Βασικές αρχές κυτταροµετρίας ροής

Βασικές αρχές κυτταροµετρίας ροής

Κυτταροµετρία ροής Πρόκειται για πολυπαραμετρική μέθοδο ανίχνευσης 2-20 διαφορετικών παραμέτρων σε εναιώρημα κυττάρων Η κυτταροµετρία ροής (flow cytometry ) είναι µέθοδος που µετρά πολλές κυτταρικές ιδιότητες καθώς τα κύτταρα, που βρίσκονται σε εναιώρηµα, περνούν ένα-ένα από ακτίνα φωτός LASER. Η µέθοδος έχει βασιστεί στις µετρήσεις νουκλειϊκών οξέων από τους Carpenson και Schultz στη δεκαετία 1930 Coons και Kaplan σύνδεση fluorescein µε αντισώµατα Ανάπτυξη κυτταροµετρητών (Coulter, Beckman)

Βασικές αρχές τα κύτταρα σηµαίνονται µε φθορίζοντα αντισώµατα, χρωστικές ή ινχηθέτες Τα κύτταρα υποχρεούνται να περάσουν από διόδο τουλάχιστον µια φωτεινής πηγής (LASER) σε νηµατική ροή. Το προσπίπτον φως σκεδάζεται σε διαφορετικές γωνίες Φθορισµός ορισµένου µήκους κύµατος εκπέµπεται από τα φθοριοχρώµατα και τις χρωστικές Πολύπλοκο σύστηµα οπτικών καθοδηγεί το φώς στο κατάλληλο ανιχνευτή (φωτοπολλαπλασιαστής) Το φως µετατρέπεται σε ηλεκτρικό σήµα και µεταφράζεται σε παράµετρο µέσω λογισµικού

Κυτταροµετρητής ροής Υδροδυναµικό σύστηµα ροής Οπτικό σύστηµα Ηλεκτρονικό σύστηµα ανάλυσης δεδοµένων

Μονοκλωνικά αντισώµατα Kohler και Milstein (1975) : ανάπτυξη μονοκλωνικών αντισωμάτων Ηybridoma ( σύντηξη φυσιολογικού σπληνικού λεμφοκυττάρου ποντικιού με πλασματικύτταρο μυελώματος ) παραγωγή ποσότητας μονοκλωνικών αντισωμάτων Πλεονεκτήματα 1. Ομοιογένεια 2. Προβλέψιμη ειδικότητα και συγγένεια 3. Διαθέσιμα σε μεγάλα ποσά

Μονοκλωνικά αντισώµατα Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigens Στα µόρια δίνεται ένα όνοµα ακολουθούµενο από το όνοµα CD (clusters of differentiation) 300 CD

Πλεονεκτήµατα Ανάλυση µεγάλου αριθµού κυττάρων Μικρός χρόνος ανάλυσης Ταυτόχρονη ανίχνευση µέχρι και 12 παραµέτρων Ανίχνευση ελάχιστου αριθµού κυττάρων

Eφαρµογές Ανοσοφαινότυπος στις αιµατολογικές κακοήθειες ( λευχαιµία, λέµφωµα) : διάγνωση, σταδιοποίηση, παρακολούθηση υπολειµµατικής νόσου Ανοσοφαινότυπος για αναγνώριση λεµφοκυτταρικών πληθυσµών ( µέτρηση CD4 λεµφοκυττάρων σε ασθενείς µε HIV, αναγνώριση ανοσοανεπάρκειας, υποπληθυσµοί λεµφοκυττάρων, ανίχνευση επιφανειακών πρωτεινών) Μεταµοσχεύση stem cells Ανάλυση κυτταρικού κύκλου Άλλες ερευνητικές εφαρµογές

Υδροδυναµικό σύστηµα

Forward scatter

Side scatter

Optical Path XL

Forward and side scatter Neutrophils Forward Scatter (Size) Lymphocytes Monocytes Side Scatter (granularity)

Fluorescence Channels

Ιστόγραµµα δύο παραµέτρων -/+ +/+ -/- +/-

Gating Forward Scatter (Size) Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter (granularity)

Bone marrow CFU- GM CD13, CD34, CD33, CD38, CD117 pluripotent S tem C ell CD34, CDw90, Thymus CFU- M CD13 CD33 CDw65 CD117 Monoblas t CD13 CD15 CD33 CDw65 unreifer Monozyt CD13 CD33 CD64 CDw65 Monoz yt CD13 CD15 CD64 CDw65 Blood CFU- G CD13 CD33 CDw65 CD117 cmpo Myeloblas t CD13 CD33 CDw65 CD117 cmpo Myeloz yt CD13 CD33 CD15 CDw65 cmpo Metamyeloz yt CD13 CD33 CD15 CD65s cympo Granulozyt CD15 CD16 CD65s cympo CFU- Meg CD34 CD33 Meg akoryblas t CD34 CD61 Meg akoryz yt CD41 CD42 CD61 Thrombozyt CD41 CD42 CD61 CFU- E CD34 CD33 Erythroblast CD34 CD36 Retikulozyt CD36 Glyko A Erythrozyt Glyko A? NK- Zelle +/- CD2 CD7 CD8 CD16 CD56 +/- CD57 prä- prä- B- Zelle CD19 ccd22 CD34 ccd79a TdT prä- B- Zelle CD19 CD22 CD24 ccd79a cm unreife B- Zelle CD10 CD19 CD20 CD22 CD24 CD79a IgM B- Lymphozyt CD19 CD20 CD22 CD24 CD79a IgM/IgD CD34, TdT subkortikaler Thymozyt ccd3 CD5 CD7 CD34 TdT cortiklaer Thymozyt CD1 +/- CD2 ccd3 CD5 CD7 medullärer Thymozyt CD2 CD3 CD5 CD7 +/- CD4 +/- CD8 T- Lymphozyt CD2 CD3 CD5 CD7 +/- CD4 +/- CD8

Παραδείγµατα ανοσοφαινότυπου οξειών λευχαιµιών

Γυναίκα 64 ετών µε αναιµία και θροµβοπενία µυελόγραµµα

Οξεία µυελογενής λευχαιµία HLADR, CD13, CD34, CD38 θετικά CD33, CD71 ασθενώς θετικά CD7, CD11b µερικώς θετικά

Άνδρας 35 ετών µε πανκυτταροπενία, λάµβανε NSAIDS λόγω ιερολαγονίτιδας, εικόνα DIC και 5% προµυελοκύτταρα στο µυελό των οστών, µυελόγραµµα µε προµυελοκύτταρα µε ραβδία Auer

Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία MPO+, CD13+, CD33+ CD2-,CD3-,CD7-PAN-B HLA-DR-, CD34-, TdT-, CD38+ (dim), CD71+(dim)

Άνδρας 54 ετών µε εµπύρετο, τραχηλική λεµφαδενοπάθεια, αναιµία και θροµβοπενία Μυελόγραµµα µε διήθηση από βλάστες

Οξεία µυελογενής λευχαιµία MPO+, CD13+, CD33+, CD14-,CD15+, CD7+/_, CD3-,CD2-, CD19-,CD34-, HLA-DR+