ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΓΑΛΑΚΤΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΟΝ ΕΝΤΕΡΙΚΟ ΒΛΕΝΝΟΓΟΝΟ ΠΟΝΤΙΚΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΤΡΟΠΟΠΟΙΗΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΓΑΛΑΚΤΟΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΤΟΝ ΕΝΤΕΡΙΚΟ ΒΛΕΝΝΟΓΟΝΟ ΠΟΝΤΙΚΩΝ ΕΙΡΗΝΗ ΖΗΝΩΝΟΣ Επιβλέπων καθηγητής : Γιάγκου Μηνάς, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΑΠΘ Θεσσαλονίκη 2007

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 2 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ. 4 1.1 Το Ανοσοβιολογικό Σύστημα. 4 1.1.1 Μη ειδική Αντίσταση... 4 1.1.2 Ειδική Αντίσταση. 5 1.1.3 Κυτοκίνες.. 9 1.1.4 Ανοσοβιολογική απόκριση στον εντερικό βλεννογόνο. 11 1.2 Προβιοτικοί Μικροοργανισμοί. 13 1.2.1 Γενικά 13 1.2.2 Κριτήρια Επιλογής Προβιοτικών και ασφάλεια... 14 1.2.3 Επιδράσεις των Προβιοτικών στην υγεία του ανθρώπου. 15 1.2.4 Προβιοτικά και ανοσοβιολογικό σύστημα 19 1.2.5 Επιδράσεις του L. acidophilus και του L. paracasei... 21 1.2.6 Πρεβιοτικοί Μικροοργανισμοί 22 1.3 Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου.. 23 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ.. 24 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ.. 25 3.1 Πειραματόζωα.. 25 3.2 Προετοιμασία Μικροοργανισμών.. 25 3.3 Αγωγή Πειραματόζωων.. 26 3.3.1 Χορήγηση Μικροοργανισμών... 26 3.3.2 Απομόνωση ιστών Λεπτού Εντέρου 27 3.4 Μονιμοποίηση και Έγκλειση ιστών... 28 3.5 Δημιουργία Τομών... 29 3.6 Μέθοδος Ανοσοϊστοχημείας (Άμεσος και Έμμεσος Ανοσοφθορισμός).. 30 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ.. 33 4.1 Αλληλεπίδραση L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) με τον εντερικό βλεννογόνο.. 33 4.2 Ανίχνευση αντισωμάτων IgA σε τομές λεπτού εντέρου.. 35 4.3 Ανίχνευση κυτοκινών TNF-a, IL-10 και IFNγ σε τομές λεπτού εντέρου... 39 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 41 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 44 1

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η διπλωματική αυτή εργασία πραγματοποιήθηκε στον Τομέα Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας, του Τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα της διπλωματικής μου εργασίας, Aναπληρωτή Καθηγητή Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής, κ. Γίαγκου Μηνά, για την εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπο μου αναθέτοντας μου αυτή την εργασία, για τις πολύτιμες συμβουλές του και την καθοδήγηση του καθ όλη τη διάρκεια της χρονιάς αυτής. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την κυρία Πηνελόπη Μαυραγάνη Τσιπίδου,που μας παραχώρησε το μικροσκόπιο φθορισμού του εργαστηρίου της. Ένα μεγάλο ευχαριστώ θέλω να πω στον υποψήφιο διδάκτορα του τμήματος Βιολογίας Κουρελή Ανδρέα για την πολύτιμη βοήθεια, την υποστήριξη και την υπομονή του γιατί χωρίς αυτόν τη διεξαγωγή αυτής της εργασίας και η συγγραφή της δε θα ήταν δυνατή. Επίσης τις πιο θερμές ευχαριστίες μου στις υποψήφιες διδάκτορες Κοντάνα Αναστασία και Τέστα Θεοδολίντα για τη βοήθεια και την υποστήριξη τους τόσο στην αρχική εξοικείωση μου με το εργαστήριο όσο και αργότερα καθ όλη τη διάρκεια του χρόνου αυτού καθώς και για τη βοήθεια τους στην συγγραφή αυτής της εργασίας. Δε θα ήθελα να παραλείψω να ευχαριστήσω τις συμφοιτήτριες μου Κακαγιάννη Μυρσίνη, Πάπιστα Χριστίνα και Καψαλά Ναυσικά για τη συμβολή τους στην εκτέλεση των πειραματικών διαδικασιών και για όλη τους τη βοήθεια. Ακόμη, πολλά ευχαριστώ στους φίλους μου για την υποστήριξη και την αγάπη τους. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ θέλω να το πω στους γονείς μου για την παντοτινή κατανόηση, βοήθεια και αγάπη που μου δείχνουν αλλά ιδιαίτερα για την υποστήριξη τους στη δύσκολη αυτή χρονική περίοδο. 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία χρόνια έχει προσδιοριστεί ότι διάφορα είδη και στελέχη που ανήκουν στα γαλακτοβακτήρια παρουσιάζουν ισχυρή ανοσοτροποποιητική δράση. Στην εργασία αυτή προσδιορίστηκε η ανοσοτροποποιητική δράση των στελεχών L.paracasei subsp. paracasei (DC 412), και L. paracasei (G15.11) στον εντερικό βλεννογόνο. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το L. acidophilus (NCFB 1748). Προσδιορίστηκε η ικανότητα αλληλεπίδρασης του επισημασμένου με φθορίζουσα ουσία στελέχους L.paracasei subsp. paracasei (DC 412) με τα κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου έπειτα από στοματική χορήγηση του σε ποντίκια. Προσδιορίστηκε επίσης ικανότητα όλων των πιο πάνω στελεχών, να επάγουν την παραγωγή IgA αντισωμάτων και των κυτοκινών IFN-γ, IL-10και TNFα έπειτα από 10ημερη χορήγησή τους σε πειραματόζωα. Διαπιστώθηκε ότι το L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) έχει ισχυρή ικανότητα αλληλεπίδρασης με τα εντερικά κύτταρα, στοιχείο ιδιαίτερης σημασίας για την ανοσοτροποποιητική δράση αλλά και για το χαρακτηρισμό προβιοτικών μικροοοργανισμών Επίσης, βρέθηκε ότι το στέλεχος L. acidophilus (NCFB 1748) και το L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) αυξάνουν τον αριθμό των κυττάρων του εντερικού βλεννογόνου που παράγουν τις κυτοκίνες IFN-γ, IL-10 και TNFα καθώς και IgA αντισωμάτων. Αντίθετα, το στέλεχος L. paracasei (G15.11) ενεργοποιεί μικρότερο αριθμό κυττάρων που παράγουν τις παραπάνω κυτοκίνες καθώς και των IgA αντισωμάτων γεγονός που δείχνει περιορισμένη ανοσοτροποποιητική δράση από το στέλεχος αυτό. Από τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, φαίνεται ότι το πρότυπο της ανοσοτροποιητικής δράσης των πιο πάνω στελεχών στον εντερικό βλεννογόνο συμφωνεί με τα αποτελέσματα προηγούμενων πειραμάτων του εργαστηρίου χρησιμοποιώντας το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για τη χρήση προβιοτικών μικροοργανισμών σε φαρμακευτικά σκευάσματα και τρόφιμα. Τα προβιοτικά βακτήρια αποτελούν μέρος της φυσιολογικής εντερικής μικροχλωρίδας του ανθρώπινου οργανισμού και χαρακτηρίζονται από μια πληθώρα ευεργετικών επιδράσεων στην υγεία του ανθρώπου. Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής δείχνουν ότι το στέλεχος DC 412 πληρεί τις προϋποθέσεις για να χαρακτηριστεί ως προβιοτικό ενώ ταυτόχρονα δείχνουν την καταλληλότητα του μοντέλου του ραχιαίου αεροθύλακα ως μίας αξιόπιστης και ταχείας ανάλυσης βιοπροσδιορισμού προβιοτικών μικροοργανισμών. Το τελευταίο αναμένει την επιβεβαίωσή του έπειτα από εφαρμογή του σε κλινικά πειράματα. 3

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΤΟ ΑΝΟΣΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το ανοσοβιολογικό σύστημα αποτελείται από ένα σύνολο αλληλεπιδρώντων κυτταρικών τύπων, μορίων και οργάνων που εξελίχθηκαν με τέτοιο τρόπο αποσκοπώντας στην άμυνα του οργανισμού από εξωτερικούς παράγοντες που εισβάλλουν σε αυτό και καλούνται «αντιγόνα» καθώς και από τροποποιημένα «εαυτά» κύτταρα. Τα κατώτερα ζώα έχουν πρωτόγονους μηχανισμούς άμυνας για την προστασία τους ενώ στα ανώτερα σπονδυλωτά οι ανοσοβιολογικές αποκρίσεις έχουν αναπτυχθεί σε ένα πολύπλοκο σύστημα, οι βασικές βιολογικές λειτουργίες του οποίου είναι η άμυνα ενάντια στην εισβολή των ξένων παραγόντων, η ανοσοβιολογική ομοιόσταση και η επιτήρηση. Η άμυνα αφορά τη σωστή λειτουργία των κυτταρικών στοιχείων. Η λειτουργία της ανοσοβιολογικής ομοιόστασης συνίσταται στην απομάκρυνση των κατεστραμμένων κυτταρικών στοιχείων έτσι ώστε να διατηρείται η φυσιολογική κατάσταση ενός ορισμένου τύπου κυττάρων. Τέλος, η επιτήρηση περιλαμβάνει την αναγνώριση μεταλλαγμένων κυτταρικών τύπων, που δημιουργούνται συνέχεια μέσα στον οργανισμό, είτε αυτόματα είτε μετά από επίδραση χημικών ουσιών ή διαφόρων ιών. Η λειτουργική δράση του ανοσοβιολογικού συστήματος λαμβάνει χώρα μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών, οι λειτουργίες των οποίων πολλές φορές αλληλεπικαλύπτονται. Οι μηχανισμοί αυτοί χαρακτηρίζονται ως μη ειδική και ειδική αντίσταση του ανοσοβιολογικού συστήματος (1). 1.1.1 Μη ειδική αντίσταση Έμφυτη, μη ειδική αντίσταση Το άτομο προστατεύεται, από δυνητικά βλαβερούς μικροοργανισμούς που βρίσκονται στο περιβάλλον του με αρκετούς μηχανισμούς που υπάρχουν από τη γέννηση του και που δεν εξαρτώνται από προηγούμενη έκθεση του ατόμου σε κάποιο εξωτερικό παράγοντα (μικροοργανισμοί, φυσικά και χημικά ερεθίσματα). Οι μηχανισμοί αυτοί δεν είναι ειδικοί με την έννοια ότι δρουν ενάντια σε ένα πλατύ φάσμα δυνητικά παθογενών παραγόντων. Οι μηχανισμοί της έμφυτης, μη ειδικής αντίστασης περιλαμβάνουν μηχανικούς φραγμούς όπως το δέρμα, τους βλεννογόνους και το κροσσωτό επιθήλιο της 4

αναπνευστικής οδού, διάφορες εκκρίσεις όπως το γαλακτικό οξύ και τα λιπαρά οξέα στον ιδρώτα και τους σμηγματογόνους αδένες, τις βλεννώδεις εκκρίσεις, τη λυσοζύμη και τους βακτηριοκτόνους παράγοντες του ορού (C-δραστική πρωτεΐνη και το σύστημα του συμπληρώματος). Περιλαμβάνει επίσης απλούς ή σύνθετους κυτταρικούς μηχανισμούς όπως η φαγοκυττάρωση, η αντίδραση της φλεγμονής, και τα ΝΚ κύτταρα (1). Επίκτητη, μη ειδική αντίσταση Η επίκτητη, μη ειδική αντίσταση περιλαμβάνει τα φυσικά αντισώματα που υπάρχουν στον ορό φυσιολογικών ατόμων και που είναι κυρίως της τάξης IgM και την αντι-ιική πρωτεΐνη ιντερφερόνη. Τα αντισώματα IgM, πιστεύεται ότι δημιουργούνται σαν απόκριση του οργανισμού σε βακτήρια της εντερικής χλωρίδας κατά την εμβρυακή ή νεογεννητική περίοδο. Η ιντερφερόνη συντίθεται από κύτταρα που μολύνθηκαν με ιό και από λεμφοκύτταρα ή μακροφάγα κύτταρα και με τη δράση της εμποδίζει την ενδοκυτταρική παραγωγή των ιών (1). 1.1.2 Ειδική αντίσταση Οι μικροοργανισμοί που μπορεί να παρακάμψουν τους μηχανισμούς της μη ειδικής αντίστασης θα αντιμετωπίσουν τη δεύτερη γραμμή άμυνας του οργανισμού, την ειδική αντίσταση ή ανοσοβιολογική απόκριση. Ανοσοβιολογική απόκριση καλείται η αντίδραση του ξενιστή προς τη ξένη ουσία, ανεξάρτητα αν αυτή είναι ή όχι βλαβερή. Περιλαμβάνει μια σειρά κυτταρικών επεξεργασιών που καταλήγουν στη δημιουργία ειδικών ή μη ειδικών κυτταρικών προϊόντων (π.χ. αντισώματα, λεμφοκίνες) ή ευαισθητοποιημένων κυττάρων. Η ειδική αντίσταση διακρίνεται από την μη ειδική έχοντας ορισμένα γενικά χαρακτηριστικά: α) εξειδίκευση β) ετερογένεια γ) μνήμη 5

Οι δύο μηχανισμοί της ανοσοβιολογικής απόκρισης είναι: α) η χυμική ανοσία που έχει σαν «μεσολαβητή» κυτταρικά προϊόντα του λεμφικού ιστού, τα αντισώματα. β) η κυτταρική ανοσία που έχει σαν «μεσολαβητή» ειδικά ευαισθητοποιημένα λεμφοκύτταρα. Χυμική Ανοσία Τα δραστικά μόρια της χυμικής ανοσίας καλούνται αντισώματα και είναι προϊόντα του λεμφικού ιστού τα οποία είτε παραμένουν συνδεδεμένα με τα λεμφοκύτταρα είτε εκκρίνονται σαν εξωκυτταρικά προϊόντα. Έχουν την ικανότητα να αντιδρούν μόνο με ξένα στοιχεία (ανοσογόνα ή αντιγόνα) που προκάλεσαν τη παραγωγή τους. Τα αντισώματα είναι πρωτεΐνες, γ-σφαιρίνες (γνωστές ως ανοσοσφαιρίνες) που διακρίνονται σε πέντε τάξεις ανάλογα με την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα, τις αντιγονικές τους ομάδες και την ορισμένη πρωτοταγή ακολουθία των αμινοξέων τους. Οι τάξεις αυτές είναι οι IgA, IgM, IgG, IgE και IgD. Οι ιστοί που διεξάγουν τους χυμικούς μηχανισμούς στους οποίους περιλαμβάνεται η διαφοροποίηση των Β-λεμφοκυττάρων, προέρχονται εμβρυολογικά από θυμοανεξάρτητο ιστό που στα πτηνά βρίσκεται στο θύλακα του Fabricious ενώ στα θηλαστικά αναφέρεται ως γαστρο-συνδεόμενος λεμφικός ιστός (π.χ. πλάκες του Peyer). Κυτταρική ανοσία Η κυτταρική ανοσία είναι πολύ σπουδαία για την άμυνα ενάντια σε πολλές μολυσματικές ασθένειες που οφείλονται σε ιούς ή ενδοκυτταρικά βακτήρια, για την επιτήρηση και άμυνα εναντίον καρκινικών κυττάρων καθώς και για την απόρριψη ομομοσχευμάτων. Η απόκριση με «μεσάζοντες» κύτταρα καλείται και αργοπορημένη υπερευαισθησία (delayed hypersensitivity). Ο μηχανισμός αυτός καθοδηγείται από το θύμο αδένα μέσω θυμοεξαρτημένου λεμφικού ιστού. Στο θύμο αδένα πραγματοποιείται η διαφοροποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Τα Τ-λεμφοκύτταρα έχουν την ικανότητα να ρυθμίζουν τη δράση των Β- λεμφοκυττάρων ή άλλων Τ-λεμφοκυττάρων. Όταν αλληλεπιδρούν με το αντιγόνο ώστε τα άλλα λεμφοκύτταρα να μπορέσουν να ανταποκριθούν ονομάζονται Τ-λεμφοκύτταρα βοηθοί (helper, Th) ενώ όταν δρουν για να καταστρέψουν άλλα κύτταρα ονομάζονται Τ- κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (CTL) ή Τ-κύτταρα φονιάδες (1). 6

Για να εκφραστεί η ειδική αντίσταση πρέπει τα αντιγόνα των μικροοργανισμών να έρθουν σε επαφή με τα κύτταρα του ανοσοβιολογικού συστήματος, τα μακροφάγα και τα λεμφοκύτταρα. Το γεγονός αυτό οδηγεί στην επαγωγή ανοσοβιολογικής απόκρισης που είναι ειδική για το αντιγόνο που τη προκαλεί. Η ειδική αντίσταση εκτελείται σε τρία διαδοχικά στάδια (2). 1) Επαγωγική φάση ή φάση αναγνώρισης: Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (Antigen Presenting Cells, APCs) συνδέονται με το αντιγόνο το παρουσιάζουν στα Τ-λεμφοκύτταρα ή στα Β-λεμφοκύτταρα ορισμένες φορές. Τα λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν τα αντιγονικά επιτόπια είτε με τον υποδοχέα του Τ- λεμφοκυττάρου (T Cell Receptor, TCR) μαζί με μόριο HLA( HLA περιορισμός, HLArestriction) είτε με ανοσοσφαιρινικές επιφάνειες. 2) Κεντρική φάση ή φάση πολλαπλασιασμού/διαφοροποίησης: Στη φάση αυτή τα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα διαφοροποιούνται σε εκτελεστικά κύτταρα (effector cells) ενώ μερικά από αυτά διαμορφώνεται σε κύτταρα μνήμης (memory cells). 3) Δραστική ή εκτελεστική φάση: Η εκτελεστική φάση έχει ως στόχο τη καταστροφή του εισβολέα ή του ξένου κυττάρου (κυττάρου στόχου, target cell) (2). Στους ανώτερους οργανισμούς η φάση αναγνώρισης και παρουσίασης του αντιγόνου λαμβάνει χώρα είτε μέσω της έμφυτης ειδικής ανοσίας είτε μέσω της επίκτητης ειδικής ανοσίας. Έμφυτη ειδική ανοσία Από τη στιγμή που το αντιγόνο εισέρχεται στον οργανισμό, θα αντιμετωπίσει τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα. Μαζί με τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα εκφράζουν πρότυπους υποδοχείς αναγνώρισης (Pattern Recognition Patterns,PRPs) που δεσμεύονται σε συντηρημένες μικροβιακές δομές που είναι γνωστές ως συνδεδεμένα με το παθογόνο μοριακά πρότυπα (Pathogen- Associated Molecular Patterns, PAMPs) όπως οι πεπτιδογλυκάνες των κατά Gram + βακτηρίων, οι λιποπολυσακχαρίτες (LPS), κτλ. Τα PRPs μπορεί να είναι α) μόρια που εκκρίνονται και βρίσκονται στο αίμα ή στη λέμφο και είναι συνδεδεμένα με το συμπλήρωμα και τον οψωνισμό, β) επιφανειακοί υποδοχείς που συνδέονται με την ενδοκύτωση ή γ) TLRs (Toll-Like Receptors), υποδοχείς που εντοπίζονται στα μακροφάγα, τα δενδριτικά και τα επιθηλιακά κύτταρα. Οι TLRs είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που επάγουν μονοπάτια μετάδοσης σήματος και ενεργοποιούν τον πυρηνικό παράγοντα κβ ( NF-κΒ) στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs). Ως 7

αποτέλεσμα εκφράζονται πολυάριθμες κυτοκίνες και ενεργοποιείται η επίκτητη ανοσία. Η αρχική απόκριση της έμφυτης ανοσίας που επάγεται από τα PAMPs είναι αυτή που διεγείρει το μηχανισμό της επίκτητης ειδικής ανοσίας (3). Επίκτητη ειδική ανοσία Όταν ενεργοποιηθούν τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs) και συνδεθούν με το αντιγόνο, στη συνέχεια έχουν την δυνατότητα να το παρουσιάσουν στα Τ- ή Β- λεμφοκύτταρα μέσω δύο οδών: 1) Η οδός των MHC μορίων τάξης Ι: σε αυτή την οδό γίνεται επεξεργασία αντιγονικών πεπτιδίων τα οποία συντίθενται μέσα στο κύτταρο (ενδογενή αντιγόνα, ιϊκά, νεοπλασματικά) και παρουσιάζονται στα Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (Tc, CD8 + ). Τα σύμπλοκα MHC-I μορίου-πεπτιδίου περιλαμβάνουν τόσο Τ-κυτταρικούς υποδοχείς (Τ Cells Receptors, TCRs) όσο και CD8 μόρια που αναγνωρίζουν τα σύμπλοκα MHC-I και υποδοχείς CD8 πάνω στα APCs. 2) Η οδός των MHC μορίων τάξης ΙΙ: η οδός αυτή προάγεται από τη παραλαβή διαλυτών αντιγόνων (εξωγενή και μικροβιακά) τα οποία παρουσιάζονται στα Τ-λεμφοκύτταρα βοήθειας (Τ Η,CD4 + ) (2). Από τις δύο οδούς αυτές φαίνεται ότι τα Τ-λεμφοκύτταρα βοήθειας (Τ Η,CD4 + ) αναγνωρίζουν ξένα αντιγόνα μόνο όταν είναι συνδεδεμένα με τα «εαυτά» (self) MHC ή HLA μόρια τάξης ΙΙ ενώ τα Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (Tc, CD8 + ) συνεργάζονται με αντιγόνα που παρουσιάζονται συνδεδεμένα με τα «εαυτά» (self) MHC ή HLA μόρια τάξης Ι. Σύμφωνα με τα πιο πάνω είναι απαραίτητα η συνεργασία των αυτόλογων MHC μορίων με τον υποδοχέα των Τ-λεμφοκυττάρων ( Τ Cells Receptors, TCRs) για τη τελική παρουσίαση του αντιγόνου στα Τ-λεμφοκύτταρα. Η διαδικασία καλείται MHC ή HLA περιορισμός (HLArestriction)(2). Πιο συγκεκριμένα, τα CD4 κύτταρα αλληλεπιδρούν με APCs που φέρουν σύμπλοκα MHC μορίων τάξης ΙΙ-αντιγονικών πεπτιδίων για να αποδώσουν είτε Τ H1 κύτταρα που ενεργοποιούν τη κυτταρική ανοσοβιολογική απόκριση είτε T H2 κύτταρα που οδηγούν στη χυμική ανοσοβιολογική απόκριση. Τα Τ H1 κύτταρα παράγουν προφλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως η ιντερφερόνη γ (IFNγ) ιντερλευκίνη 2 (IL-2), παράγοντα ογκονέκρωσης β (TNF-β) και επάγουν τη παραγωγή κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων (CTL). Τα T H2 κύτταρα παράγουν τις κυτοκίνες IL-4 και IL-10 που ευνοούν τη παραγωγή αντισωμάτων και την εναλλαγή τάξης, ενώ επίσης παρεμποδίζουν τα T H κύτταρα να μπουν στο μονοπάτι Τ H1 (3). 8

Η διαφοροποίηση σε Τ H1 προάγεται από την έκφραση της IL-12 ενώ η έκφραση των κυτοκινών IL-4 και IL-6 διεγείρει τη διαφοροποίηση σε T H2 κύτταρα (4). Στην εικόνα 1 αναπαρίσταται όλη η διαδικασία της ειδικής αντίστασης που περιγράφηκε πιο πάνω. Εικόνα 1. Μηχανισμοί της ειδικής ανοσίας (ηλεκτρονική πηγή 1). 1.1.3 Κυτοκίνες Οι κυτοκίνες είναι διαλυτές πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες, μικρού μοριακού βάρους (6 000-60 000) που παράγονται από πολλούς διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους (π.χ. Τ- λεμφοκύτταρα, μακροφάγα). Δρουν ως μεσολαβητικοί παράγοντες για την επικοινωνία και το συντονισμό των λειτουργιών διαφόρων κυτταρικών στοιχείων που συμμετέχουν στην ανοσοβιολογική απόκριση αλλά αλληλεπιδρούν και μεταξύ τους δημιουργώντας ένα περίπλοκο δίκτυο όπως φαίνεται στο σχεδιάγραμμα 1. Στη συγκεκριμένη διπλωματική 9

εργασία μελετήθηκαν οι κυτοκίνες ιντερφερόνη-γ (IFNγ), ιντρελευκίνη-10 (IL-10 ) και ο παράγοντας ογκονέκρωσης α (TNFα) των οποίων οι σημαντικές λειτουργίες αναφέρονται στον πίνακα 1. Σχεδιάγραμμα 1. Δίκτυο δράσης κυτοκινών (ηλεκτρονική πηγή 2) 10

Πίνακας 1. Λειτουργίες των κυτοκινών TNFα, IL-10 και IFNγ Κυτοκίνη Κυτταρική πηγή Λειτουργίες - Μακροφάγα TNFα - Δενδριτικά κύτταρα - Τ H1 κύτταρα (προφλεγμονώδης κυτοκίνη) IL-10 (αντιφλεγμονώδης κυτοκίνη) IFNγ (προφλεγμονώδης κυτοκίνη) - Μακροφάγα - T H2 κύτταρα - Τ H1 κύτταρα - ΝΚ κύτταρα - Κυτταροτοξικά Τ-λεμφοκύτταρα - Είναι ισχυρός επαγωγέας της φλεγμονής και κύριος ρυθμιστής της πρωτογενούς ανοσοβιολογικής απόκρισης (5) - Έμμεσος ρυθμιστής της επίκτητης ανοσοβιολογικής απόκρισης μέσω της επαγωγής της σύνθεσης των κυτοκινών IL-12 και IL-18 οι οποίες διεγείρουν τη παραγωγή IFNγ (5) - Αναστέλλει τη παραγωγή IL-2 και τη σύνθεση προφλεγμονωδών κυτοκινών - Παρεμποδίζει τη λειτουργία των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων και των μακροφάγων (6) - καταστέλλει τη παραγωγή των Τ H1 τύπου κυτοκινών TNFα και IFNγ (6) - Παρεμποδίζει την έκκριση των επιφανειακών κυτταρικών αντιγόνων μείζονος συμβατότητας της τάξης ΙΙ (MHC II)(7) - Διεγείρει τη διαφοροποίηση των Τ H1 κυττάρων (1) - Ρυθμίζει τη παραγωγή αντισωμάτων και τη λειτουργία των μακροφάγων και των ΝΚ κυττάρων (1) 1.1.4 Ανοσοβιολογική απόκριση στον εντερικό βλεννογόνο Η επιφάνεια του εντερικού βλεννογόνου, στην οποία ο ξενιστής αντιμετωπίζει πολλούς διαφορετικούς μικροοργανισμούς που προέρχονται από το εξωτερικό περιβάλλον, αποτελεί πρόσφορο έδαφος για προσβολή από διάφορα παθογόνα και πρόκληση μολύνσεων. Παρόλα αυτά, η περιοχή του εντερικού σωλήνα δεν είναι απροστάτευτη (8). Ένα πλήρες ανεπτυγμένο γαστρεντερικό σύστημα περιλαμβάνει μια πληθώρα μη ειδικών αμυντικών φραγμών που δρουν για την προστασία του από αυτά τα παθογόνα μικρόβια. Σε αυτούς τους έμφυτους φραγμούς συμπεριλαμβάνονται η γαστρική οξύτητα και τα πεπτικά ένζυμα που καταστρέφουν τα διάφορα αντιγόνα, η παραγωγή βλέννας που παρεμποδίζει την προσκόλληση των παθογόνων μικροβίων, η συνεχή περισταλτική δραστηριότητα για παρεμπόδιση της εγκατάστασης των παθογόνων και για τη γρήγορη απέκκριση των συμπλεγμάτων αντιγόνου-αντισώματος (9). 11

Στην άμυνα του εντέρου σημαντικό ρόλο διαδραματίζει το εκκριτικό αμυντικό σύστημα. Η άμυνα εναντίον των αντιγόνων των παθογόνων στο έντερο των θηλαστικών γίνεται μόνο με την παραγωγή ειδικών IgA αντισωμάτων (10). Η διαδικασία της έκκριση IgA καλείται «αμυντικός αποκλεισμός» και παρέχει προστασία στον εντερικό βλεννογόνο από φλεγμονώδεις αντιδράσεις (11). Το έμφυτο αμυντικό σύστημα δεν εξυπηρετεί μόνο στο αρχικό στάδιο της δυνατότητας του εντερικού βλεννογόνου να διατηρήσει την ομοιόσταση του αλλά συμβάλλει και ως σημαντική γέφυρα για την ενεργοποίηση και τη ρύθμιση της ειδικής ανοσίας στο έντερο. Για την ενεργοποίηση των μηχανισμών της ειδικής αντίστασης είναι απαραίτητη η μετανάστευση λεμφοκυττάρων στη περιοχή για τη μεταφορά ανοσοβιολογικών πληροφοριών μεταξύ των διαφορετικών διαμερισμάτων του εντερικού αμυντικού συστήματος. Μετά τη μετανάστευση των Τ-λεμφοκυττάρων στο lamina propria, αυτά εισχωρούν στα μεσοδιαστήματα των επιθηλιακών κυττάρων και παρουσιάζονται ως ενδοεπιθηλιακά λεμφοκύτταρα (intra-epithelial lymphocytes, IEL) (12). Τα ενδο-επιθηλιακά λεμφοκύτταρα μπορεί να αποτελούν μέχρι και το 27% του πληθυσμού των επιθηλιακών κυττάρων και το 40% του συνόλου των περιφερικών Τ- λεμφοκυττάρων. Τα εντερικά IEL είναι ανοσολογικά ικανά κύτταρα κάτω από τη μόνιμη διέγερση ρυθμιστικών παραγόντων του εντέρου συμπεριλαμβανομένων και των παραγόντων των βακτηρίων. Τα IEL συμμετέχουν ενεργά στην τοπική αντίδραση εναντίον των παθογόνων (13). Οι ανοσολογικές λειτουργίες των επιθηλιακών εντεροκυττάρων περιλαμβάνουν αλληλεπιδράσεις με παράγοντες του μικροπεριβάλλοντος του εντέρου, ενζυματική επεξεργασία των διατροφικών αντιγόνων, έκφραση μορίων προσκόλλησης, έκφραση MHC Ι και MHC ΙΙ μορίων, παρουσίαση των αντιγόνων στα λεμφοκύτταρα, παραγωγή κυτοκινών (συμμετοχή του δικτύου των κυτοκινών), μεταγωγή των εκκριτικών ανοσοσφαιρινών και δημιουργία συμπλεγμάτων με IgA. Επίσης συμβάλλουν στην «εκπαίδευση» των θυμοανεξάρτητων υποπληθυσμών των IEL. Η ενεργοποίηση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων που γίνεται από βακτήρια απαιτεί την άμεση επαφή με τα IEL και πιθανά αλληλεπίδραση με τα επιφανειακά αντιγόνα τους. Για την έναρξη τοπικής ανοσολογικής απόκρισης και για την ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων, είναι απαραίτητη η μετάβαση των αντιγόνων διαμέσου του στρώματος των επιθηλιακών κυττάρων (14). Τα Τ-λεμφοκύτταρα του εντερικού σωλήνα βρίσκονται κάτω από τη συνεχή επίδραση των αντιγόνων in vivo. Ενεργοποιούνται ( μέσω IL-2) και αντιδρούν στη μόλυνση 12

(15). Η μόνιμη αντιγονική ενεργοποίηση είναι υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό, την ωρίμανση και τη μετανάστευση των Τ-λεμφοκυττάρων σε απομακρυσμένους ιστούς (16). Παράγουν κυτοκίνες υπεύθυνες για τη συσσώρευση άλλων ανοσολογικών κυττάρων (Βλεμφοκυττάρων, κυττάρων φλεγμονής) και για τη διαφοροποίηση του μικροπεριβάλλοντος τους. Μια από τις σημαντικότερες κυτοκίνες που παράγεται από τα ενεργοποιημένα Τ- λεμφοκύτταρα είναι η IFNγ που ενεργοποιεί εκτελεστικά κύτταρα όπως τα μακροφάγα ή τα IEL (17). Τα IEL εκφράζουν MHC ΙΙ και ICAM-1 μόρια και παρουσιάζουν το αντιγόνο στα Τ- λεμφοκύτταρα. Αυτή η λειτουργία τους μεταβάλλεται ανάλογα με τη φυσιολογική ή την παθολογική κατάσταση του ξενιστή (18). Τα IEL είναι ικανά να παράγουν in vitro μεγάλου εύρους προφλεγμονώδεις κυτοκίνες όπως η IL-8, η MCP-1, ο TNF-α και GM-CSF. Η IL-8 και η MCP-1 είναι κυτοκίνες που προσελκύουν και ενεργοποιούν ουδετερόφιλα λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα. Ο TNF-α ενεργοποιεί ανοσολογικά και φλεγμονώδη κύτταρα και ο GM-CSF παρουσιάζει συνεργιστική δράση στην ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών (13). Η φυσιολογική μικροχλωρίδα του εντέρου συμμετέχει στους αμυντικούς μηχανισμούς της ανοσολογικής απόκρισης. Τα βακτήρια της φυσιολογικής χλωρίδας παρεμποδίζουν άλλα παθογόνα να προσκολληθούν στον εντερικό βλεννογόνο, παράγουν αντιβακτηριακούς παράγοντες και διεγείρουν την παραγωγή ειδικών αντισωμάτων (19). 1.2 ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ 1.2.1 Γενικά Στον καθένα οργανισμό κατοικεί ένας τεράστιος αριθμός από βακτήρια χωρίς τα οποία δε θα μπορούσε να διατηρηθεί στη ζωή για πολύ καιρό. Ο συνολικός τους αριθμός είναι αρκετές χιλιάδες δισεκατομμύρια και κάποια είναι μόνιμοι κάτοικοι, ενώ άλλοι παροδικοί επισκέπτες που απομακρύνονται και επανέρχονται αναλόγα με την κατανάλωση συγκεκριμένων τροφίμων. Τα βακτήρια αυτά διαχωρίζονται περίπου σε 400 κατηγορίες και τα περισσότερα κατοικούν στο πεπτικό σύστημα και ειδικότερα στην περιοχή του εντέρου. Δεν ζουν σαν παράσιτα αλλά «πληρώνουν ένα πάρα πολύ καλό ενοίκιο» για τη στέγη που τους προσφέρεται συμβάλλοντας τα μέγιστα στη διατήρηση της υγείας του ξενιστή τους. Για αυτό το λόγο τα βακτήρια αυτά ονομάστηκαν Προβιοτικά που σε ελεύθερη μετάφραση σημαίνει τα βακτήρια που είναι υπέρ της ζωής! 13

Γενικότερα, προβιοτικοί είναι οι μικροοργανισμοί που έχουν τη δυνατότητα να βελτιώνουν την υγεία του ξενιστή τους, παρεμποδίζοντας την προσβολή του από παθογόνα μικρόβια ή ενδυναμώνοντας τους αμυντικούς μηχανισμούς του μέσω ρύθμισης των λειτουργιών του ανοσοποιητικού συστήματος (20). Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για τη χρήση προβιοτικών μικροοργανισμών σε φαρμακευτικά σκευάσματα ή τρόφιμα. Διατίθενται στο εμπόριο κυρίως υπό τη μορφή γαλακτοκομικών προϊόντων (π.χ. γιαούρτι) αλλά απαντώνται και σε λυόφιλο μορφή ή κάψουλες ως συμπληρώματα διατροφής ή φάρμακα. Χαρακτηριστικοί προβιοτικοί μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται ευρέως σήμερα ως καλλιέργειες παρουσιάζονται στον πίνακα 2. Πίνακας 2. Χαρακτηριστικά είδη μικροοργανισμών που χρησιμοποιούνται ως προβιοτικά Γαλακτικά βακτήρια Lactobacillus (Λακτοβάκιλλοι) Lactobacillus acidophilus, L. gasseri, L. johnsonii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. helveticus, L. paracasei subsp. paracasei, L. casei, L. plantarum, L. GG, L. rhamnosus, L. curvatus, L. brevis, L. fermentum, L. reuteri, L. cellobiosus Lactococcus (Λακτόκοκκοι) Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris Streptococcus (Στρεπτόκοκκοι) Streptococcus thermophilus Enterococcus (Εντερόκοκκοι) Enterococcus faecium, E. faecalis Pediococcus (Πεδιόκοκκοι) Pediococcus acidilactici Leuconostoc Leu. mesenteroides subsp. dextranicus Bifidobacteria Bifidobacterium bifidum, B. infantis, B. longum, B. breve, B. adolescentis Προπιονικά βακτήρια Propionibacterium freudenreichii Ζύμες Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii 1.2.2 Κριτήρια Επιλογής Προβιοτικών και ασφάλεια Για να είναι εφικτός ο χαρακτηρισμός ενός μικροοργανισμού ως προβιοτικό στέλεχος, πρέπει ο μικροοργανισμός αυτός να πληρεί συγκεκριμένα κριτήρια. Αυτά τα κριτήρια έχουν θεσπιστεί από τον F.A.O (Food and Agriculture Organisation) και τα σημαντικότερα παρατίθενται στον πίνακα 3 (20, 21, 22). 14

Πίνακας 3. Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών Να είναι ανθρώπινης προέλευσης αν πρόκειται να χρησιμοποιηθούν από τον άνθρωπο Να είναι ανθεκτικά στο χαμηλό ph Να διατηρούν τη σταθερότητα τους στο γαστρικό οξύ και στα χολικά άλατα Να έχουν ικανότητα προσκόλλησης σε επιφάνειες βλεννογόνου και ιδιαίτερα στον εντερικό βλεννογόνο Να έχουν ικανότητα πολλαπλασιασμού και αποικισμού στο έντερο Να ενεργοποιούν το ανοσοβιολογικό σύστημα του ανθρώπου Να παρεμποδίζουν ή να μειώνουν τη προσκόλληση παθογόνων μικροβίων στον εντερικό βλεννογόνο και να χαρακτηρίζονται από ανταγωνιστική δράση για τον αποκλεισμό τους Να έχουν χαρακτηριστεί ως ασφαλή (GRAS) Να έχουν αντικαρκινική δράση Να έχουν καλές τεχνολογικές δυνατότητες (σταθερότητα, να έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής, να πολλαπλασιάζονται σε μεγάλη κλίμακα, να μην έχουν καμιά επίδραση στην γεύση του προϊόντος και να είναι ανθεκτικά στο οξυγόνο) Προτού ενσωματωθούν σε διατροφικά ή φαρμακευτικά προϊόντα, τα νέα στελέχη πρέπει να εκτιμηθούν και να ελεγχθούν προσεκτικά για την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα τους. Για να εκτιμηθεί η ασφάλεια των νέων στελεχών εκτελούνται ειδικές διαδικασίες αξιολόγησης όπως φαίνεται στο σχεδιάγραμμα 2 (23) μέσα από το οποίο εφαρμόζονται συνήθως τρεις προσεγγίσεις : α) μελέτη των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών του στελέχους (βιοχημικοί χαρακτήρες, ικανότητα προσκόλλησης και διεισδυτικότητας) β) μελέτη των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων του στελέχους (επιβίωση, δραστηριοποίηση στο έντερο, σχέση δόσης-απόκρισης, ανάκτηση από κόπρανα και βλεννογόνο) γ) μελέτες ανίχνευσης αλληλεπιδράσεων μεταξύ του στελέχους και του ξενιστή (21). 1.2.3 Επιδράσεις των Προβιοτικών στην υγεία του ανθρώπου Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί, μέσω των διάφορων δραστηριοτήτων τους, βελτιώνουν την υγεία του ξενιστή τους. Οι δραστηριότητες αυτές μπορεί να είναι αντιμικροβιακές, βιοχημικές ή και φυσιολογικές (24). Στη συνέχεια αναφέρονται οι σημαντικότερες: 15

Αναγνώριση του στελέχους με φαινοτυπικές και γενοτυπικές μεθόδους Γένος, είδος, στέλεχος Καταχώρηση στελέχους σε διεθνή βάση συλλογής μικροοργανισμών Χαρακτηρισμός λειτουργιών In vitro πειράματα Μελέτη σε ζώα Εκτίμηση ασφάλειας In vitro ή/και σε ζώα 1 η φάση μελέτης στον άνθρωπο 2 η φάση μελέτης σε άνθρωπο με κατάλληλα σχεδιασμένες δοκιμασίες (DBPC*), για την εξαγωγή συμπερασμάτων όσον αφορά τη δυναμικότητα του στελέχους και κατ επέκταση του προϊόντος 2 η, κατά προτίμηση μελέτη για την επαλήθευση των αποτελεσμάτων του DBPC 3 η φάση: η λειτουργικότητα της δοκιμασίας είναι κατάλληλη ώστε να γίνει σύγκριση των προβιοτικών με αναγνωρισμένη θεραπεία μιας συγκεκριμένης ασθένειας Προβιοτικά Τιτλοποίηση Ονομασία γένους, είδους και στελέχους Ελάχιστος αριθμός βακτηρίων στο τέλος της ζωής του προϊόντος Κατάλληλες συνθήκες αποθήκευσης Λεπτομέρειες σχετικά με την εταιρία παραγωγής του προϊόντος για την ενημέρωση του καταναλωτή DBPC (Double Bind placebo-control): Πειραματική διαδικασία με δύο ομάδες πειραματόζωων (η ανθρώπων). Στην μια ομάδα γίνεται επίδραση με το εξεταζόμενο στέλεχος ενώ στην άλλη χορηγείται γνωστό φάρμακο και γίνεται σύγκριση των αποτελεσμάτων Σχεδιάγραμμα 2. Κατευθυντήριες γραμμές για την αξιολόγηση της ασφάλειας των προβιοτικών 16

i. Συντονισμός και ρύθμιση της λειτουργίας της εντερικής μικροχλωρίδας Η ιδέα της χρήσης των προβιοτικών στελεχών στηριζόταν στην πιθανή ικανότητα τους να αλλάζουν τη σύνθεση της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου από μια δυναμικά επιβλαβή ομάδα παθογόνων σε μια ευεργετική μικροχλωρίδα για τον ξενιστή. Γενικότερα, αυτό σήμαινε τον περιορισμό των παθογόνων μικροβίων (π.χ.clostridia, Coliforms) και αύξηση της συγκέντρωσης των γαλακτοβακτηρίων και των Bifidobacteria. Είναι φανερό ότι αποφεύγοντας τον πολλαπλασιασμό των παθογόνων και μειώνοντας την πιθανότητα της υπερ-ανάπτυξης δυναμικά παθογόνων βακτηρίων, προκύπτει μια κατάσταση με ευεργετικές συνέπειες στον ξενιστή. Τέτοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε πράγματι από συγκεκριμένα στελέχη προβιοτικών όπως το L. rhamnosus GG (25). ii. Ανοσορυθμιστική δράση Το γεγονός ότι η απουσία μικροβιολογικής χλωρίδας οδηγεί σε αύξηση της μεταφοράς των αντιγόνων, υποδηλώνει ότι αυτή αποτελεί σημαντικό συστατικό του αμυντικού φραγμού του εντέρου κατευθύνοντας τη συστηματική και τοπική ανοσοαπόκριση. Σε πολλές φλεγμονές του εντέρου, η υγιής αλληλεπίδραση ξενιστήμικροοργανισμών διαταράσσεται και η φλεγμονή συνοδεύεται με διαταραχή της ισορροπίας της μικροβιολογικής χλωρίδας με τέτοιο τόπο ώστε να ενεργοποιείται ανοσοβιολογική απόκριση από τα ενδογενή βακτήρια. Η ρύθμιση των ιδιοτήτων της διαταραγμένης μικροχλωρίδας από συγκεκριμένα στελέχη αποτελεί το χαρακτηριστικό της προβιοτικής θεραπείας. Η επιτυχία της προβιοτικής θεραπείας στηρίζεται στην αποκατάσταση της μικροοικολογίας και της διαπερατότητας του εντέρου, στη βελτίωση των αμυντικών μηχανισμών και στην εξάλειψη της φλεγμονώδους αντίδρασης (26). iii. Προβιοτικά και αλλεργικές αντιδράσεις Ο ρυθμιστικός ρόλος των προβιοτικών μικροοργανισμών σε αλλεργικές καταστάσεις αρχικά υποστηρίχθηκε από την εκδήλωση κατασταλτικής δράσης στον πολλαπλασιασμό των λεμφοκυττάρων και στην παραγωγή της IL-4 in vitro (27). Στη συνέχεια, η φλεγμονώδης ανοσοαπόκριση εναντίον των διατροφικών αντιγόνων των αλλεργικών μορίων, φάνηκε να ελαττώνεται από τα προβιοτικά, γεγονός που αποδόθηκε στην αύξηση της παραγωγής αντι-φλεγμονωδών κυτοκινών όπως η IL-10 και ο TNF-β και στον έλεγχο των αλλεργικών αντιδράσεων στο έντερο (28,29). Έχει προταθεί ότι οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί μπορούν να απορυθμίσουν την αλλεργική φλεγμονή με εξισορρόπηση 17

της Th 2 αμυντικής απόκρισης και προάγοντας τη παραγωγή IgA αντισωμάτων εναντίον των αλλεργικών αντιγόνων (22). Κλινικές εφαρμογές σε βρέφη, έχουν δείξει σημαντική βελτίωση στα συμπτώματα από αλλεργικές αντιδράσεις ενώ η προληπτική δυναμική των προβιοτικών σε αλλεργικές καταστάσεις έχει πρόσφατα αποδειχθεί και με πειραματική μελέτη DBPC (30,25). iv. Προβιοτικά και ασθένειες του πεπτικού συστήματος Τα προβιοτικά έχουν παραδοσιακά χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με το πεπτικό σύστημα μερικές από τις οποίες είναι η παρακάτω: α) Δυσανεξία στη λακτόζη Η δυσανεξία στη λακτόζη είναι μια παθολογική κατάσταση που προκαλείται από τη μειωμένη παραγωγή του ενζύμου β-γαλακτοσιδάση. Σε άτομα με αυτή την ασθένεια δεν γίνεται αφομοίωση της λακτόζης, γεγονός που οδηγεί σε διαταραχή του ωσμωτικού φορτίου στο λεπτό έντερο που συνοδεύεται από έκκριση υγρών και πρόκληση διάρροιας (31). Στα πλαίσια πειραμάτων έχουν χορηγηθεί προβιοτικά βακτήρια σε ασθενείς που πάσχουν από την ασθένεια αυτή και παρατηρήθηκε ότι στελέχη λακτοβάκιλλων ανακουφίζουν τη δυσαπορρόφηση της λακτόζης, γεγονός που αποδόθηκε στο γεγονός ότι τα γαλακτικά βακτήρια παράγουν τη β-γαλακτοσιδάση που απουσιάζει από τους ασθενείς αυτούς (32). β) Οξεία γαστρεντερίτιδα Η οξεία γαστρεντερίτιδα μπορεί να είναι ιογενούς ή βακτηριακής προελεύσεως. Ο ιός rotavirus είναι μια από τις πιο κοινές αιτίες της ασθένειας αυτής (33). Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι συγκεκριμένα προβιοτικά στελέχη μπορούν να μειώσουν τη διάρκεια της διάρροιας και αυτό αποδίδεται σε διάφορους μηχανισμούς. Μετά από θεραπεία με επιλεγμένα προβιοτικά παρατηρήθηκε αυξανόμενη παραγωγή αντισωμάτων IgA εναντίον του ιού rotavirus, η διαπερατότητα του εντερικού βλεννογόνου να μειώνεται και να σταθεροποιείται και να ρυθμίζεται η εντερική μικροχλωρίδα (34,35). Σε περιπτώσεις διάρροιας που προκαλείται από τη λήψη αντιβιοτικών, υπάρχει μεγάλη αύξηση του πληθυσμού του μικροβίου Clostridium dificcile και έχει παρατηρηθεί ότι η χορήγηση προβιοτικών μειώνει τον κίνδυνο αυτής της ασθένειας (31). γ) Καρκίνος του εντέρου Τα γαλακτοβακτήρια ή προϊόντα τους μπορούν να αλληλεπιδράσουν απευθείας με καρκινικά κύτταρα σε καλλιέργειες και να παρεμποδίσουν τον πολλαπλασιασμό τους. Έχει παρατηρηθεί ότι μειώνουν την ανάπτυξη και την βιωσιμότητα των κυττάρων της ανθρώπινης εντερικής καρκινικής σειράς HT-29. Οι ακριβείς μηχανισμοί με τους οποίους τα 18

γαλακτοβακτήρια μπορεί να παρεμποδίζουν το καρκίνο του εντέρου δεν είναι γνωστοί αλλά μέσω αυτών μπορεί να συμπεριλαμβάνονται η ενίσχυση της ανοσοαπόκρισης του ξενιστή, η δέσμευση και η αποικοδόμηση καρκινικών αντιγόνων, η ποιοτική ή ποσοτική τροποποίηση της φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου, η παραγωγή αντικαρκινικών ή αντιμεταλλαξιγόνων παραγόντων στο έντερο, η τροποποίηση της μεταβολικής δραστηριότητας της μικροβιολογικής χλωρίδας του εντέρου, η διαφοροποίηση βιοχημικών παραγόντων στο έντερο και η επίδραση στη φυσιολογία του ξενιστή (36). v. Άλλες ευεργετικές επιδράσεις των προβιοτικών μικροοργανισμών Εκτός από τις πιο πάνω θετικές επιδράσεις των προβιοτικών στην υγεία του ξενιστή, οι ερευνητές προτείνουν και μελετούν και άλλες πιθανές δράσεις αυτών μερικές από τις οποίες παρατίθενται στον πίνακα 4. Πίνακας 4. Προτεινόμενες θετικές επιδράσεις των προβιοτικών (2,15) 1. Επίδραση στο μεταβολισμό της χοληστερόλης μειώνοντας τα επίπεδα της στον ορό και παρεμποδίζοντας έτσι την εμφάνιση αθηροσκλήρωσης (20,30) 2. Αύξηση της κινητικότητας του εντέρου και της απορρόφησης των θρεπτικών συστατικών των τροφών (30) 3. Αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας μετάλλων και βιταμινών (20) 4. Μείωση των καταβολικών προϊόντων που απεκκρίνονται από τα νεφρά και το ήπαρ (30) 5. Θετική επίδραση στην αναπτυξιακή διαδικασία (30) 1.2.4 Προβιοτικά και ανοσοβιολογικό σύστημα Τα προβιοτικά και ιδιαίτερα τα γαλακτοβακτήρια επηρεάζουν σημαντικά τις ανοσοβιολογικές αποκρίσεις συμμετέχοντας τόσο στη μη ειδική όσο και την ειδική αντίσταση. Η μη ειδική αντίσταση αποτελεί τη πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού. Η κυτταρική βάση της μη ειδικής αντίστασης αποτελείται από φαγοκύτταρα (μονοκύτταρα και μακροφάγα), πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα (κυρίως ουδετερόφιλα) και ΝΚ κύτταρα. Η φαγοκυττάρωση επάγει μια σειρά από ενδοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις που συνεχίζονται με τη παραγωγή ενεργών ριζών οξυγόνου και αζώτου, TNF-a και IL-1 (37). Η συμμετοχή διαφόρων στελεχών γαλακτοβακτηρίων στην μη ειδική αντίσταση εκφράζεται ως: 1) ενίσχυση της δράσης των περιτοναϊκών και πνευμονικών μακροφάγων (38) 2) αύξηση της παραγωγής και έκκρισης λυσοσωμικών ενζύμων (39) 19

3) αύξηση της παραγωγής ενεργών ριζών οξυγόνου και αζώτου και των κυτοκινών των φαγοκυττάρων (40). Η ειδική αντίσταση εκφράζεται με δύο μηχανισμούς: την χυμική ανοσία και την κυτταρική ανοσία. Αντισώματα που παράγονται από πλασματοκύτταρα (ώριμα Β- λεμφοκύτταρα) χαρακτηρίζουν τη χυμική ανοσία ενώ η κυτταρική ανοσία επάγεται από Τ- λεμφοκύτταρα τα οποία πολλαπλασιάζονται μετά από την επαφή τους με τα αντιγόνα, παράγουν κυτοκίνες και επηρεάζουν την δράση άλλως ανοσοϊκανών κυττάρων (37). Πολλοί ερευνητές υποστηρίζουν ότι συγκεκριμένα στελέχη γαλακτοβακτηρίων που δρουν ως προβιοτικά, εμπλέκονται στις δράσεις της ειδικής ανοσίας για καταπολέμηση μολύνσεων και καταστροφή ιικών ή καρκινικών κυττάρων (41,42,43). Στο σχεδιάγραμμα 3 περιγράφονται οι δράσεις διαφόρων προβιοτικών στελεχών μέσω της χυμικής και της κυτταρικής ανοσίας (22). ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΗ ΑΝΟΣΟΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ Ενεργοποίηση Κυτταρικής Ανοσοβιολογικής απόκρισης Διέγερση Τ H1 βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων (L.casei) Διέγερση μονοκυττάρων για τον αποκλεισμό των παθογόνων βακτηρίων (L.acidophilus) Διέγερση μακροφάγων προς παραγωγή TNF-a, IL-6 και NO Αντικαρκινική δράση Ενεργοποίηση Χυμικής Ανοσοβιολογικής απόκρισης Παραγωγή αντι-ρετροϊκής IgA και αντι-γριπικής IgG Σχεδιάγραμμα 3. Ανοσοτροποιητικοί μηχανισμοί διαφόρων προβιοτικών στελεχών 20

1.2.5 Επιδράσεις του L.acidophilus και του L.paracasei Τα γαλακτικά βακτήρια (Lactic Acid Bacteria, LAB) αποτελούν μια ομάδα βακτηρίων που εντοπίζονται φυσιολογικά στο γαστρεντερικό σύστημα των θηλαστικών. Είναι κατά Gram + (θετικοί) μικροοργανισμοί, μη σποριογόνοι και αναερόβιοι που παράγουν γαλακτικό οξύ ως τελικό προϊόν κατά τη ζύμωση των υδατανθράκων (44). Τα στελέχη L. acidophilus και L. paracasei είναι από τα πιο γνωστά γαλακτοβακτήρια που έχουν χαρακτηριστεί ως προβιοτικά. Οι χαρακτηριστικές ιδιότητες και επιδράσεις αυτών παρατίθενται στον πίνακα 5. Πίνακας 5. Ιδιότητες και ευεργετικές επιδράσεις των στελεχών L. acidophilus και L. paracasei L. acidophilus L. paracasei Ικανότητα επιβίωσης στο όξινο περιβάλλον του γαστρεντερικού σωλήνα Προκαλεί αλλαγές στη μεταβολική δραστηριότητα της εντερικής μικροχλωρίδας (45) Αλλαγή των φυσικοχημικών συνθηκών στο έντερο (μείωση του ph με συνέπεια τη παρεμπόδιση της ανάπτυξης σηπτικών βακτηρίων) (46) Συμβάλλει στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων προϊόντων ζύμωσης (ικανότητα οξεοποίησης του γάλακτος ) (53) Προκαλεί μείωση των επιπέδων της χοληστερόλης στον ορό (49) Ικανότητα επιβίωσης στο όξινο περιβάλλον του γαστρεντερικού σωλήνα, στη παρουσία λυσοζύμης και χολικών αλάτων Επίδραση σε διαταραχές της μικροχλωρίδας του εντέρου (είναι ανθεκτικό σε θεραπευτικά αντιβιοτικά) (53) Παρεμποδίζει την αύξηση παθογόνων μικροβίων όπως E.coli, Salmonella typhimurium και Listeria innocua (54) Συμβάλλει στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών ιδιοτήτων προϊόντων ζύμωσης (ικανότητα οξεοποίησης του γάλακτος) (53) Προκαλεί μείωση των επιπέδων της χοληστερόλης στον ορό (49) Αντικαρκινική δράση μέσω δέσμευσης μεταλλαξιγόνων και καρκινικών συστατικών αποτρέποντας την απορρόφηση τους από τον οργανισμό (50,51) Παρεμποδίζει την αύξηση παθογόνων μικροβίων όπως της Candida albicans Ενεργοποιεί το ανοσοβιολογικό σύστημα προκαλώντας παραγωγή των κυτοκινών IL-6,!L-10 και IL-12 (52) Θεραπευτικές ιδιότητες σε περιπτώσεις οξείας γαστρεντερίτιδας (47,48) Προκαλεί αύξηση των πληθυσμών CD4 και CD8 Τ-λεμφοκυττάρων στο λεπτό έντερο και ενεργοποίηση των μακροφάγων (55) Παρουσιάζει αντικαρκινικές ιδιότητες παράγοντας ένζυμα που εξουδετερώνουν ελεύθερες ρίζες και καρκινογόνες ουσίες (56) 21

1.2.6 Πρεβιοτικοί Μικροοργανισμοί Τα πρεβιοτικά ορίζονται ως μη ζωντανά συστατικά της τροφής, μη απορροφούμενα από το γαστρεντερικό σύστημα που επηρεάζουν ευεργετικά τον οργανισμό μας μέσω επιλεκτικής διέγερσης της ανάπτυξης και της ενεργής δραστηριότητας ενός αριθμού συγκεκριμένων βακτηρίων στο έντερο τα οποία βελτιώνουν την υγεία του ξενιστή. Πρεβιοτικά με αποδεδειγμένη δραστικότητα που είναι εμπορικά διαθέσιμα είναι οι φρουκτοολιγοσακχαρίτες (FOS), η λακτουλόζη, η ινσουλίνη και οι γαλακτοολιγοσακχαρίτες. Άλλα πιθανά πρεβιοτικά που βρίσκονται κάτω από πειραματική διερεύνηση είναι η λακτόλη, οι πεπτιδοολιγοσακχαρίτες, οι ισομαλτοολιγοσακχαρίτες, οι ξυλοολιγοσακχαρίτες, κτλ (57). Για να χαρακτηριστεί ένα διατροφικό συστατικό ως πρεβιοτικό πρέπει α) να μην υδρολύεται ούτε να απορροφάται από τον εντερικό βλεννογόνο, β) να είναι ικανό να προκαλεί διαφοροποίηση στην εντερική μικροχλωρίδα προς μια πιο ευεργετική σύνθεση βακτηρίων, γ) να επάγει συστηματικές αντιδράσεις που είναι ευεργετικές για το ξενιστή. Μερικές από τις ευεργετικές επιδράσεις των πρεβιοτικών στην υγεία του ξενιστή τους που προκύπτουν κυρίως από την αύξηση των bifidobacteria είναι η ανακούφιση από τη δυσανεξία της λακτόζης, η διέγερση ανοσίας ως απόκριση στην εισβολή παθογόνων στον οργανισμό και η αντικαρκινική δράση μειώνοντας τη δράση ενζύμων που συμμετέχουν στη παραγωγή τοξινών και καρκινικών ουσιών (57). Επίσης υποστηρίζεται ότι μπορούν να μειώνουν τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων και της χοληστερόλης στον ορό και ότι σχετίζονται με τη αποδοτική απορρόφηση σημαντικών απαραίτητων στοιχείων από το παχύ έντερο όπως το ασβέστιο και το μαγνήσιο (58) Το μίγμα προβιοτικών μικροοργανισμών και πρεβιοτικών που επιδρούν θετικά στην υγεία του ξενιστή τους ονομάζεται συμβιωτικά. Τα συμβιωτικά βελτιώνουν την επιβίωση και τον αποικισμό ζωντανών μικροβιακών συμπληρωμάτων διατροφής στο γαστρεντερικό δίκτυο, διεγείροντας την ανάπτυξη ή και την ενεργοποίηση της μεταβολικής δραστηριότητας των βακτηρίων που είναι ωφέλιμα για τον οργανισμό. (57) 22

1.3 Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου Σε προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα ποντικών ή επίμυων (59) για την εκτίμηση της ανοσοτροποποιητικής δράσης διάφορων στελεχών γαλακτοβακτηρίων τα οποία, με βιοχημικά κριτήρια, είχαν χαρακτηριστεί ως πιθανά προβιοτικά. Βρέθηκε ότι η τοπική χορήγηση των στελεχών L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) και L. acidophilus (NCFB 1748) επάγουν ισχυρή μη ειδική ανοσοβιολογική απόκριση στον αεροθύλακα σε σύντομο χρονικό διάστημα και συσσώρευση μεγάλου αριθμού πολυμορφοπύρηνων μονοπυρηνων (ΠΜΝ) κυττάρων του ανοσοβιολογικού συστήματος. Αντίθετα, η χορήγηση του στελέχους L. paracasei (G15.11) προκαλεί συσσώρευση μικρού αριθμού ΠΜΝ κυττάρων στον αεροθύλακα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα στελέχη DC 412 και L. acidophilus διεγείρουν την επαγωγή χημειοτακτικών παραγόντων οι οποίοι προκαλούν τη συσσώρευση μακροφάγωνμονοκυττάρων στον αεροθύλακα σε αντίθεση με το στέλεχος G15.11. Από περαιτέρω πειράματα βρέθηκε επίσης ότι τα κύτταρα του ανοσοβιολογικού συστήματος που συσσωρεύονται στον αεροθύλακα παρουσιάζουν αυξημένη ικανότητα φαγοκυττάρωσης ζυμών μετά από ενεργοποίηση με τα στελέχη DC 412 και L. acidophilus. Τα στελέχη αυτά είναι ικανά να προκαλούν ακόμη και συγκόλληση των κυττάρων του αεροθύλακα γεγονός που μπορεί να αποτελέσει κριτήριο ενεργοποίησης των κυττάρων του ανοσοβιολογικού συστήματος ή ότι προσομοιάζει την προσκόλληση των προβιοτικών, στον εντερικό βλεννογόνο. Επίσης, σε άλλα πειράματα του εργαστηρίου, μελετήθηκε και η επίδραση διαφόρων προβιοτικών και μη στελεχών στα επίπεδα των κυτοκινών (TNF-α, IFNγ και IL-10) που ανιχνεύονται στον αεροθύλακα έπειτα από χορήγηση των βακτηρίων. Διαπιστώθηκε ότι το στέλεχος L. acidophilus επάγει στον αεροθύλακα αυξημένα επίπεδα TNF-α. Το στέλεχος DC 412 προκαλεί επαγωγή υψηλότερων επιπέδων των κυτοκινών αυτών σε σχέση με το G15.11 ενώ κανένα από τα στελέχη που μελετήθηκαν δεν προκαλεί τη παραγωγή IFNγ και IL-10. 23

2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Δεν υπάρχει κάποια μελέτη που να συσχετίζει τις ανοσοαποκρίσεις που παρατηρούνται τοπικά στον ραχιαίο αροθύλακα με τις ανοσοαποκρίσεις στον εντερικό βλεννογόνο. Προκειμένου ένας μικροοργανισμός να χαρακτηριστεί ως προβιοτικός, είναι απαραίτητο το πρότυπο της ανοσοτροποποιητικής δράσης που εμφανίζεται από τη χορήγηση του στον αεροθύλακα να συμφωνεί με το πρότυπο της ανοσοτροποποιητικής δράσης του μετά από τη χορήγηση τους, στον γαστρεντερικό σωλήνα. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η μελέτη της ανοσοτροποποιητικής δράσης των στελεχών L. paracasei subsp. paracasei (DC 412), L. paracasei (G15.11) και L. acidophilus (NCFB 1748) στον εντερικό βλεννογόνο. Από προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου χρησιμοποιώντας το μοντέλο του ραχιαίου αεροθύλακα διαπιστώθηκε ότι το στέλεχος DC 412 παρουσιάζει ισχυρή ανοσοτροποποιητική δράση ενώ το G15.11 όχι. Προκειμένου να αξιολογηθεί αν το πρότυπο της ανοσοτροποιητικής δράσης που παρουσιάζουν τα στελέχη αυτά στον ραχιαίο αεροθύλακα επαναλαμβάνεται και στον εντερικό βλεννογόνο, προσδιορίστηκαν διάφοροι παράμετροι που αφορούσαν την ικανότητα αλληλεπίδρασης των παραπάνω στελεχών με τον εντερικό βλεννογόνο καθώς και η ικανότητα των στελεχών αυτών να επάγουν την παραγωγή κυτοκινών από τα εντεροκύτταρα. 24

3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Πειραματόζωα Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν θηλυκά ποντίκια της αιμομικτικής σειράς BALB/c, ηλικίας 2-3 μηνών και βάρους 20-30 gr. Τα πειραματόζωα διατηρούνται σε κλωβούς από Plexiglas, σε σταθερή θερμοκρασία (18-20 C) και τεχνητή φωτοπεριοδικότητα 12 ωρών. Είχαν απεριόριστη σίτιση με τροφή του εμπορίου σε μορφή κόκκων και έπιναν νερό του δικτύου της πόλης. 3.2 Προετοιμασία Μικροοργανισμών Τα γαλακτοβακτήρια L. paracasei subsp. paracasei (DC 412), L. paracasei (G15.11) και L. acidophilus (NCFB 1748) είναι ανθρώπινης προέλευσης (60) και διατηρούνται σε γλυκερόλη στη κατάψυξη (-20 C). Για την ανάπτυξη τους χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό υλικό MRS. Η πρώτη ανακαλλιέργεια από το stock γλυκερόλης αναπτύχθηκε για 48 ώρες στη βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης για κάθε μικροοργανισμό (DC 412 και G15.11 στους 30 C ενώ για το L. acidophilus στους 37 C). Ακολούθως πραγματοποιήθηκε και δεύτερη ανακαλλιέργεια στις βέλτιστες θερμοκρασίες για 24 ώρες. Οι καλλιέργειες στη συνέχεια διατηρήθηκαν στο ψυγείο, μέχρι τη προηγούμενη μέρα του πειράματος όπου πριν τη χορήγηση γίνεται νέα ανακαλλιέργεια και ανάπτυξη για 18-20 ώρες. Πριν από τη χορήγηση, οι μικροοργανισμοί φυγοκεντρούνται, «ξεπλένονται» και επαναιωρούνται σε φυσιολογικό ορό (0,9% NaCl). Στη συνέχεια εκτιμάται η βιομάζα τους σε cfu (colony forming units) με τη βοήθεια καμπύλων ανάπτυξης και φωτομέτρησης διαφορετικών αραιώσεων στα 570 nm (OD 570 ) σύμφωνα με το πρότυπο Mc Farland όπως φαίνεται στον πίνακα 6. Οι μικροοργανισμοί επαναιωρούνται σε φυσιολογικό ορό έτσι ώστε ο αριθμός τους να ισούται με 10 9 cfu/ml και ακολουθεί χορήγηση τους στα πειραματόζωα. Πίνακας 6. Πρότυπο Mc Farland Standard Αριθμός βακτηρίων x 10 6 /ml Οπτική πυκνότητα OD στα 550 nm 0,5 150 0,125 1 300 0,250 2 600 0,500 3 900 0,750 4 1200 1,000 5 1500 1,250 25

3.3 Αγωγή Πειραματόζωων 3.3.1 Χορήγηση Μικροοργανισμών α) Στοματική χορήγηση στελεχών L. paracasei subsp. paracasei (DC 412), L. paracasei (G15.11) και L. acidophilus (NCFB 1748) Η χορήγηση των μικροοργανισμών στα πειραματόζωα έγινε από το στόμα με τη βοήθεια μικροπιπέτας και χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα tips. Αρχικά αναισθητοποιήθηκε ελαφρά το κάθε ποντίκι με αιθέρα. Στη συνέχεια κρατώντας το ζώο από τον αυχένα τοποθετήθηκε η άκρη του tip στο στόμα του και με αργό και σταθερό ρυθμό του χορηγήθηκαν 50 μl από το αιώρημα του μικροοργανισμού που ετοιμάστηκε προηγουμένως. Τα ζώα καθώς συνέρχονταν, κατάπιναν σιγά-σιγά το αιώρημα των στελεχών που είχαν στο στόμα τους. Αφού τους χορηγήθηκε όλη η ποσότητα με προσοχή τοποθετήθηκαν ξανά στο κλωβό. Το κάθε στέλεχος χορηγήθηκε σε 3 πειραματόζωα κάθε μέρα για 10 μέρες και την 11 η τα ζώα θυσιάστηκαν για απομόνωση ιστών λεπτού εντέρου. β) Στοματική χορήγηση γαλακτοβακτηρίου L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) επισημασμένο με FITC (fluorescein isothiocyanate) Για τον έλεγχο της ικανότητας αλληλεπίδραση του στελέχους L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) με τα κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου, χορηγήθηκε σε πειραματόζωα επισημασμένο με φθορίζουσα ουσία, τη FITC (fluorescein isothiocyanate). Ανακαλλιέγεια του στελέχους DC 412 αναπτύχθηκε για 18-20 ώρες στη βέλτιστη θερμοκρασία των 30 C. Μετά την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης, υπολογίστηκε η βιομάζα των βακτηρίων σύμφωνα με το πρότυπο Mc Farland. Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η διαδικασία της επισήμανσης με FITC. Μετά την επισήμανση των βακτηρίων, πραγματοποιήθηκε στοματική χορήγηση, με τη διαδικασία που περιγράφηκε πιο πάνω, όπου χορηγήθηκαν 100 μl από το αιώρημα του μικροοργανισμού σε ένα πειραματόζωο. 20 λεπτά αργότερα το ζώο θυσιάστηκε και πραγματοποιήθηκε ανατομία για απομόνωση ιστών λεπτού εντέρου. 26

Διαδικασία επισήμανσης των βακτηρίων με FITC: Υλικά: - PBS 1X - Na 2 CO 3 0,1 Μ (ph 9) - Ισοθυακινική φλουορεσκεΐνη (FITC) 1) Η καλλιέργεια φυγοκεντρείται στις 3500 rpm για 10 λεπτά και απομακρύνεται το υπερκείμενο. 3) Το ίζημα των βακτηρίων επαναιωρείται σε 2-3 ml PBS 1X, μεταφέρεται το αιώρημα σε falcon (50 ml) και συμπληρώνεται το falcon μέχρι τα 50 ml με PBS 1X. Ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 10 λεπτά. 4) Αποκρίνεται το υπερκείμενο και επαναιωρείται το ίζημα σε PBS 1X, μέχρι τα 50 ml. Επαναλαμβάνεται η φυγοκέντρηση στις 3000 rpm για 10 λεπτά και αφαιρείται το υπερκείμενο, αφήνοντας λίγα ml PBS με το ίζημα. 5) Διαλύονται 100 μg FITC σε 1 ml Na 2 CO 3. Στη συνέχεια το ίζημα των βακτηρίων επαναιωρείται σε 2 ml με Na 2 CO 3 και προστίθενται 200 μl από το διαλυμένο FITC. 6) Ακολουθεί επώαση των βακτηρίων στο σκοτάδι για 1 ώρα στους 37 C, με ανάδευση ανά10 λεπτά. 7) Μετά το πέρας της επώασης, ακολουθούν επανειλημμένες πλύσεις με PBS για απομάκρυνση της περίσσειας του FITC με φυγοκεντρήσεις στις 3000 rpm για 10 λεπτά. 8) Τέλος τα βακτήρια επαναιωρούνται στη επιθυμητό αριθμό σε συγκεκριμένη ποσότητα φυσιολογικού ορού.. 3.3.2 Απομόνωση ιστών Λεπτού Εντέρου Για την απομόνωση του λεπτού εντέρου τα πειραματόζωα, θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση έπειτα από ελαφριά αναισθησία. Το λεπτό έντερο απομακρύνθηκε και στη συνέχεια με ειδικό λεπτό σωληνάκι έγινε καθαρισμός του εντέρου με πλύσεις με μεγάλο όγκο φυσιολογικού ορού. Το έντερο τεμαχίστηκε σε μικρότερα τμήματα, ~ 1cm και τοποθετήθηκε για 48 ώρες στους 4 C σε σωλήνα που περιείχε 4% παραφολμαλδεΰδη σε PBS. 27

3.4 Μονιμοποίηση και Έγκλειση ιστών Υλικά: - αιθανόλη (50%, 70%, 80%, 90%, και 100%) - ξυλένιο - παραφίνη σε κόκκους Μετά τη1cm μονιμοποίηση οι ιστοί μεταφέρθηκαν σε νέους σωλήνας και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε διαδοχικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης 50% αιθανόλη για 60 λεπτά 70% αιθανόλη για 60 λεπτά 80% αιθανόλη για 60 λεπτά 90% αιθανόλη για 60 λεπτά 100% αιθανόλη για 60 λεπτά 100% αιθανόλη για 12-15 ώρες Μετά την ολοκλήρωση των 12-15 ωρών επώασης σε αιθανόλη 100%, οι ιστοί μεταφέρονται σε νέους σωλήνες και εμβαπτίζονται σε ξυλένιο για 60 λεπτά. Το στάδιο επαναλαμβάνεται ακόμα μια φορά με τη διαφορά ότι τα τελευταία 15 λεπτά της επώασης γίνονται σε υδατόλουτρο στους 60 C όπως και τα επόμενα στάδια της διαδικασίας της έγκλεισης. Στη συνέχεια οι ιστοί μεταφέρονται σε σωλήνες που περιέχουν λιωμένη παραφίνη και επωάζονται στο υδατόλουτρο για 60 λεπτά. Το στάδιο επαναλαμβάνεται άλλη μια φορά. Ακολούθως, οι ιστοί μεταφέρονται σε καθαρές, πλαστικές παγοθήκες που περιέχουν μικρή ποσότητα λιωμένης παραφίνης. Οι παγοθήκες γεμίζονται μέχρι την κορυφή τους με παραφίνη οι ιστοί ευθυγραμμίζονται με γυάλινη πιπέτα για να μπορέσουν να γίνουν ομοιόμορφές τομές στη συνέχεια. Μετά από αυτό, οι παγοθήκες απομακρύνονται προσεκτικά από το υδατόλουτρο και παραμένουν σε θερμοκρασία δωματίου για ~ 2 μέρες προκειμένου να γίνει η τελική έγκλειση των ιστών. Αφού στεγνώσει η παραφίνη, τα blocks με τους ιστούς αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου και είναι έτοιμα να χρησιμοποιηθούν για τις τομές. 28

3.5 Δημιουργία τομών Προετοιμασία αντικειμενοφόρων πλακών για τις τομές Υλικά: - ζελατίνη σε σκόνη - KCr(SO 4 ).12H 2 O - οξικό οξύ - αιθανόλη - απεσταγμένο νερό Η διαδικασία για τη δημιουργία αντικειμενοφόρων πλακών για τις τομές είναι η εξής: 1) 15 gr ζελατίνης διαλύονται σε 500 ml απεσταγμένου νερού. Για την πλήρη διάλυση της ζελατίνης, το διάλυμα θερμαίνεται μέχρι βρασμού. 2) Σε 250 ml διαλύεται 1gr KCr(SO 4 ).12H 2 O, τα οποία αναμειγνύονται με τι διάλυμα της ζελατίνης αφού κρυώσει. 3) Προστίθενται 70 ml οξικού οξέος και 300 ml αιθανόλης. 4) Οι καθαρές αντικειμενοφόροι εμβαπτίζονται στο διάλυμα κάλυψης για λίγα δευτερόλεπτα και στη συνέχεια τοποθετούνται σε όρθια υποστηρίγματα. 5) Ακολουθεί στέγνωμα των αντικειμενοφόρων σε κλίβανο στους 37 C μέχρι να χρησιμοποιηθούν Δημιουργία τομών Οι τομές δημιουργήθηκαν από ιστούς λεπτού εντέρου από πειραματόζωα μάρτυρες και πειραματόζωα στα οποία χορηγήθηκαν τα στελέχη L. paracasei subsp. paracasei (DC 412), L. paracasei (G15.11) και L. acidophilus (NCFB 1748). Οι τομές έγιναν σε χειροκίνητη μικροτόμο με πάχος 4 μm. Όταν αποκόπτονται από το block, τοποθετούνται για 2-3 λεπτά σε νερό στους 58 C για να απλώσουν και ακολουθεί προσκόλληση τους σε αντικειμενοφόρους πλάκες που έχουν καλυφθεί με ζελατίνη. Στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι να στεγνώσουν καλά (~24 ώρες) πριν γίνει η αποπαραφινοποίηση τους. Αποπαραφινοποίηση Υλικά: - ξυλένιο - αιθανόλη (100%, 95%, 70% και 50%) 29

- απεσταγμένο νερό Οι τομές εμβαπτίζονται αρχικά σε ξυλένιο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια τοποθετούνται ανά 2-3 λεπτά σε διαδοχικά μειούμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης 100%, 95%, 70% και 50%. Μετά τοποθετούνται σε απεσταγμένο νερό. Μπορούν να αποθηκευτούν στο νερό ή να υποστούν περαιτέρω επεξεργασία (χρώση ή ανοσοϊστοχημεία) και να παρατηρηθούν στο μικροσκόπιο. 3.5 Μέθοδος Ανοσοϊστοχημείας (Άμεσος και Έμμεσος Ανοσοφθορισμός) Στις τομές που δημιουργήθηκαν πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία για την ανίχνευση των κυττάρων που παράγουν IgA αντισώματα ή τις κυτοκίνες IFN-γ, IL-10 και TNFα (61). α) Ανοσοϊστοχημεία για IgA (Άμεσος Ασνοσοφθορισμός) Υλικά: αντι IgA/FITC ποντικού [anti-mouse IgA (α-chain specific) FITC-conjugate, Product No:F9384 (SIGMA)] - PBS 1Χ - απεσταγμένο νερό Για την ανίχνευση των κυττάρων που παράγουν IgA αντισώματα ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Μετά την αποπαραφινοποίηση τους, οι τομές τοποθετούνται σε απεσταγμένο νερό για ~ 10 λεπτά πριν την ανοσοϊστοχημεία. Αφού στεγνώσουν, προστίθενται σε κάθε τομή 25-50 μl αντι- IgA/FITC σε αραίωση 1:100 σε PBS. Οι τομές καλύπτονται με καλυπτρίδα και επωάζονται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά. Στη συνέχεια οι αντικειμενοφόροι ξεπλένονται με απεσταγμένο για να απομακρυνθεί η καλυπτρίδα και ακολουθεί στεγνωμά τους.. Μετά την ανοσοϊστοχημεία οι τομές χρωματιζονται με χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης και παρατηρούνται σε μικροσκόπιο φθορισμού. Ο αριθμός των κυττάρων που φθορίζουν μετρήθηκε σε 8 πεδία σε μεγέθυνση 40Χ και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο αριθμός των θετικών κυττάρων ανά πεδίο. 30

β) Ανοσοϊστοχημεία για τις κυτοκίνες IFN-γ, IL-10και TNFα (Έμμεσος Ανοσοφθορισμός) Υλικά: - 5% FBS σε PBS - PBS 1cm - 1 ο αντίσωμα ( αντι-rat IFN-γ ή anti-rat IL-10, ή anti-rat TNF-α*) - 2 ο αντίσωμα (αντι-goat IgG-FITC conjugate*) Μετά την αποπαραφινοποίηση τους, οι τομές τοποθετούνται σε απεσταγμένο νερό για ~ 10 λεπτά πριν την ανοσοϊστοχημεία. Ακολουθεί στέγνωμα και προσθήκη 25-50 μl διαλύματος δέσμευσης 5% FBS σε PBS 1X και οι τομές καλύπτονται με καλυπτρίδα. Έπειτα από επώαση 30 λεπτών σε θερμοκρασία δωματίου γίνεται για 3 φορές ξέπλυμα με PBS. Ακολουθεί προσθήκη 25-50 μl του 1 ου αντισώματος (anti-rat IFN-γ ή anti-rat IL-10 ή anti-rat TNF-α σε συγκέντρωση 1μg/ml σε PBS 1Χ) σε κάθε τομή, κάλυψη με καλυπτρίδα και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Μετά το τέλος της επώασης γίνεται ξέπλυμα για 2 φορές με PBS 1Χ. Στη συνέχεια προστίθενται 25-50 μl του 2 ου αντισώματος ( anti-goat IgG-FITC conjugate σε αραίωση 1:400 σε PBS 1Χ) και τα δείγματα επωάζονται στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά.. Στη συνέχεια οι τομές ξεπλένονται 2 φορές με PBS. Ακολούθησε χρώση των τομών με αιματοξυλίνη εωσίνη και μικροσκοπική παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Ο αριθμός των κυττάρων που φθοριζουν μετρήθηκε σε 8 πεδία σε μεγέθυνση 40Χ και τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο αριθμός των θετικών κυττάρων ανά πεδίο. * Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: - anti-rat IFN-γ Antibody, Catalog No:AF-585-NA, (R&D) - anti-rat IL-10 Antibody, Catalog No:AF519, (R&D) - anti-rat TNF-α Antibody, Catalog No:AF-510-NA, (R&D) - anti-mouse IgG (whole molecule) FITC-conjugate, Product No:F7367 (SIGMA) 31

γ) Χρώση Αιματοξυλίνης Εωσίνης Υλικά: 1) Αιματοξυλίνη (Mayers filtered) 2) Εωσίνη - 1gr εωσίνη - 100ml απεσταγμένο νερό 3) Οξινισμένη αλκοόλη 1% - 99 ml 70% αλκοόλη - 1 ml υδροχλωρικό οξύ (conc.) 4) απεσταγμένο νερό Η μέθοδος που ακολουθείται για τη χρώση είναι η εξής: Αρχικά τομές που έχουν ενυδατωθεί τοποθετούνται σε διάλυμα αιματοξυλίνης για 3 λεπτά και μετά ξεπλένονται με τρεχούμενο νερό. Ακολούθως εμβαπτίζονται σε απεσταγμένο νερό μέχρι να γίνουν χρωματιστούν γαλάζιες (~10 λεπτά). Στη συνέχεια τοποθετούνται στο διάλυμα οξινισμένης αλκοόλης 1% για 10 δευτερόλεπτα. Ακολουθεί ξέπλυμα με τρεχούμενο νερό και οι τομές τοποθετούνται στο διάλυμα εωσίνης για 20 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια ξεπλένονται και πάλι με τρεχούμενο νερό και τέλος τοποθετούνται σε απεσταγμένο νερό για 10 λεπτά πριν γίνει παρατήρηση τους στο οπτικό μικροσκόπιο. 32

4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η μελέτη της ικανότητας αλληλεπίδρασης των μικροοργανισμών με τα κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου είναι ένα από τα σημαντικότερα βήματα που πραγματοποιούνται πριν να χαρακτηριστεί ένας μικροοργανισμός ως προβιοτικός (52). Σε προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου μας είχε βρεθεί ότι τόσο το στέλεχος DC 412 όσο και το μη προβιοτικό L. helveticus παρουσιάζουν αυξημένη ικανότητα προσκόλλησης στη σειρά εντεροκυττάρων Caco-2. Αντίθετα, το προβιοτικό L. acidophilus όσο και το στέλεχος G.15.11 δεν παρουσίαζαν αυξημένη ικανότητα προσκόλλησης στα Caco-2. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι η αλληλεπίδραση βακτηριακών στελεχών με τα Caco-2 εντεροκύτταρα είναι επισφαλής για τον χαρακτηρισμό τους ως πιθανά προβιοτικά. 4.1 Ικανότητα αλληλεπίδρασης L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) με τον εντερικό βλεννογόνο. Αρχικά, θεωρήθηκε σημαντικό να επιβεβαιωθεί η ικανότητα αλληλεπίδρασης του πιθανού προβιοτικού DC 412 με τον εντερικό βλεννογόνο. Στη παρούσα εργασία, η στοματική χορήγηση επισημασμένου με FITC L. paracasei subsp. paracasei (DC 412) σε πειραματόζωα είχε ως αποτέλεσμα κύτταρα του στελέχους αυτού να αλληλεπιδρούν με κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου (εικόνα 3 α,β). Το γεγονός αυτό επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα των πειραμάτων που δείχνουν την ικανότητα του στελέχους αυτού να προσκολλάται σε κύτταρα ανθρώπινων εντερικών σειρών. 33

α) β) Εικόνα 2. Μικροσκοπία φθορισμού σε τομές λεπτού εντέρου ποντικιού, το οποίο θυσιάστηκε 20 λεπτά μετά τη χορήγηση του επισημασμένου με FITC στελέχους DC412. Τα βέλη δείχνουν τα κύτταρα ή αντιγόνα του στελέχους DC 412 προσκολλημένα στις λάχνες του λεπτού εντέρου. 34

Εκτίμηση της Ανοσοτροποιητικής δράσης των στελεχών DC 412 και G15.11 in vivo Πραγματοποιήθηκε στοματική χορήγηση των στελεχών καθημερινά για 10 μέρες σε πειραματόζωα από τα οποία την 11η μέρα απομονώθηκαν ιστοί λεπτού εντέρου για να εξεταστεί η ικανότητα των στελεχών αυτών να επάγουν τη παραγωγή αντισωμάτων και κυτοκινών. Τόσο η στοματική χορήγηση όσο και η δόση των στελεχών βακτηρίων στα ποντίκια δεν οδήγησαν στη δημιουργία παρενεργειών ή αντίδρασης φλεγμονής. Στην εικόνα 3 παρουσιάζονται τομές λεπτού εντέρου φυσιολογικών ποντικών καθώς και ποντικών έπειτα από αγωγή με γαλακτοβακτήρια και στις οποίες δεν παρατηρείται κάποια σημαντική αλλοίωση της δομής του εντερικού βλεννογόνου ούτε συσσώρευση κυττάρων της φλεγμονής. Τα μεμονωμένα φλεγμονώδη κύτταρα που μπορεί να εμφανίζονται στις εικόνες (βέλη) δεν είναι αποτέλεσμα φλεγμονικής αντίδρασης αλλά πιθανά αντιπροσωπεύουν την επίδραση της χορήγησης μεγάλου αριθμού βακτηρίων στα πειραματόζωα (60). 4.2 Ανίχνευση αντισωμάτων IgA σε τομές λεπτού εντέρου Είναι γνωστό ότι τα διάφορα προβιοτικά στελέχη έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν την ανοσοβιολογική απόκριση επάγοντας την παραγωγή IgA αντισωμάτων (41,42,43). Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η δράση των στελεχών L. paracasei subsp. paracasei (DC 412), L. paracasei (G15.11) και L. acidophilus (NCFB 1748) στην επαγωγή αντισωμάτων μετά από διάστημα 10 ημερών στοματικής χορήγησης. Μετά το πέρας των χορηγήσεων τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και απομονώθηκαν ιστοί λεπτού εντέρου από αυτά. Σε τομές από τους ιστούς που απομονώθηκαν για το κάθε στέλεχος και σε τομές από ζώα μάρτυρες (εικόνα 4), πραγματοποιήθηκε η μέθοδος της ανοσοϊστοχημείας με άμεσο ανοσοφθορισμό και παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο φθορισμού για την ανίχνευση κυττάρων που παράγουν αντισώματα IgA. 35

α) Μάρτυρας β) L. acidophilus γ) DC 412 Εικόνα 3. Οπτική μικροσκοπία σε τομές λεπτού εντέρου από ζώα μάρτυρες και από ζώα στα οποία πραγματοποιήθηκε 10ημερη στοματική χορήγηση των στελεχών L. acidophilus και DC 412 36

α) Μάρτυρας β) L.acid. IgA γ) DC 412. IgA δ) G15.11. IgA Εικόνα 4. Άμεσος ανοσοφθορισμός σε τομές λεπτού εντέρου ποντικών στους οποίους έγινε δια στόματος 10ήμερη χορήγηση των διαφόρων βακτηριακών στελεχών για την ανίχνευση κυττάρων που παράγουν αντίσωμα IgA. 37