Τ.Ε.Ι. Ηπείρου Σχολή Τεχνολογίας Γεωπονίας Τμήμα Φυτικής Παραγωγής ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ IN VITRO Εργαστήριο 2 ο Υλικό Καλλιέργειας Δούμα Δήμητρα Άρτα, 2013
ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ o Ο ζυγώτης εμφανίζει ολοδυναμικότητα (totipotensy) δηλ. περιέχει στον πυρήνα του όλες εκείνες τις εντολές, οι οποίες είναι απαραίτητες για την δημιουργία των διαφόρων οργάνων. Μπορεί κάθε κύτταρο να «αποστασιοποιηθεί» και να γίνει ένας νέος ζυγώτης; o Η αναγέννηση ενός οργανισμού (= η δημιουργία ενός νέου οργανισμού από ένα μεμονωμένο κύτταρο ή από ένα ιστό ή όργανο) εξαρτάται από τον βαθμό διαφοροποίησης του κάθε κυττάρου ή ιστού ή οργάνου. o Στους ζωικούς οργανισμούς και στις ρίζες των περισσότερων φυτών, καθώς και στους διαφοροποιημένους γυρεόκοκκους η διαφοροποίηση είναι μη αναστρέψιμη. o Αντίθετα, στα περισσότερα τμήματα των φυτών η διαφοροποίηση είναι προσωρινή.
Τα τμήματα που χρησιμοποιούνται στις καλλιέργειες in vitro χωρίζονται σε: 1. Τμήματα με οργανωμένη ανάπτυξη: o o o o o o o ακραία μεριστώματα καταβολές φύλλων κοτυληδόνες μεσογονάτια διαστήματα νεαροί οφθαλμοί μικροί σπόροι καρποί Έκφυτα: μικρά όργανα ή τμήματα ιστών που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια in vitro. 2. Τμήματα με μη οργανωμένη ανάπτυξη: (μεμονωμένα φυτικά κύτταρα, πρωτοπλάστες, γυρεόκοκκοι ή ωάρια) που δίνουν ιστό στον οποίο με κατάλληλη μεταχείριση είναι δυνατό να προκαλέσουμε ανάπτυξη οργανωμένων ιστών (οργανογένεση ή μορφογένεση).
Η επιλογή του κατάλληλου εκφύτου εξαρτάται από: 1. τον τύπο της καλλιέργειας που πρόκειται να αρχίσει 2. τον σκοπό σοπότης καλλιέργειας 3. το είδος του φυτού που θα χρησιμοποιηθεί Ο σκοπός της καλλιέργειας είναι: a. Μικροπολλαπλασιασμός b. Εξυγίανση φυτικού υλικού c. Γενετική βελτίωση των φυτών d. Μελέτη φυσιολογικών φαινομένων και παραγωγή μεταβολικών παραπροϊόντων
Διάφοροι τύποι φυτικών τμημάτων για καλλιέργεια in vitro.
Α. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΟΡΓΑΝΩΜΕΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ
1. Καλλιέργεια σπόρων o Οι σπόροι σπάνια χρησιμοποιούνται σε εργασίες μικροπολλαπλασιασμού λόγω μεγάλης παραλλακτικότητας. o Εξαίρεση: σπόροι με πολύ μικρή βλαστικότητα (π.χ. invivo(ορχεοειδή) ή σε πειράματα βελτίωσης). o Από τους σπόρους παράγεται συστάδα βλαστών που με υποκαλλιέργεια δίνουν μεγάλο αριθμό φυτών. o Από τους σπόρους μπορεί να δημιουργηθεί κάλος
Μικροπολλαπλασιασμός από σπόρο.
2. Καλλιέργεια εμβρύων Ώριμων εμβρύων o Σε φυτά που το έμβρυο δεν συμφύεται με το ενδοσπέρμιο ή τις κοτυληδόνες (π.χ. ψυχανθή), αυτό απομακρύνεται με απλή αποκοπή. o Στα μονοκοτυλήδονα, μουσκεύουμε και αποστειρώνουμε τους σπόρους και μετά απομακρύνουμε με αποστειρωμένη λεπίδα το έμβρυο. Ανώριμων εμβρύων o Που παράγονται λόγω ασυμβίβαστου. o Σε προζυγωτικό ασυμβίβαστο γίνεται in vitro γονιμοποίηση.
Καλλιέργεια εμβρύου καλαμποκιού (Α: θέση του εμβρύο σε πλάγια όψη, Β: έκφυτο εμβρύου).
3. Καλλιέργεια βλαστικών κορυφών o Βλαστικές κορυφές: ακραίοι ή μασχαλιαίοι βλαστοί μήκους 5 10 mm. o Χρησιμοποιείται για in vitro πολλαπλασιασμό ξυλωδών φυτών. Στα ξυλώδη φυτά χρησιμοποιούνται κυρίως: 1. μοσχεύματα με ένα ή δύο γόνατα 2. κοιμώμενοι οφθαλμοί 3. βλαστική κορυφή
Μικροπολλαπλασιασμός από μασχαλιαίο οφθαλμό γονάτου.
4. Καλλιέργεια ακραίων μεριστωμάτων o Ακραίο μερίστωμα: πολύ μικρό τμήμα βλαστού (μήκους 0,1 0,5 mm και πλάτους 0,08 0,3 0,3 mm) με 1 2 καταβολές φύλλων και το ακραίο αραίοτμήμα του βλαστού. o Χρησιμοποιείται για εξυγίανση των φυτών από ιώσεις και άλλους o Χρησιμοποιείται για εξυγίανση των φυτών από ιώσεις και άλλους ενδοπαρασιτικούς παθογόνους μικροοργανισμούς (π.χ. πατάτα).
5. Καλλιέργεια ανθικών μεριστωμάτων o Ανθικό μερίστωμα: μεριστώματα που σε κανονικές συνθήκες θα έδιναν άνθη άθηή ανθικά αθιάτμήματα. o Σε συνθήκες in vitro μετατρέπονται σε βλαστικές κορυφές
6. Καλλιέργεια ριζών o Χρησιμοποιούνται μικρά τμήματα αμόλυντων ριζών o Τα έκφυτα λαμβάνονται από βλαστάνοντες σπόρους που έχουν αποστειρωθεί.
Β. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΜΗΜΑΤΩΝ ΜΗ ΟΡΓΑΝΩΜΕΝΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ
1. Καλλιέργεια κυττάρων o Αρχίζει με τη μεταφορά κάλου σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα από τον οποίο με ανάδευση, παρουσία ενζύμων, ζύμω, προκύπτουν απλά κύτταρα ή συσσωματώματα κυττάρων. o Από τις καλλιέργειες των κυττάρων παίρνουμε: κάλους, σωματικά έμβρυα ή βλαστούς, από τα οποία άμεσα ή έμμεσα παίρνουμε ολοκληρωμένα φυτά.
2. Καλλιέργεια πρωτοπλαστών o Πρωτοπλάστες: Στα φυτικά κύτταρα προκύπτουν με απομάκρυνση του κυτταρικού τοιχώματος. o Η απομόνωσή τους γίνεται: Μηχανικά Με πέψη Με συνδυασμό μηχανικού και ενζυμικού μηχανισμού.
2. Καλλιέργεια πρωτοπλαστών o Καλλιεργούνται σε πολύ αβαθή δοχεία o Οι πρωτοπλάστες, στην συνέχεια, παράγουν κυτταρικό τοίχωμα και το νέο φυτικό κύτταρο διαιρείται σε 3 5 μέρες. o Με την κυτταροδιαίρεση παράγεται κάλος και από κει ολοκληρωμένο φυτό. o Κατά την καλλιέργεια, είναι δυνατόν να συμβεί «μείξη πρωτοπλ αστώ ν».
2. Καλλιέργεια πρωτοπλαστών Μείξη πρωτοπλαστών μπορεί να γίνει: o μείξη του ίδιου φυτού o μείξη εντός ποικιλιών ή ειδών o μείξηειδώνήγενών
Μείξη πρωτοπλαστών.
3. Καλλιέργεια ανθήρων o Αντί να σχηματιστεί γύρη, σχηματίζονται οργανωμένα προέμβρυα ή κάλος. o Ανδρογένεση: το φαινόμενο δημιουργίας νέων, απλοειδών κυττάρων. o Με διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων τους προκύπτουν πλήρως ομοζύγωτα φυτά (ισογονικές γραμμές).
3. Καλλιέργεια ανθήρων o Η γύρη ή τα ωάρια μπορούν να δώσουν είτε «εμβρυοειδή» (άμεση ανδρογένεση) είτε κάλο (έμμεση ανδρογένεση) από τον οποίο προκύπτουν βλαστοί ή σωματικά έμβρυα. o Ο διπλασιαμός των χρωμοσωμάτων γίνεται είτε αυτόματα είτε με την επίδραση της κολχικίνης. o Το σωματικό έμβρυο προέρχεται απ τον βλαστικό πυρήνα μέσω μίτωσης.
3. Καλλιέργεια ανθήρων Στάδιο μητρικού φυτού o Απαιτείται υγιής γύρη που προέρχεται από εύρωστα και υγιή φυτά. o Τα μητρικά φυτά θα πρέπει: a) Να καλλιεργηθούν σε άριστες συνθήκες θρέψης και φωτισμού. b) Να μεταφυτευτούν πριν την καταβολή των ανθοφόρων οφθαλμών. c) Να αποφύγουν την εφαρμογή εντομοκτόνων ή μυκητοκτόνων για τις 3 4 εβδομάδες πριν τη γυρεοληψία. d) Να υποστούν γυρεοληψία στο κατάλληλο λ ανά είδος στάδιο ανάπτυξης της γύρης e) Να βρίσκονται σε νεαρό στάδιο.
4. Καλλιέργεια στύλου Ο στύλος των ανθήρων: a) Αποτελεί μητρικό ιστό. b) Είναι διπλοειδής και γενετικά όμοιος με το μητρικό φυτό. c) Για ορισμένα είδη (π.χ. εσπεριδοειδή) αποτελεί το μοναδικό τρόπο αναπαραγωγής. d) Δίνει κάλο και από εκεί σωματικά έμβρυα.
5. Καλλιέργεια κάλου o Κάλος: άμορφη μάζα κυττάρων που δεν εμφανίζουν οργανωμένη δομή ιστού ή οργάνου. o Από τον κάλο μπορούμε να πάρουμε: a) Βλαστούς άμεσα ή έμμεσα μέσω σχηματισμού σωματικών εμβρύων. b) Αιωρήματα κυττάρων, τα οποία με τη σειρά τους μπορούν να μας δώσουν κάλο ή σωματικά έμβρυα. o Το σημαντικότερο πρόβλημα στην καλλιέργεια κάλου είναι ηγενετική αστάθεια των κυττάρων του.
ΠΑΡΑΓΩΓΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΣΤΙΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΣ IN VITRO Ηιστοκαλλιέργεια σε συνθήκες in vitro ολοκληρώνεται σε 4 φάσεις: o Φάση εγκατάστασης εκφύτων in vitro. o Φάση βλαστικού πολλαπλασιασμού. o Φάση ριζογένεσης. o Φάση προσαρμογής στο περιβάλλον.
1 η Φάση: εγκατάσταση φυτικών ιστών in vitro o Παραλαβή φυτικού ιστού. o Αποστείρωση εκφύτου. o Τοποθέτηση σε κατάλληλο δοχείο και υπόστρωμα κάτω από ασηπτικές συνθήκες. o Τοποθέτηση δοχείων στο θάλαμο καλλιέργειας.
2 η Φάση: βλαστικός πολλαπλασιασμός o Έναρξη σχηματισμού βλαστών (12 εβδομάδες). o Σχηματισμός10 30 βλαστών (4 8 εβδομάδες). o Απομόνωση βλαστών σε νέο υπόστρωμα. o Παραγωγή νέων βλαστών (4 8 εβδομάδες). o Ολοκλήρωση παραγωγής βλαστών.
3 η Φάση: ριζογένεση o Τοποθέτηση βλαστών σε νέα δοχεία με θρεπτικό διάλυμα πλούσιο σε αυξίνες. o Σχηματισμός ριζιδίων (3 εβδομάδες). o Παραγωγή φυταρίων.
4 η Φάση: προσαρμογή στις φυσικές συνθήκες o Σταδιακή προσαρμογή φυταρίων (συνολικά ά 30 40 0 μέρες). o Μεταφύτευση φυταρίων σε γλαστράκια και τοποθέτηση για 10 15 μέρες σε θάλαμο υδρονέφωσης ή κατάλληλο θερμοκήπιο. o Μείωση υγρασίας προοδευτικά. o Μεταφύτευση στο φυτώριο.
ΥΠΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Η ανάπτυξη του εκφύτου μετά την τοποθέτηση του στο υπόστρωμα ακολουθεί 3 φάσεις: 1. Τη φάση προσαρμογής. 2. Τη φάση εκθετικής ανάπτυξης. 3. Τη φάση ηρεμίας (στατική). Στο τέλος της εκθετικής φάσης τα νέα φυτάρια πρέπει να μεταφερθούν σε νέο υπόστρωμα (=υποκαλλιέργεια).
Ανάπτυξη του εκφύτου μέσα στο δοχείο καλλιέργειας συναρτήσει του χρόνου.
ΥΠΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ Ηυποκαλλιέργεια: o o o Γίνεται στο θάλαμο εμβολιασμού με αποστειρωμένα εργαλεία (κάθε 15 30 μέρες). Αφορά το διαχωρισμό βλαστών και μεταφορά σε νέο θρεπτικό υπόστρωμα. Εμπεριέχει κινδύνους μόλυνσης, μετάλλαξης.