19,20. Αντίθετα το ποσοστό των CD23+ Β κυττάρων ήταν αυξηµένο µόνο στα παιδιά µε ΚΕΝΣ. Παρόµοια ήταν τα αποτελέσµατα των Kemper και συν 21 και Cho και συν 22, οι οποίοι επίσης παρατήρησαν αυξηµένο ποσοστό CD23+ Β κυττάρων σε παιδιά µε ενεργό ΚΕΝΣ. Αναφορικά µε την ενδοκυττάρια παραγωγή κυτταροκινών (ποσοστό CD3+/CD69+/INF-γ + και CD3+/ CD69+/IL-4 + T κυττάρων) και την ταυτοποίηση της κάτοψης των κυτταροκινών που παράγονται και εκκρίνονται στο ΚΕΝΣ και ΚΑΝΣ τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει αρκετές µελέτες µε αποτελέσµατα συχνά αντικρουόµενα µεταξύ τους 7-9,23-26. Σε πολλές περιπτώσεις η µεθοδολογία τόσο αναφορικά µε τους ασθενείς (φάση ΝΣ, λήψη ή όχι ανοσοκατασταλτικών φαρµάκων κ.α), όσο και µε τη µέθοδο µέτρησης και προσδιορισµού των κυτταροκινών διέφερε σηµαντικά, ώστε τα αποτελέσµατα να µην είναι συγκρίσιµα µεταξύ τους. Tα αποτελέσµατα της µελέτης µας, αναφορικά µε την κάτοψη των παραγόµενων και εκκρινόµενων κυτταροκινών δείχνουν ότι στους ασθενείς µε ΚΕΝΣ υπάρχει διαταραγµένη ισορροπία της τύπου-1 προς τύπο-2 ανοσιακής απάντησης µε υπεροχή της τύπου-2 (αντί της τύπου-1 που συµβαίνει σε υγιή άτοµα), όπως αυτή εκφράζεται κυρίως από την αυξηµένη σύνθεση και έκκριση της IL-4 και IL-13 και τη µειωµένη σύνθεση της INF-γ. Αναφορικά µε την IL-4 στα παιδια µε ΚΕΝΣ τα αποτελέσµατά µας συµφωνούν µε αυτά των Neuhaus και συν 25 και Cho και συν. 26, οι οποίοι βρήκαν αυξηµένα επίπεδα της IL-4 στον ορό. Αντίθετα οι Stachowski και συν. 27 σε ενεργό φάση του ΚΕΝΣ παρατήρησαν µειωµένα επίπεδα της IL-4. Η διαφορά αυτή στα επίπεδα µπορεί να αποδοθεί στη διαφορετική τεχνική που χρησιµοποίησαν οι Stachowski και συν
(προσδιορισµό των κυτταροκινών στο υπερκείµενο από καλλιέργειες µονοκυττάρων) και η οποία δεν µετράει άµεσα τα κύτταρα που παράγουν IL-4, όπως έγινε στη δική µας µελέτη. Σε προηγούµενες µελέτες οι Yap και συν. 24 βρήκαν στους ασθενείς µε ενεργό ΚΕΝΣ, µε τη χρήση ηµι-ποσοτικής PCR τεχνικής, αυξηµένη έκφραση του mrna της IL-13 τόσο στα CD4+ όσο και στα CD8+ Τ λεµφοκύτταρα σε σύγκριση µε τους ασθενείς που βρίσκονται σε φάση ύφεσης της νόσου και µε τους υγιείς µάρτυρες. H IL-13 σύµφωνα µε τους συγγραφείς, πιθανότατα, δρα στα µονοκύτταρα επάγοντας την παραγωγή ενός υποθετικού παράγοντα που αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα (vascular permeability factor) συµβάλλοντας έτσι στην εµφάνιση της πρωτεϊνουρίας 24. Τα ευρήµατα της µελέτης µας όσον αφορά την τύπου-2 κάτοψη των κυτταροκινών, που βρήκαµε να υπερτερεί σε όλες τις φάσεις του ΚΕΝΣ, ενισχύονται και από την ανεύρεση µειωµένης ενδοκυττάριας σύνθεσης της INF-γ (κυτταροκίνη της τύπου-1 ανοσιακής απάντησης). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα αποτελέσµατα της µελέτης µας σχετικά µε τα αυξηµένα επίπεδα της IL-18 σε όλες τις φάσεις του ΚΕΝΣ, ιδιαίτερα δε στην ενεργό φάση, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. H IL-18 αποτελεί µία κυτταροκίνη που άλλοτε επάγει την τύπου-1 και άλλοτε την τύπου-2 ανοσιακή απάντηση 28. Σε προηγούµενη µελέτη οι Matsumoto και συν. 29 βρήκαν αυξηµένα επίπεδα IL-18 σε ενήλικες µε ενεργό ΚΕΝΣ. Μέχρι σήµερα δεν υπάρχουν περισσότερα δεδοµένα σχετικά µε το ρόλο της IL-18 στην παθογένεια του ΚΕΝΣ. Στη µελέτη µας στα παιδιά µε ΚΑΝΣ δεν βρέθηκε να υπερτερεί η τύπου-2 ανοσιακή απάντηση, αλλά αντίθετα παρατηρήθηκε οριακή αύξηση στη σύνθεση της INF-γ µε φυσιολογικά όµως επίπεδα της κυτταροκίνης στον ορό. Ελάχιστες µελέτες υπάρχουν αναφορικά µε τις ανοσολογικές διαταραχές στα παιδιά µε ΚΑΝΣ. Σε ορισµένες µελέτες 18,30, όπως και στη δική µας, έχει φανεί ότι τα επίπεδα της IL-4 στα παιδιά µε ενεργό ΚΑΝΣ είναι συγκρίσηµα µε αυτά των µαρτύρων. Αναφορικά µε την IL-2 τα αποτελέσµατά µας συµφωνούν µε αυτά των Syranyi και συν 31, Daniel και συν. 32, οι οποίοι βρήκαν φυσιολογικά επίπεδα της IL-2 στον ορό των παιδιών µε ΚΑΝΣ. Σε τρείς µελέτες, όπου αξιολοξήθηκαν τα επίπεδα της INF-γ στον ορό παιδιών µε ΚΑΝΣ βρέθηκαν, όπως και στη δική µας µελέτη σε επίπεδα συγκρίσιµα µε αυτά των µαρτύρων 7,31,32. εν υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδοµένα σχετικά µε τα επίπεδα της ΙL-13 και της IL-18 στα παιδιά µε ΚΑΝΣ. Στην δική µας µελέτη παρατηρήθηκε οριακά σηµαντική αύξηση των κυτταροκινών αυτών στα παιδιά µε ΚΑΝΣ. Γνωρίζοντας ότι η IL-18 δεν αποτελεί ειδική κυτταροκίνη της τύπου-1 ή τύπου-2 ανοσιακής απάντησης η οριακή αυτή αύξηση δεν µπορεί να αξιολογηθεί περαιτέρω. Συµπερασµατικά, τα ευρήµατα της µελέτης µας δείχνουν ότι στα παιδιά µε ενεργό ΚΕΝΣ υπερέχει η ανοσιακή απάντηση τύπου-2, ενώ στα παιδιά µε ΚΑΝΣ δεν υπάρχει εµφανής υπεροχή της τύπου-1 ή τύπου-2 ανοσιακής απάντησης. Φαίνεται δηλαδή ότι η σαφής υπεροχή της τύπου-2 ανοσιακής απάντησης σχετίζεται µε απάντηση του ΝΣ στα κορτικοστεροειδή (κορτικοευαισθησία). Πίνακας 1. Επίπεδα στον ορό, διάµεση τιµή και διακύµανση, των κυτταροκινών IFN-γ, IL-2, IL4, IL-13 και IL-18 στα παιδιά µε ΚΕΝΣ, στις διαφορετικές φάσεις της νόσου, µε ΚΑΝΣ και στους µάρτυρες Eπίπεδα στον ΚΕΝΣ ΚΑΝΣ Μάρτυρες ορό pg/ml Ενεργός Ύφεση υπό Ύφεση χωρίς φάση κορτ/ειδή κορτ/ειδή IL-2 διάµεσος 7,9 1 8,2 1 8,4 1 8,1 1 7,5
διακύµανση 7,1-12,8 7,6-11,9 7,3-12,1 7,0-12,3 6,2-11,5 IFN-γ διάµεσος 14,82 2 21,95 24,2 18,5 1 19,23 διακύµανση 13,7-27,37 13,92-34,45 16,9-35,56 13,1-28,3 13,96-32,27 IL-4 διάµεσος 58 3 30,33 21,76 13,8 1 12,4 διακύµανση 17,8-194 12,13-72,04 10,8-51,65 6,3-25,8 6,43-33,53 IL-13 διάµεσος 75,69 4 41,03 37 23,2 5 14,6 διακύµανση 20-187 13,7-134 12-88 16,8-34,5 14,2-19,2 IL-18 διάµεσος 1613.75 6 926,75 670 324 7 214,8 διακύµανση 521-4090 455-1291 394-1136 123-514 78,3-386,8 1 στατιστικά µη σηµαντικό 2 p<0.0001, p<0.0001,p=0.019 για σύγκριση µεταξύ ενεργού φάσης σε σχέση µε φάση ύφεσης υπό κορτικοστεροειδή, φάση ύφεσης χωρίς κορτικοστεροειδή και µάρτυρες αντίστοιχα 3 p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001 για σύγκριση µεταξύ ενεργού φάσης σε σχέση µε φάση ύφεσης υπό κορτικοστεροειδή, φάση ύφεσης χωρίς κορτικοστεροειδή και µάρτυρες αντίστοιχα 4 p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001 για σύγκριση µεταξύ ενεργού φάσης σε σχέση µε φάση ύφεσης υπό κορτικοστεροειδή, φάση ύφεσης χωρίς κορτικοστεροειδή και µάρτυρες αντίστοιχα 5 p=0.04 για σύγκριση µεταξύ παιδιών µε ΚΑΝΣ και µαρτύρων 6 p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001 για σύγκριση µεταξύ ενεργού φάσης σε σχέση µε φάση ύφεσης υπό κορτικοστεροειδή, φάση ύφεσης χωρίς κορτικοστεροειδή και µάρτυρες αντίστοιχα 7 p=0.04 για σύγκριση µεταξύ παιδιών µε ΚΑΝΣ και µαρτύρων Βιβλιογραφία 1. Hogg R, Portman R, Milliner D, Lemley K, Eddy A, Ingerfinger J. Evaluation and Management of Proteinuria and Nephrotic Syndrome in Children: Recommendations From a Pediatric Nephrotic Panel Established at the National Kidney Foundation Conference on Proteinuria, Albuminuria, Risk, Assessment, Detection and Elimination (PARADE). Pediatrics 2000, 105: 1242-1249. 2. Eddy A, Symons J. Nephrotic syndrome in childhood. The Lancet 2003, 362: 629-639. 3. Roth K, Amaker B, Chan J. Nephrotic syndrome. Pathogenesis and management. Pediatr in Review 2002, 23: 237-247. 4. Churg J, Habib R, White, R. H. Pathology of the nephrotic syndrome in children: a report for the International Study of Kidney Disease in Children. Lancet 1970, i: 1299-1302. 5. Shalhoub RJ. Pathogenesis of lipid nephrosis: a disorder of T-cell function. Lancet 1974, 2: 556-560. 6. Anonymous. The primary nephrotic syndrome in children. Identification of patients with minimal change nephrotic syndrome from initial response to prednisone. A report of the International Study of Kidney Diseases in Children. J Pediatr 1981, 98: 561-564. 7. Lama G, Luongo I, Tirino G, Borriello A, Carangio C, Salsano ME. T-lymphocyte populations and cytokines in childhood nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis 2002, 39: 958-965. 8. Fiser RT, Arnold WE, Charlton RK, et al. T lymphocyte subsets in nephrotic syndrome. Kidney Int 1991, 40: 913-916. 9. José G, Van De Berg, J Weening. Role of the immune system in the pathogenesis of idiopathic nephrotic syndrome. Clinical Science 2004, 107: 125-136. 10. White RH, Glasgow EF, Mills RJ. Clinicopathological study of nephrotic syndrome in childhood. Lancet 1970, i: 1353-1359. 11. Boute N, Gribouval O, Roselli. NSHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nat Genet 2000, 24: 349-354.
12. Kaplan JM, Kim SH, Noth KN. Mutations in ACTN4, encoding alpha actinin-4, cause familial focal segmental glomerulosclerosis. Nat Genet 2000, 24: 251-256. 13. Guo JK, Menke AL, Gubler MC. WT1 is a key regulator of podocyte function:reduced expression levels cause cresentic glomerulonephritis and messangial sclerosis. Hum Mol Genet 2002,11: 651-659. 14. Gilbert R, Hulse E, Rigden S. Rituximab therapy for steroid-dependent minimal change nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol 2002, 21: 1698-1700. 15. Neuhaus TJ, Shah V, Callard RE, Barrat TM. T-lymphocyte activation in steroid sensitive nephrotic syndrome in childhood. Nephrol Dial Transplant 1995,10: 1348-1352. 16. Mathienson P. Immune dysregulation in minimal change nephropathy. Nephrol Dial Transplant 2003,18: 26-29. 17. Lama G, Luongo I, Tirino G, Borrielo A, Carangio C, Esposito Salsano M. T-Lymphocyte populations and cytokines in childhood nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis 2002, 39: 958-965. 18. Salsano M, Graziano L, Luongo I, Pilla P, Giordano M, Lama G. Atopy in childhood nephritic syndrome. Acta Paediatrica 2007, 96: 561-566. 19. Ahmed MC, Wong C. Rituximab and nephrotic syndrome: a new therapeutic hope? Nephrol Dial Transplant, 2008 23: 11 17. 20. François H, Daugas E, Bensman A, Ronco P.Unexpected efficacy of rituximab in multirelapsing minimal change nephrotic syndrome in the adult: first case report and pathophysiological considerations. Am J Kidney Dis. 2007, 49: 158-161. 21. Kemper MJ, Meyer-Jark T, Lilova M, Muller-Wiefel DE. Combined T- and B-cell activation in childhood steroidsensitive nephrotic syndrome. Clin Nephrol 2003, 60: 242 247. 22. Cho BS, Yoon SR, Jang JY, et al. Upregulation of interleukin-4 and CD23/FcepsilonRII in minimal change nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol 1999, 13: 199-204. 23. Frank C., Herrmann M., Fernandez S, et al. Dominant T cells in idiopathic nephrotic syndrome of childhood. Kidney Int. 2000, 57: 510-517. 24. Yap HK, Cheung W, Murugasu B, Sim SK, Seah C, Jordan SC. Th1 and Th2 Cytokine Profiles in Childhood Nephrotic Syndrome: Evidence for Increased IL-13 mrna Expression in Relapse. J Am Soc Nephrol 1999, 10: 529-537. 25. Neuhaus TJ, Wadhwa M, Callard R, Barratt TM. Increased IL-2, IL-4 and interferon-γ (IFN-γ ) in steroid-sensitive nephrotic syndrome. Clin. Exp. Immunol. 1995, 100: 475-479. 26. Araya C, Wasserfall C, Brusko T, Mu W, Segal M, Johnson R, Garin E. A case of unfulfilled expectations. Cytokines in idiopathic minimal lesion nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol 2006, 21: 603-610. 27. Stachowski J, Barth C, Michalkiewicz J, Krynicki T, et al. Th1/Th2 balance and CD45+ positive T cells subsets in primary nephrotic syndrome. Pediatr Nephrol 2000, 14: 779-785. 28. Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, Okamura H. IL-18 is a unique cytokine that stimulates both Th-1 and Th-2 responses depending on its cytokine milieu. Cytokine Growth Factor Rev 2001, 12 (1): 53-72. 29. Matsumoto K, Kanmatsuse K. Augmented interleukin-18 production by peripheral blood monocytes in patients with minimal-change nephrotic syndrome. Am J Nephrol 2001, 21: 20-27. 30. Tai YL, Chen TY, Yang K. Implications of serum IgE in childhood nephritic syndrome. Pediatr Nephrol 2003, 18: 1211-1215. 31. Suranyi MG, Guasch A, Hall BM, Myers BD. Elevated levels of tumor necrosis factor-alpha in the nephrotic syndrome in humans. Am J Kidney Dis 1993, 21: 251-259. 32. Daniel V, Trautmann Y, Konrad M, Nayir A, Scharer K. T-lymphocyte populations, cytokines and other growth factors in serum and urine of children with idiopathic nephrotic syndrome. Clin Nephrol 1997, 47: 289 297.
Αλληλογραφία: N. Πρίντζα Α Παιδιατρική Κλινική ΑΠΘ Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο, Θεσσαλονίκη Κωνσταντινουπόλεως 49 Τηλ.: +302310 892466 Fax: +302310 892784 e-mail: nprintza@in.gr Correspondence author: N. Printza 1 st Paediatric Department Hippokration General Hospital Konstantinoupoleos 49 Τhessaloniki, Greece Tel.: +302310 892466 Fax: +302310 892784 e-mail: nprintza@in.gr