ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΟΣΟΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΒΡΟΓΧΟΚΥΨΕΛΙΔΙΚΟΥ ΕΚΠΛΥΜΑΤΟΣ ΣΕ ΔΙΑΜΕΣΕΣ ΠΝΕΥΜΟΝΟΠΑΘΕΙΕΣ ΚΟΣΜΑ ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ Μεταπτυχιακή φοιτήτρια, Κλινική κατεύθυνση ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΥΡΙΑΖΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Καθηγητής Ανοσολογίας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2009

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ σελ 1. Εισαγωγή.3 1α. Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL): τεχνική και φυσιολογικά ευρήματα...6 1β. Η διαγνωστική αξία του BAL στις διάχυτες διηθητικές πνευμονοπάθειες...8 1γ. Ανοσοφαινότυποι των λεμφοκυττάρων...9 1δ. Κυτταρομετρία ροής...11 1ε. Διάχυτες παρεγχυματικές πνευμονοπάθειες: Κλινικο-εργαστηριακά και ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά... 13 2. Σκοπός.....19 3. Ασθενείς και μέθοδοι......20 4. Αποτελέσματα......22 5. Συζήτηση.....28 6. Συμπεράσματα...32 7. Περίληψη..34 8. Summary..35 Παράρτημα.....36 Βιβλιογραφία... 54 2

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο όρος «διάχυτες παρεγχυματικές πνευμονοπάθειες», αντίστοιχος του προγενέστερου «διάμεσες πνευμονοπάθειες», περιγράφει ένα ετερογενές σύνολο μη λοιμωδών και μη νεοπλασματικών παρεγχυματικών πνευμονικών νοσημάτων με κοινό χαρακτηριστικό την αποδιοργάνωση των κυψελιδικών τοιχωμάτων και την απώλεια των λειτουργικών τριχοειδοκυψελιδικών μονάδων, τη χρόνια φλεγμονή και την προοδευτική ίνωση που καταλήγει σε καταστροφή της αρχιτεκτονικής του πνευμονικού διαμέσου ιστού (του χώρου μεταξύ του κυψελιδικού επιθηλίου και του τριχοειδικού ενδοθηλίου) (1). Σύμφωνα με την κατάταξη των Raghu και Brown τα διάχυτα παρεγχυματικά πνευμονικά νοσήματα ταξινομούνται ως εξής (2) : 1. Νοσήματα κολλαγόνου, αγγειίτιδες και πνευμονονεφρικά σύνδρομα 2. Κοκκιωματώδη νοσήματα α. άγνωστης αιτιολογίας (σαρκοείδωση, εωσινόφιλο κοκκίωμα) β. γνωστής αιτιολογίας (εξωγενής αλλεργική κυψελιδίτιδα, φαρμακογενείς πνευμονοπάθειες, πνευμονοπάθειες από εισπνεόμενες οργανικές ουσίες) 3. Ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες α. ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση β. άλλες: AIP, NSIP, RB-ILD, DIP, COP, LIP 4. Διάχυτες πνευμονοπάθειες από έκθεση σε εισπνεόμενες ουσίες (ανόργανες και οργανικές σκόνες, οικιακή και περιβαλλοντική έκθεση, καπνοί, αεροζόλ, εξωγενής αλλεργική κυψελιδίτιδα) 5. Κληρονομικές διάχυτες πνευμονοπάθειες (οικογενής ιδιοπαθής ίνωση, οζώδης σκλήρυνση, σύνδρομο Hermansky-Pudlak, νευροϊνωμάτωση, σύνδρομα μεταβολικής δυσλειτουργίας) 6. Ειδικές κατηγορίες (εωσινοφιλικές πνευμονοπάθειες, ιατρογενείς πνευμονοπάθειες από φάρμακα ή ακτινοβολία, λεμφαγγειολειομυομάτωση, κυψελιδική πρωτεΐνωση, φλεβοαποφρακτική νόσος, πνευμονική τριχοειδίτιδα). Τα νοσήματα αυτά χαρακτηρίζονται από μεγάλο εύρος κλινικο-εργαστηριακών ευρημάτων, σπάνια όμως κάποιο από τα ευρήματα αυτά έχει αφεαυτού υψηλή διαγνωστική αξία ή παθογνωμονικό χαρακτήρα. Τα συμπτώματα (συνήθως δύσπνοια και ξηρός βήχας και σπανιότερα πυρετός και θωρακικό άλγος) είναι μάλλον κοινά, μη ειδικά και μπορεί να συνθέτουν ένα ευρύ φάσμα κλινικών εικόνων που εκτείνεται από την απουσία συμπτωμάτων ως την εκδήλωση βαριάς νόσου. Οι απλές εργαστηριακές εξετάσεις αίματος γενικά δε βοηθούν στη διάγνωση, εξαιρουμένης της περιφερικής εωσινοφιλίας που αποτελεί χαρακτηριστικό ειδικής μορφής εωσινοφιλικής πνευμονίας (χρόνια εωσινοφιλική πνευμονία). 3

Ωστόσο, έχει αξία η αναζήτηση ευρημάτων από τον ανοσολογικό έλεγχο (c-anca, p-anca, αντισώματα κατά της βασικής μεμβράνης, ιζηματίνες, ΑΝΑ, ρευματοειδής παράγοντας) εφόσον αυτά μπορούν να περιορίσουν το φάσμα της διαφορικής διάγνωσης ή και να θέσουν, ενίοτε, τη διάγνωση της νόσου. Ο ρόλος και η διαγνωστική αξία της βρογχοκυψελιδικής έκπλυσης θα αναλυθούν περαιτέρω στη συνέχεια. Από τις λοιπές επεμβατικές μεθόδους, η διαβρογχική βιοψία πνεύμονα κατά τη διενέργεια βρογχοσκόπησης έχει διαφορετική αξία σε κάθε διάχυτη διηθητική πνευμονοπάθεια (πολύ χρήσιμη στη σαρκοείδωση, στη λεμφαγγειακή καρκινωμάτωση, στην εωσινοφιλική πνευμονία, λιγότερο χρήσιμη στην εξωγενή κυψελιδίτιδα και καθόλου χρήσιμη στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση) και επομένως χρησιμοποιείται κατά την ένδειξη. Όταν η διαβρογχική βιοψία πνεύμονα δεν είναι διαγνωστική, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η βιντεοθωρακοσκοπική βιοψία πνεύμονος (VATS, Video-assisted Thoracoscopic Surgery). Η πλέον επεμβατική μέθοδος, η βιοψία πνεύμονα μέσω ανοιχτής θωρακοτομής, χρησιμοποιείται όταν όλες οι προηγούμενες εξετάσεις αποδεικνύονται μη διαγνωστικές και εφόσον το επιτρέπει η κλινική κατάσταση του ασθενούς. Από την άποψη του λειτουργικού ελέγχου της αναπνοής, οι διάχυτες παρεγχυματικές (διάμεσες) πνευμονοπάθειες χαρακτηρίζονται, γενικά, από την παρουσία περιοριστικού τύπου διαταραχής κατά την μέτρηση των στατικών όγκων και των ροών και από τη μείωση της διαχυτικής ικανότητας του πνεύμονα, τουλάχιστο σε προχωρημένα στάδια των νόσων. Η μείωση της ζωτικής χωρητικότητας (VC, Vital Capacity) οφείλεται περισσότερο στην καταστροφή ενός αριθμού κυψελίδων από τη νόσο αλλά και στην κατάληψη τους από φλεγμονώδες υλικό και λιγότερο στην ελάττωση της ελαστικότητας του πνευμονικού παρεγχύματος. H ολική πνευμονική χωρητικότητα (TLC, Total Lung Capacity) είναι επίσης μειωμένη αλλά λιγότερο από τη ζωτική χωρητικότητα και ενδέχεται να είναι σχεδόν φυσιολογική όταν συνυπάρχει νόσος των μικρών αεραγωγών (αποφρακτική πνευμονοπάθεια). Η σχετικά μικρότερη μείωσή της εξηγείται από την ευνοϊκότερη θέση λειτουργίας των εισπνευστικών μυών στην καμπύλη πιέσεως-όγκου στη θέση της ολικής πνευμονικής χωρητικότητας. Ακόμη λιγότερο μειωμένη από τις δύο προηγούμενες χωρητικότητες φαίνεται να είναι η λειτουργική υπολειπόμενη χωρητικότητα (FRC, Functional Residual Capacity), λόγω της διατήρησης σχετικά χαμηλής της διαφοράς μεταξύ της τάσης έκπτυξης του θωρακικού τοιχώματος και της τάσης σύμπτυξης του ινωτικού πνεύμονα. Η διαχυτική ικανότητα του πνεύμονα (DLCO) βρίσκεται μειωμένη σε ασθενείς με μέτρια ή βαριά διάχυτη παρεγχυματική πνευμονοπάθεια και η μείωση αυτή μπορεί να προηγείται της μείωσης των πνευμονικών όγκων. Τα αίτια περιλαμβάνουν την απώλεια μέρους της τριχοειδικής κοίτης της πνευμονικής κυκλοφορίας, την πάχυνση της 4

κυψελιδοαρτηριακής μεμβράνης και την ελάττωση του όγκου του αίματος στα πνευμονικά τριχοειδή. Η μείωση της DLCO ευθύνεται μόνο εν μέρει για την υποξυγοναιμία που παρατηρείται στα νοσήματα αυτά. Η υποξυγοναιμία σε ηρεμία και άσκηση που χαρακτηρίζει τα διάχυτα παρεγχυματικά νοσήματα του πνεύμονα οφείλεται κυρίως σε διαταραχές της σχέσης αερισμού αιμάτωσης αλλά και στην ανάπτυξη διαφυγών (αναστομώσεις μεταξύ βρογχικής και πνευμονικής κυκλοφορίας, ενδοκαρδιακά shunts) τουλάχιστον σε συνθήκες κόπωσης. Η ανταλλαγή αερίων εκτιμάται με μεγαλύτερη ευαισθησία με την κυψελιδοαρτηριακή διαφορά μερικών πιέσεων οξυγόνου [P (A-a) O 2 ] από όσο με τη μερική πίεση οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα (PaO 2 ). Ακόμη, αξίζει να αναφερθεί ότι παρατηρούνται διαφορές στις παραμέτρους του λειτουργικού έλεγχου της αναπνοής μεταξύ των διάχυτων παρεγχυματικών πνευμονοπαθειών. Έτσι, οι διάχυτες παρεγχυματικές πνευμονοπάθειες που χαρακτηρίζονται παθολογοανατομικά από την παρουσία κοκκιώματος (σαρκοείδωση, εξωγενής αλλεργική κυψελιδίτιδα, εωσινόφιλο κοκκίωμα) μπορεί να εμφανίζουν επηρεασμένη τη λειτουργία των αεραγωγών και αυτό οφείλεται στην περιβρογχική εντόπιση των κοκκιωμάτων. Πάντως, για τον έλεγχο της λειτουργίας των μικρών αεραγωγών και τη μέτρηση των αντιστάσεών τους θεωρούνται αξιόπιστες οι ισο-ογκικές μετρήσεις πίεσης ροής, η εκτίμηση της σχέσης δυναμικής στατικής διατασιμότητας, η μέτρηση του όγκου σύγκλεισης και οι σταθερές χρόνου. Ακόμη, έχει παρατηρηθεί ότι η DLCO για δεδομένη τιμή VC είναι χαμηλότερη και η P (A-a) O 2 για δεδομένη τιμή VC και DLCO είναι μεγαλύτερη στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση σε σχέση με τη σαρκοείδωση. Οι διαταραχές της ανταλλαγής αναπνευστικών αερίων κατά την άσκηση και τον ύπνο θεωρούνται πρώιμοι δείκτες διάγνωσης στα νοσήματα αυτά. Η βρογχοκυψελιδική έκπλυση, που στοχεύει στη λήψη και ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (Bronchoalveolar lavage, BAL), είναι μια ασφαλής επεμβατική μέθοδος που χρησιμοποιείται στη διαγνωστική διερεύνηση αρκετών νοσημάτων του πνεύμονα εδώ και αρκετά χρόνια. Οι κλινικές ενδείξεις για τη διενέργεια της εξέτασης αυτής περιλαμβάνουν νοσήματα του διαμέσου ιστού και του κυψελιδικού, πνευμονικές διηθήσεις σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και νοσήματα από περιβαλλοντική έκθεση σε σκόνες (3). Πιο συγκεκριμένα η σαρκοείδωση, η εξωγενής αλλεργική κυψελιδίτιδα (παλιότερα γνωστή ως πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία), η πνευμονοπάθεια από φάρμακα, η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση, η πνευμονική εντόπιση των νοσημάτων του συνδετικού ιστού (κολλαγονώσεις), το εωσινόφιλo κοκκίωμα, οι πνευμονικές παθήσεις από επαγγελματική έκθεση, η λεμφαγγειακή καρκινωμάτωση, η πνευμονία (μικροβιακή και ιογενής), η κυψελιδική 5

αιμορραγία, η κυψελιδική πρωτεΐνωση, η εωσινοφιλική πνευμονία, η αποφρακτική βρογχιολίτιδα με οργανούμενη πνευμονία, η λοίμωξη από HIV (human immunodeficiency virus), η πνευμονοπάθεια που συνοδεύει χημειοθεραπεία, ακτινοβολία, ανοσοκατασταλτική θεραπεία ή μεταμόσχευση (4,5) διερευνώνται, εν μέρει, με αυτή τη διαγνωστική μέθοδο. Βέβαια, στη διαγνωστική προσέγγιση των εν λόγω νοσημάτων, είναι απαραίτητη η συναξιολόγηση των ευρημάτων του υλικού που λαμβάνεται με τη βρογχοκυψελιδική έκπλυση, των πληροφοριών από το ιστορικό και των κλινικο-εργαστηριακών ευρημάτων. 1α. Βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (Bronchoalveolar lavage, BAL): τεχνική και φυσιολογικά ευρήματα Η λήψη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BAL, Bronchoalveolar lavage) γίνεται με το εύκαμπτο βρογχοσκόπιο μετά από ενσφήνωση αυτού σε κατάλληλο υποτμηματικό βρόγχο και ενστάλαξη ακολουθούμενη από επαναρρόφηση προκαθορισμένης ποσότητας φυσιολογικού ορού (120-200ml) (6). Όταν οι βλάβες κατανέμονται αμφοτερόπλευρα στους πνεύμονες, προτιμάται η λήψη από το μέσο λοβό ή τη γλωσσίδα. Αντίστοιχα, η παρουσία εντοπισμένων βλαβών κατευθύνει τη λήψη του υλικού από την επηρεασμένη πνευμονική περιοχή (5). Το δείγμα του εκπλύματος συλλέγεται σε σιλικονισμένους περιέκτες και μπορεί να φυλαχτεί σε κατάψυξη μέχρι να μελετηθεί. Κατά τα διάφορα στάδια της επεξεργασίας του το δείγμα διηθείται διαμέσου γάζας, γίνεται μέτρηση των κυττάρων σε κάμερα Neubauer και φυγοκεντρείται. Στη συνέχεια ελέγχεται η μακροσκοπική του εικόνα για ειδικά χαρακτηριστικά, μετράται ο αριθμός κυττάρων ανά ml υγρού και υπολογίζεται ο ολικός αριθμός κυττάρων. Μετά την επίστρωση και τη μονιμοποίηση των παρασκευασμάτων, τα κύτταρα χρώνυνται και προσδιορίζονται οι κυτταρικοί τύποι (κυψελιδικά μακροφάγα, λεμφοκύτταρα, ουδετερόφιλα, επιθηλιακά κύτταρα). Με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων και την κατάλληλη τεχνική αναγνώρισης μπορούν να μελετηθούν οι κυτταρικοί υποπληθυσμοί (προσδιορισμός ανοσοφαινοτύπων) που είναι παρόντες στο δείγμα (8). Ακόμη, το δείγμα προετοιμάζεται κατάλληλα όταν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν νεότερες μεθοδολογίες, όπως η κυτταρομετρία ροής, η οποία βρίσκει πλέον ευρύτατη εφαρμογή στη μελέτη αυτού του υλικού. Οι φυσιολογικές τιμές για τα κυτταρικά στοιχεία του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος είναι διαφορετικές σε καπνιστές και μη καπνιστές. Στους μη καπνιστές, φυσιολογικά, ο ολικός αριθμός κυττάρων είναι μικρότερος των 13Χ10 6 (εύρος τιμών 6-27Χ10 6 ) και τα κυψελιδικά μακροφάγα είναι ο κυρίαρχος πληθυσμός (8). Ως προς τα χαρακτηριστικά τους, τα κύτταρα αυτά είναι ομοιόμορφα, ισομεγέθη, ασθενώς 6

βασεόφιλα και δεν έχουν έγκλειστα σκόνης ούτε κενοτόπια. Στα φυγοκεντρημένα δείγματα και στα επιχρίσματα, τα κυψελιδικά μακροφάγα ανέρχονται σε ποσοστό >80% (80-95%). Στην ίδια ομάδα ατόμων και στα εν λόγω δείγματα, τα λεμφοκύτταρα αποτελούν ποσοστό μικρότερο ή ίσο του 15% (εύρος 5-15%) και δεν είναι ενεργοποιημένα. Πλασματοκύτταρα δεν παρατηρούνται ποτέ, ενώ τα ουδετερόφιλα αποτελούν ποσοστό 3% και τα εωσινόφιλα και μαστοκύτταρα 0,5% (4). Μεταξύ των λεμφοκυττάρων, τα Β λεμφοκύτταρα βρίσκονται σε ποσοστό <4%, τα Τ λεμφοκύτταρα σε ποσοστό 63-83%, τα βοηθητικά λεμφοκύτταρα Τ (T helper, CD4 + ) αποτελούν το 40-70% των λεμφοκυττάρων, τα κατασταλτικά κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα Τ (T suppressor, CD8 + ) το 20-40% των λεμφοκυττάρων, η σχέση CD4 + /CD8 + βρίσκεται μεταξύ 1,1-3,5 (συνήθως 2,0 παρόμοια με την αντίστοιχη στο αίμα), τα ΝΚ κύτταρα αποτελούν το 2-14% των λεμφοκυττάρων, τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα (HLA-DR + ) αποτελούν ποσοστό <5% των λεμφοκυττάρων, τα Τ λεμφοκύτταρα που εμφανίζουν υποδοχείς ιντερλευκίνης 2 (CD25 + ) αποτελούν ποσοστό <5% των λεμφοκυττάρων. Τα κύτταρα Langerhans (CD1 + ) ανέρχονται σε ποσοστό μέχρι 3% των ολικών κυττάρων του δείγματος (4, 8). Σε καπνιστές χωρίς άλλο νόσημα του αναπνευστικού, ο ολικός αριθμός κυττάρων είναι υψηλότερος (έως και 5 φορές, 36-80X10 6 ). Το ποσοστό των κυψελιδικών μακροφάγων, τα οποία εξάλλου παρουσιάζουν και αξιοσημείωτες μορφολογικές μεταβολές με χαρακτηριστικά έγκλειστα αιθάλης και λιπιδίων, είναι αυξημένο, των λεμφοκυττάρων χαμηλότερο ενώ τα ουδετερόφιλα ανέρχονται στα ίδια ποσοστά με τους υγιείς μη καπνιστές, αν και ο απόλυτος αριθμός τους είναι αυξημένος. Σ αυτή την ομάδα ατόμων, οι υποπληθυσμοί των λεμφοκυττάρων έχουν ως εξής: Β λεμφοκύτταρα <4% των λεμφοκυττάρων, Τ λεμφοκύτταρα 63-83% των λεμφοκυττάρων, βοηθητικά λεμφοκύτταρα Τ (T helper, CD4 + ) 20-50% του ίδιου πληθυσμού αναφοράς, κατασταλτικά κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα Τ (T suppressor, CD8 + ) 30-70% των λεμφοκυττάρων, ΝΚ κύτταρα 1-11% των λεμφοκυττάρων, ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα (HLA-DR + ) <5% των λεμφοκυττάρων, Τ λεμφοκύτταρα που εμφανίζουν υποδοχείς ιντερλευκίνης 2 (CD25 + ) <6% των λεμφοκυττάρων. Η σχέση CD4 + /CD8 + είναι μειωμένη (0,5-1,5) ενώ στο αίμα παραμένει όπως στους μη καπνιστές (~ 2,0). Εδώ τα κύτταρα Langerhans (CD1 + ) ανέρχονται σε ποσοστό μέχρι 4% των ολικών κυττάρων. Κατά την αξιολόγηση ενός δείγματος τα επιθηλιακά κύτταρα πρέπει να ανέρχονται το πολύ σε 5 ανά 100 κύτταρα. Υψηλότερη παρουσία είναι ενδεικτική συμμετοχής του βρογχικού χώρου στο δείγμα και αυτό δυσχεραίνει την εκτίμηση των κυτταρικών στοιχείων του κυρίως ως προς τα ουδετερόφιλα. 7

1β. Η διαγνωστική αξία του BAL στις διάχυτες διηθητικές νοσήματα πνευμονοπάθειες Η σύγκριση ανάμεσα στα ευρήματα από το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και τα ιστολογικά ευρήματα δείχνει ότι τα ευρήματα από το BAL αντανακλούν σχετικά καλά τη φλεγμονώδη κυτταρική διήθηση των κυψελιδικών τοιχωμάτων και του διάμεσου ιστού και η σημασία του συμπεράσματος αυτού επιτείνεται από το γεγονός ότι το δείγμα της έκπλυσης αντιστοιχεί σε εκτενέστερη περιοχή του παρεγχύματος σε σχέση με αυτή που μπορεί να ληφθεί με τη βρογχική ή διαβρογχική βιοψία. Γεγονός παραμένει ότι τα ευρήματα από το BAL έχουν ρόλο βοηθητικό στη διαφορική διάγνωση των διάχυτων παρεγχυματικών (διαμέσων) νοσημάτων. Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα δε χαρακτηρίζεται από ειδικά των διάχυτων πνευμονοπαθειών ευρήματα παρά μόνο σπάνια, αλλά η παρουσία κυτταρικών τύπων σε αυξημένα ποσοστά είναι ενδεικτική ή σχετιζόμενη με αυξημένη πιθανότητα συγκεκριμένων διαγνώσεων. Έτσι, η λεμφοκυττάρωση στο BAL (παρουσία λεμφοκυττάρων σε ποσοστό άνω του συνηθισμένου) χαρακτηρίζει τη σαρκοείδωση, την εξωγενή αλλεργική κυψελιδίτιδα και τη φυματίωση. Από την άλλη, η ουδετεροφιλία στο BAL μπορεί να υποδηλώνει ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση. Γενικά πάντως, διακρίνουμε τέσσερις τύπους κυψελιδίτιδας ανάλογα με τον προεξάρχοντα τύπο φλεγμονωδών κυττάρων: τη λεμφοκυτταρική, την ουδετεροφιλική (με ή χωρίς αυξημένα εωσινόφιλα), την εωσινοφιλική και τη μικτή (3). Κάθε ένας από τους προαναφερθέντες τύπους κυψελιδίτιδας εμφανίζεται σε ή συνδέεται αιτιολογικά με συγκεκριμένες νόσους. Έτσι, η σαρκοείδωση, η εξωγενής αλλεργική κυψελιδίτιδα, η βηρυλλίωση, η BOOP (Bronchiolitis Obliterans Organizing Pneumonia), η πνευμονοπάθεια από φάρμακα, οι νόσοι του κολλαγόνου, η κυψελιδική πρωτεϊνωση αλλά και η φυματίωση, η ιογενής πνευμονία, η λοίμωξη από HIV (Human Immunodeficiency Virus), η λεμφαγγειακή καρκινωμάτωση, οι διάχυτες πνευμονοπάθειες από επαγγελματική έκθεση και άλλα νοσήματα χαρακτηρίζονται από λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα. Η ουδετεροφιλία αποτελεί εύρημα στην ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, τα νοσήματα του συνδετικού ιστού αλλά και στην πνευμονία, τις διάχυτες πνευμονοπάθειες από επαγγελματική έκθεση, το ARDS κα. Η εωσινοφιλία συναντάται στα εωσινοφιλικά πνευμονικά νοσήματα, την ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, τις πνευμονοπάθειες από έκθεση σε φάρμακα αλλά και την αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση και το άσθμα, δύο νοσήματα που δεν ανήκουν στις διάχυτες παρεγχυματικές πνευμονοπάθειες. Μικτή κυψελιδίτιδα παρατηρείται στη BOOP, τα νοσήματα του συνδετικού ιστού και τη μη ειδική διάμεση πνευμονία (NSIP, Nonspecific interstitial pneumonia). Στα νοσήματα που χαρακτηρίζονται από λεμφοκυτταρική κυψελιδίτιδα, σημαντικό διαγνωστικό ρόλο έχει ο καθορισμός των λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Έτσι, με βάση τη σχέση CD4 + /CD8 + τα εν λόγω νοσήματα 8

διακρίνονται σε αυτά που χαρακτηρίζονται από χαμηλή τέτοια σχέση, σε αυτά που χαρακτηρίζονται από υψηλή και σε αυτά με φυσιολογική σχέση. Στην πρώτη ομάδα νοσημάτων (χαμηλή σχέση) ανήκουν η εξωγενής αλλεργική κυψελιδίτιδα, η πυριτίαση (σιλίκωση), η κυψελιδίτιδα από έκθεση σε φάρμακα και η ΒΟΟΡ. Στη δεύτερη ομάδα (υψηλή σχέση) ανήκουν η σαρκοείδωση, η βηρυλλίωση, η αμιάντωση, οι νόσοι του κολλαγόνου καθώς και η πνευμονική εντόπιση της νόσου του Crohn. Στην ομάδα νοσημάτων με φυσιολογική σχέση CD4 + /CD8 + ανήκουν λοιμώδεις (φυματίωση) και κακοήθεις διηθήσεις (καρκινωμάτωση). Η αξία της ανάλυσης του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος στη διερεύνηση της παθογένειας, στην εκτίμηση της πρόγνωσης και της ανταπόκρισης στη θεραπεία δεν μπορεί να τεκμηριωθεί με τα μέχρι στιγμής δεδομένα για όλο το φάσμα των διάχυτων παρεγχυματικών νοσημάτων, αν και υπήρξαν συχνά σχετικές αναφορές και προτάσεις. 1γ. Ανοσοφαινότυποι των λεμφοκυττάρων Η ανοσολογία διακρίνει την ανοσία σε φυσική (μη ειδική) και ειδική (επίκτητη). Τα κύτταρα που διεκπεραιώνουν τη φυσική ανοσία είναι τα δενδριτικά κύτταρα, τα μακροφάγα και τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (ΝΚ, natural killer cells) τα οποία ανήκουν στα λεμφοκύτταρα. Τα κύτταρα που διεκπεραιώνουν την ειδική ανοσία είναι τα CD4 + (helpers, βοηθητικά) και τα CD8 + (cytotoxic / supprerors, κυτταροτοξικά) Τ λεμφοκύτταρα. Ο ρόλος της ειδικής ανοσίας είναι να εξειδικεύει, να κατευθύνει και να ρυθμίζει την ανοσολογική αντίδραση. Μια απλοποιημένη σχηματική αναπαράσταση της ανοσιακής απόκρισης θεωρεί ότι τα δενδριτικά κύτταρα παρουσιάζουν το αντιγόνο στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα της ειδικής ανοσίας. Τα Τ λεμφοκύτταρα της ειδικής ανοσίας ενεργοποιούνται σύμφωνα με το μοντέλο της συνδιέγερσης, κατά το οποίο απαιτούνται δύο διαφορετικοί τύποι σημάτων: η διέγερση (σύνδεση με το αντιγόνο) και η συνδιέγερση που εμπλέκει υποδοχείς της επιφάνειας των Τ λεμφοκυττάρων, αντιαποπτωτικά μόρια και την ιντερλευκίνη 2 και τελικά την ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων από τα ενεργοποιημένα κύτταρα παρουσίασης του αντιγόνου. Τα ΝΚ κύτταρα της φυσικής ανοσίας είναι κυτταροτοξικά όπως και τα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα της ειδικής ανοσίας και έχει αποδειχθεί ότι τα πρώτα ενεργοποιούν μέσω κυτταροκινών τα δεύτερα. Ο ανοσοφαινοτυπικός προσδιορισμός των λεμφοκυττάρων, δηλαδή η αναζήτηση και ανίχνευση των διαφόρων τύπων τους με βάση τη σύνδεση μονοκλωνικών αντισωμάτων σε ειδικά μόρια που τα κύτταρα αυτά εκφράζουν, εφαρμόζεται σε μεγάλη ποικιλία βιολογικών 9

υλικών: περιφερικό αίμα, διάφορα εξωαγγειακά υγρά, βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (9), ακόμη και εναιωρήματα κυττάρων που προέρχονται από αναρρόφηση με λεπτή βελόνη (FNA fine needle aspiration τεχνική). Οι πληροφορίες που λαμβάνονται από τον καθορισμό των ανοσοφαινοτύπων στο περιφερικό αίμα είναι πολύτιμες στη διερεύνηση των ανοσοανεπαρκειών και των κακοήθων αιματολογικών νοσημάτων. Όπως έχει φανεί από τα παραπάνω και θα αναλυθεί εκτενώς στη συνέχεια, ο ανοσοφαινοτυπικός προσδιορισμός είναι επίσης πολύ χρήσιμος στη μελέτη των κυτταρικών πληθυσμών που συναποτελούν το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και στη διερεύνηση της διαφορικής διάγνωσης των διάχυτων διηθητικών πνευμονοπαθειών. Όπως προαναφέρθηκε, οι ανοσοφαινότυποι των λεμφοκυττάρων διακρίνονται με τη βοήθεια μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι αντιγόνων επιφανείας των κυττάρων αυτών. Ο καθορισμός των ανοσοφαινοτύπων των λεμφοκυττάρων χαρακτηρίζει αυτά τα κύτταρα πληρέστερα και προσφέρει πολύτιμη βοήθεια στη διαφορική διάγνωση των διάχυτων παρεγχυματικών (διάμεσων) νοσημάτων. Οι τεχνικές ανίχνευσης των ανοσοφαινοτύπων των λεμφοκυττάρων μετά τη σύνδεση με τα αντίστοιχα μονοκλωνικά αντισώματα είναι ο έμμεσος ανοσοφθορισμός, οι ανοσοϊστοχημικές μέθοδοι και η κυτταρομετρία ροής. Τα ακόλουθα αντιγόνα επιφανειακά μόρια (CD, Clusters of differentiation ή Clusters of designation) ανιχνεύονται με την κυτταρομετρία ροής στους αντίστοιχους τύπους λεμφοκυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα: CD1 στα κύτταρα Langerhans, CD3 στα Τ - λεμφοκύτταρα, CD4 στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα, CD8 στα κατασταλτικά Τ λεμφοκύτταρα, CD19 και CD20 στα Β λεμφοκύτταρα, CD25 στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα της ιντερλευκίνης 2 (το αντιγόνο CD25 ταυτίζεται με τον υποδοχέα ιντερλευκίνης 2), CD57 στα ΝΚ Τ λεμφοκύτταρα, CD56 στα ΝΚ (natural killers) κύτταρα, HLA-DR στα ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα. Ακόμη, άλλα μονοκλωνικά αντισώματα χρησιμεύουν για την αναγνώριση και άλλων κυττάρων (μονοκυττάρων, μακροφάγων). Πρόσφατα, με τη μεθοδολογία αυτή έχουν ανιχνευθεί στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα πλασματοκυτταροειδή και μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα (pdc, mdc, dendritic cells αντίστοιχα) και έχει μελετηθεί η κατανομή τους στο υλικό αυτό σε ασθενείς με διάχυτα διηθητικά νοσήματα (10) : η σαρκοείδωση χαρακτηρίζεται από αυξημένα μυελοειδή δενδριτικά κύτταρα ενώ η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση από φυσιολογικά ποσοστά και των δύο υποτύπων δενδριτικών κυττάρων. Τα φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (ΝΚ) εκφράζουν στην επιφάνειά τους αρκετούς δείκτες με χαρακτηριστικότερους τους CD16 και CD56. Ανάλογα με την έκφραση αυτών των μορίων διακρίνονται δύο υποπληθυσμοί κυττάρων ΝΚ: α) τα κύτταρα ΝΚ με χαμηλή έκφραση 10

των CD56 και υψηλή των CD16, που χαρακτηρίζονται από έντονη κυτταροτοξική δράση και υπερτερούν στο περιφερικό αίμα και β) τα κύτταρα ΝΚ με υψηλή έκφραση των CD56 και χαμηλή ή ανύπαρκτη των CD16 που παράγουν κυτταροκίνες και υπερτερούν στα όργανα του λεμφικού ιστού (11). Τα ΝΚ CD56+ κύτταρα διακρίνονται σε δύο υποσύνολα ανάλογα με την πυκνότητα επιφανειακής έκφρασης του δείκτη CD56: NKCD56 + bright και NKCD56 + dim. Τα Τ φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα (ΝΚΤ, Natural Killer T-cells) έχουν χαρακτηριστικά τόσο των Τ λεμφοκυττάρων όσο και των ΝΚ κυττάρων και διακρίνονται σε δύο μεγάλα υποσύνολα: τα CD1d-dependent και τα CD1d-independent κύτταρα. Τα ΝΚΤ κύτταρα όταν ενεργοποιηθούν παράγουν κυτοκίνες τύπου τόσο Th1 όσο και Th2 και επιδεικνύουν τόσο αντιγονική ειδικότητα όσο και κυτταρολυτικές δράσεις παρόμοιες με των κυττάρων ΝΚ. Εκφράζουν υποδοχείς των Τ λεμφοκυττάρων όσο και δείκτες των ΝΚ κυττάρων (όπως το CD56). Ο ρόλος τους δεν είναι ακριβώς γνωστός, αλλά φαίνεται ότι συμμετέχουν τόσο στη φυσική ανοσία όσο και στις προσαρμοσμένες άνοσες αντιδράσεις. Η δράση τους έχει παρατηρηθεί σε πολλές νοσολογικές καταστάσεις όπως ο καρκίνος, η αυτο-ανοσία και οι λοιμώδεις νόσοι. 1δ. Κυτταρομετρία ροής Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί τις αρχές της σκέδασης και ενίσχυσης του φωτός, της διέγερσης μορίων διαφόρων φθοριοχρωμάτων και της επακόλουθης εκπομπής φωτονίων με αποτέλεσμα την παραγωγή πολυπαραμετρικών δεδομένων από σωματίδια ικανού μεγέθους. Έτσι, επιτυγχάνεται η ανίχνευση, μέτρηση, αναγνώριση, ταυτοποίηση και διαλογή κυττάρων αλλά και κυτταρικών οργανιδίων, θραυσμάτων κυττάρων ακόμη και σωματιδίων. Τα υπό εξέταση κύτταρα επωάζονται με τα κατάλληλα, σημασμένα με φθοριόχρωμα, μονοκλωνικά αντισώματα. Τα σημασμένα πλέον κύτταρα προσάγονται ένα-ένα και υπό μορφή νηματικής ροής στο σημείο ανίχνευσης όπου δέχονται την ακτινοβολία μιας φωτεινής πηγής (συνήθως laser). Έτσι, τα κύτταρα, λόγω της σύνδεσής τους με τα φθορίζοντα μονοκλωνικά αντισώματα, εκπέμπουν φωτεινά σήματα λόγω σκέδασης της ακτινοβολίας και λόγω φθορισμού. Τα φωτεινά σήματα που παράγονται από τη σκέδαση της ακτινοβολίας εξαρτώνται από το μέγεθος και την κοκκίωση του κυττάρου, ενώ τα φωτεινά σήματα που οφείλονται στο φθορισμό εξαρτώνται από τα αντιγονικά χαρακτηριστικά του. Μετά την ανίχνευσή τους από οπτικούς ανιχνευτές, τα φωτεινά αυτά σήματα υφίστανται επεξεργασία (διαχωρισμός μηκών κύματος με οπτικά φίλτρα, μετατροπή σε ηλεκτρικά σήματα, ενίσχυση, μέτρηση, ψηφιοποίηση, στατιστική επεξεργασία, γραφική απεικόνιση). Επιπλέον, τα ίδια τα σημασμένα κύτταρα μπορούν να συλλεχθούν και να διαχωριστούν περαιτέρω μετά από εγκλωβισμό τους σε 11

σταγονίδια, ηλεκτρική φόρτιση και διέλευση μέσω ηλεκτροστατικού πεδίου όπου εκτρέπονται από την πορεία τους ανάλογα με το ηλεκτρικό τους φορτίο και να οδηγηθούν σε χωριστούς χώρους διατήρησης. Οι εφαρμογές της μεθόδου περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό των κυτταρικών πληθυσμών και υποπληθυσμών σε διάφορα βιολογικά υλικά, τον ποσοτικό προσδιορισμό (μέτρηση) των αντισωμάτων και άρα των CD επιφανειακών μορίων ανά κύτταρο από τη μέτρηση της έντασης του παραγόμενου φθορισμού και με πολλές προεκτάσεις στη μελέτη της κυτταρικής ανάπτυξης και λειτουργίας καθώς και στη μελέτη κυτταρικών προϊόντων, τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης διαλυτών μορίων, την απομόνωση ομοιογενών κυτταρικών πληθυσμών σε διαλύματα υψηλής καθαρότητας, την παρακολούθηση κυτταρικών μεταβολών σε κυτταρικές σειρές, τη διάγνωση και παρακολούθηση νοσημάτων καθώς και άλλες κλινικές εφαρμογές. Ο απαραίτητος εξοπλισμός για τη μέθοδο αυτή είναι ο κυτταρομετρητής ροής. Αυτός αποτελείται από μια πηγή ακτινοβολίας, ένα σύστημα ροής, ένα σύστημα συλλογής και διαχωρισμού των φωτεινών σημάτων, ένα σύστημα ανίχνευσης, επεξεργασίας και ψηφιακής μετατροπής των σημάτων, ένα σύστημα παρουσίασης και ανάλυσης των αποτελεσμάτων των μετρήσεων και ένα σύστημα διαλογής των κυττάρων. Η πηγή ακτινοβολίας είναι συνήθως μία λυχνία laser (ατομική, ιοντική, μοριακή και, ιδανικά, στερεάς κατάστασης). Το σύστημα ροής είναι έτσι κατασκευασμένο ώστε τα κύτταρα να ρέουν διαδοχικά το ένα μετά το άλλο, με μεγάλη ταχύτητα δια ειδικού υγρού (sheath fluid). Ο διαχωρισμός των φωτεινών σημάτων, και άρα των κυττάρων που τα φέρουν, βασίζεται στις ιδιότητες της σκέδασης (πρόσθια σκέδαση, που εξαρτάται από το μέγεθος του κυττάρου και κάθετη ή πλάγια σκέδαση, που εξαρτάται από την κοκκίωση του) και του φθορισμού (που εξαρτάται από τα αντιγονικά χαρακτηριστικά των κυττάρων). Πιο συγκεκριμένα, ο φθορισμός μπορεί να είναι διπλός, όταν χρησιμοποιούνται δύο μονοκλωνικά αντισώματα. Συνήθως, το ένα σημαίνεται με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) που εκπέμπει πράσινο φθορισμό και το άλλο με φυκοερυθρίνη (PE) που εκπέμπει ερυθρό φθορισμό. Συνεπώς, το συγκεκριμένο χρώμα του φθορισμού δηλώνει ότι το κύτταρο εκφράζει το αντίστοιχο αντιγόνο. Ο φθορισμός μπορεί να είναι τριπλός, οπότε προστίθεται και τρίτο φθοριόχρωμα (peridinin chlorophyll protein, Per CP). Χρησιμοποιώντας την κατάλληλη τεχνολογία, υπάρχει η δυνατότητα για εφαρμογή και τετραπλού φθορισμού (τα τρία πιο πάνω φθοριοχρώματα μαζί με αλλοφυκοκυανίνη, σε άλλη όμως λυχνία), ο οποίος επιτρέπει την ανίχνευση και τέταρτου αντιγονικού χαρακτηριστικού. Από το συνδυασμό των πληροφοριών που δίνουν τα σήματα της πρόσθιας και κάθετης σκέδασης και τα σήματα του φθορισμού παίρνουμε πληροφορίες για το μέγεθος των κυττάρων, την κοκκίωσή τους και τα αντιγονικά 12

χαρακτηριστικά τους και από το συνδυασμό τους μπορούμε να διακρίνουμε τους κυτταρικούς τύπους και υποπληθυσμούς σε ένα δείγμα. Βέβαια, για τα τελικά συμπεράσματα, τα σήματα εισάγονται στο σύστημα ανίχνευσης επεξεργασίας και ψηφιακής μετατροπής, όπου πολλαπλασιάζονται, μετατρέπονται σε ηλεκτρικά σήματα και τελικά παλμικά σήματα τάσης και τελικά ψηφιοποιούνται. Τα ψηφιοποιημένα σήματα αναλύονται από ηλεκτρονικό υπολογιστή, υφίστανται στατιστική επεξεργασία και τελικά παρουσιάζονται με τη μορφή διαγραμμάτων, συνήθως σημειακών (scatter diagrams). Στα διαγράμματα αυτά ολόκληρες περιοχές μπορούν να οριοθετηθούν (gate) και να αναλυθούν περαιτέρω. Τέλος, όπως προαναφέρθηκε, υπάρχει η δυνατότητα τα ίδια τα σημασμένα κύτταρα να οδηγηθούν σε διαφορετικές θέσεις συλλογής (διαλογή κυττάρων, sorting) και έτσι να ληφθούν εναιωρήματα υψηλής καθαρότητας για περαιτέρω μελέτη ή και για χρησιμοποίηση των κυττάρων σε άλλες κλινικές εφαρμογές. Τέλος, άλλες εφαρμογές χρήσεις της κυτταρομετρίας ροής περιλαμβάνουν τον προσδιορισμό κυτταροκινών, την ανίχνευση κλώνων των CD4 + και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων, την ανίχνευση ενεργοποιημένων υποπληθυσμών των Τ - λεμφοκυττάρων, την ανίχνευση κυττάρων σε φάση πολλαπλασιασμού, την παρακολούθηση της ανοσολογικής απόκρισης σε εμβολιασμούς, κα. 1ε. Διάχυτες παρεγχυματικές πνευμονοπάθειες: κλινικο-εργαστηριακά και ανοσοφαινοτυπικά χαρακτηριστικά Μερικές βασικές γνώσεις για το ρόλο και την αξία της ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα στις διάχυτες διηθητικές πνευμονοπάθειες έχουν ήδη αναφερθεί. Ακολουθεί λεπτομερέστερη παράθεση πληροφοριών για τα κλινικο-εργαστηριακά χαρακτηριστικά ορισμένων από τα νοσήματα αυτά. Σαρκοείδωση Η σαρκοείδωση είναι μια κοκκιωματώδης νόσος αγνώστου αιτιολογίας που μπορεί να προσβάλλει πολλά όργανα. Στην παθογένεια της εμπλέκονται διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί (12). Το χαρακτηριστικό πάντως γεγονός είναι η διήθηση από ενεργοποιημένα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (T helper, CD4 + ), τα οποία παράγουν ιντερλευκίνη 2 και ιντερφερόνη γ και επομένως ανήκουν στα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα τύπου 1 (Th1). Επίσης, τα κυψελιδικά μακροφάγα παρουσιάζουν το άγνωστο αντιγόνο και εκκρίνουν ιντερλευκίνη 1 ενεργοποιώντας έτσι τα βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα (T helper, CD4 + ). Mε τη δράση της ιντερλευκίνης 2, αυξάνει ο αριθμός των Τ λεμφοκυττάρων και τα λεμφοκύτταρα CD4 + 13

συσσωρεύονται στις θέσεις όπου αναπτύσσεται η φλεγμονή. Επιπλέον, το σύστημα Fas / Fas ligand φαίνεται πως έχει ρυθμιστικό ρόλο στη φλεγμονώδη αυτή διεργασία και καταστέλλει τα κυτταροτοξικά Τ - λεμφοκύτταρα. Σε γενικές γραμμές, πιστεύεται ότι η δράση της ιντερφερόνης γ και της ιντερλευκίνης 1 και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ μακροφάγων και Τ λεμφοκυττάρων οδηγούν στο σχηματισμό γιγαντοκυττάρων και τελικά κοκκιωμάτων. Ο προτεινόμενος μηχανισμός περιλαμβάνει ένα μακρύ κατάλογο κυτταροκινών, παραγόντων διέγερσης αποικιών, χημειοκινών, παραγόντων ενεργοποίησης, υποδοχέων και συνδετών και ένα πολύπλοκο δίκτυο σχέσεων μεταξύ αυτών. Η στρατολόγηση ινοβλαστών και επιθηλιακών κυττάρων, η παραγωγή μακρομορίων της θεμέλιας ουσίας και οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ινοβλαστών και θεμέλιας ουσίας οδηγούν, σε μικρό ποσοστό περιπτώσεων, στην ανάπτυξη ινώδους ιστού, χωρίς ωστόσο να έχει διακριβωθεί ο ακριβής μηχανισμός αυτής της διεργασίας. Το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα επί σαρκοείδωσης εμφανίζει φυσιολογικό ή ελαφρώς αυξημένο ολικό αριθμό κυττάρων και αύξηση του αριθμού των λεμφοκυττάρων (λεμφοκυττάρωση) στο 90% των ασθενών κατά το χρόνο της διάγνωσης, τα ευρήματα όμως αυτά δεν είναι ειδικά (4, 13). Το ποσοστό των λεμφοκυττάρων ανέρχεται στο 30-60% (ή >28%) (φυσιολογική τιμή 15%) όταν η νόσος είναι ενεργός και μειώνεται σε ανενεργό νόσο (όταν δε σχηματίζονται πια κοκκιώματα). Τα Τ λεμφοκύτταρα ανέρχονται στο 86-94% των λεμφοκυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Τα ποσοστά των εωσινοφίλων και των ουδετεροφίλων βρίσκονται εντός των φυσιολογικών ορίων ενώ απουσιάζουν τα πλασματοκύτταρα και τα αφρώδη κυψελιδικά μακροφάγα (14). Φυσιολογική κυτταρική σύσταση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος επί παρουσίας σαρκοείδωσης είναι σπάνιο εύρημα. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι υποπληθυσμοί των λεμφοκυττάρων στη διάγνωση της σαρκοείδωσης (13). Τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα αυξάνουν (15-60%) και τα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα μειώνονται, ενώ η σχέση μεταξύ των δύο αυτών λεμφοκυτταρικών πληθυσμών (CD4 + /CD8 + ratio) βρίσκεται πάνω από το ανώτερο φυσιολογικό επίπεδο (3,5) στο 60% των ασθενών κατά τη χρονική στιγμή της διάγνωσης. Εξάλλου, η ειδικότητα του εν λόγω πηλίκου για τη διάγνωση της νόσου αυξάνει όσο αυξάνει η τιμή του. Τιμή του πηλίκου CD4 + /CD8 + >3,5 θεωρείται εύρημα υψηλής ειδικότητας για τη σαρκοείδωση (ειδικότητα 90-96%) ενώ η ευαισθησία του είναι μικρή (52-59%). Αν το πηλίκο είναι μεγαλύτερο του 5,0 παρουσία συμβατών κλινικών και ακτινολογικών ευρημάτων η διάγνωση της σαρκοείδωσης μπορεί να τεθεί με βεβαιότητα από το συνδυασμό των ευρημάτων, χωρίς να αναζητηθεί ιστολογική επιβεβαίωση. Από τα ανωτέρω, διαπιστώνει κανείς εύκολα τη μεγάλη αξία της 14

ανοσοφαινοτυπικής ανάλυσης στη διάγνωση αυτού του νοσήματος. Ακόμη, η διαγνωστική ισχύς της διαβρογχικής βιοψίας είναι υψηλή (μέχρι και 80%, αν ληφθούν 4-5 δείγματα). Τα NK κύτταρα (CD57 + ) βρίσκονται στα φυσιολογικά επίπεδα. Η ανίχνευση, με μονοκλωνικά αντισώματα, μακροφάγων με διπλό αντιγόνο επιφανείας RFD 1 /RFD 7 (φαινότυπος RFD 1+ /RFD 7+ ) σε ποσοστό >25% θεωρείται ενδεικτική σαρκοείδωσης. Επίσης, πρόσφατα, ένα υποσύνολο των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων του εκπλύματος, τα CD4+/CD28- συνδέθηκαν με βαρύτερη νόσο και ανάγκη για θεραπεία. Στην πορεία της νόσου, είτε έχει χορηγηθεί θεραπεία είτε όχι, η σχέση CD4 + /CD8 + γίνεται φυσιολογική και στην ανενεργό νόσο (όταν δηλαδή δε σχηματίζονται πια κοκκιώματα) υπάρχει μόνο μέτρια λεμφοκυττάρωση. Το στάδιο της ίνωσης στη σαρκοείδωση χαρακτηρίζεται από ουδετεροφιλία στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, όπως άλλωστε συμβαίνει σε όλες τις περιπτώσεις ινωτικής εξεργασίας ανεξάρτητα από την αιτιολογία. Πάντως, οι ανοσοφαινότυποι των λεμφοκυττάρων στο BAL δε φαίνεται να είναι χρήσιμοι δείκτες ενεργότητας της νόσου (13). Επίσης, η προγνωστική αξία της σχέσης CD4 + /CD8 + στη σαρκοείδωση τυγχάνει δυσχερούς τεκμηρίωσης λόγω των αντικρουόμενων αποτελεσμάτων των σχετικών μελετών (15). Κατά τη διαφορική διάγνωση της σαρκοείδωσης λαμβάνονται υπόψη και εξετάζονται σε συνδυασμό διάφορες παράμετροι του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση Η νόσος αυτή έχει άγνωστη αιτιολογία και κακή πρόγνωση. Η παθογένεια της νόσου είναι πολύπλοκη και φαίνεται να συμμετέχουν διάφορα κύτταρα, ενώ ο κύριος ρόλος αποδίδεται στα ουδετερόφιλα. Αυτά καταστρέφουν το πνευμονικό παρέγχυμα, εκλύοντας ένζυμα όπως η κολλαγενάση. Το παθολογοανατομικό ισοδύναμο της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης είναι η συνήθης διάμεση πνευμονία (UIP, Usual Interstitial Pneumonia). Το ιστοπαθολογικό αυτό πρότυπο χαρακτηρίζεται από εναλλασσόμενες περιοχές φυσιολογικού πνεύμονα, φλεγμονής του διαμέσου ιστού και ίνωσης κυρίως στην περιφέρεια του πνεύμονα και στις υποϋπεζωκοτικές περιοχές, με τα κυψελιδικά διαφράγματα να εμφανίζονται διηθημένα από λεμφοκύτταρα και πλασματοκύτταρα ενώ παρατηρείται και υπερπλασία των πνευμονικών κυττάρων τύπου 2. Χαρακτηριστικό μορφολογικό γνώρισμα είναι οι διάσπαρτες εστίες πολλαπλασιαζόμενων ινοβλαστών (foci, «ινοβλαστικές εστίες»). Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα, ο ολικός αριθμός κυττάρων βρίσκεται αυξημένος ενώ τα ουδετερόφιλα κυριαρχούν (35%) και τα κυψελιδικά μακροφάγα μειώνονται. Επιπλέον, ποσοστό ουδετεροφίλων >5% διαπιστώνεται στο 70-90% των ασθενών και σε υψηλό 15

ποσοστό ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση (περίπου στα 2/3 αυτών, κατ άλλους 40-60%) συνυπάρχει αύξηση και των εωσινοφίλων και ίσως των μαστοκυττάρων. Σε 10-20% των ασθενών σημειώνεται επίσης αύξηση των λεμφοκυττάρων, αλλά η μεμονωμένη αύξησή τους είναι σπάνια (10%) και αποτελεί ισχυρό λόγο αναζήτησης εναλλακτικής διάγνωσης. Οι αριθμοί ουδετεροφίλων και εωσινοφίλων σχετίζονται με την ενεργότητα της νόσου, ενώ η εωσινοφιλία και η παρουσία μαστοκυττάρων είναι δείκτης κακής πρόγνωσης (6). Πάντως, ο ρόλος του BAL στη διάγνωση της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης φαίνεται να είναι περιορισμένος: εδώ, το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα έχει κυρίως ερευνητικό ενδιαφέρον και χρησιμεύει στον αποκλεισμό άλλων νοσημάτων (16). BOOP (Bronchiolitis obliterans organizing pneumonia) Η νόσος αυτή χαρακτηρίζεται από την παρουσία κοκκιώδους ιστού στο τοίχωμα των αναπνευστικών βρογχιολίων και των κυψελίδων καθώς και μέσα στις κυψελίδες, ενώ παθογενετικά πρόκειται για φλεγμονώδη αντίδραση με έντονη αγγειογενετική δραστηριότητα. Αιτιολογικά η νόσος είναι δυνατό να σχετίζεται με τα νοσήματα του συνδετικού ιστού, τις λοιμώξεις του αναπνευστικού, τη λήψη φαρμάκων, την ακτινοθεραπεία, τη μεταμόσχευση οργάνων, τα κακοήθη νοσήματα, ποικίλης φύσεως παθολογικές καταστάσεις στο πνευμονικό παρέγχυμα ενώ σε υψηλό ποσοστό (70-90%) χαρακτηρίζεται ιδιοπαθής. Στο λειτουργικό έλεγχο της αναπνοής διαπιστώνεται διαταραχή περιοριστικού ή μικτού τύπου (λόγω συνύπαρξης απόφραξης των αεραγωγών στους καπνιστές), ελάττωση της διαχυτικής ικανότητας του πνεύμονα, υποξυγοναιμία και αύξηση της κυψελιδοαρτηριακής διαφοράς μερικής πίεσης οξυγόνου. Στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα τα λεμφοκύτταρα βρίσκονται αυξημένα (>25%). Αυξημένες μπορεί να είναι και οι αναλογίες των ουδετερόφιλων (5-15%) και των εωσινόφιλων (2-20%), δεν υπερβαίνουν όμως το 25%. Παρατηρούνται επίσης αφρώδη μακροφάγα και πλασματοκύτταρα. Αλλεργική εξωγενής κυψελιδίτιδα (ή πνευμονίτιδα από υπερευαισθησία) Η αιτιολογία αυτής της, επίσης κοκκιωματώδους, νόσου είναι η επανειλημμένη έκθεση και ειδική ευαισθητοποίηση σε εισπνεόμενες οργανικές κόνεις (συνήθως πρωτεΐνες διαφόρων οργανισμών) καθώς και χαμηλού μοριακού βάρους χημικά αντιγόνα. Στην παθογένεια της νόσου πρωταγωνιστούν σταθερά συμπλέγματα που ενεργοποιούν τα μακροφάγα, κινητοποιούν τα ουδετερόφιλα, απελευθερώνουν παράγοντες φλεγμονής, πρωτεολυτικά ένζυμα, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, κυτταροκίνες και αυξητικούς παράγοντες και οδηγεί σε φλεγμονή και ιστική βλάβη (17, 18). Παθολογοανατομικά, 16

τυπικό άλλά όχι χαρακτηριστικό εύρημα της νόσου είναι η παρουσία μη νεκρωτικών κοκκιωμάτων και η προσβολή των βρογχιολίων από κυτταρικά διηθήματα. Ο ρόλος της ιντερφερόνης γ είναι καθοριστικός για την ανάπτυξη της νόσου ενώ η ιντερλευκίνη 10 φαίνεται να ρυθμίζει τη βαρύτητα της νόσου. Η ΤΚΕ και η CRP καθώς και άλλοι ανοσολογικοί δείκτες μπορεί να είναι αυξημένοι, αλλά είναι σαφές ότι δεν έχουν διαγνωστική αξία λόγω της μικρής ειδικότητάς τους. Τα ευρήματα του BAL μεταβάλλονται στις διάφορες φάσεις εξέλιξης της νόσου (οξεία, υποξεία, χρόνια) και μερικοί από τους κυτταρικούς τύπους που συνθέτουν το σχετικό προφίλ παρουσιάζουν τόσο μορφολογικά όσο και λειτουργικά ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Αυτή η ετερογένεια στην εικόνα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος δυσχεραίνει την αξιολόγησή του στη διαγνωστική προσπέλαση αυτής της νόσου. Έτσι, στην οξεία φάση ο ολικός αριθμός κυττάρων είναι πενταπλάσιος του φυσιολογικού και τα ουδετερόφιλα παρουσιάζουν αύξηση (>5%). Μετά την παρέλευση της οξείας φάσης, η αύξηση των λεμφοκυττάρων κυριαρχεί στην εικόνα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος. Η νόσος αυτή εμφανίζει την υψηλότερη λεμφοκυττάρωση από όλες τις διάχυτες παρεγχυματικές (διάμεσες) πνευμονοπάθειες (συνήθως >20%, συχνά έως 70%) και πολύ συχνά τα λεμφοκύτταρα αυτά είναι ενεργοποιημένα. Τα κυψελιδικά μακροφάγα έχουν κι αυτά μορφολογικές και λειτουργικές ιδιαιτερότητες καθώς είναι αφρώδη, εκφυλισμένα και, επίσης, με δείκτες ενεργοποίησης. Σ ό,τι αφορά τους υποπληθυσμούς των λεμφοκυττάρων, κυριαρχούν τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (T suppressor, CD8 + ) (παρουσία >50%), τα ΝΚ κύτταρα (Natural killer cells) CD56 + και CD57 + είναι χαρακτηριστικά αυξημένα ενώ τα CD16 + NK δεν αυξάνουν. Ακόμη, τα ΝΚΤ (CD56 + ) ανήκουν κυρίως στα CD8 + και σπανιότερα στα CD4 + (19). Σε αντίθεση με τη σαρκοείδωση, στην οποία η λεμφοκυττάρωση είναι επίσης χαρακτηριστική, στην εξωγενή αλλεργική κυψελιδίτιδα η σχέση CD4 + /CD8 + είναι χαμηλή (συχνά 1, συνήθως 1,3). Παρατηρείται, ωστόσο, σχετικά μεγάλο εύρος στο μέγεθος αυτό και η διακύμανση του έχει συσχετιστεί με το είδος του αντιγόνου και με τη φάση της νόσου (20, 21, 22). Στην οξεία και υποξεία φάση ο λόγος CD4 + /CD8 + είναι συχνά μεγαλύτερος της μονάδας. Από την άλλη, έχουν βρεθεί υψηλά CD8 + στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών που δεν εκδήλωσαν νόσο αλλά ανέφεραν συνεχή έκθεση σε σχετικά αντιγόνα. Ο συνδυασμός CD3 + /CD8 + /CD56 + /CD57 + /CD16 - δείχνει μεγάλη ειδικότητα για τη νόσο. Στην υποξεία φάση της νόσου, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα παρατηρούνται μαστοκύτταρα (>1%), πλασματοκύτταρα και εωσινόφιλα (>5%) (19). Με την άρση της έκθεσης στον αιτιολογικό παράγοντα, τα λεμφοκύτταρα ελαττώνονται και η σχέση CD4 + /CD8 + αυξάνει. Επίσης, θεωρείται ότι η μεγάλη αύξηση του αριθμού των 17

CD8 + Τ λεμφοκυττάρων συνδέεται με μεγαλύτερη πιθανότητα εξέλιξης προς πνευμονική ίνωση. Από το λειτουργικό έλεγχο της αναπνοής, συνήθως διαπιστώνεται διαταραχή περιοριστικού τύπου που συνίσταται κυρίως σε ελάττωση της ζωτικής χωρητικότητας και λιγότερο της ολικής πνευμονικής χωρητικότητας, ενώ ο λειτουργικός υπολειπόμενος όγκος διατηρείται. Η διαχυτική ικανότητα του πνεύμονα εμφανίζεται ελαττωμένη και η κυψελιδοαρτηριακή διαφορά μερικής πίεσης οξυγόνου είναι αυξημένη. Λόγω της συμμετοχής των μικρών αεραγωγών στην παθοφυσιολογία της νόσου, είναι δυνατό να παρατηρηθεί αρχικά διαταραχή αποφρακτικού τύπου και στη συνέχεια να εγκατασταθεί το περιοριστικό σύνδρομο που περιγράφηκε πιο πάνω. Η διάγνωση της νόσου τίθεται μετά από την εφαρμογή κριτηρίων (μειζόνων: ανίχνευση ειδικής IgG ανοσοσφαιρίνης, συμβατά συμπτώματα, συμβατή εικόνα στην αξονική τομογραφία υψηλής ευκρίνειας και ελασσόνων: τρίζοντες στην ακρόαση των πνευμόνων, πτώση της DLCO, υποξυγοναιμία στην άσκηση, συμβατή ιστολογική εικόνα, θετική δοκιμασία πρόκλησης, λεμφοκυττάρωση στο BAL). Θεωρείται ότι πρέπει να πληρούνται όλα τα μείζονα και τουλάχιστο δύο από τα ελάσσονα κριτήρια για να τεθεί η διάγνωση της νόσου (23). Εωσινοφιλικές πνευμονοπάθειες (εωσινοφιλικά πνευμονικά νοσήματα) Το γενικό ιστοπαθολογικό χαρακτηριστικό γνώρισμα των νοσημάτων αυτών είναι η αύξηση των εωσινοφίλων στο διάμεσο ιστό και τις κυψελίδες που συνοδεύεται ή όχι από εωσινοφιλία στο περιφερικό αίμα. Από την άλλη, το γενικό κλινικό χαρακτηριστικό τους γνώρισμα είναι η «θορυβώδης» συμπτωματολογία τους και η γρήγορη ανταπόκρισή τους στη θεραπεία με κορτικοστεροειδή όταν αυτή απαιτείται. Παρά τον καθοριστικό ρόλο της παρουσίας των εωσινοφίλων στα ανωτέρω νοσήματα, η εωσινοφιλική κυψελιδίτιδα χαρακτηρίζει μερικά μόνο από αυτά και τελικά ο όρος αναφέρεται στο σύνδρομο Löffler, τη χρόνια εωσινοφιλική πνευμονία και το σύνδρομο Churg-Strauss, στα οποία το ποσοστό των εωσινοφίλων ξεπερνά το 30% των κυττάρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (εύρος μεταξύ 20-90%). Πιο συγκεκριμένα, στη χρόνια εωσινοφιλική πνευμονία το μέσο ποσοστό εωσινοφίλων στο BAL είναι 44% και, χαρακτηριστικά, η εωσινοφιλία στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα συνοδεύεται από εωσινοφιλία στο περιφερικό αίμα και τα πτύελα (20). Στην οξεία εωσινοφιλική πνευμονία, το ποσοστό εωσινοφίλων στο BAL ανέρχεται σε >25%, ενώ τα εωσινόφιλα του περιφερικού αίματος δεν είναι αυξημένα (24). 2. ΣΚΟΠΟΣ 18

Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση και ανάδειξη πιθανών σημαντικών σχέσεων ανάμεσα στα ευρήματα από την ανοσοφαινοτυπική ανάλυση των κυττάρων του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος και τα λοιπά κλινικο-εργαστηριακά ευρήματα σε ασθενείς με διάχυτες διηθητικές πνευμονοπάθειες, καθώς και της συσχέτισης των πρώτων με την τελική διάγνωση. Πιο συγκεκριμένα, αναζητήθηκαν πληροφορίες από τη συσχέτιση των ανοσοφαινοτύπων με τη διαχυτική ικανότητα του πνεύμονα και την κυψελιδοαρτηριακή διαφορά οξυγόνου σε κάθε νόσημα και στα διάφορα στάδια σαρκοείδωσης με σκοπό να διερευνηθεί αν η επικράτηση ή παρουσία κάποιου ανοσοφαινοτύπου έχει επίδραση στην / ή σχέση με την αναπνευστική λειτουργία. Έγινε προσπάθεια να μελετηθεί η διακύμανση των ανοσοφαινοτύπων στα στάδια της σαρκοείδωσης. Επίσης, συσχετίστηκαν σε κάθε νόσημα οι ανοσοφαινότυποι των λεμφοκυττάρων μεταξύ τους για να διερευνηθεί αν η σχέση τους έχει σημασία στην παθοφυσιολογία των νόσων αυτών. Τέλος, τα ευρήματα της παρούσας εργασίας συγκρίθηκαν με αυτά που προκύπτουν από τη σχετική βιβλιογραφία. 19

3. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εξετάστηκαν αναδρομικά οι φάκελοι 250 ασθενών που υποβλήθηκαν σε βρογχοκυψελιδική έκπλυση και ανοσοφαινοτυπική ανάλυση στο πλαίσιο διερεύνησης τους για διάχυτη διηθητική πνευμονοπάθεια στην Α Πνευμονολογική Κλινική του Νοσοκομείου «Γ. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ» κατά τη διάρκεια έξι (6) ετών (περίοδος 2003-2008). Οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε μέτρηση στατικών όγκων και διαχυτικής ικανότητας του πνεύμονα και καταγράφηκαν οι % των προβλεπόμενων τιμές για τις εξής παραμέτρους της αναπνευστικής λειτουργίας: TLC, FRC, RV (Residual Volume, Υπολειπόμενος Όγκος) και DLCO. Στους φακέλους των ασθενών αναζητήθηκε επίσης η τιμή της κυψελιδοαρτηριακής διαφοράς, της ΤΚΕ (Ταχύτητα Καθίζησης Ερυθρών Αιμοσφαιρίων), της CRP (C reacting protein) και του μετατρεπτικού ενζύμου αγγειοτενσίνης (ACE, Angiotensin Converting Enzyme) του ορού. Η CRP εκφράζεται σε mg/dl (φυσιολογικές τιμές: <0,5 mg/dl). Το ACE εκφράζεται σε U/L και το εύρος των φυσιολογικών τιμών είναι 8-52 U/L. Οι βρογχοσκοπήσεις και οι βρογχοκυψελιδικές εκπλύσεις διενεργήθηκαν στη Μονάδα Βρογχοσκοπήσεων, στο Νοσοκομείο «Γ. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ» και η ποσότητα του φυσιολογικού ορού που ενσταλάχθηκε ήταν 200ml (4 ποσότητες των 50ml). Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος έγινε στο Ανοσολογικό Εργαστήριο της Πανεπιστημιακής Πνευμονολογικής Κλινικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (ΑΠΘ). Οι υποπληθυσμοί των λεμφοκυττάρων που προσδιορίστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία ήταν Τ κύτταρα (CD3 + ), Β κύτταρα (CD3 - /CD19 + ), NK κύτταρα (CD3 - /CD16,56 + ), T βοηθητικά κύτταρα (CD3 + /CD4 + ), Τ κατασταλτικά κύτταρα (CD3 + /CD8 + ) και NKT, MHCunrestrict κύτταρα (CD3 + /CD16,56 + ). Πληρότητα δεδομένων που επέτρεπε την ανάλυση τους για τους σκοπούς της εργασίας διαπιστώθηκε σε 129 φακέλους (51,6%). Στο σύνολο αυτών των ασθενών, περιλαμβάνονται 114 με διάχυτη διηθητική (διάμεση) πνευμονοπάθεια (88,37%), 8 ασθενείς με κακοήθεια (6,2%) και 7 ασθενείς με λοίμωξη (5,4%), ενώ στους υπόλοιπους 15 δεν κατέστη δυνατό να τεθεί τελική διάγνωση από το γενόμενο έλεγχο, κυρίως επειδή επρόκειτο για περιπτώσεις ασθενών με ίνωση τελικού σταδίου ή πνευμονοπάθειες με προεξάρχουσα κλινικοεργαστηριακή εικόνα ίνωσης και αδύνατη ή ανεπιτυχή τη διερεύνηση της αρχικής νοσολογικής οντότητας. Η καταγραφή και η διαχείριση των δεδομένων έγινε σε αρχείο έργου βάσης δεδομένων με το πρόγραμμα ACCESS MS 2003. Για τη στατιστική επεξεργασία του υλικού χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα SPSS Statistics 17.0. Για τις συγκρίσεις ποσοτικών μεταβλητών μεταξύ ομάδων χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία t (για μεταβλητές κανονικής κατανομής) ή η δοκιμασία Mann- 20

Whitney (για μεταβλητές μη κανονικής κατανομής) για δύο ομάδες και η δοκιμασία ANOVA (για μεταβλητές κανονικής κατανομής) ή η δοκιμασία Kruskal-Wallis (για μεταβλητές μη κανονικής κατανομής) όταν έπρεπε να συγκριθούν περισσότερες ομάδες των δύο ομάδων μεταξύ τους. Για τις post hoc συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Tukey HSD. Για την ανίχνευση και διερεύνηση συσχετίσεων χρησιμοποιήθηκε ο υπολογισμός του συντελεστή Pearson (για μεταβλητές κανονικής κατανομής) και του συντελεστή Spearman (για μεταβλητές μη κανονικής κατανομής). Οι ποιοτικές μεταβλητές συγκρίθηκαν με τη μη παραμετρική δοκιμασία χ 2. Οι εκτιμητές θέσης των τιμών των εκάστοτε παραμέτρων εκφράζονται κατά τα πρότυπα «μέση τιμή +/- τυπική απόκλιση» προκειμένου για μεταβλητές κανονικής κατανομής και «διάμεση τιμή, όρια» για μεταβλητές μη κανονικής κατανομής. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε σε <0,05. Καταγράφηκαν και μελετήθηκαν τα ευρήματα 91 ασθενών για τους οποίους η διάγνωση συγκεκριμένης διάχυτης διηθητικής πνευμονοπάθειας τέθηκε είτε με ιστολογική εξέταση, είτε με παθογνωμονικά ευρήματα από το λοιπό εργαστηριακό έλεγχο είτε λαμβάνοντας υπόψιν ισχύοντα κριτήρια διάγνωσης. Οι ασθενείς αυτοί είχαν μέση (mean) ηλικία 59,47+/-13,87 έτη και διάμεση (median) ηλικία 64 έτη (όρια: 24-81). 40,7% των ασθενών ήταν άνδρες και 59,3% γυναίκες. Η μέση (59 έτη) και διάμεση (64 έτη) ηλικία δε διέφερε στα δύο φύλα. Ακόμη, 33% των ασθενών ήταν καπνιστές και 57,1% μη καπνιστές, ενώ στο 9,9% των περιπτώσεων η καπνισματική συνήθεια ήταν άγνωστη. 23,07% (Ν=21) των ασθενών είχαν ως τελική διάγνωση σαρκοείδωση, 19,78% (18) ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, 19,78% (18) BOOP, 13,18% (12) νόσο του συνδετικού ιστού, 9,9% (9) εξωγενή αλλεργική κυψελιδίτιδα, 6,6% (6) διάχυτη πνευμονοπάθεια οφειλόμενη σε λήψη φαρμάκων, 4,39% (4) εωσινοφιλική πνευμονοπάθεια, 3,3% (3) αγγειίτιδα. (Σχήμα 1). Τα χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 1. 21

4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Από τη σύγκριση των νοσημάτων μεταξύ τους ως προς τις τιμές της CRP κατά τη διάγνωση της νόσου, δε διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ τους με τη μη παραμετρική δοκιμασία Kruskal-Wallis (p=0,092). Επομένως, οι ασθενείς παρουσιάζονταν κατά τη διάγνωση χωρίς διαφορές στις τιμές της CRP, ανεξάρτητα από το νόσημα από το οποίο έπασχαν. Το ίδιο διαπιστώθηκε και για την ΤΚΕ (p=0,116). Αντίθετα, με την ίδια δοκιμασία, δείχθηκε ότι υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά στην ηλικία κατά τη διάγνωση των ασθενών (p<0,05), με τους ασθενείς με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση να προσέρχονται σε μεγαλύτερη ηλικία και τους ασθενείς με σαρκοείδωση σε νεότερη. (Σχήμα 2). Η δοκιμασία one way ANOVA χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση των τιμών %TLC κατά το χρόνο διάγνωσης των διαφόρων νοσημάτων. Έτσι, η ολική πνευμονική χωρητικότητα διέφερε στατιστικά μεταξύ των νοσημάτων [F(4, 57)=3,324, p=0,016]. Από την post-hoc σύγκριση δείχθηκε ότι η TLC διέφερε στατιστικά μεταξύ σαρκοείδωσης (M=82,57%, SD=15,297%) και ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (M=62,46%, SD=17,723%) καθώς και μεταξύ ιδιοπαθούς ίνωσης (M=62,46%, SD=17,723%) και εξωγενούς αλλεργικής κυψελιδίτιδας M=86,43%, SD=30,30%). (Σχήμα 3). Με την ίδια δοκιμασία διαπιστώθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές και στην % FRC στις ομάδες ασθενών ανάλογα με τη διάγνωσή τους. Διαπιστώθηκε ότι η λειτουργική υπολειπόμενη χωρητικότητα διέφερε στατιστικά ανάλογα με τη διάγνωση [F(4, 57)=4,322, p=0,04]. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Tukey HSD για την επιμέρους σύγκριση των ομάδων μεταξύ τους (συγκρίσεις post-hoc), από την οποία φάνηκε ότι υπήρχε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ σαρκοείδωσης (M=82,61%, SD=15,29%) και ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (M=56,65%, SD=18,45%) και μεταξύ εξωγενούς αλλεργικής κυψελιδίτιδας (M=97,69%, SD=39,34%) και ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης (M=56,65%, SD=18,45%). (Σχήμα 4). Η κυψελιδοαρτηριακή διαφορά δε διέφερε στατιστικώς μεταξύ των ομάδων [F=(4, 45)=0,153, p=0,960]. Στη συνέχεια συγκρίθηκαν τα ποσοστά των ανοσοφαινοτύπων: τα κύτταρα CD3 + /CD4 + και τα CD3 + /CD8 + ήταν στατιστικώς σημαντικά κατανεμημένα διαφορετικά μεταξύ των ομάδων [F(4, 72)=7,959, p<0,001] και [F(4, 72)=6,384, p<0,05]. Τα κύτταρα CD3 + /CD4 + διέφεραν μεταξύ σαρκοείδωσης (M=65,95%, SD=20,41%) και BOOP (M=45,52%, SD=20,05%), σαρκοείδωσης (M=65,95%, SD=20,41%) και νόσου του συνδετικού ιστού (M=31,46%, SD=18,41%) και μεταξύ σαρκοείδωσης (M=65,95%, SD=20,41%) και εξωγενούς 22