ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΕΥΡΟΥΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΚΟΡΥΦΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗ ΔΙΑΧΥΣΗΣ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC)

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΕΥΡΟΥΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΩΝ ΚΟΡΥΦΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗ ΔΙΑΧΥΣΗΣ ΣΤΗΝ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (HPLC ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑΣ: ΧΡΥΣΟΣΤΟΜΗ ΖΗΣΗ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Π. ΝΙΚΗΤΑΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 8

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος 3. Εισαγωγή 4. Γενικά 4. Ιστορική αναδρομή 4.3 Η χρωματογραφική διαδικασία 4.4 Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC 8.5 Οργανολογία υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης.6 Βασικές σχέσεις 3.7 Διαχωριστική ικανότητα 6.8 Μοντέλα χρωματογραφικών κορυφών. Πειραματικό μέρος 3. Όργανα 3. Αντιδραστήρια 3.3 Πειραματική διαδικασία 3 3. Ανάλυση δεδομένων 36 4. Αποτελέσματα και συζήτηση 39 Α. Μεταβολές του εύρους των κορυφών 39 4. Επίδραση της χρωματογραφικής στήλης 39 4. Επίδραση της σύστασης της κινητής φάσης 48 4.3 Επίδραση της θερμοκρασίας 55 Β. Μεταβολές του συντελεστή διάχυσης 59 4.4 Επίδραση της στατικής φάσης της χρωματογραφικής στήλης 59 4.5 Επίδραση της σύστασης της κινητής φάσης 6 4.6 Επίδραση της θερμοκρασίας 7 5. Συμπεράσματα 7 Βιβλιογραφία 74

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC είναι μια χρωματογραφική μέθοδος με ευρεία εφαρμογή τόσο σε επίπεδο εργαστηρίου όσο και σε βιομηχανική κλίμακα. Χρησιμοποιείται σε διάφορες επιστήμες όπως ιατρική, βιοχημεία, χημεία τροφίμων κ.α. Η απλότητα και η αξιοπιστία της μεθόδου αυτής καθώς και η επαναληψιμότητα των μετρήσεων έχει σαν αποτέλεσμα την χρήση της σε όλο και περισσότερους τομείς. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι μεταβολές του εύρους των κορυφών χρωματογραφημάτων και του συντελεστή διάχυσης για διάφορες θερμοκρασίες, συγκεντρώσεις της κινητής φάσης και για διαφορετική χρωματογραφική στήλη. Αλλάζοντας, λοιπόν, αυτές τις τρεις παραμέτρους και με την χρήση του excel καταγράφονται οι τιμές του εύρους και του συντελεστή διάχυσης από χωματογραφήματα που λήφθηκαν στο εργαστήριο της Φυσικής Χημείας και προσαρμόζονται οι πειραματικές τιμές τους σε θεωρητικές εξισώσεις. Σκοπός της εργασίας είναι να μελετηθεί η επίδραση των παραμέτρων αυτών στο εύρος των κορυφών και στον συντελεστή διάχυσης και να βρεθούν σχέσεις που να περιγράφουν τις μεταβολές αυτές όσο τον δυνατόν πιο ικανοποιητικά. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Καθηγητή Π. Νικήτα για την δυνατότητα που μου έδωσε να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο θέμα, για την πολύτιμη βοήθειά του και για την υπομονή που έδειξε έτσι ώστε να ολοκληρωθεί η εργασία αυτή. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Α. Παππά για την βοήθειά της και την υποστήριξή της κατά την εκπόνηση της μεταπτυχιακής μου εργασίας, καθώς επίσης και τον Επίκουρο Καθηγητή Σ. Σωτηρόπουλο για την συνεργασία του. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την Π. Αγραφιώτου και την Π. Μπαλκατζοπούλου, των οποίων τα πειραματικά δεδομένα χρησιμοποίησα, για την συνεργασία τους και την βοήθειά τους.

4. ΕΙΣΑΓΩΓΗ. Γενικά Η υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC ανήκει στις χρωματογραφικές τεχνικές, έτσι ο διαχωρισμός ενώσεων ή ιόντων είναι αποτέλεσμα συνδυαστικής δράσης μιας στατικής και μιας κινητής φάσης. Πιο συγκεκριμένα, διαχωρίζονται καθώς εισέρχονται και διαπερνούν την στήλη, λόγω της διαφορετικής κατανομής τους μεταξύ της υγρής κινητής φάσης και της στατικής φάσης. Η μέθοδος αυτή χαρακτηρίζεται από μεγάλη ακρίβεια και επαναληψημότητα.. Ιστορική Αναδρομή Το έτος 3 η χρωματογραφία συμπλήρωσε χρόνια. Τον Μάρτιο του 93 ο Mikhail Semenovich Tswett, βοηθός στο Πανεπιστήμιο της Βαρσοβίας παρουσίασε τα αποτελέσματα της μελέτης του πάνω στις χρωστικές των φύλλων. Η προσπάθεια του αυτή οδήγησε στην ανάπτυξη μιας ειδικής τεχνικής προσρόφησης η οποία επέτρεψε τον διαχωρισμό των χρωστικών των φύλλων. Τα επόμενα χρόνια αφιερώθηκε σε αυτή την τεχνική που αργότερα έγινε γνωστή ως χρωματογραφία. Αρκετά χρόνια μετά αναπτύχθηκε και η υγρή χρωματογραφία. Η κύρια διαφορά ανάμεσα στην υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC και στην κλασσική υγρή χρωματογραφία (LC είναι χρησιμοποιεί πολύπλοκη οργανολογία ενώ η δεύτερη όχι, έτσι στη δεύτερη η επαναληψιμότητα είναι θέμα αναλυτή και όχι θέμα τεχνικής, αν και πλέον έχουν σημειωθεί βελτιώσεις στην αυτοματοποίηση της..3 Η Χρωματογραφική Διαδικασία Ένας υποθετικός διαχωρισμός μίγματος δύο ενώσεων μπορεί να απεικονιστεί στα παρακάτω σχήματα. Οι ενώσεις αυτές αναπαρίστανται με διαφορετικό χρώμα (μπλε και κόκκινο. Στο σχήμα φαίνονται το μίγμα μετά την εισαγωγή του στην στήλη:

5 Σχήμα Σχήμα

6 Η ροή της κινητής φάσης μέσα στη στήλη έχει σαν αποτέλεσμα την κίνηση των ενώσεων του μίγματος με διαφορετική ταχύτητα μέσα σε αυτή μέχρι να επιτευχθεί ο πλήρης διαχωρισμός του (σχήμα. Έτσι γίνονται πλέον εμφανείς οι δύο ενώσεις. Η ένωση που απεικονίζεται με μπλε χρώμα κινείται πιο γρήγορα μέσα στην στήλη με αποτέλεσμα να εξέρχεται πρώτη από αυτή. Έτσι στο χρωματογράφημα αρχίζει να εμφανίζεται η πρώτη κορυφή η οποία αντιστοιχεί σε αυτή την ένωση (μπλε την στιγμή που αυτή εξέρχεται από την στήλη (Σχήμα 3. Σχήμα 3 Τέλος, αφού εξέλθει και η δεύτερη ένωση από την στήλη εμφανίζεται και η δεύτερη κορυφή (Σχήμα 4.

7 Σχήμα 4 Γενικά τα μόρια των συστατικών του μίγματος προσροφώνται στα σωματίδια της στατικής φάσης με αποτέλεσμα να παραμένουν ακίνητα. Όταν μέσα στη στήλη εισέλθει ο διαλύτης (έκλουση τότε αυτά λόγω της διαφορετικής κατανομής τους στην στατική και στην κινητή φάση κινούνται με διαφορετική ταχύτητα με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται. Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι δεδομένου ότι ο κύριος όγκος του διαλύτη (S δεν προσροφάται, κινείται με την μεγαλύτερη δυνατή ταχύτητα. Η κατανομή δύο συστατικών, Α και Β, ανάμεσα στην κινητή φάση και σε ένα σωματίδιο στατικής φάσης φαίνεται στο παρακάτω σχήμα:

8 S Κινητή Φάση Β Β A A Στατική φάση Σχήμα 5 Κατανομή συστατικών Α και Β ανάμεσα στην κινητή φάση και σε ένα σωματίδιο στατικής φάσης. Φαίνεται, λοιπόν, ότι το συστατικό Β στην ισορροπία παρουσιάζεται κυρίως στην στατική φάση και μόνο ένα μικρό ποσοστό αυτού παρασύρεται από τον διαλύτη σε κάθε χρονική στιγμή. Το ακριβώς αντίθετο συμβαίνει για το συστατικό Α. Η ταχύτητα με την οποία κάθε συστατικό x κινείται μέσα στη στήλη, u x, καθορίζεται από τον αριθμό των μορίων του που βρίσκονται στην κινητή φάση σε κάθε χρονική. Εφόσον το συστατικό Β βρίσκεται σε μικρό ποσοστό στην κινητή φάση θα κινείται με μικρότερη ταχύτητα μέσα στην στήλη σε σχέση με το Α. Δηλαδή θα ισχύει: u A > uβ. Επίσης η διαφορετική ταχύτητα τους μέσα στη στήλη εξαρτάται από την σύσταση της κινητής φάσης, τη σύσταση της στατικής φάσης και από την θερμοκρασία..4 Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης (HPLC Οι χρωματογραφικοί διαχωρισμοί μιγμάτων διαφόρων ουσιών βασίζονται στην κατανομή των ουσιών μεταξύ μιας στατικής (stationary και μιας κινητής (mobile φάσης, που βρίσκονται σε μια χρωματογραφική στήλη. Η κινητή φάση κινείται κατά μήκος της στήλης, παρασύροντας κάθε ένωση με διαφορετική ταχύτητα. Οι διαφοροποιήσεις αυτές μπορεί να βασίζονται σε ιδιότητες των ουσιών, όπως το σημείο βρασμού, η πολικότητα, το ηλεκτρικό φορτίο (για τις ιοντικές ενώσεις, το μέγεθος του μορίου κ.λπ. Εάν στην έξοδο της χρωματογραφικής στήλης υπάρχει ένα σύστημα για την ανίχνευση και μέτρηση της ποσότητας κάθε εκλουόμενου

9 συστατικού, τότε είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός κάθε διαχωριζόμενου συστατικού. Με την αντλία υψηλής πίεσης το μίγμα περνά μέσα από την στήλη και διαχωρίζεται στα διάφορα συστατικά του. Έτσι, λοιπόν, κάτω από σωστά επιλεγμένες πειραματικές συνθήκες, τα διάφορα συστατικά του μίγματος σχηματίζουν ζώνες κατά μήκος της στήλης και εξέρχονται από αυτή ανάλογα με την πολικότητα τους σε σχέση με το εκλουστικό σύστημα. Κάτω από ιδανικές συνθήκες οι ταινίες των διαφόρων συστατικών που ανιχνεύονται από τον ανιχνευτή, αποτυπώνονται στο καταγραφικό σύστημα σαν καμπύλη Gauss. Πιο συγκεκριμένα η συγκέντρωση μιας ουσίας του μίγματος μεταβάλλεται με την απόσταση που διανύει αλλά και με τον χρόνο. Στο επόμενο σχήμα φαίνεται η συγκέντρωση μιας χρωματογραφούμενης ουσίας κατά μήκος της στήλης σε μια ιδανική και σε μια πραγματική χρωματογραφική στήλη. Σχήμα 6 Η αριστερή κατανομή αποδίδει την ιδανική περίπτωση άμεσης αποκατάστασης ισορροπίας κατανομής μιας ουσίας μεταξύ των φάσεων. Στην περίπτωση αυτή ο λόγος κατανομής ισχύει σε κάθε σημείο της στήλης. Η δεξιά κατανομή αποδίδει μια πιο πραγματική κατάσταση, όπου η ατελής εξισορρόπηση προκαλεί την εμφάνιση ουράς στη χρωματογραφική κορυφή. Το πόσο έντονη είναι αυτή η ανάπτυξη ουράς εξαρτάται από την ποιότητα της χρωματογραφικής στήλης (γεωμετρικά χαρακτηριστικά ως και από τις τρέχουσες συνθήκες διαχωρισμού (π.χ. ταχύτητα κινητής φάσης, θερμοκρασία. Η εξάρτηση της συγκέντρωσης των ουσιών του μίγματος από την απόσταση μέσα στη χρωματογραφική στήλη και από τον χρόνο μπορεί να γίνει πιο κατανοητή από τα παρακάτω σχήματα.

Σχήμα 7 Διαχωρισμός πέντε ενώσεων Φάση Σχήμα 8 Διαχωρισμός πέντε ενώσεων Φάση

Σχήμα 9 Διαχωρισμός πέντε ενώσεων Φάση 3 Σχήμα Διαχωρισμός πέντε ενώσεων Φάση 4 Στο σχήμα 7 εισάγεται στη χρωματογραφική στήλη μίγμα πέντε ενώσεων οι οποίες σχεδιάζονται με διαφορετικό χρώμα η καθεμία. Καθώς αυτές κινούνται μέσα στη στήλη διαχωρίζονται και η συγκέντρωση τους κάθε χρονική στιγμή μπορεί να παρασταθεί με μια καμπύλη σαν αυτή που υπάρχει στο πάνω μέρος του κάθε σχήματος. Δηλαδή για συγκεκριμένη χρονική στιγμή η μέγιστη ποσότητα της κάθε

ουσίας παρουσιάζεται σε συγκεκριμένη θέση στη στήλη. Στα σχήματα 8 και 9 καταγράφονται οι κορυφές του χρωματογραφήματος καθώς οι ενώσεις εξέρχονται από την στήλη. Τέλος, στο σχήμα δίνεται η πλήρης μορφή του χρωματογραφήματος..5 Οργανολογία Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Πίεσης Το παρακάτω σχήμα απεικονίζει τα όργανα που χρησιμοποιούνται στην HPLC: Σχήμα Οργανολογία HPLC Πιο συγκεκριμένα το σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης αποτελείται από: Φιάλες αποθήκευσης διαλυτών (mobile phase reservoirs Αντλία (pump Μονάδα εισαγωγής δείγματος (injector Προστήλη, όχι απαραίτητα (guard column Χρωματογραφική στήλη (analytical column Ανιχνευτής (detector Σύστημα συλλογής και καταγραφής αποτελεσμάτων (computer

3 Οι διαλύτες πρέπει αρχικά να απαερωθούν για να μην εισέλθουν φυσαλίδες στην αντλία, την στήλη ή τον ανιχνευτή, πράγμα που θα σημαίνει ότι θα αλλοιωθεί η μέτρηση. Ο διαλύτης-κινητή φάση αντλείται με σκοπό να εισαχθεί στην στήλη. Το μίγμα των ενώσεων εισάγεται επίσης στη στήλη με ένεση και αφού διαχωριστεί καταγράφεται η μέτρηση σε υπολογιστή..6 Βασικές Σχέσεις Η μέση τιμή της ταχύτητας των μορίων του διαλύτη, < u >, και της ταχύτητας ενός συστατικού x του μίγματος μέσα στη στήλη, σχέση: u x, συνδέονται με την παρακάτω u x = u ( όπου είναι το κλάσμα των μορίων του συστατικού x στην κινητή φάση, δηλαδή: m = ( n s n + n m Εάν το κλάσμα των μορίων του συστατικού x στην κινητή φάση είναι μηδέν ( = σημαίνει ότι αυτό δεν κινείται μέσα στην στήλη και άρα ισχύει u =. Εάν όμως = σημαίνει ότι τα μόρια του συστατικού x κινούνται μέσα στη στήλη με την ταχύτητα του διαλύτη, δηλαδή u x = u. Το κλάσμα των μορίων του x στην κινητή φάση,, μπορεί να εκφραστεί και με τον εξής τρόπο: Θεωρούμε τον παράγοντα n k ' = s, όπου n n m είναι ο αριθμός των μορίων του συστατικού x στην κινητή φάση και n s στην στατική. Έτσι ισχύει: m x n n k + n n s m + = (3 m m οπότε σε συνδυασμό με την σχέση (:

4 = + k (4 και τελικά: u u = x + k (5 Η ποσότητα u x μπορεί να συσχετιστεί με τον χρόνο που απαιτείται για να εμφανιστεί η κορυφή στο χρωματογράφημα, L (απόσταση που διανύουν τα μόρια: t, και το μήκος της στήλης, L t = (6 u x Όμοια ο χρόνος που απαιτείται να για να κινηθούν τα μόρια του διαλύτη από την μια άκρη της στήλης στην άλλη είναι: L t ο = (7 u Αντικαθιστώντας την σχέση (7 στην σχέση (6 προκύπτει: ut o t = (8 u x Η οποία σε συνδυασμό με την σχέση (4 δίνει: ( k t = to + (9 Εδώ ο χρόνος που εμφανίζεται η κορυφή, t, δίνεται σαν συνάρτηση των παραμέτρων t o και k και για k = ισχύει t = to. Εφόσον το t o εξαρτάται από την ταχύτητα του διαλύτη σημαίνει ότι και το t εξαρτάται από αυτήν επίσης. Ο παράγων

5 k είναι σταθερός για συγκεκριμένη στήλη, κινητή φάση, θερμοκρασία και συστατικό x. Συνεπώς το t καθορίζεται από το συστατικό x για συγκεκριμένο χρωματογραφικό σύστημα και η μέτρησή του χρησιμοποιείται για την ποιοτική του ανίχνευση. Η παράμετρος της στήλης to μπορεί να υπολογιστεί με διάφορους τρόπους. Συνήθως για τη θέση του t o χρησιμοποιείται ένας αδύναμος διαλύτης, δηλαδή ένας διαλύτης που δεν συγκρατείται από την στατική φάση της στήλης, για παράδειγμα MeOH ή H O, που εισάγεται με ένεση στην στήλη και η τιμή t της κορυφής που εμφανίζεται στο χρωματογράφημα θεωρείται ότι αντιστοιχεί στο t o. Το εύρος στο % του ύψους των κορυφών,, στην υγρή χρωματογραφία μπορεί να συσχετιστεί με τον αριθμό των θεωρητικών πλακών, Ν: N t = 6 ( Η ποσότητα Ν είναι σταθερή για τις διάφορες κορυφές στο χρωματογράφημα, δηλαδή για συγκεκριμένη στήλη, κινητή φάση, ροή κινητής φάσης και θερμοκρασία. Επίσης ο αριθμός των θεωρητικών πλακών εκφράζει την ικανότητα της στήλης, δηλαδή την ικανότητα να δίνει η στήλη κορυφές με μικρό εύρος και ικανοποιητικά διαχωρισμένες. Δεδομένου ότι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών είναι σταθερός για τις διάφορες κορυφές ενός χρωματογραφήματος, από την σχέση ( προκύπτει ότι το εύρος της κορυφής, w, αυξάνεται με τον χρόνο, t. Βέβαια υπάρχουν και κάποιες εξαιρέσεις. Με την αύξηση του εύρους μιας κορυφής με τον χρόνο εμφάνισης της παρουσιάζεται μια ελάττωση στο ύψος της. Η ποιότητα της στήλης χαρακτηρίζεται από την ικανότητα της για διαχωρισμό ή από το ύψος των θεωρητικών πλακών HEPT: L H = ( N Όπου L το μήκος της στήλης σε cm, Ν ο αριθμός των θεωρητικών πλακών και Η το μέσο ύψος των θεωρητικών πλακών.

6 Ο γενικός τύπος υπολογισμού της ικανότητας της στήλης είναι: V r Ν = α ( Όπου V r ο όγκος συγκράτησης, το εύρος της καμπύλης Gauss και α μια σταθερά αναλογίας. Η ικανότητα της στήλης εξαρτάται από τη σύσταση του διαλύτη έκλουσης, από τη γραμμική του ταχύτητα, από την θερμοκρασία και από τη μέθοδο αποτίμησης της καμπύλης Gauss..7 Διαχωριστική ικανότητα Διαχωριστική ικανότητα, s, μιας στήλης είναι η ικανότητα που έχει η στήλη να διαχωρίζει δύο ή και περισσότερα συστατικά. Έτσι η ποιότητα του διαχωρισμού μπορεί να μετρηθεί με την διαχωριστική ικανότητα. Πιο συγκεκριμένα δύο κορυφές που επικαλύπτονται σε μεγάλο βαθμό έχουν μικρή τιμή s : ( t t ( s = (3 + όπου t και t είναι οι χρόνοι που εμφανίζονται οι δύο γειτονικές κορυφές των οποίων την διαχωριστική ικανότητα υπολογίζουμε και και είναι τα εύρη των κορυφών στην βάση τους. Η σχέση (3 μπορεί εύκολα να χρησιμοποιηθεί για να υπολογιστεί η διαχωριστική ικανότητα σε κορυφές που είναι ικανοποιητικά διαχωρισμένες, δηλαδή όταν ισχύει, 5. Σε όλες τις άλλες περιπτώσεις είναι δύσκολο να μετρηθεί το s εύρος της βάσης της κορυφής. Για αυτό το λόγο χρησιμοποιείται το εύρος στο μισό του ύψους της κορυφής. Αν συμβολίσουμε αυτή την ποσότητα με w και w τότε ισχύει: ( t t ( w w =,8 s + (4

7 Η μορφή ενός χρωματογραφήματος δύο κορυφών με διάφορες τιμές του s δίνονται στα παρακάτω σχήματα. Σχήμα Καμπύλες διαχωριστικής ικανότητας για κορυφές με λόγο υψών : Σχήμα 3 Καμπύλες διαχωριστικής ικανότητας για κορυφές με λόγο υψών :

8 Σχήμα 4 Καμπύλες διαχωριστικής ικανότητας για κορυφές με λόγο υψών 4: Σχήμα 5 Καμπύλες διαχωριστικής ικανότητας για κορυφές με λόγο υψών 8:

9 Σχήμα 6 Καμπύλες διαχωριστικής ικανότητας για κορυφές με λόγο υψών 6: Για τα χρωματογρφήματα που έχουν περισσότερες από μία κορυφές η τιμή της διαχωριστικής ικανότητας για κάθε ζευγάρι γειτονικών κορυφών είναι διαφορετική. Έτσι δίνεται έμφαση κυρίως στο ζευγάρι των κορυφών που αντιστοιχεί στα συστατικά που μας ενδιαφέρουν και παράλληλα παρουσιάζουν την μικρότερη τιμή s. Αλλαγή σε κάποια πειραματικά δεδομένα μπορεί να δώσει διαφορετική τιμή διαχωριστικής ικανότητας. Έτσι ένα ζευγάρι κορυφών που κάτω από ορισμένες συνθήκες δίνουν μικρό s μπορεί κάτω από άλλες συνθήκες να διαχωρίζονται ικανοποιητικά. Λόγω αυτής της συμπεριφοράς είναι χρήσιμο να γίνεται διάγραμμα της διαχωριστικής ικανότητας σαν συνάρτηση των διαφόρων συνθηκών. Είναι σημαντικό να λαμβάνεται υπόψη η s τόσο για κορυφές που βρίσκονται πολύ κοντά όσο και για κορυφές που απέχουν περισσότερο, δηλαδή που έχουν μεγάλη τιμή διαχωριστικής ικανότητας. Αυτό φαίνεται καθαρά στα παρακάτω παραδείγματα. Στο σχήμα 7α η s για τις δύο πρώτες κορυφές είναι μικρή σε αντίθεση με την s για τις κορυφές και 3. Κάτω όμως από διαφορετικές συνθήκες (σχήμα 7b ενώ η τιμή της s για τις κορυφές και παραμένει σταθερή για τις κορυφές και 3 αυξάνεται. Η σημασία αυτού έγκειται στο γεγονός ότι στην πρώτη περίπτωση μειώνεται ο χρόνος λήψης του χρωματογραφήματος. Όμοια στα σχήματα 7c και 7d. Εάν δεν είναι γνωστός ο αριθμός των συστατικών στο μίγμα, με μια πρώτη ματιά φαίνεται ότι στο σχήμα 7d ο διαχωρισμός είναι καλύτερος εφόσον οι τιμές της s είναι μεγάλες. Κάτω όμως από διαφορετικές συνθήκες (σχήμα 7c

εμφανίζεται μια επιπλέον κορυφή που επικαλύπτεται εν μέρει με την γειτονική της (μικρή s. Έτσι το χρωματογράφημα αυτό δίνει πιο ικανοποιητικά αποτελέσματα αφού θεωρείται ότι για το σχήμα 7d ισχύει s =. Σχήμα 7 Παραδείγματα για την σημασία υπολογισμού s.8 Μοντέλα Χρωματογραφικών Κορυφών Το σχήμα των κορυφών ενός χρωματογραφήματος είναι πολύ σημαντικό λόγω του ότι αυτές προκύπτουν από διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα μέσα στη στήλη. Εάν βρεθεί ένα μοντέλο το οποίο μπορεί να περιγράψει όλες τις κορυφές θα ήταν χρήσιμο τόσο για την μελέτη των κορυφών που δεν διαχωρίζονται καλά όσο και για την αποκόμιση επιπλέον πληροφοριών από αυτές. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, μετά την εισαγωγή ενός μίγματος ενώσεων στη στήλη αυτές διαχωρίζονται και εμφανίζουν στο χρωματογράφημα μια καμπύλη που έχει την κωδωνοειδή μορφή, καμπύλη Gauss.

Για θεωρητική μελέτη του σχήματος των κορυφών θεωρούμε σωλήνα διατομής Α (που για την περίπτωση της χρωματογραφίας είναι η χρωματογραφική στήλη μέσα στον οποίο κινείται ποσότητα ουσίας με φορά ίδια με τη θετική φορά του άξονα των x. Η συγκέντρωση του συστατικού μεταβάλλεται κατά τη θετική φορά του άξονα των x. Σε κάθε σημείο x η συγκέντρωση δεν είναι σταθερή ως προς το χρόνο t. Επομένως, η συγκέντρωση είναι συνάρτηση του x και του t, c c( x, t. z area A J x y x J x+dx x+dx Σχήμα 8 Σωλήνας ροής διατομής Α. x Η χρονική μεταβολή της συγκέντρωσης της ουσίας σε ένα στοιχείο όγκου που ορίζεται από τις συντεταγμένες x και x+dx είναι: c t = dj dx (5 όπου J είναι η ποσότητα της ουσίας που ρέει κάθετα προς την μοναδιαία επιφάνεια στην μονάδα του χρόνου. Από την (5 προκύπτει η σχέση: c t = u x c c + x x (6

η οποία είναι γνωστή ως εξίσωση διάχυσης, όπου u x η ταχύτητα του συστατικού που οφείλεται στην επίδραση εξωτερικών πεδίων και στη μακροσκοπική κίνηση του μέσου μέσα στο οποίο βρίσκονται και κινούνται τα μόρια της ουσίας και ο συντελεστής διάχυσης της ουσίας. Αν η ουσία καθώς διατρέχει το σωλήνα δεν αντιδρά, ούτε εισάγεται ή εξάγεται ποσότητα ουσίας τότε θα ισχύει + n c( x, y dx = (7 A όπου ο λόγος A n είναι η ποσότητα της ουσίας ανά μονάδα επιφάνειας (της εγκάρσιας n διατομής. Για λόγους απλούστευσης θα θεωρούμε από εδώ και πέρα ότι = A συνεπώς προκύπτει: και + c ( x, y dx = (8 Υποθέτουμε ότι αρχικά η ζώνη του συστατικού εκτελεί μονοδιάστατη κίνηση κατά την θετική φορά του άξονα x. Το προφίλ της συγκέντρωσης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω είναι μια κωδωνοειδής καμπύλη. Στην αρχή του χρόνου t =, η ζώνη βρίσκεται στην αρχή του άξονα x και έχει την μορφή δ συνάρτησης. Ορίζουμε νέο σύστημα συντεταγμένων που κινείται προς το αρχικό με ταχύτητα u x και τη στιγμή t = βρίσκεται στη θέση x =. Στο νέο σύστημα συντεταγμένων η συγκέντρωση είναι συνάρτηση του χρόνου, t, και της μεταβλητής y που συνδέεται με την μεταβλητή x με την σχέση διαφορικό της συγκέντρωσης: y = x u t, δηλαδή c c( y, t. Το ολικό x c c dc = dt + dy (9 t y y t

3 Από την σχέση (9 παίρνουμε: t x y x y c u t c t c = ( Επίσης ισχύει: t t y c x c = ( και t t y c x c = ( Από τις σχέσεις (5, (, ( και ( παίρνουμε: t y y c t c = (3 Θεωρούμε ότι η συγκέντρωση μπορεί να γραφτεί με την μορφή: ( ( exp (, ( y t g y F t y c = (4 όπου F t F ( και g t g ( είναι συναρτήσεις του χρόνου. Οι μερικές παράγωγοι της συνάρτησης είναι: + = dt df F dt dg y c t c y (5

4 c y t = c ( g + 4g y (6 Αντικαθιστώντας αυτές στην εξίσωση (5 προκύπτει: dg dt F df dt y + = + 4 (7 g g y Για να ισχύει η σχέση (7 για κάθε y πρέπει: dg = dt 4g (8 και κατά συνέπεια df = g (9 F dt Η εξίσωση (8 γράφεται: dg = 4dt = 4t + const = 4t (3 g g g διότι πρέπει lim g( t. t Επίσης η (9 μπορεί να γραφεί: F df dt = t df F = dt t ln F = ln const t F const = t (3 Τελικά η (4 παίρνει την μορφή: const y c = exp (3 t 4t

5 Όμως πρέπει + n c ( y, t dy = οπότε προκύπτει ότι η σταθερά const θα ισούται με: A n const = (33 A( 4π και τελικά: c = A ( 4πt y exp 4t (34 Για να είναι όμως η συνάρτηση c c( x, t λύση της εξίσωσης (6 και της δ συνάρτησης στην αρχή του χρόνου γράφεται: c ( x, t = ( 4πt exp ( x u t 4t x (35 Επειδή μια χρωματογραφική κορυφή καταγράφεται στο τέλος της στήλης, δηλαδή όταν x = L οπότε t = t, για την εξίσωσή της θα έχουμε: y(t c(l,t y(t ( L uxt exp / ( 4πt 4t y(t ( 4πt / ( L / ux t exp 4t / u x, ισχύει όμως: t = L / u x

6 και συνεπώς: y(t ( 4πt / ( t t exp 4t / u x y(t ( t t exp / ( 4πt σ (36 Όπου σ = t / ux = t t / L (37 Στο παρακάτω σχήμα δίνεται η γραφική παράσταση στην οποία ο άξονας x αναφέρεται η απόσταση που διανύει η ουσία και ο άξονας y στην συγκέντρωση. C σ w=4σ x Σχήμα 9 Γραφική απεικόνιση της απόστασης ως προς την συγκέντρωση της ουσίας στην στήλη. Χρωματογραφική καμπύλη τύπου Gauss. Σύμφωνα λοιπόν με τα παραπάνω, η διακύμανση, σ, είναι ανάλογη του συντελεστή διάχυσης,. Ωστόσο, σε μία χρωματογραφική στήλη η διάχυση δεν είναι ο μοναδικός μηχανισμός διεύρυνσης της κορυφής αλλά υπάρχουν και άλλοι

7 μηχανισμοί στατιστικής φύσης που συμπεριφέρονται όμοια με τη μοριακή διάχυση (diffusion-like processes. Δεδομένου δε ότι το προφίλ της συγκέντρωσης είναι μία καμπύλη τύπου Gauss, μπορούμε να εισαγάγουμε τον ενεργό (ή αποτελεσματικό συντελεστή διάχυσης T (effective diffusion coefficient που θα συνδέεται με την ενεργό τυπική απόκλιση σ Τ με τη σχέση (37. Λόγω της γνωστής σχέσης της στατιστικής για διακυμάνσεις ανεξάρτητων τυχαίων μεταβλητών προκύπτει ότι σ = σ + σ + σ +... και T = + +... όπου οι δείκτες,,3, Τ 3 3 + αναφέρονται στους μηχανισμούς διεύρυνσης της ζώνης. Οι μηχανισμοί που συμβάλουν στην αύξηση του εύρους των κορυφών/ζωνών είναι στατιστικής φύσης και συμπεριφέρονται όμοια με τη διάχυση. Αυτοί είναι οι εξής:. Μοριακή διάχυση (longitudinal molecular diffusion: Η επίδραση της μοριακής διάχυσης είναι σημαντικός παράγοντες κυρίως σε χαμηλές ταχύτητες κινητής φάσης.. Στροβιλώδης διάχυση (eddy diffusion or multiple flowpaths: Οφείλεται στις διαφορετικές διαδρομές που ακολουθεί η κινητή φάση ανάμεσα από τα διάφορα σωματίδια της πακτωμένης στήλης. Η ταχύτητα της κινητής φάσης εξαρτάται από το εύρος της διαδρομής. Έτσι, όσο πιο στενή η διαδρομή τόσο πιο αργά κινείται η κινητή φάση. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τα μόρια που ακολουθούν διαφορετικές ροές να μη διανύουν το ίδιο διάστημα στον ίδιο χρόνο. 3. Μεταφορά μάζας στην κινητή φάση (mobile-phase mass transfer: Οφείλεται σε ανομοιογένεια του πεδίου ταχυτήτων σε μία διαδρομή που ορίζεται από τα σωματίδια της στήλης. Η κινητή φάση που βρίσκεται κοντά στα σωματίδια της στατικής φάσης κινείται με πολύ μικρή ταχύτητα ή και καθόλου. Αντίθετα, η κινητή φάση που βρίσκεται στο κέντρο της διαδρομής κινείται με μεγαλύτερη ταχύτητα. 4. Μεταφορά μάζας σε ακινητοποιημένη κινητή φάση (stagnant mobile-phase mass transfer: Τα σωματίδια της στερεής στατικής φάσης έχουν πόρους. Ο διαλύτης που βρίσκεται μέσα στους πόρους είναι στάσιμος. Μόρια τα οποία λόγω διάχυσης εισέρχονται μέσα στους πόρους κάνουν περισσότερο χρόνο να κατέλθουν τη στήλη. 5. Μεταφορά μάζας στη στατική φάση (stationary phase mass transfer: Μόρια τα οποία εισέρχονται μέσα στους πόρους και διεισδύουν μέσα στη στατική φάση ή συνδέονται με αυτή με οποιονδήποτε τρόπο (ρόφηση, περνούν περισσότερο χρόνο στη στατική φάση και χρειάζονται περισσότερο χρόνο να κατέλθουν τη στήλη όπως στην προηγούμενη περίπτωση.

8 Αυτοί οι μηχανισμοί διερεύνησης των κορυφών του χρωματογραφήματος γίνονται πιο κατανοητές από το παρακάτω σχήμα: Σχήμα Μηχανισμοί διερεύνησης των χρωματογραφικών κορυφών Η εξίσωση (36 μπορεί επίσης να γραφεί και ως εξής: ( t t A h t = exp (38 σ π σ όπου h t είναι το ύψος της κορυφής σε χρόνο t, A το εμβαδόν της κορυφής, t ο χρόνος που εμφανίζεται το μέγιστο της κορυφής και τέλος, σ είναι η τυπική απόκλιση της κορυφής εκφρασμένη σε μονάδες χρόνου. Στο παρακάτω σχήμα φαίνεται η καμπύλη η οποία έχει μορφή καμπάνας και ο άξονας x αναφέρεται στον χρόνο, t, ενώ ο άξονας y στο ύψος της κορυφής.

9 Σχήμα Κανονική καμπύλη ή καμπύλη Gauss Η πρώτη παράγωγος της εξίσωσης (38 είναι: h ' t ( t t A ( t t ( t t exp σ π = σ σ = σ h t (39 και μηδενίζεται όταν t = t. Σε αυτό το σημείο η καμπύλη παρουσιάζει ένα μέγιστο που αντιστοιχεί σε ύψος h: H A A = ht = =, 3989 (4 σ π σ Εφόσον η ποσότητα της ουσίας του μίγματος μπορεί να υπολογιστεί από το εμβαδόν της κορυφής, Α, και αυτό είναι ανάλογο με το ύψος της κορυφής καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η ποσότητα της ουσίας μπορεί επίσης να υπολογιστεί και από το ύψος της κορυφής, Η. Με την προϋπόθεση ότι η τυπική απόκλιση, σ, είναι σταθερή. Πειραματικά έχει δειχθεί ότι κάτω από ίδιες συνθήκες το σχήμα της κορυφής παραμένει ίδιο. Από τις σχέσεις (38 και (4 προκύπτει:

3 ( t t h t = H exp (4 σ στην οποία ο όρος t t μπορεί να αντικατασταθεί με το μισό του εύρους της κορυφής σε χρόνο t, δηλαδή: w (4 ( t t = t Επιπλέον από την εξίσωση (4 έχουμε: A H = σ π =, 569σ (43 Αντικαθιστώντας την σχέση (4 στην (4 παίρνουμε: w t ht = σ ln (44 h Στο παρακάτω σχήμα δίνεται το εύρος της καμπύλης για διάφορες τιμές του ύψους αυτής: Σχήμα Εύρος της καμπύλης Gauss για συγκεκριμένες τιμές του ύψους, h t

3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ. Όργανα Η συσκευή της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης που χρησιμοποιήθηκε στην πειραματική διαδικασία αποτελείται από τα παρακάτω: Αντλία Shimadzu LC-A Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος μοντέλου 75 με βρόγχο των μl Στήλη SB-C8 Zorbax 3,5μm (4,6 x 5mm Φούρνος Shimadzu CTO-AS Φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή UV (Shimadzu SP-A Λογισμικό καταγραφής και επεξεργασίας δεδομένων AQ for chemists. Αντιδραστήρια Σαν κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε διάλυμα 4% ακετονιτρίλιο (ΑCN σε νερό. Το προς μελέτη μίγμα ουσιών περιέχει τις εξής έξι μη πολικές ενώσεις: βενζόλιο (Β, τολουόλιο (Τ, αιθύλενο βενζόλιο (Ε, κουμένιο (C, προπύλενο βενζόλιο (Ρ και tert-βούτυλο βενζόλιο (Te τις οποίες τις διαλύουμε σε μεθανόλη..3 Πειραματική διαδικασία Κατά την πειραματική διαδικασία λαμβάνονται χρωματογραφήματα του μίγματος των ενώσεων σε τέσσερις διαφορετικές θερμοκρασίες (5, 35, 55 και 75 ο C και για συγκέντρωση κινητής φάσης 4% και 5% ACN. Επίσης στη θερμοκρασία 75 ο C και για 5% ACN λαμβάνεται χρωματογράφημα και για ροή κινητής φάσης ml/min. Έτσι ρυθμίζεται ο φούρνος στην αντίστοιχη θερμοκρασία και αφού ισορροπήσει η στήλη στη θερμοκρασία αυτή αλλά και στην δεδομένη συγκέντρωση της κινητής φάσης εισάγεται με ένεση το μίγμα των έξι ενώσεων. Το μήκος κύματος στο φασματοφωτομετρικό ανιχνευτή ρυθμίζεται στα 54 nm. Στα παρακάτω σχήματα δίνονται τα χρωματογραφήματα των έξι μη πολικών ενώσεων στους 5 και στους 75 ο C για συγκέντρωση κινητής φάσης 4% ACN και στους 5, 35, 55 και 75 ο C για συγκέντρωση κινητής φάσης 5% ACN. Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι η οι κορυφές που εμφανίζονται στο χρωματογράφημα αντιστοιχούν στις μη πολικές ενώσεις με την εξής σειρά: Β, Τ, Ε, C, Ρ, Τe

3 Σχήμα 3 Χρωματογράφημα μη πολικών ενώσεων στους 5 ο C και 4% ACN. Σχήμα 4 Χρωματογράφημα μη πολικών ενώσεων στους 75 ο C και 4% ACN.

35 Σχήμα 9 Χρωματογράφημα μη πολικών ενώσεων στους 75 ο C και 5% ACN και ροή ml/min.

36 3. ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Τα δεδομένα που αναλύθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν α δεδομένα των μη πολικών ουσιών που προσδιορίστηκαν στο πειραματικό μέρος και β δεδομένα πολικών ουσιών που εξετάστηκαν σε προηγούμενες μελέτες που έγιναν στο εργαστήριο της φυσικοχημείας. Αναλυτικότερα οι πολικές ενώσεις ήταν: φαινόλη (F, 4-νιτροφαινόλη (4NF, -μεθυλοφαινόλη (MF, -χλωροφαινόλη (CF, - νιτροφαινόλη (NF, 4-χλωροφαινόλη (PCF,,4-διμέθυλοφαινόλη (4MF, 4- βρωμοφαινόλη (4BF/PBF, μετα-βρωμοφαινόλη (MBF και,4-δίχλωροφαινόλη (4CF. Επίσης σαν κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε μεθανόλη, ισοπροπανόλη, ακετονιτρίλιο και τετραϋδροφουράνιο. Τα χρωματογραφήματα λήφθηκαν σε δύο διαφορετικές στήλες PLC εκ των οποίων η μία ήταν C 8 (5 4 mm MZ- Analytical column (5μm Inertsil OS-3 και η άλλη C (5 4.6 mm, Lichrosorb [7]. Κάθε χρωματογράφημα επεξεργάστηκε με δύο μεθόδους. Με την πρώτη μέθοδο η μελέτη έγινε μέσω του λογισμικού AQ for chemists, ενός λογισμικού που έχει γίνει στο εργαστήριο της φυσικοχημείας για αλλαγή και ανάλυση χρωματογραφημάτων. Έτσι με το πρόγραμμα αυτό καταγράφεται για κάθε κορυφή ο χρόνος εμφάνισης της, η ασυμμετρία, το ύψος και το εύρος της τόσο στο % όσο και στο 5% του ύψους της. Από τις τιμές αυτές του εύρους υπολογίζεται ο συντελεστής διάχυσης σύμφωνα με τις παρακάτω σχέσεις. Είδαμε ότι ισχύει: x x σ = t / u σ = t / u = t t / L (45 όπου σ είναι η τυπική απόκλιση, ο συντελεστής διάχυσης και t ο χρόνος εμφάνισης της κορυφής. Επίσης από τις ιδιότητες της καμπύλης Gauss παίρνουμε: =,46 σ =,46t t L (46 % / και = 77, σ = 77t, t L (47 5 % /

37 Όπου % και 5% είναι το εύρος της κορυφής στο % και στο 5% του ύψους της κορυφής αντίστοιχα. Οπότε λύνοντας ως προς τις σχέσεις (46 και (47 προκύπτει: % L = (48 % 3 (.46 t 5% L = (49 5% 3 (,77 t όπου % και 5 % ο συντελεστής διάχυσης που υπολογίζεται από τις αντίστοιχες τιμές του εύρους. Προφανώς οι τιμές αυτές του συντελεστή διάχυσης,, πρέπει να ταυτίζονται μέσα στο πειραματικό σφάλμα. Το μήκος της στήλης που χρησιμοποιήθηκε για να ληθφούν τα πειραματικά δεδομένα των πολικών ενώσεων είναι πολικών ενώσεων χρησιμοποιήθηκε στήλη μήκους L = 5cm, ενώ για τα δεδομένα των μη L = 5cm. Η ανάλυση των χρωματογραφημάτων και ο υπολογισμός του συντελεστή διάχυσης έγινε επίσης σε φύλλα εργασίας του Microsoft Excel και συγκεκριμένα με την χρήση του προγράμματος Solver (Επίλυση. Για τον θεωρητικό υπολογισμό της καμπύλης χρησιμοποιείται η παρακάτω σχέση: y hexp ( t t = σ + c (5 όπου c μια σταθερά που δείχνει πόσο απέχει η γραμμή της βάσης της κορυφής από τον άξονα των x. Με προσαρμογή των μεταβλητών h, t, σ και c υπολογίζεται η τυπική απόκλιση, σ, και αυτή πολλαπλασιασμένη με,665 δίνει το εύρος στο 5% του ύψους της κορυφής. Δηλαδή: =, 665 σ (5 5%

38 Τέλος για κάθε κινητή φάση και για κάθε πολική ένωση συγκεντρώνονται οι τιμές που υπολογίστηκαν για το εύρος της κορυφής σε κάθε συγκέντρωση της κινητής φάσης και σε κάθε στήλη και καταγράφονται σε πίνακα από τον οποίο γίνεται το αντίστοιχο διάγραμμα.

39 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ A. ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΟΥ ΕΥΡΟΥΣ ΤΩΝ ΚΟΡΥΦΩΝ 4. Επίδραση της χρωματογραφικής στήλης και της φύσης του οργανικού διαλύτη Είναι γνωστό ότι το εύρος μιας κορυφής,, εξαρτάται από τον χρόνο έκλουσης αυτής, t. Πιο συγκεκριμένα όσο πιο μεγάλος είναι ο χρόνος έκλουσης τόσο πιο μεγάλο το εύρος της κορυφής. Για τον λόγο αυτό γίνονται διαγράμματα του εύρους ως προς τον t τόσο για τη στήλη C 8 όσο και για την C, για τις δέκα πολικές ενώσεις και για τους τέσσερις διαλύτες. Τα διαγράμματα αυτά για κινητές φάσεις ισοπροπανόλη, μεθανόλη, τετραϋδροφουράνιο και ακετονιτρίλιο δίνονται αντίστοιχα στα παρακάτω σχήματα:.5.45.4.35.3.5..5..5 4 6 8 F.9.8.7.6.5.4.3.. 4NF 5 5 5.8.7.6.5.4.3.. MF 5 5 5 3.9.8.7.6.5.4.3.. CF 3 4

4.9.8.7.6.5.4.3.. NF 5 5 5 3.8.6.4..8.6.4. PCF 4 6 8.6.4..8.6.4. 4MF 3 4 5 6.5.5.5 PBF 4 6 8 3.5.5.5 MBF 4 6 8 5 4.5 4 3.5 3.5.5.5 4CF 5 5 Σχήμα 3 Διαγράμματα εύρους κορυφών (σε min πολικών ενώσεων ως προς τον χρόνο εμφάνισης τους χρησιμοποιώντας κινητή φάση ισοπροπανόλη και στήλη C ( και C 8 (.

4.6.5.4.3.. 5 5 F..8.6.4. 4NF 5 5 5.9.8.7.6.5.4.3.. MF 3 4..8.6.4. CF 3 4 w.6.4..8.6.4. NF 3 4 5.6.4..8.6.4. PCF 3 4 5 6

4.5.5.5 4MF 4 6 8.5.5.5 PBF 4 6 8.5 5 4.5.5 MBF 4 6 8 3 4CF 5 5 Σχήμα 3 Διαγράμματα εύρους κορυφών (σε min πολικών ενώσεων ως προς τον χρόνο εμφάνισης τους χρησιμοποιώντας κινητή φάση μεθανόλη και στήλη C ( και C 8 (.

43.5.5 3 4 F.4..8.6.4. 4NF 3 4.4..8.6.4. MF 3 4.5.5 CF 4 6 8.5.5.5.5 NF 4 6 8.5.5 PCF 5 5

44.5.5.5 4MF 5 3.5.5.5 PBF 5 5 3.5 3.5.5.5 MBF 5 5 8 6 4 4CF 3 Σχήμα 3 Διαγράμματα εύρους κορυφών (σε min πολικών ενώσεων ως προς τον χρόνο εμφάνισης τους χρησιμοποιώντας κινητή φάση τετραϋδροφουράνιο και στήλη C ( και C 8 (.

45.8.6.4. 3 4 F.6.4..8.6.4. 4NF 3 4 5 6.6.4..8.6.4. MF 3 4 5 6 7.8.6.4..8.6.4. CF 4 6 8.5.5.5 NF 4 6 8 3.5.5.5 PCF 5 5

46 4.5 4 3.5 3.5.5.5 4MF 5 5 5 4 3 PBF 5 5 4.5 4 3.5 3.5.5.5 MBF 5 5 3.5.5.5 4CF 5 5 Σχήμα 33 Διαγράμματα εύρους κορυφών (σε min πολικών ενώσεων ως προς τον χρόνο εμφάνισης τους χρησιμοποιώντας κινητή φάση ακετονιτρίλιο και στήλη C ( και C 8 (. Από τα παραπάνω διαγράμματα παρατηρούμε ότι η στήλη έχει σημαντική επίδραση στο εύρος των κορυφών. Πιο συγκεκριμένα, η στήλη C δίνει κορυφές με μεγαλύτερο εύρος σε σχέση με την στήλη C 8. Επίσης παρατηρούμε ότι το εύρος της κορυφής είναι ανάλογο με τον χρόνο έκλουσης της ουσίας. Μπορούμε να συνοψίσουμε τα αποτελέσματα των χρόνων έκλουσης όλων των ουσιών σε κάθε κινητή φάση και των αντίστοιχων τιμών του εύρους στα παρακάτω διαγράμματα:

47 5 4 3 ISO 5 5 5 4 3 MeOH 5 5 t,min 8 5 6 4 THF 3 4 3 ACN 5 5 Σχήμα 34 Συγκεντρωτικά διαγράμματα εύρους κορυφών (σε min πολικών ενώσεων ως προς τον χρόνο εμφάνισης τους για στήλη C ( και για C 8 ( για τις τέσσερις κινητές φάσεις. Οι εξισώσεις των ευθειών καθώς και οι τιμές των δίνονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας Εξισώσεις ευθειών και τιμές. A/A Στήλη C Στήλη C 8 Ισοπροπανόλη =.38t =.963 +.573 =.6t =.994 +.93 Μεθανόλη =.59t =.986 +.49 =.6t =.99 +. Τετραϋδροφουράνιο =.9t =.9896 +.453 =.33t =.93 +.977 Ακετονιτρίλιο =.3t =.9878 +.545 =.3t =.994 +.56 Από τον παραπάνω πίνακα συμπεραίνουμε ότι, όταν η κινητή φάση είναι μεθανόλη ή ισοπροπανόλη, η επιλογή της στήλης επηρεάζει τα αποτελέσματα.

48 Δηλαδή, η στήλη έχει διαφορετική συμπεριφορά. Αντίθετα, όταν η κινητή φάση είναι τετραϋδροφουράνιο ή ακετονιτρίλιο η στήλη δεν επηρεάζει τα αποτελέσματα και συνεπώς όλα τα δεδομένα μπορούν να περιγραφούν από την ίδια ή σχεδόν την ίδια εξίσωση. Από τα διαγράμματα του σχήματος 34 παρατηρούμε επίσης ότι το εύρος των κορυφών είναι ανάλογο με τον χρόνο έκλουσης των ουσιών χωρίς όμως να επηρεάζονται από την ουσία. Αυτό μας επιτρέπει να προβλέπουμε εύκολα το εύρος των κορυφών σε ορισμένο χρόνο έκλουσης χωρίς να εξετάζουμε την κάθε ουσία χωριστά. 4. Επίδραση της σύστασης της κινητής φάσης Εάν θεωρήσουμε ότι το lnk δίνεται από την σχέση [4]: ln k + = a + aφ aφ (5 όπου φ εκφράζει τη σύσταση της κινητής φάσης, τότε με αντικατάσταση του k στην παρακάτω εξίσωση προκύπτει: + k = t exp ( + ( a + a φ a t = t ( + φ (53 και τελικά ( aφ +α φ t = t + ce (54 Αλλά γνωρίζοντας ότι το εύρος της κορυφής είναι ανάλογο με τον χρόνο εμφάνισης t παίρνουμε: ( Cφ + Cφ = C + C e (55 Όμοια αν θεωρήσουμε ότι [4]:

49 bφ ln k = a (56 + cφ τότε το εύρος της κορυφής δίνεται από την σχέση: Cφ ( + C3φ = C + Ce (57 Εναλλακτικά μπορούν να χρησιμοποιηθούν και οι παρακάτω εξισώσεις για τον υπολογισμό του εύρους των κορυφών [4]: και Cφ = C + C3φ (58 + C φ + Cφ Cφ = C + (59 Για να ελεγχθεί η ισχύς των σχέσεων (55, (57, (58 και (59 γίνεται προσαρμογή αυτών στα πειραματικά δεδομένα με την χρήση του προγράμματος Solver του Excel. Από αυτή την επεξεργασία υπολογίζεται το σ y για το οποίο ισχύει: SS σ y = (6 N P όπου = ( exp SS th, th είναι η τιμή του εύρους της κορυφής που υπολογίζεται από την αντίστοιχη σχέση, exp η τιμή του εύρους που υπολογίζεται από τα χρωματογραφήματα με την χρήση του προγράμματος Solver και προσαρμογή των πειραματικών σημείων στην σχέση (49, Ν ο αριθμός των πειραματικών δεδομένων και Ρ ο αριθμός των μεταβλητών της κάθε εξίσωσης. Οι τιμές σ y για τις τέσσερις εξισώσεις και για κάθε μία από τις τέσσερις κινητές φάσεις στις δύο στήλες δίνονται από τους παρακάτω πίνακες και αναπαρίστανται στα αντίστοιχα διαγράμματα:

5 Πίνακας Τιμές σ y σε στήλη C 8 για κινητή φάση MeOH. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.3.4.3.9...4.53.9.3.5..5.3..8.3.83.9.6.8.3.4.7.38.6.7.7.5.47..5..9..36.94.9.8.7 Πίνακας 3 Τιμές σ y σε στήλη C για κινητή φάση MeOH. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.7.48.48.59.6.36.3..8.79...37.4..9.5.33.54.99.4.73.66.8.4.7.35.7.77.74.3.36.37.45...65.4.63.96

5..5 σy. C C 8.5 σy...5.5. 3 4 5 6 7 8 9. 3 4 5 6 7 8 9 Σχήμα 35 Διαγράμματα των τιμών του σ y για τις εξισώσεις (55-(, (57-(, (58-( και (59-( σε διαλύτη MeOH για στήλη C και C 8 αντίστοιχα. Πίνακας 4 Τιμές σ y σε στήλη C 8 για κινητή φάση ισοπροπανόλη. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf..3.7.35.4.34.9.44..55...68.68.76.5.65.79.8.84..3.5.5.4.94.97.65.3.57.3..68.65.76.6.77.88.8.59

5 Πίνακας 5 Τιμές σ y σε στήλη C για κινητή φάση ισοπροπανόλη. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.64.6.5.39.35.8.4..7..6.7.49.6.38.9.5.6.7.5.65..56..39.4.37.5.36.5.5..46.3.33.78.56.9.8.4..5..5 σ y. C C 8.5..5 σy. 3 4 5 6 7 8 9. 3 4 5 6 7 8 9 Σχήμα 36 Διαγράμματα των τιμών του σ y για τις εξισώσεις (55-(, (57-(, (58-( και (59-( σε διαλύτη ισοπροπανόλη για στήλη C και C 8 αντίστοιχα.

53 Πίνακας 6 Τιμές σ y σε στήλη C 8 για κινητή φάση THF. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.3.6..5.36.3..4.8.4.9.35.6.5.6.3.3.5..7....3.3.45.46.69.68.5.8.78.34.5..7.87.4.7.8 Πίνακας 7 Τιμές σ y σε στήλη C για κινητή φάση THF. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.46.3.9.6.6.4.38.5.9.79.46.3.3.4.54.5.54.58.6.85.46.47.44.59.57.93.77.8.46.4.5.77.83.55.47.89.7.4.73.57

54..5 σy. C C 8.5 σy...5.5. 3 4 5 6 7 8 9. 3 4 5 6 7 8 9 Σχήμα 37 Διαγράμματα των τιμών του σ y για τις εξισώσεις (55-(, (57-(, (58-( και (59-( σε διαλύτη THF για στήλη C και C 8 αντίστοιχα. Πίνακας 8 Τιμές σ y σε στήλη C 8 για κινητή φάση ACN. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.97.43.5.3.43.48.8.46.6.5.3.36.43.9.7.36.8.3.47.8..9.44.37.4.6.5.63.4.98.9.5.8.77.9.389.477.53.477.8

55 Πίνακας 9 Τιμές σ y σε στήλη C για κινητή φάση ACN. Ουσίες/Εξισώσεις Εξ. (55 Εξ. (57 Εξ. (58 Εξ.(59 φαινόλη(f 4-νιτροφαινόλη(4NF μέθυλο φαινόλη(mf -χλωροφαινόλη(cf -νιτροφαινόλη(nf πάρα χλωροφαινόλη(pcf,4-διμέθυλο φαινόλη(4mf πάρα βρωμοφαινόλη(pbf μέτα βρώμοφαινόλη(mbf,4-διχλωρο φαινόλη(4cf.63...36.8.4.9.7.6.7.44.9.7.35.9.46.9.59.56.9.4.4.5.39.7.39.35.57.5.39.53.93.98.93.63.65..4.46.5..5..5 σy. C C 8.5..5 σy. 3 4 5 6 7 8 9. 3 4 5 6 7 8 9 Σχήμα 38 Διαγράμματα των τιμών του σ y για τις εξισώσεις (55-(, (57-(, (58-( και (59-( σε διαλύτη ACN για στήλη C και C 8 αντίστοιχα. Η τιμή σy είναι ένα μέτρο της ποιότητας προσαρμογής μιας εξίσωσης. Όσο μικρότερη τιμή παίρνει, τόσο καλύτερη η εξίσωση. Με βάση αυτό, από τα παραπάνω σχήματα προκύπτει ότι οι εξισώσεις (55 και (57 υπερτερούν των εξισώσεων (58 και (59 και η περιγραφή που δίνουν είναι σχεδόν ισότιμη, αλλού υπερτερεί η μία και αλλού η άλλη. 4.3 Επίδραση της θερμοκρασίας Η επίδραση της θερμοκρασίας μελετήθηκε σε σύστημα έξι μη πολικών ενώσεων (βενζόλιο, τολουόλιο, αιθύλενο βενζόλιο, κουμένιο, προπύλενο βενζόλιο και tert-βούτυλο βενζόλιο. Οι τιμές του εύρους υπολογίζονται με την διαδικασία που

56 περιγράφεται στην παράγραφο Ανάλυση Δεδομένων. Οι τιμές αυτές συνοψίζονται στα παρακάτω διαγράμματα:.5.5.5 Α 5.8.6.4. Β 3 4 Σχήμα 39 Συγκεντρωτικό διαγράμματα εύρους κορυφών (σε min μη πολικών ενώσεων ως προς τον χρόνο εμφάνισης τους. Το διάγραμμα Α περιλαμβάνει όλα τα πειραματικά δεδομένα, δηλαδή τα εύρη των κορυφών και των έξι μη πολικών ενώσεων για τις τέσσερις θερμοκρασίες και για συγκέντρωση κινητής φάσης 4% και 5% ACN. Ειδικότερα για θερμοκρασία 75 ο C υπάρχουν και δεδομένα για ροή κινητής φάσης ml/min. Παρατηρούμε ότι τα δεδομένα αυτά είναι γραμμικά με τιμή =. 9894 και εξίσωση της ευθείας =.6t +.6. Το διάγραμμα Β όμως διάγραμμα περιλαμβάνει μόνο τα πειραματικά δεδομένα που λήφθηκαν για συγκέντρωση κινητής φάσης 5% ACN και για τις τέσσερις θερμοκρασίες. Η εξίσωση της ευθείας δίνεται από την σχέση =.73t +. 79 και =. 999. Από τα διαγράμματα αυτά συμπεραίνουμε ότι είναι εύκολη η πρόβλεψη του εύρους μιας κορυφής για συγκεκριμένο χρόνο έκλουσης χωρίς να εξετάσουμε κάθε ουσία χωριστά ή τη θερμοκρασία στην οποία λαμβάνεται το κάθε χρωματογράφημα. Οι κλίσεις.6 και.73 δεν διαφέρουν σημαντικά μεταξύ τους και είναι πολύ κοντά στην τιμή.3 που βρέθηκε για τις πολικές ενώσεις. Άρα, τουλάχιστον για ενώσεις με παραπλήσιες διαστάσεις η γραμμική εξάρτηση του εύρους από τον χρόνο έκλουσης είναι ίδια στον ίδιο διαλύτη αυτό φαίνεται και στο παρακάτω σχήμα:

57 4.5 4 3.5 3.5.5.5 ΑCN 5 5 Σχήμα 4 Συγκεντρωτικό διάγραμμα εύρους κορυφών (σε min πολικών ενώσεων ( και μη πολικών ενώσεων (. Στο σχήμα 4 δίνεται η γραμμική εξάρτηση του εύρους μιας κορυφής από τον χρόνο έκλουσης για όλες τις πολικές και μη πολικές ενώσεις. Η εξίσωση που περιγράφει αυτήν την εξάρτηση για τις πολικές ενώσεις είναι =.3t +. 56 και =. 9945, ενώ για τις μη πολικές είδαμε ότι ισχύει =.73t +. 79 και =.999. Η διαφορά στις κλίσεις είναι πολύ μικρή, είναι όμως στατιστικά σημαντική. Η επίδραση της θερμοκρασίας στο εύρος των κορυφών των πολικών ενώσεων μπορεί να αναπαρασταθεί στο παρακάτω διάγραμμα:

58.8.7.6.5.4.3.. 8 3 3 34 T, K Σχήμα 4 Συγκεντρωτικό διάγραμμα του εύρους ως προς την θερμοκρασία για το βενζόλιο(, τολουόλιο(, αιθύλενο βενζόλιο(, κούμενιο(, προπύλενο βενζόλιο (, tert-βούτυλο βενζόλιο (. Από το διάγραμμα αυτό παρατηρούμε ότι το εύρος της κορυφής μιας συγκεκριμένης ουσίας αυξάνεται γραμμικά με την ελάττωση θερμοκρασία. Οι εξισώσεις των ευθειών αυτών και οι τιμές δίνονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας Εξισώσεις του εύρους σε συνάρτηση με την θερμοκρασία Βενζόλιο Τολουόλιο Αιθύλενο Βενζόλιο Κουμένιο Προπύλενο Βενζόλιο =.4T +.97 =.9873 =.7T +.4 =.989 =.3T +.68 =.9896 =.T +.67 =.9947 =.6T +.6 =.9946 Tert-Βούτυλο Βενζόλιο =.3T +.5433 =.996

59 B. ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΟΥ ΣΥΝΤΕΛΕΣΤΗ ΔΙΑΧΥΣΗΣ 4.4 Επίδραση της στατικής φάσης της χρωματογραφικής στήλης Για να μελετηθεί η επίδραση της χρωματογραφικής στήλης στην τιμή του συντελεστή διάχυσης γίνονται επίσης διαγράμματα του ως προς τον χρόνο εμφάνισης της κορυφής της κάθε ουσίας. Για τις τέσσερις κινητές φάσεις, ισοπροπανόλη, μεθανόλη, τετραϋδροφουράνιο και ακετονιτρίλιο τα διαγράμματα αυτά δίνονται παρακάτω...5..5 ISO - 3 5.6.5.4.3.. MeOH - 3 5.4...8.6.4. THF 3 4.9.7.5.3. -. ΑCN 3 4 Σχήμα 4 Διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min από πειραματικά δεδομένα ( και η θεωρητική μεταβολή του ( για στήλη C 8.

6.4.3.. ISO 3 4 5.9.7.5.3. -. MeOH 3 4 5.6.5.4.3.. THF 3 4.4.3.. ACN 3 4 Σχήμα 43 Διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min από πειραματικά δεδομένα ( και η θεωρητική μεταβολή του ( για στήλη C. Στα διαγράμματα αυτά τα σημεία είναι οι πειραματικές τιμές του συντελεστή διάχυσης, ενώ οι συνεχείς καμπύλες υπολογίστηκαν ως εξής: Ο συντελεστής διάχυσης δίνεται από την σχέση (49: 5% = L 5% 3 (,77 t Αλλά όπως φαίνεται και στον πίνακα το εύρος μιας κορυφής είναι γραμμικά ανάλογο με τον χρόνο έκλουσης με μια σχέση της μορφής αντικατασταθεί στην σχέση (49 προκύπτει: = a + b t, η οποία αν ( a + b t L ( C + C t = = (6 3 3 (.77 t t Όπου L είναι το μήκος της στήλης, a και b είναι σταθερές που δίνονται στον πίνακα και:

6 al C = (6.77 bl C = (63.77 Οι καμπύλες στα σχήματα 4 και 4 υπολογίστηκαν με βάση τις σχέσεις (6 (63. Παρατηρούμε ότι η θεωρητική καμπύλη περιγράφει απόλυτα ικανοποιητικά τα πειραματικά δεδομένα. Επίσης είναι ενδιαφέρον να παρατηρήσουμε ότι ο συντελεστής διάχυσης αρχικά ελαττώνεται απότομα με το χρόνο t και μετά τείνει να σταθεροποιηθεί. Μάλιστα η ελάττωση αυτή είναι πιο απότομη στους διαλύτες THF και ACN. 4.5 Επίδραση της σύστασης της κινητής φάσης H θεωρητική εξάρτηση του συντελεστή διάχυσης από το φ προκύπτει από τη σχέση (49 αν σ αυτή αντικαταστήσουμε το με = a + b t και ακολούθως το t με βάση τις σχέσεις (9, (5 ή (56. Η σχέση όμως που προκύπτει είναι εξαιρετικά πολύπλοκη, χωρίς να προσφέρει κανένα ιδιαίτερο πλεονέκτημα. Για το λόγο αυτό αναζητήσαμε απλούστερες εξισώσεις για το που προκύπτουν από τη μεταβολή των πειραματικών τιμών του με το φ. Στα σχήματα που ακολουθούν δίνονται επιλεκτικά διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min ως προς την σύσταση της κινητής φάσης για στήλη C 8 ( και C ( στους τέσσερεις διαλύτες που μελετήσαμε.

6.35.3.5..5..5..4.6.8 φ F.35.3.5..5..5 MF..4.6.8 φ.4.35.3.5..5..5 NF..4.6.8 φ.3.5..5..5 4MF..4.6.8 φ.5.4.5..3.5... PBF..4.6.8 φ.5 4CF..4.6.8 φ Σχήμα 44 Διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min ως προς την σύσταση της κινητής φάσης για στήλη C 8 ( και C ( σε διαλύτη ισοπροπανόλη.

63 Η μεταβολή του με το φ φαίνεται να είναι εκθετική με εξαίρεση την φαινόλη και την 4-νιτροφαινόλη. Οι εξισώσεις των καμπύλων του ως προς φ όλων των ουσιών που μελετήθηκαν δίνονται στον πίνακα που ακολουθεί: Πίνακας Εξισώσεις των καμπύλων του συντελεστή διάχυσης ως προς την σύσταση της κινητής φάσης. A/A Στήλη C 8 Στήλη C φαινόλη =.86φ +.45 =.93φ +.33 =.938 =.3444 4-νιτροφαινόλη =.9φ +.5 =.365φ +.68 =.933 =.9436 -μέθυλοφαινόλη =.7 exp( 4.5758φ =.38exp(.883φ =.943 =.84 -χλωροφαινόλη =.6 exp( 5.44φ =.55exp(.34φ =.9467 =.936 -νίτροφαινόλη =.3exp( 3.55φ =.47 exp(.899φ =.99 =.84 p-χλωροφαινόλη =. exp( 6.66φ =.exp( 4.887φ =.953 =.9376,4-διμέθυλο φαινόλη =.3exp( 5.69φ =.8exp( 3.333φ =.959 =.964 p-βρώμο φαινόλη =. exp( 6.4796φ =. exp( 5.659φ =.948 =.759 m-βρώμο φαινόλη =. exp( 6.556φ =. exp( 4.46φ =.94 =.7848,4-δίχλωρο φαινόλη 5 = 6 exp( 7.683φ =. exp( 4.68φ =.933 =.938

64.7.6.6.5.4.3....4.6.8 φ F.5.4.3.. MF..4.6.8 φ..6.8.5.6.4. NF..4.6.8 φ.4.3.. 4MF..4.6.8 φ...8.8.6.6.4.4. PBF..4.6.8 φ. 4CF.5 φ Σχήμα 45 Διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min ως προς την σύσταση της κινητής φάσης για στήλη C 8 ( και C ( σε διαλύτη μεθανόλη.

65 Οι εξισώσεις των καμπύλων του ως προς φ όλων των ουσιών που μελετήθηκαν σε διαλύτη μεθανόλη δίνονται στον πίνακα που ακολουθεί: Πίνακας Εξισώσεις των καμπυλών του συντελεστή διάχυσης ως προς την σύσταση της κινητής φάσης. A/A Στήλη C 8 Στήλη C φαινόλη =.3exp( 3.576φ =.8exp(.3φ =.9589 =.946 4-νιτροφαινόλη =.7 exp( 5.36φ =.56 exp(.8φ =.999 =.85 -μέθυλοφαινόλη =.3exp( 5.98φ =.7exp(.5887φ =.9869 =.995 -χλωροφαινόλη =. exp( 7.96φ =.58exp(.884φ =.974 =.9945 -νίτροφαινόλη =.3exp( 5.5595φ =.74 exp(.95φ =.9966 =.944 p-χλωροφαινόλη 5 = 9 exp( 4.346φ =.3exp( 4.346φ =.996 =.9895,4-διμέθυλο φαινόλη =.exp( 6.3673φ =.4 exp( 3.758φ =.977 =.949 p-βρώμο φαινόλη 5 =.exp( 4.79φ = 4 exp( 8.334φ =.99 =.985 m-βρώμο φαινόλη 5 = 5 exp( 8.7φ =. exp( 4.7φ =.99 =.996,4-δίχλωρο φαινόλη 5 = exp( 9.445φ =.7 exp( 5.985φ =.9964 =.997

66.6.5.4.3....4.6.8 φ F.4...8.6.4. MF..4.6.8 φ.8.7.6.5.4.3.. NF..4.6.8 φ.4...8.6.4. 4MF..4.6.8 φ.8.7.6.5.4.3.. PBF..4.6.8 φ.6.5.4.3.. 4CF..4.6.8 φ Σχήμα 46 Διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min ως προς την σύσταση της κινητής φάσης για στήλη C 8 ( και C ( σε διαλύτη τετραϋδροφουράνιο.

67 Οι εξισώσεις των καμπύλων του ως προς φ δίνονται στον πίνακα που ακολουθεί: Πίνακας 3 Εξισώσεις των καμπυλών του συντελεστή διάχυσης ως προς την σύσταση της κινητής φάσης. A/A Στήλη C 8 Στήλη C φαινόλη =.8exp( 5.965φ =.exp( 5.735φ =.9863 =.9736 4-νιτροφαινόλη =.3exp( 8.44φ =.4 exp( 7.4876φ =.95 =.8973 -μέθυλοφαινόλη 5 = 3 exp(.73φ =.4 exp( 6.8369φ =.9964 =.899 -χλωροφαινόλη 5 =. exp( 7.57φ = 8 exp( 9.535φ =.9696 =.9788 -νίτροφαινόλη =. exp( 8.49φ =.4 exp( 6.53φ =.9967 =.9547 p-χλωροφαινόλη 5 5 = 3 exp(.536φ = 4 exp(.64φ =.996 =.9637,4-διμέθυλο φαινόλη 4 5 = exp( 8.996φ = 6 exp(.8φ =.9745 =.9965 p-βρώμο φαινόλη 5 5 = exp(.646φ = 4 exp( 9.66φ =.993 =.9955 m-βρώμο φαινόλη 5 5 = exp(.646φ = 4 exp( 9.66φ =.993 =.9955,4-δίχλωρο φαινόλη 6 5 = 8 exp(.575φ = exp(.573φ =.999 =.9859

68.35.3.5..5..5..4.6.8 φ F.7.6.5.4.3.. MF..4.6.8 φ.7.6.5.4.3.. NF..4.6.8 φ.45.4.35.3.5..5..5 4MF..4.6.8 φ.45.4.35.3.5..5..5 PBF..4.6.8 φ.4.35.3.5..5..5 4CF..4.6.8 φ Σχήμα 47 Διαγράμματα του συντελεστή διάχυσης (σε cm /min ως προς την σύσταση της κινητής φάσης για στήλη C 8 ( και C ( σε διαλύτη τετραϋδροφουράνιο.

69 Οι εξισώσεις των καμπυλών του ως προς φ δίνονται στον πίνακα που ακολουθεί: Πίνακας 4 Εξισώσεις των καμπυλών του συντελεστή διάχυσης ως προς την σύσταση της κινητής φάσης. A/A Στήλη C 8 Στήλη C φαινόλη =.6 exp( 4.86φ =.3exp( 3.5φ =.9544 =.9646 4-νιτροφαινόλη =.9 exp( 5.7779φ =. exp( 4.775φ =.95 =.8969 -μέθυλοφαινόλη =.3exp( 6.754φ =.5exp( 5.79φ =.998 =.9775 -χλωροφαινόλη =. exp( 7.858φ =.4 exp( 5.36φ =.98 =.9843 -νίτροφαινόλη =.3exp( 6.4944φ =.6 exp( 5.3φ =.974 =.965 p-χλωροφαινόλη =. exp( 7.389φ =.3exp( 5.7354φ =.979 =.9595,4-διμέθυλο φαινόλη 5 = 9 exp( 7.553φ =. exp( 6.4534φ =.994 =.9838 p-βρώμο φαινόλη =.exp( 7.845φ =.3exp( 5.77φ =.983 =.9647 m-βρώμο φαινόλη 4 = exp( 8.67φ =.3exp( 5.375φ =.989 =.96,4-δίχλωρο φαινόλη 5 = 5 exp( 8.89φ =.exp( 6.83φ =.9936 =.99

7 4.6 Επίδραση της θερμοκρασίας Οι τιμές του συντελεστή διάχυσης σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία δίνονται στο παρακάτω σχήμα:.5.4.3.. 8 3 3 34 T, K Σχήμα 48 Συγκεντρωτικό διάγραμμα του συντελεστή διάχυσης ως προς την θερμοκρασία για το βενζόλιο(, τολουόλιο(, αιθύλενο βενζόλιο(, κούμενιο(,προπύλενο βενζόλιο (,tert-βούτυλο βενζόλιο (. Παρατηρούμε ότι ο συντελεστής διάχυσης στην HPLC αυξάνεται με την αύξηση της θερμοκρασίας και η μεταβολή αυτή φαίνεται να είναι δευτέρου βαθμού. Οι εξισώσεις αυτής της εξάρτησης δίνονται στον παρακάτω πίνακα: