ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΜΟΤΙΒΟΥ ΥΠΟΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ NAT/NCS2

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΜΟΤΙΒΟΥ ΥΠΟΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ NAT/NCS2 ΠΑΝΟΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ ΙΩΑΝΝΙΝΑ, 2005

ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΜΟΤΙΒΟΥ ΥΠΟΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ ΜΕΤΑΦΟΡΕΩΝ NAT/NCS2 ΠΑΝΟΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ Επιβλέπων : ΕΥΣΤΑΘΙΟΣ ΦΡΙΛΙΓΓΟΣ Επικ. Καθηγητής ΙΩΑΝΝΙΝΑ, 2005

Αφιερώνεται στους γονείς µου και τη Χριστίνα µου

Όταν κάτι δεν ακούγεται δεν σηµαίνει ότι παύει να υπάρχει Αντί Προλόγου Η εργασία που κρατάτε στα χέρια σαςείναι το αποτέλεσµα µια πειραµατικής προσπάθειαςπου διεξήχθη στο Εργαστήριο ΒιολογικήςΧηµείαςτηςΙατρικήςΣχολής του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος Σπουδών Βιοτεχνολογία και διήρκησε έναν χρόνο. Σε όλη αυτή την προσπάθεια πολλοί ήταν οι άνθρωποι που µε βοήθησαν στις δύσκολεςστιγµέςκαι χάρηκαν µαζί µε τη χαρά µου. Ο ΕυστάθιοςΦριλίγγοςήταν ο επιβλέπων µου και βασικόςαρωγόςσε όλη αυτή την προσπάθεια. Η θέλησή του για σωστή δουλειά, η βοήθεια και η στήριξη του σε όλα τα επιστηµονικά θέµατα αποτέλεσαν σηµαντικό στοιχείο για µια σωστή πορεία µε αποτελέσµατα. Ένα µεγάλο κοµµάτι των επιστηµονικών γνώσεων που έχω οφείλεται σε αυτόν και γι αυτό τον ευχαριστώ θερµά. Η Παναγιώτα Καρατζά, η δασκάλα µου, αποτέλεσε βασικό παράγοντα τόσο για το νέο ξεκίνηµα στον πάγκο όσο και για τη δηµιουργία ενόςπολύ καλού κλίµατος εντόςτου εργαστηρίου. Έκλαψε, γέλασε και θύµωσε µαζί µου, έγινε φίλη µου για µια ζωή και γι αυτό την ευχαριστώ µε όλη µου την ψυχή. Η Σωτηρία Ταβουλάρη ήταν η πρώτη µου δασκάλα στα θέµατα πάγκου και στη γενικότερη συµπεριφορά µέσα στο εργαστήριο κατά την πρώτη θητεία µου εκεί πριν από δυο χρόνια. Ήταν δίπλα µου σε ό,τι τη χρειάστηκα, εντόςκαι εκτός εργαστηρίου, είναι και θα παραµείνει πολύ καλή µου φίλη και γι αυτό τηςχρωστάω πολλά. Ακόµη, θέλω να εκφράσω τιςευχαριστίεςµου σε όλουςαυτούςπου µας επέτρεψαν να παρακολουθήσουµε αυτό το Μεταπτυχιακό Πρόγραµµα και στη διάρκειά του προσπάθησαν να µαςµάθουν τιςγνώσειςπου οι ίδιοι κατέχουν µε ένα τρόπο γόνιµο και εποικοδοµητικό. Θα ήταν παράλειψή µου να µην ευχαριστήσω όλα τα µέλη του εργαστηρίου τηςβιολογικήςχηµείαςπου βοήθησαν σε µια καλή συνεργασία και σε ένα ευχάριστο εργασιακό περιβάλλον. Επίσης, ευχαριστώ όλα τα παιδιά του µεταπτυχιακού που βίωσαν µαζί µου αυτή την εµπειρία και βοήθησαν στην οµαλή έκβαση των δύσκολων στιγµών που κάποιοι δοκίµασαν τιςαντοχέςµας.

Μια τεράστια ευγνωµοσύνη χρωστάω στη Χριστίνα µου, που αν δεν ήταν στο πλάι µου, αυτή η εµπειρία δε θα είχε ξεκινήσει αλλά και να ξεκίναγε θα ήταν ατελής. Χωρίςτη βοήθειά τηςεγώ δε θα είχα φτάσει σήµερα εδώ, οπότε λίγα λόγια δεν µπορούν να εκφράσουν αυτά που θέλω να πω. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς µου που δεν παρέλειψαν ποτέ να µε στηρίζουν, να µε µαθαίνουν, να µου δίνουν απλόχερα την αγάπη τουςκαι να χρηµατοδοτούν αυτή την προσπάθεια. Αυτοί, µαζί µε όλα τα παραπάνω άτοµα, τα αδέρφια µου, τη Γεωργία και όλη την οικογένειά µου µε κράτησαν µέσα σε αυτή την προσπάθεια ωςτο τέλος. Καλή ανάγνωση

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείµενο τηςµελέτηςµαςήταν ο µεταφορέαςygfo του βακτηρίου Escherichia coli, έναςσυµµεταφορέαςξανθίνης: Η + που παρουσιάζει 30% ταυτότητα αλληλουχίαςµε το µεταφορέα UapA του Aspergillus nidulans, ένα συµµεταφορέα ξανθίνης/ ουρικού οξέος: Η +. Και οι δυο µεταφορείςανήκουν στην οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού NAT/NCS2, λίγα µέλη της οποίαςέχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά, µε το εκτενέστερα µελετηµένο µέλοςτηςνα είναι ο UapA. Οι µελέτεςστον UapA κατέδειξαν µια συντηρηµένη περιοχή, που ονοµάστηκε αλληλουχία υπογραφή για την οικογένεια NAT/NCS2 και περιέχει κατάλοιπα που επηρεάζουν την αναγνώριση υποστρώµατοςκαι την εξειδίκευση του µεταφορέα ( 324 [Q/E/P]-N-X-G-X-X-X-X-T-[R/K/G] 333 ). Παρ όλ αυτά, θεµελιώδεις πλευρέςτων σχέσεων δοµής λειτουργίας, καθώςκαι τηςτοπολογικήςοργάνωσης των µεταφορέων αυτήςτηςοικογένειαςπαραµένουν αδιευκρίνιστες. Στην παρούσα εργασία έγινε η πρώτη συστηµατική µελέτη µιαςπεριοχής26 καταλοίπων που περιλαµβάνει την αλληλουχία υπογραφή µε τη χρήση τηςτεχνικής µεταλλαξιγένεσηςσάρωσηςκυστεϊνών. Χρησιµοποιώνταςµια πλήρωςλειτουργική εναλλακτική µορφή του YgfO, µε τις5 εγγενείςcys αλλαγµένεςσε Ser (YgfO-Cysless), προχωρήσαµε σε αντικατάσταση κάθε ενόςαπό τα αµινοξέα τηςπεριοχής καταλοίπων 315 340 σε Cys. Οι 26 διαπεράσεςµοναδικήςκυστεΐνης(single-cys YgfOs) που προέκυψαν ελέγχθηκαν ωςπροςτην ικανότητα πρόσληψηςξανθίνηςκαι την ορθή έκφρασή τουςστη µεµβράνη των κυττάρων, ενώ για αυτέςπου δεν ήταν λειτουργικέςέγιναν µεταλλάξειςσηµειακήςστόχευσηςσε φυσικού τύπου υπόστρωµα. Ακόµα, έγιναν πειράµατα αναστολήςτηςενεργότηταςµε ειδικά έναντι των σουλφυδρυλοµάδων των Cys αντιδραστήρια όπωςτο Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (NEM) και το µεθανο-θειο-σουλφονικο αιθυλσουλφονικό αντιδραστήριο (MTSES) και πειράµατα µε ΝΕΜ παρουσία ή απουσία µη ραδιενεργού ξανθίνης. Τα αποτελέσµατά µαςανέδειξαν 2 κατάλοιπα (Pro318 και Gly340) που επηρεάζουν τη σωστή έκφραση του YgfO και 2 κατάλοιπα (Gln324 και Asn325) που είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του YgfO. Ακόµη, τα πειράµατα αναστολήςµε το ΝΕΜ υποδεικνύουν δοµή α έλικαςγια την τελευταία περιοχή των καταλοίπων που

µελετήθηκαν (κατάλοιπα 330 340). Τα µέχρι τώρα αποτελέσµατα δίνουν το έναυσµα για την περαιτέρω µελέτη τηςσυγκεκριµένηςπεριοχήςκαι εντάσσονται στα πλαίσια δηµιουργίαςενόςπρότυπου συστήµατοςµελέτηςτων σχέσεων δοµής λειτουργίαςτων µεταφορέων τηςοικογένειαςnat/ncs2.

Συντµήσεις Όροι NAT (Nucleobase Ascorbate Transporter) = οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού NCS2 (Nucleobase-Cation Symporter-2) = οικογένεια-2 συµµεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων κατιόντων ΝΕΜ (N-ethylmaleimide) = Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο OGM (Oregon Green Maleimide) = πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon MTSES (Sodium (2-Sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) = µεθανο-θειοσουλφονικό αιθυλσουλφονικό αντιδραστήριο BAD (biotin acceptor domain) = περιοχή δέσµευσηςβιοτίνης PCR (polymerase chain reaction) = αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης IPTG (isopropyl-β-d-thiogalactoside) = ισοπροπυλ-β-d-θειογαλακτοσίδιο DTT (dithiothreitol) = διθειοθρεϊτόλη SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) = ηλεκτροφόρηση επί πήγµατοςπολυακρυλαµιδίου-δωδεκυλoθειϊκού νατρίου Permease = διαπεράση Cys-scanning mutagenesis = µεταλλαξιγένεση σάρωσηςκυστεϊνών Sense primer = εκκινητήςνοηµατικού κλώνου Epitope tail = C-τελικόςεπίτοπος Transport assay = δοκιµασία διαµεµβρανικήςµεταφοράς Native = εγγενής TMS (transmembrane) = διαµεµβρανικό Loop = θηλειά

1. Εισαγωγή 1 1.1 ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς : Βιολογική σηµασία και τρόποι µελέτης τους 2 1.2 Η οικογένεια µεταφορέων πουρινών NAT/NCS2 3 1.3 Ο µεταφορέας UapA και το µοτίβο υπογραφή της οικογένειας NAT/NCS2 4 1.4 Μεταφορείς πουρινών στα βακτήρια 6 1.5 Ο µεταφορέας ξανθίνης YgfO : τι είναι γνωστό έως σήµερα 7 1.6 Οι στόχοι της παρούσας εργασίας 10 2. Υλικά και Μέθοδοι 11 2.1 Όργανα 12 2.2 Χηµικά Αναλώσιµα 12 2.3 Πλασµίδια και κυτταρικά στελέχη 13 2.4 Κατασκευή ανασυνδυασµένου DNA 15 2.4.1 Μεταλλαξιγένεση σηµειακήςστόχευσηςµε τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασηςπολυµεράσηςδυο σταδίων (επικάλυψη/επέκταση) 15 2.4.2 Ανασύνδεση των περιοριστικών θραυσµάτων 17 2.5 οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς (Transport Assay) 20 2.6 Αλκυλίωση των σουλφυδρυλικών οµάδων των κυστεϊνών µε τα αντιδραστήρια NEM και MTSES 21 2.7 Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών 22 2.7.1 οκιµασία αλκυλίωσηςµε το πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon (Oregon Green Maleimide) 23 2.8 Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) 24 2.9 Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης 25

3. Αποτελέσµατα 26 3.1 Μεταλλαξιγένεση σάρωσης κυστεϊνών των καταλοίπων 315 340 της διαπεράσης YgfO 27 3.1.1 Έκφραση των single-cys YgfOs 27 3.1.2 Ενεργότητα των single-cys YgfOs 28 3.2 Περαιτέρω µεταλλαξιγένεση των καταλοίπων Pro318, Phe322, Gln324, Asn325, Asn326, Gly340 31 3.2.1 Μεταλλαξιγένεση σηµειακήςστόχευσηςµε Cys σε φυσικού τύπου υπόστρωµα για τα κατάλοιπα Phe322, Gln324, Asn325, Asn326, Gly340 32 3.2.2 Μεταλλαξιγένεση σηµειακήςστόχευσηςµε τη χρήση άλλων αµινοξέων πλην Cys για τα κατάλοιπα Pro318, Gln324, Asn325, Asn326, Gly340 34 3.3 Επίδραση αλκυλιωτικών αντιδραστηρίων στην ενεργότητα των διαπερασών 37 3.3.1 Επίδραση του ΝΕΜ στην ενεργότητα των διαπερασών 37 3.3.1.1 Επίδραση εύρουςσυγκεντρώσεων ΝΕΜ στην ενεργότητα των διαπερασών 39 3.3.2 Επίδραση µη ραδιενεργού ξανθίνηςστην αναστολή τηςενεργότηταςαπό το ΝΕΜ 41 3.3.3 Επίδραση του MTSES στην ενεργότητα των διαπερασών 43 4. Συζήτηση Συµπεράσµατα 47 5. Αναφορές - Παράρτηµα 55 Παράρτηµα 63

1. Εισαγωγή 1

1.1 ιαµεµβρανικές πρωτεΐνες µεταφοράς : Βιολογική σηµασία και τρόποι µελέτης τους Οι µεµβρανικέςπρωτεΐνεςµεταφοράςδιεκπεραιώνουν λειτουργίεςζωτικής σηµασίαςγια το κύτταρο όπωςείναι η πρόσληψη µικροµορίων, η ρύθµιση των ενδοκυττάριων συγκεντρώσεων σηµαντικών ιόντων και η εξώθηση κυτταροτοξικών ενώσεων. Η σπουδαιότητά τουςαντανακλάται και από τα αποτελέσµατα πρόσφατων µελετών που δείχνουν ότι περί το 1/3 του συνόλου των γονιδιακών προϊόντων σε όλα τα γονιδιώµατα είναι διαµεµβρανικέςπρωτεΐνεςκαι περί το 1/5 διαµεµβρανικές πρωτεΐνεςµεταφοράς(iwata and Kaback, 2004). Οι πρωτεΐνεςµεταφοράς (transporters) διαχωρίζονται σε διαύλους(channels) που επιτελούν διευκολυνόµενη διάχυση και µεταφορείς(carriers). Οι µεταφορείςµπορούν να επιτελούν αντιδράσειςδιευκολυνόµενηςδιάχυσηςαλλά και αντιδράσειςενεργού µεταφοράς (Saier, 2000). Οι ενεργοί µεταφορείςχρησιµοποιούν την ενέργεια που ελευθερώνεται από την υδρόλυση του ATP ή την ηλεκτροχηµική διαβάθµιση ιόντων για να µεταφέρουν ένα υπόστρωµα από τη µια µεριά τηςµεµβράνηςστην άλλη και είναι απαραίτητοι για την πρόσληψη θρεπτικών µικροµορίων ή την αποβολή τοξικών ουσιών από το κύτταρο ακόµα και όταν αυτέςπαρουσιάζονται σε ελάχιστες συγκεντρώσεις. Η ευελιξία στερεοδιάταξηςπου παρουσιάζουν οι διαµεµβρανικέςπρωτεΐνες µεταφοράςέχει αποτελέσει σοβαρό εµπόδιο στην εύρεση τηςλειτουργικήςτους δοµήςκαι του µηχανισµού λειτουργίαςτους. Λίγεςαπό αυτέςέχουν χαρακτηριστεί κρυσταλλογραφικά και µάλιστα σχετικά πρόσφατα (Murakami et al., 2002, Abramson et al., 2003, 2004, Iwata and Kaback, 2004). Τα δεδοµένα που έχουµε για τέτοιου είδουςπρωτεΐνεςπροέρχονται έωςκαι σήµερα κυρίωςαπό πρωτοποριακέςαναλύσειςµε βιοχηµικές(frillingos et al., 1998, Kaback et al., 2001), βιοφυσικές(le Coutre and Kaback, 2000, Hubbel et al., 2000) και πρωτεϊνωµατικές (Whitelegge et al., 1999, Weinglass et al., 2003) τεχνικέςσηµειακήςστόχευσης(site directed techniques). Αυτέςοι πολύ αποτελεσµατικές, όπωςαποδείχτηκε τόσο στην περίπτωση του µεταφορέα LacY όσο και σε άλλεςπεριπτώσεις, προσεγγίσεις συµπληρώνονται πλέον από τα κρυσταλλογραφικά δεδοµένα δηµιουργώνταςµια πληρέστερη εικόνα γύρω από τουςµεταφορείςενεργού µεταφοράς. 2

1.2 Η οικογένεια µεταφορέων πουρινών NAT/NCS2 Παρ όλα αυτά, τα προβλήµατα που υπάρχουν στον τρόπο ανάλυσηςµιας διαµεµβρανικήςπρωτεΐνηςπαραµένουν πολλά. Έτσι, ενώ ο αριθµόςγονιδίων που υπάρχουν στιςσηµερινέςτράπεζεςδεδοµένων και θεωρείται ότι κωδικοποιούν για πρωτεΐνεςµεταφοράςείναι µεγάλος(saier, 2000, Ren et al., 2004), πολύ λίγεςαπό αυτέςέχουν χαρακτηριστεί ή µελετηθεί εκτενώςσε µοριακό επίπεδο. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί η ευρέωςδιαδεδοµένη οικογένεια µεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων ασκορβικού (NAT, Nucleobase-Ascorbate Transporter) (de Koning and Diallinas, 2000) που ονοµάζεται και οικογένεια-2 συµµεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων κατιόντων (NCS2, Nucleobase-Cation Symporter-2) (TC 2.A.40, http://saier-144-164.ucsd.edu/tcdb/). Η οικογένεια αριθµεί σήµερα πάνω από 90 µέλη των οποίων η αλληλουχία έχει προσδιορισθεί, αλλά λίγα από αυτά έχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά. Η οικογένεια NAT/NCS2 είναι η σηµαντικότερη και πληρέστερη εξελικτικά από τις6 γνωστέςγονιδιακέςοικογένειεςµεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων που γνωρίζουµε σήµερα (Kraupp and Marz, 1995, de Koninng and Jarvis, 1999, de Koning and Diallinas, 2000, Willins et al, 2002, Wallace et al., 2002, Cecchetto et al., 2004) και απαντάται σε όλα σχεδόν τα είδη και στα 5 βασίλεια οργανισµών, εξαιρουµένων µόνο των εκφυλισµένων γονιδιωµάτων ορισµένων ζυµοµυκήτων, παρασιτικών πρωτόζωων και ενδοπαρασιτικών βακτηρίων. Τα µέλη τηςοικογένειας αυτήςπαρουσιάζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον κυρίωςλόγω τηςσηµασίαςτων νουκλεοτιδικών βάσεων στο µεταβολισµό των κυττάρων, αλλά και λόγω του γεγονότοςότι πολλά αντιµικροβιακά, αντιϊκά και αντικαρκινικά φάρµακα (π.χ 5- φθοροκυτοσίνη, 5-φθοροουρακίλη, αλλοπουρινόλη, οξυπουρινόλη) φαίνεται ότι αναγνωρίζονται και / ή εισέρχονται µέσα στα κύτταρα διαµέσου αυτήςτης οικογένειαςµεταφορέων (Kraupp and Marz, 1995, de Koninng and Jarvis, 1999, de Koning and Diallinas, 2000, Willins et al, 2002, Wallace et al., 2002). Εποµένως, η έρευνα των µοριακών µηχανισµών αναγνώρισηςκαι µεταφοράςνουκλεοτιδικών βάσεων µέσα στα κύτταρα συνδέεται µε βιοϊατρικέςκαι φαρµακολογικέςεφαρµογές. Παρά το µεγάλο ενδιαφέρον, τα µέλη τηςοικογένειαςπου έχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά έωςσήµερα είναι λίγα. Χαρακτηριστικότερα από αυτά είναι οι µεταφορείςξανθίνηςygfo και YicE του βακτηρίου E.coli (Karatza and Frillingos, 2005), ο µεταφορέαςξανθίνηςpbux (Christiansen et al., 1997) και οι 3

µεταφορείςουρικού PucJ και PucK (Schultz et al., 2001) του βακτηρίου Bacillus subtilis. Ακόµη, ο µεταφορέαςξανθίνης/ ουρικού οξέοςuapa και έναςµεταφορέας ευρύτερηςεξειδίκευσης, ο UapC, του ασκοµύκητα Aspergillus nidulans (Gorfinkiel et al., 1993, Diallinas et al., 1995, Diallinas et al., 1998) και ο µεταφορέαςξανθίνης/ ουρικού Xut1 του ζυµοµύκητα C.albicans (Goudela et al., 2005). Επιπλέον, o µεταφορέαςξανθίνης/ ουρικού Lpe1 του καλαµποκιού (Argyrou et al., 2001), ο µεταφορέαςουρακίληςuraa τηςe.coli (Andersen et al., 1995) και ο µεταφορέας ουρακίληςpyrp του Bacillus subtilis (Turner et al., 1994, Martinussen et al., 2001). Τέλος, χαρακτηρισµένοι λειτουργικά είναι και οι µεταφορείς θηλαστικών SVCT1 και SVCT2 (Tsukaguchi et al., 1999), οι οποίοι δεν δρουν ωςσυµµεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων : H +, όπωςόλοι οι παραπάνω, αλλά ωςσυµµεταφορείς ασκορβικού οξέος (βιταµίνης C) : Na +. Από τα παραπάνω φαίνεται ότι τα µέλη της οικογένειαςnat/ncs2 µπορούν να διαχωριστούν σε τρειςοµάδεςµεταφορέων. Η πρώτη οµάδα µεταφέρει οξειδωµένεςπουρίνες(ξανθίνη και / ή ουρικό οξύ), η δεύτερη ουρακίλη και η τρίτη, που συναντάµε µόνο στα θηλαστικά, L-ασκορβικό (Tsukaguchi et al., 1999, Liang et al., 2001, de Koning and Diallinas, 2000, Goudela et al., 2005). 1.3 Ο µεταφορέας UapA και το µοτίβο υπογραφή της οικογένειας NAT/NCS2 Έωςσήµερα, το εκτενέστερα µελετηµένο µέλοςτηςοικογένειαςnat/ncs2 είναι ο µεταφορέαςuapa του ασκοµύκητα Aspergillus nidulans. Πρόκειται για µια πρωτεΐνη 615 καταλοίπων µε πιθανή δοµή 12-14 διαµεµβρανικών τµηµάτων που είναι συµµεταφορέαςουρικού οξέος/ ξανθίνηςκαι κατιόντων Η +, ενώ µπορεί να µεταφέρει και ανάλογα αυτών (2-θειοουρικό οξύ, 2-θειοξανθίνη, αλλοπουρινόλη, οξυπουρινόλη) (Diallinas and Scazzocchio, 1989, Gorfinkiel et al., 1993, Diallinas et al., 1995, 1998, Meintanis et al., 2000, Amillis et al., 2001, 2004). Πειράµατα µεταλλαξιγένεσηςσηµειακήςστόχευσης, καταστολήςαπό µεταλλάξειςδεύτερης θέσηςκαι κυρίωςαναλύσειςχιµαιρικών µεταφορέων πουρινών µε τµήµατα της πρωτεΐνηςuapa και τηςπαράλογηςαυτήςπρωτεΐνηςτου Aspergillus nidulans UapC (Diallinas et al., 1998, Meintanis et al., 2000, Amillis et al., 2001), κατέδειξαν µια συντηρηµένη περιοχή που περιέχει κατάλοιπα που επηρεάζουν την αναγνώριση 4

υποστρώµατοςκαι την εξειδίκευση του µεταφορέα. Η αλληλουχία αυτή ονοµάστηκε αλληλουχία υπογραφή για την οικογένεια NAT/NCS2 ή απλά µοτίβο υπογραφή (Diallinas et al., 1998, Meintanis et al., 2000). Η αλληλουχία υπογραφή αποτελείται από 10 κατάλοιπα 324 [Q/E/P]-N-X-G- X-X-X-X-T-[R/K/G] 333 (όπου Χ, υδρόφοβο αµινοξύ, η αρίθµηση είναι από την πρωτεΐνη YgfO) (Εικόνα 1), εντοπίζεται θεωρητικά στην κυτταροπλασµατική θηλειά (loop) αµέσωςπριν το ένατο διαµεµβρανικό τµήµα (TMS9) σε τοπολογικό µοντέλο µε 12 διαµεµβρανικά τµήµατα, όπωςπροβλέπεται από in silico αναλύσειςτης δευτεροταγούςδοµής(πρόγραµµα TMHMM, www.sbc.su.se/prodiv-tmhmm). Η αλληλουχία υπογραφή είναι διατηρηµένη σε πολλά µέλη τηςοικογένειαςαπό τα βακτήρια µέχρι τον άνθρωπο (de Koning and Diallinas, 2000). Τα κατάλοιπα που εµφανίζονται µε έντονα µαύρα γράµµατα φαίνεται να είναι απόλυτα συντηρηµένα σε όλουςτουςλειτουργικά χαρακτηρισµένουςµεταφορείς. Tο κατάλοιπο 333 φαίνεται να διαδραµατίζει ρόλο στο είδοςκαι το εύροςτων υποστρωµάτων που προσλαµβάνονται από το µεταφορέα (Π. Καρατζά και Ε. Φριλίγγος, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα, Koukaki et al., 2005). Ακόµα, µετάλλαξη 2 εκ των καταλοίπων του µοτίβου (Q324, N325) ακόµη και στα πιο συγγενή αµινοξέα φαίνεται να επηρεάζει σηµαντικά για την λειτουργία και την εξειδίκευση του µεταφορέα UapA (de Koning and Diallinas, 2000, Meintanis et al., 2000, Koukaki et al., 2005). Πρόσφατεςµελέτεςέδωσαν κάποια στοιχεία για τον τρόπο µε τον οποίο ο µεταφορέαςuapa αντιδρά µε τα υποστρώµατά του, δίνονταςπαράλληλα και κάποιες ενδείξειςγια τα κατάλοιπα που συµµετέχουν στη δέσµευση και µεταφορά αυτών. Έτσι, από πειράµατα αναστολήςµε ανάλογα πουρινών υποδείχθηκε ότι οι απαραίτητεςγια τη δέσµευση του υποστρώµατοςαλληλεπιδράσειςγίνονται κυρίωςµε το Ν1-Η και το =Ο6 του πυριµιδινικού δακτυλίου ενώ η αλληλεπίδραση µε τον ιµιδαζολικό δακτύλιο γίνεται µέσω των Ν7, Ν8 ή Ν9 (Goudela et al., 2005) (Εικόνα 2). Παρ όλα αυτά, θεµελιώδειςπλευρέςτων σχέσεων δοµής λειτουργίας, καθώς και τηςτοπολογικήςοργάνωσης, ειδικότερα προςτο στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνηςόπου βρίσκεται και το µοτίβο, παραµένουν αδιευκρίνιστες. 5

SVCT1_R. norvegicus Lpe1_ Z. mays UapA_ A.nidulans UapC_ A.nidulans Xut1_ C.albicans PbuX_ B.subtilis PucJ_ B.subtilis YgfO_ E.coli YicE_ E.coli YgfU_ E.coli YcdG_ E.coli YbbY _E.coli YgfQ_ E.coli YjcD_ E.coli YicO_ E.coli YieG_ E.coli 491 P N I G V L G I T K - (ascorbate) - 500 346 - E N A G L L AV T R -355 (uric acid/ xanthine) 433 - Q N N G V I A L T R - 442 (uric acid/ xanthine) 407 - Q N N G V I A L T R - 416 (uric acid/ xanthine) 386 - Q N N G V I S I T K - 395 (uric acid/ xanthine) 293 -Q N V G LV Q L T G - 302 (xanthine) 298 -Q N A G L L Q L T K -307 (uric acid) 324 - Q N N G V I QM T G -333 xanthine 336 - Q N N G V I Q L T G -345 xanthine 341 - Q N V G LVS V T R -350 331 - E N I G V M AVT K - 340 I 306 - S S I G L L T Q T G - 315 328 - E S A A G T AA G G -337 322 - E S A A G T AA G G - 331 A - T - S 345 - E S T S G V AVGG - 354 318 - E S S S G V S VG G - 327 Εικόνα 1. Το µοτίβο υπογραφή στην αλληλουχία µελών τις οικογένειας NAT/NCS2. Στη δεξιά µεριά φαίνεται το υπόστρωµα των µεταφορέων που έχει βρεθεί ότι µεταφέρουν πουρίνεςή ασκορβικό οξύ. Κάτω από τη γραµµή διακρίνονται τα 9 από τα 10 µέλη τηςοικογένειαςπου υπάρχουν στο γονιδίωµα της E.coli (http://www.membranetransport.org), ενώ ανάµεσα στις2 γραµµές διακρίνονται οι 4 µεταφορείςπου διατηρούν το µοτίβο. Με κάθετεςµπάρεςεπισηµαίνονται τα αµινοξέα που είναι πλήρωςσυντηρηµένα σε όσουςµεταφορείςέχουν χαρακτηριστεί λειτουργικά ενώ µε γκρι πλαίσιο επισηµαίνεται ο µεταφορέαςygfo. Η αρίθµηση αντιστοιχεί στην αλληλουχία κάθε µεταφορέα. 1.4 Μεταφορείς πουρινών στα βακτήρια Στα βακτήρια, µέχρι πρόσφατα δεν είχε χαρακτηριστεί κανέναςµεταφορέας οξειδωµένων πουρινών (ξανθίνης, ουρικού, υποξανθίνης). Σε αντίθεση µε το βακτήριο B.subtilis (Schultz et al., 2001) και άλλα βακτήρια που µπορούν να αναπτυχθούν χρησιµοποιώνταςόλεςτιςφυσικέςπουρίνεςωςβασική πηγή αζώτου, η E.coli δεν µπορεί να αξιοποιήσει πουρίνεςωςµοναδική πηγή αζώτου, πλην τις αδενίνης. Παρ όλα αυτά, µπορεί να χρησιµοποιήσει πουρίνες όπως η ξανθίνη, η υποξανθίνη και η γουανίνη προκειµένου να υποβοηθήσει την αερόβια αύξηση των κυττάρων όταν ωςβασική πηγή αζώτου χρησιµοποιούνται άλλα µόρια (αµµώνιο, ασπαρτικό) (Xi et al., 2000). Tα παραπάνω αποκτούν ιδιαίτερο ενδιαφέρον αν αναλογιστούµε ότι µελέτεςβιοπληροφορικήςστην E.coli έδειξαν ότι στο γονιδίωµά τηςυπάρχουν πολλά παράλογα τηςοικογένειαςnat/ncs2 που θα µπορούσαν να λειτουργούν φυσιολογικά ωςµεταφορείςξανθίνης. 6

Πιο συγκεκριµένα, από in silico αναλύσειςβρέθηκε ότι 10 µέλη της οικογένειαςnat/ncs2 υπάρχουν στο γονιδίωµα τηςe.coli (http://www.membranetransport.org) (Εικόνα 1). Από αυτά µόνο ο µεταφορέας ουρακίληςuraa είχε χαρακτηριστεί λειτουργικά (Andersen et al., 1995). Από τους υπόλοιπους9 µεταφορείς, µόνο 4 είχαν στην αλληλουχία τουςτο µοτίβο υπογραφή (YgfO, YicE, YgfU, YcdG) (Diallinas et al., 1998; Amillis et al., 2001, Karatza and Frillingos, 2005). Από αυτούςτους4, οι µεταφορείςygfo και YicE οµοιάζουν µε τουςµεταφορείςuapa και UapC του A.nidulans καθώςέχουν 30% ταυτότητα αλληλουχίαςκαι 70% ταυτότητα στα 10 κατάλοιπα του µοτίβου ( 324 [Q/E/P]-N-X-G- X-X-X-X-T-[R/K/G] 333 ). Οι δυο αυτοί µεταφορείςθεωρήθηκαν ωςπιθανοί µεταφορείςξανθίνηςκαι πρόσφατα τα γονίδιά τουςκλωνοποιήθηκαν από το γονιδίωµα της E.coli και υπερεκφράσθηκαν εξωχρωµοσωµικά σε λειτουργική µορφή (Karatza and Frillingos, 2005). Ο λειτουργικόςχαρακτηρισµόςτουςέδειξε ότι και οι δυο µεταφορείςλειτουργούν ωςειδικοί και µεγάληςσυγγένειαςµεταφορείςξανθίνης, χωρίςνα µπορούν να µεταφέρουν ουρικό οξύ, υποξανθίνη, ουρακίλη ή οποιαδήποτε άλλη φυσική νουκλεοτιδική αζωτούχο βάση. 1.5 Ο µεταφορέας ξανθίνης YgfO : τι είναι γνωστό έως σήµερα Ο µεταφορέαςygfo, που αποτελεί το αντικείµενο µελέτηςαυτήςτης εργασίας, είναι µια πρωτεΐνη 466 αµινοξέων µε πιθανή δοµή 12 διαµεµβρανικών τµηµάτων και 45% ταυτότητα καταλοίπων µε το µεταφορέα YicE. Πειράµατα διαµεµβρανικήςµεταφοράςµε [ 3 Η] ξανθίνηςέδειξαν ότι µπορεί να λειτουργήσει ως έναςειδικόςκαι µε µεγάλη συγγένεια µεταφορέαςξανθίνης(k m 4.8 µμ, V max 6.6 nmol.mg -1.min -1 ). Ακόµη, πειράµατα που έγιναν µε πρωτονιοφόρα µόρια (π.χ CCCP), έδειξαν ότι η µεταφορά του υποστρώµατοςεξαρτάται από τη συµµεταφορά πρωτονίων (Karatza and Frillingos, 2005). Συνεπώς, πρόκειται για έναν ειδικό συµµεταφορέα ξανθίνης: Η +. Εναλλακτικέςκατασκευέςτου µεταφορέα σηµασµένες στο C-τελικό άκρο είτε µε την περιοχή δέσµευσηςβιοτίνηςτου βακτηρίου Klebsiella pneumoniae (92 αµινοξέα), είτε µε την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (239 αµινοξέα), είτε µε 10 συνεχόµενα κωδικόνια His, έδειξαν την έκφραση του µεταφορέα στη µεµβράνη κυττάρων E.coli. Οι σηµασµένοι µεταφορείςδεν έδειξαν καµία αλλαγή ωςπροςτην ικανότητα πρόσληψηςξανθίνης(π.χ ο µεταφορέαςygfo- 7

BAD έχει K m 4.6 µμ), κάτι που τιςκαθιστά ικανέςνα χρησιµοποιηθούν σε περαιτέρω πειράµατα (Karatza and Frillingos, 2005). Πειράµατα ανταγωνισµού τηςπρόσληψης[ 3 Η] ξανθίνης, έδειξαν ότι ο YgfO δεν µπορεί να µεταφέρει ή να αναγνωρίσει ωςυπόστρωµα ή προσδέτη (ligand) ούτε ουρικό οξύ, ούτε και ανάλογα ξανθίνηςµε ογκώδη αµινοξέα ή Ν στη θέση 8 του ιµιδαζολικού δακτυλίου, σε έντονη αντίθεση µε τουςµεταφορείςuapa του ασκοµύκητα A.nidulans και Xut1 του ζυµοµύκητα C.albicans (Goudela et al., 2005). Ακόµη, δείχθηκε ότι, οι απαραίτητεςγια τη δέσµευση του υποστρώµατος αλληλεπιδράσεις, γίνονται κυρίως µε το Ν3-Η και το =Ο2 του πυριµιδινικού δακτυλίου ενώ η αλληλεπίδραση µε τον ιµιδαζολικό δακτύλιο γίνεται κυρίωςµέσω του Ν9 (Karatza and Frillingos, 2005, Goudela et al., 2005) (Εικόνα 2). Από παρόµοιεςµελέτες, είχε δειχθεί και η σπουδαιότητα του τελευταίου καταλοίπου του µοτίβου υπογραφής (Gly στο µεταφορέα YgfO), αλλαγή του οποίου στο αµινοξύ που υπάρχει στη διαπεράση UapA (Arg) έδειξε ότι βοηθά στην αναγνώριση του ουρικού οξέοςαπό το YgfO (Π. Καρατζά και Ε. Φριλίγγος, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). UapA/Xut1 YgfO/YicE H O N O 6 1 5 2 3 4 N N 7 8 9 N H H O N O 6 1 2 3 4 5 N N 7 8 9 N H H H Xanthine/uric acid xanthine Εικόνα 2. Σχετική σηµασία των θέσεων 1-9 του πουρινικού δακτυλίου της ξανθίνης για την αναγνώριση υποστρώµατος από µυκητιακά (UapA/Xut1) ή βακτηριακά (YgfO/YicE) µέλη της οικογένειας µεταφορέων NAT/NCS2 (βλ. κείµενο). Με γκρι βέλη φαίνονται οι θέσεις που όταν τροποποιηθούν επηρεάζουν σηµαντικά την αναγνώριση υποστρώµατος ενώ µε µαύρα βέλη φαίνονται οι θέσεις, τροποποίηση των οποίων δεν επιτρέπει την αναγνώριση υποστρώµατος. Η µελέτη του µεταφορέα YgfO καθώςκαι του YicE αποτέλεσε την αρχή για την ανάπτυξη ενόςπρότυπου βακτηριακού συστήµατοςγια την έρευνα των 8

σχέσεων δοµήςλειτουργίας, τηςτοπολογίας, των αλληλεπιδράσεων στη θέση δέσµευσηςυποστρώµατος, τηςδυναµικήςτηςδοµήςκαι άλλων στοιχείων του µηχανισµού λειτουργίαςτων µεταφορέων τηςοικογένειαςnat/ncs2. Για τη βέλτιστη αξιοποίηση αυτού του συστήµατος, κατασκευάσθηκε στο εργαστήριό µας έναςµεταφορέαςπου είχε αντικατεστηµένεςόλεςτιςεγγενείςκυστεΐνες(5) του µεταφορέα µε σερίνη (YgfO-Cys-less). Ο µεταφορέαςygfo-cys-less εκφραζόταν κανονικά στη µεµβράνη των κυττάρων και είχε παρόµοια ενεργότητα και συγγένεια µεταφοράςξανθίνης(k m 5.5 µμ, V max 10.2 nmol.mg -1.min -1 ) µε αυτόν του φυσικού τύπου (Π. Καρατζά, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα). 9

1.6 Οι στόχοι της παρούσας εργασίας Με έναυσµα τα µέχρι σήµερα δεδοµένα τόσο για τον µεταφορέα UapA όσο και για το µεταφορέα YgfO, αλλά και τα ερωτήµατα που παραµένουν αναπάντητα για τη λειτουργία τους, προχωρήσαµε στη µελέτη των σχέσεων δοµής-λειτουργίας του µεταφορέα YgfO µε τεχνικέςκυστεϊνικήςσάρωσηςκαι µελέτεςσηµειακών τροποποιήσεων. Οι µελέτεςέγιναν σε µια σειρά 26 καταλοίπων (Gly315 Gly340) που εµπεριέχει το µοτίβο υπογραφή των µελών τηςοικογένειαςnat/ncs2. Σκοπόςµαςήταν η εύρεση του ρόλου των καταλοίπων του µοτίβου και η ανάδειξη καταλοίπων που επηρεάζουν τη δέσµευση, τη µεταφορά ή την εξειδίκευση υποστρώµατοςαπό το µεταφορέα YgfO. Ακόµη, µε πειράµατα αλκυλίωσηςµε αλκυλιωτικά, έναντι των σουλφυδρυλοµάδων των κυστεϊνών, αντιδραστήρια όπωςτο Ν-αιθυλµηλειµίδιο (ΝΕΜ) (Smyth et al., 1964) και το µεθανο-θειο-σουλφονικο αιθυλσουλφονικό αντιδραστήριο (MTSES) (Akabas et al., 1992) διερευνήσαµε τη δοµή και τη θέση τηςσειράςκαταλοίπων που µελετήθηκε. Τα αποτελέσµατά µαςαναδεικνύουν δυο κατάλοιπα σηµαντικά για τη σωστή διαµόρφωση και έκφραση του YgfO στη µεµβράνη των κυττάρων και δυο κατάλοιπα που είναι απαραίτητα για τη σωστή λειτουργία του µεταφορέα. Ακόµη, τα πειράµατα αναστολήςυποδεικνύουν ότι η τελευταία περιοχή των καταλοίπων που µελετήθηκαν έχει δοµή α έλικας. 10

2. Υλικά και Μέθοδοι 11

2.1 Όργανα Κατά την εκπόνηση τηςσυγκεκριµένηςµεταπτυχιακήςεργασίας χρησιµοποιήθηκαν τα ακόλουθα όργανα : φυγόκεντροςsorvall RC-5B (Du Pont Instruments, Newton, Connecticut), φυγόκεντροςheraeus Megafuge 1.0R (Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Germany), υπερφυγόκεντροςbeckmann Optima TM Ultracentrifuge (Beckmann Instruments, Palo Alto, California), συσκευή ηλεκτροφόρησηςπρωτεϊνών ProteanII xi Cell και συσκευή ηλεκτροφορητικής µεταφοράςmini Trans-Blot transfer Cell (Bio-Rad, Hercules, California), µετρητής υγρού σπινθηρισµού σωµατιδίων β (Liquid Scintillation Counter) (Packard Instruments, Meriden, Connecticut), συσκευή ταχείαςδιήθησης(glass filter holder assembly) (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA.), φωτόµετρο Ultraspec-2001 (Biochrom, Cambridge, England), συσκευή αλυσιδωτήςαντίδρασηςπολυµεράσης GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, California), φυγοκεντρικόςσυµπυκνωτήςκενού (SpeedVac concentrator) (Savant Instruments, Hicksville, New York), Slab gel dryer-1160 (Hoefer Science International, San Francisco, California), digital sonifier model 250-D (Branson Ultrasonics, Danbery, Connecticut). 2.2 Χηµικά Αναλώσιµα Η [8-3 Η] ξανθίνη (18 Ci/mmol) αγοράσθηκε από την εταιρεία Moravek Biochemicals (Brea, CA), ενώ οι µη ραδιενεργέςνουκλεοτιδικέςβάσειςήταν της εταιρείαςsigma (St. Louis, MO). Τα δεοξυριβονουκλεοτίδια που χρησιµοποιήθηκαν ωςεκκινητές(primers) στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης(polymerase Chain Reaction, PCR) συντέθηκαν από την εταιρεία BioSpring GmbH (Frankfurt, Germany). Η επαλήθευση αλληλουχιών DNA έγινε σε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας(mwg-biotech Α.G, Ebersberg, Germany). Στην αντίδραση PCR χρησιµοποιήθηκε η Expand High Fidelity Taq πολυµεράση (Expand High Fidelity PCR System) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Στιςαντιδράσειςανασύνδεσης χρησιµοποιήθηκε DNA λιγάση του βακτηριοφάγου Τ4 τηςεταιρείαςinvitrogen (Groningen, The Netherlands). Η περιοριστική ενδονουκλεάση BamH1 που 12

χρησιµοποιήθηκε ήταν τηςεταιρείαςmbi Fermentas GmbH (St. Leon-Rot, Germany) ενώ η περιοριστική ενδονουκλεάση Hpa1 ήταν τηςεταιρείαςnew England Biolabs, Inc. (Beverly, Massachusetts). Το Ν-αιθυλµηλεϊµίδιο (NEM) ήταν τηςεταιρείαςsigma. To πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon (Oregon Green Maleimide, OGM) ήταν από την εταιρεία Molecular Probes ενώ το µεθανο-θειο-σουλφονικο αιθυλσουλφονικό αντιδραστήριο (MTSES) (Sodium(2-Sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) ήταν από την εταιρεία Toronto Chemical Research (Toronto, Canada). Το αντίσωµα έναντι του δωδεκαπεπτιδίου που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο τηςlacy του βακτηρίου E.coli (Carrasco et al., 1984) συντέθηκε από την εταιρεία BabCo (Richmond, California) και παραχωρήθηκε ευγενώςαπό τον H. R. Kaback (Howard Hughes Medical Institute, UCLA). Η πρωτεΐνη Α συνδεδεµένη µε το ένζυµο υπεροξειδάση (horseradish peroxidase (HRP)-labeled protein A) που χρησιµοποιείται σαν δεύτερο αντίσωµα καθώςκαι το σύζευγµα αβιδίνηςυπεροξειδάσης(avidin-hrp) ήταν τηςεταιρείαςamersham Pharmacia BioTech (Upsala, Sweden). Το αντίσωµα έναντι του πράσινου µηλεϊµιδίου του Oregon ήταν τηςεταιρείαςmolecular Probes (Eugene, Oregon). Η µονοµερήςαβιδίνη (monomericavidin) ήταν τηςεταιρείαςpierce (Rockford, Illinois). 2.3 Πλασµίδια και κυτταρικά στελέχη Ωςφορέαςκλωνοποίησηςχρησιµοποιήθηκε το πλασµίδιο pt7-5 (Tabor and Richardson, 1985). Ωςεκµαγείο στιςκατασκευέςµε αντίδραση PCR, ωςφορείς κλωνοποίησηςή ωςδείγµατα ελέγχου χρησιµοποιήθηκαν τα εξήςπλασµίδια : 1) pt7-5/ygfo-cys-less (Π. Καρατζά, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα) που περιέχει το γονίδιο για τη διαπεράση YgfO µε αλλαγµένα τα 5 κατάλοιπα εγγενών Cys σε Ser, υπό το µεταγραφικό έλεγχο του υποκινητή/χειριστή του συνεργειώµατοςτηςλακτόζης(lac operon), την περιοχή δέσµευσηςβιοτίνης(biotin acceptor domain, BAD) που προέρχεται από την οξαλοξική αποκαρβοξυλάση του βακτηρίου Klebsiella pneumoniae (Consler et al., 1993) και το καρβοξυτελικό δωδεκαπεπτίδιο τηςlacy (LSLLRRQVNEVA, C-τελικός επίτοπος) τα οποία προστέθηκαν αµέσωςµετά το καρβοξυτελικό άκρο του γονιδίου. 2) pt7-5/ygfo-bad (Karatza and Frillingos, 2005), το οποίο περιέχει το γονίδιο για τη διαπεράση YgfΟ φυσικού τύπου υπό το 13

µεταγραφικό έλεγχο του υποκινητή/χειριστή του συνεργειώµατοςτηςλακτόζηςτην περιοχή δέσµευσηςβιοτίνηςκαι το C-τελικό επίτοπο. 3) pt7-5/lacy-cxb (Wu and Kaback, 1994) περιέχει το γονίδιο για τη LacY υπό τον µεταγραφικό έλεγχο του υποκινητή του συνεργειώµατοςτηςλακτόζης, µια θέση αναγνώρισης στο C-τελικό άκρο για τον παράγοντα Χα (factor Xa protease site) και την περιοχή δέσµευσης βιοτίνης(biotin acceptor domain, BAD). Ωςξενιστέςγια την κλωνοποίηση και την αναπαραγωγή των πλασµιδίων χρησιµοποιήθηκαν βακτηριακά κύτταρα E.coli. Το στέλεχος TOP10F (F {laci q, Tn10(Tet R )} mcra (mrr-hsdrms-mrcbc) φ80lacζ Μ15 lacx74 deor reca1 arad139 (ara-leu)7697 galu galk rpsl(str R ) enda1 nupg) (Invitrogen) χρησιµοποιήθηκε λόγω του υψηλού βαθµό επιδεκτικότηταςπου διαθέτει. Το στέλεχος T184 [laci + O + Z - Y - (A), prsl, Μet -, Τhr -, reca, hsdm, hsdr/f, laci q O + Z D118 (Y + A + )] (lacz - Y - ) (Teather et al., 1980) χρησιµοποιήθηκε για την επαγόµενη έκφραση των διαπερασών εξωγενώς, λόγω του ότι δεν περιέχει ενδογενή γονίδια που επάγονται µε IPTG. Τα κύτταρα TOP10F καταστήθηκαν επιδεκτικά (competent) µε βάση το πρωτόκολλο των Inoue et al. (1990). Το πρωτόκολλο χρησιµοποιεί σαν θρεπτικό υλικό διάλυµα S.O.B (2% w/v τρυπτόνη, 0.5% w/v εκχύλισµα ζύµης, 10 mm NaCl, 2.5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 10 mm MgSO 4 ) και διάλυµα αναδιάλυσηςτβ (10 mm PIPES, 15 mm CaCl 2, 250 mm KCl, 55 mm MnCl 2, ph 6.7). Τα επιδεκτικά κύτταρα επωάσθηκαν µε το εξωγενέςdna στους0 4 0 C για 5 min και το εναιώρηµα επιστρώθηκε απευθείαςσε προθερµασµένα στους37 0 C τρυβλία, που περιείχαν το κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωµα. Η ανάπτυξη των κυττάρων έγινε στους37 0 C, σε πλήρεςθρεπτικό υλικό, υπό αερόβιεςσυνθήκεςκαι υπό ανακίνηση στον επωαστήρα του θερµού θαλάµου, παρουσία των αντιβιοτικών αµπικιλλίνη (τελική συγκέντρωση 0.1 mg/ml) για τα TOP10F και αµπικιλλίνη (τελική συγκέντρωση 0.1 mg/ml)-στρεπτοµυκίνη (τελική συγκέντρωση 0.01 mg/ml) για τα T184. 14

2.4 Κατασκευή ανασυνδυασµένου DNA Για τιςκατασκευέςανασυνδυασµένων πλασµιδίων έγιναν αντιδράσειςpcr δυο σταδίων (Ho et al., 1989, Frillingos et al., 1994) και χρησιµοποιήθηκαν καθιερωµένεςτεχνικέςγενετικήςµηχανικής(sambrook et al., 1989). ΣτιςαντιδράσειςPCR χρησιµοποιήθηκε η Expand High Fidelity Taq πολυµεράση που είναι µίγµα των Taq και Pfu πολυµερασών. Οι εκκινητέςπου σχεδιάστηκαν και χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή των 26 µεταλλαγµάτων µοναδικήςκυστεΐνης(single-cys YgfOs) καθώςκαι για τις10 κατασκευέςπου έγιναν σε υπόστρωµα φυσικού τύπου φαίνονται στον Πίνακα 1. Σε κάθε αντίδραση PCR χρησιµοποιήθηκαν : 100 ng πλασµιδιακού DNA ή αντίστοιχεςποσότητεςπροϊόντων PCR µετά από καθαρισµό 0.3 µm από κάθε εκκινητή 10Χ ρυθµιστικού διαλύµατοςαντίδρασηςπου περιέχει MgCl 2 (τελική συγκέντρωση 1.5 mm) 0.25 mm από κάθε δεόξυριβονουκλεοτίδιο (ddatp, ddttp, ddctp, ddgtp) 2.8 U από την Expand High Fidelity Taq πολυµεράση (Roche) Αποστειρωµένο dd. H 2 O από στήλη Millipore µέχρι τελικό όγκο 100 µl. 2.4.1 Μεταλλαξιγένεση σηµειακής στόχευσης µε τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης δυο σταδίων (επικάλυψη/επέκταση) Η τεχνική αυτή επιτρέπει την αλλαγή ενόςκωδικονίου µιαςαλληλουχίας DNA σε ένα άλλο µε τη χρήση αντίδρασηςpcr ενόςή περισσότερων σταδίων. Σε ένα πρώτο στάδιο χρησιµοποιούνται συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια για να δηµιουργηθούν τµήµατα DNA µε επικαλυπτόµενα άκρα, προερχόµενα από το ίδιο υπόστρωµα. Τα τµήµατα αυτά χρησιµοποιούνται στη συνέχεια ωςεκµαγεία για το δεύτερο στάδιο PCR στο οποίο εξαιτίαςτων επικαλυπτόµενων άκρων τους υβριδίζουν και µε τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων επεκτείνονται και δίνουν ένα προϊόν που αποτελείται από τα προηγούµενα τµήµατα (Σχήµα 1). 15

Αναλυτικότερα για το πρώτο στάδιο τηςαντίδρασηςχρησιµοποιούνται τέσσεριςεκκινητές(primers), οι Α, Β, Γ,. Οι δυο από αυτούς(γ, ) είναι εσωτερικοί και έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε να εισάγουν το κωδίκιο που εµείς θέλουµε (YYY) στη θέση του κωδικίου που έχει επιλεγεί (XXX). Ο έναςείναι εκκινητήςνοηµατικού κλώνου και ο άλλοςεκκινητήςµη νοηµατικού κλώνου, συµπληρωµατικοί µεταξύ τους. Οι άλλοι δυο εκκινητές (Α, Β), ένας νοηµατικού και έναςµη νοηµατικού κλώνου, είναι εξωτερικοί και έχουν σχεδιαστεί έτσι ώστε να υβριδίζουν στο 5 άκρο και στο 3 άκρο του γονιδίου στόχου, αντίστοιχα. Στο πρώτο στάδιο (Σχήµα 1) γίνονται 2 ξεχωριστέςαντιδράσεις(1, 2), που σαν εκµαγείο χρησιµοποιούν ολόκληρο το γονίδιο στόχο. Στην πρώτη αντίδραση, ωςζεύγη εκκινητών χρησιµοποιούνται ο Α και o ενώ στη δεύτερη αντίδραση ο Γ και ο Β. Τα δυο προϊόντα που προκύπτουν από αυτό το στάδιο αποτελούν το εκµαγείο για το δεύτερο στάδιο όπου χρησιµοποιούνται οι εκκινητέςα και Β. Λόγω της αλληλεπικάλυψηςτων άκρων τουςτα δυο προϊόντα υβριδίζουν και µε τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων επεκτείνονται και δίνουν ένα τελικό προϊόν που έχει τα χαρακτηριστικά του αρχικού γονιδίου και την επιθυµητή αλλαγή που εµείςεισάγαµε (ΧΧΧ σε ΥΥΥ) (Σχήµα 1). 16

Σχήµα 1. Σχηµατική απεικόνιση της µεταλλαξιγένεσης κατευθυνόµενης στόχευσης µε τη χρήση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης δυο σταδίων (βλ. Παράγραφος 2.4.1). 2.4.2 Ανασύνδεση των περιοριστικών θραυσµάτων Το τελικό προϊόν τηςπαραπάνω αντίδρασηςηλεκτροφορήθηκε σε πήγµα αγαρόζηςκαι αποµονώθηκε από αυτό µε βάση το πρωτόκολλο MinElute Gel Extraction Kit (Qiagen, West Sussex, UK). Στο καθαρισµένο προϊόν έγινε περιοριστική πέψη µε τα ένζυµα BamHI και HpaI που έχουν µοναδικέςθέσεις αναγνώρισης. Με τα ίδια ένζυµα κόπηκε και το πλασµίδιο που χρησιµοποιήθηκε ως φορέαςκλωνοποίησης(pt7-5/ygfo-bad) (βλ. Παράγραφο 2.3). Στην αντίδραση του φορέα έγινε αποφωσφορυλίωση των 5 άκρων µε αλκαλική φωσφατάση (Amersham Pharmacia Biοtech, London, UK). Τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν σε πήγµα αγαρόζης, καθαρίσθηκαν και συνδέθηκαν µε χρήση Τ4 DNA λιγάσης. Tο προϊόν της αντίδρασηςλιγάσηςεισήχθη µε µετασχηµατισµό σε κύτταρα TOP10F (βλ. 17

Παράγραφο 2.3). Οι αποικίεςεπιλέχθηκαν µε βάση την ανθεκτικότητά τουςσε αµπικιλλίνη και στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση του DNA σε µικρή κλίµακα µε βάση το πρωτόκολλο QiAprep Spin Mini Prep Kit (Qiagen). Η επιβεβαίωση τηςαλληλουχίαςτου DNA ανάµεσα στιςπεριοριστικέςθέσεις(bamhi- HpaI) έγινε σε αυτόµατο αναλυτή αλληλουχίας(mwg-biotech. A.G, Ebersberg, Germany) (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Τµήµα της αλληλουχίας (νουκλεοτίδια 1 453) της διαπεράσης µοναδικής κυστεΐνης Y338C, όπως προκύπτει από τον αυτόµατο αναλυτή αλληλούχισης της εταιρείας MWG. 18

Ανασδυασµένα πλασµίδια σε υπόστρωµα ελεύθερο κυστεϊνών pt7-5/ygfo/single-cys/g315c pt7-5/ygfo/single-cys S316C pt7-5/ygfo/single-cys L317C pt7-5/ygfo/single-cys P318C pt7-5/ygfo/single-cys L319C pt7-5/ygfo/single-cys T320C pt7-5/ygfo/single-cys T321C pt7-5/ygfo/single-cys F322C pt7-5/ygfo/single-cys A323C pt7-5/ygfo/single-cys Q324C pt7-5/ygfo/single-cys N325C pt7-5/ygfo/single-cys N326C pt7-5/ygfo/single-cys G327C pt7-5/ygfo/single-cys V328C pt7-5/ygfo/single-cys I329C pt7-5/ygfo/single-cys Q330C pt7-5/ygfo/single-cys M331C pt7-5/ygfo/single-cys T332C pt7-5/ygfo/single-cys G333C pt7-5/ygfo/single-cys V334C pt7-5/ygfo/single-cys A335C pt7-5/ygfo/single-cys S336C pt7-5/ygfo/single-cys R337C pt7-5/ygfo/single-cys Y338C pt7-5/ygfo/single-cys V339C pt7-5/ygfo/single-cys G340C Αλληλουχία εκκινητή νοηµατικού κλώνου (sense primer sequence) 5 -CCTCCGCTGTCTGTTCATTACCATTAAC- 3 5 -GCTGTCGGTTGCTTACCATTAACC- 3 5 -GTCGGTTCATGTCCATTAACCACG- 3 5 -GTCGGTTCATTATGCTTAACCACGTTTGC- 3 5 -GTTCATTACCATGC ACCACGTTTGC- 3 5 -GGTTCATTACCACTATGCACGTTTGCG- 3 5 -CATTACCACTAACCTGCTTTGCGCAAAATAATGG- 3 5 CATTACCACTAACCACGTGTGCGCAAAATAATG- 3 5 -CATTACCACTAACCACGTTCTGCCAAAATAATGG-3 5 -CCACGTTTGCGTGCAATAATGGG- 3 5 -CGTTTGCGCAATGCAATGGGGTTATTC- 3 5 -GTT TGCGCAAAATTGCGGGGTTATTCA- 3 5 -GCGCAAAATAACTGCGTGATTCAGATG- 3 5 -GCAAAATAACGGGTGTATCCAGATGAC- 3 5 -GCAAAATAATGGGGTTTGCCAGATGACTG- 3 5 -GGGTTATTTGCATGACTGGCGTC- 3 5 -GGGTTATTCAGTGTACTGGCGTC- 3 5 -GTTATTCAGATGTGTGGCGTCGCTTC- 3 5 -GTTATTCAGATGACTTGCGTCGCTTCA- 3 5 -CAGATGACTGGTTGTGCTTCACGTTATG- 3 5 -GATGACTGGCGTTTGTTCACGTTATGTC- 3 5 -GACTGGCGTTGCTTGTCGTTATGTC- 3 5 -GTCGCTTCATGTTAAATGTTGGGCGAAC- 3 5 -CTTCACGTTGTGTTGGTCGAACCATC- 3 5 -CTTCACGTTATTGTGGGCGAACCATC- 3 5 -CACGTTATGTCTGCCGAACCATC- 3 Πίνακας 1A. Τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια που κωδικοποιούν για διαπεράσες µοναδικής Cys και οι εκκινητές νοηµατικού κλώνου που χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή τους. Υπογραµµισµένη και µε έντονα πλάγια γράµµατα φαίνεται η τριπλέτα που εισήγαγε µια αλλαγή στη θέση του επιλεγέντοςαµινοξέος. Ο τρόποςονοµασίαςτων εκκινητών αλλά και των µεταλλαγµένων διαπερασών που ακολουθείτε σε όλη την εργασία, π.χ G315C, αναφέρεται στον αριθµό του καταλοίπου, στην αλληλουχία του YgfO, στο οποίο γίνεται η αλλαγή (315), στο κατάλοιπο που υπάρχει στη φυσικού τύπου διαπεράση στη θέση αυτή (G = Gly) και στο κατάλοιπο που εµείςεισάγουµε στη θέση (C = Cys). 19

Ανασδυασµένα πλασµίδια σε υπόστρωµα φυσικού τύπου pt7-5/ygfo/f322c (wt) pt7-5/ygfo/q324c (wt) pt7-5/ygfo/n325c (wt) pt7-5/ygfo/n326c (wt) pt7-5/ygfo/g340c (wt) pt7-5/ygfo/p318g (wt) pt7-5/ygfo/q324n (wt) pt7-5/ygfo/n325q (wt) pt7-5/ygfo/n326q (wt) pt7-5/ygfo/g340a (wt) Αλληλουχία εκκινητή νοηµατικού κλώνου (sense primer sequence) 5 CATTACCACTAACCACGTGTGCGCAAAATAATG- 3 5 -CCACGTTTGCGTGCAATAATGGG- 3 5 -CGTTTGCGCAATGCAATGGGGTTATTC- 3 5 -GTT TGCGCAAAATTGCGGGGTTATTCA- 3 5 -CACGTTATGTCTGCCGAACCATC- 3 5 -GTCGGTTCATTAGGATTAACCACGTTTGC- 3 5 -CCACGTTTGCGAACAACAATGGG- 3 5 -CGTTTGCGCAACAGAATGGGGTTATTC- 3 5 -GTTTGCGCAGAATCAAGGGGTTATTCAG-3 5 -CACGTTATGTCGCACGAACCATC- 3 Πίνακας 1Β. Τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια που κωδικοποιούν για διαπεράσες σε φυσικού τύπου υπόστρωµα και οι εκκινητές νοηµατικού κλώνου που χρησιµοποιήθηκαν για την κατασκευή τους. Υπογραµµισµένη και µε έντονα πλάγια γράµµατα φαίνεται η τριπλέτα που εισήγαγε µια αλλαγή στη θέση του επιλεγέντοςαµινοξέος. Ο τρόποςονοµασίαςτων εκκινητών αλλά και των µεταλλαγµένων διαπερασών που ακολουθείτε σε όλη την εργασία, π.χ F322C (wt), αναφέρεται στον αριθµό του καταλοίπου, στην αλληλουχία του YgfO, στο οποίο γίνεται η αλλαγή (322), στο κατάλοιπο που υπάρχει στη φυσικού τύπου διαπεράση στη θέση αυτή (F = Phe) και στο κατάλοιπο που εµείςεισάγουµε στη θέση (C = Cys). Τo (wt) (wild type) σηµατοδοτεί ότι η διαπεράση κατασκεύασθηκε σε υπόστρωµα φυσικού τύπου. 2.5 οκιµασία διαµεµβρανικής µεταφοράς (Transport Assay) Τα κύτταρα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν κύτταρα E.coli του στελέχουςτ184. Έγινε υγρή καλλιέργεια (37 0 C, 16 h) στιςκατάλληλεςσυνθήκεςεπιλογής(βλ. ανωτέρω) των κυττάρων που περιείχαν τα προςµελέτη πλασµίδια. Εν συνεχεία 1 ml καλλιέργειαςαραιώθηκε µε προσθήκη 9 ml θρεπτικού υλικού και αναπτύχθηκε στους 37 0 C έωςότου τα κύτταρα φθάσουν στο µέσο τηςλογαριθµικήςφάσηςανάπτυξης(2 h), όπωςπροέκυψε από προκαταρτικά πειράµατα µέτρησηςτηςοπτικήςπυκνότητας τηςκαλλιέργειας(στα 600 nm) συναρτήσει του χρόνου. Ακολούθησε επαγωγή των διαπερασών µε προσθήκη ισοπροπυλ-β-d-θειογαλακτοσιδίου (IPTG) (σε τελική συγκέντρωση 0.5 mm) και ανάπτυξη στους37 0 C για ακόµη 2 h. Μετά από 20

φυγοκέντρηση στην υπερφυγόκεντρο Heraeus (κεφαλή 3360 4 ) (6000 rpm, 10 min), το κυτταρικό ίζηµα ξεπλύθηκε, για την αποµάκρυνση του θρεπτικού υλικού, δυο φορές µε 10 ml ρυθµιστικού διαλύµατοςκp i (0.1 M, ph 7.5). Ακολούθησε τρίτη φυγοκέντρηση και το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1mL του ίδιου διαλύµατος. Μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 420 nm και τα δείγµατα αραιώθηκαν µε προσθήκη κατάλληλου όγκου ρυθµιστικού διαλύµατοςέτσι ώστε η τελική τιµή της οπτικήςπυκνότηταςστα 420 nm να είναι 10. Η τιµή αυτή ισοδυναµεί µε συγκέντρωση πρωτεΐνης0.7 mg/ml σύµφωνα µε πρότυπεςκαµπύλεςπαλαιότερων πειραµάτων (Karatza and Frillingos, 2005). Η επώαση µε το ραδιενεργό υπόστρωµα έγινε σε 50 µl δείγµατοςστα οποία προστέθηκε η ραδιενεργόςξανθίνη ([ 3 Η] Xanthine) (ειδική ενεργότητα 18 Ci/mmol) (τελική συγκέντρωση 1µΜ). Ο τερµατισµόςτηςαντίδρασηςέγινε µετά από τους επιθυµητούςχρόνουςµε 2Χ3 ml διαλύµατοςτερµατισµού (KP i 0.1M, LiCl 0.1M, ph 5.5) µε ταχεία διήθηση (rapid filtration) υπό κενό σε ηθµό διήθησης(whatman GF/C, 25 mm-circle, µε διάµετρο πόρων 1.2 µm) (Frillingos et al., 1994). Ο ηθµός τοποθετήθηκε σε κατάλληλα σωληνάρια (scintiallation vials) και αναµίχθηκε µε υγρό σπινθηρισµού (scintillation fluid) (8 ml). Tο υγρό σπινθηρισµού ήταν µίγµα τολουόλιου, 66% (v/v) και Triton X-100, 33% (v/v) που περιέχει 2,5-διφαινυλοξαζόλη (ΡΡΟ), 4% (w/v), και 1,4-δις(5-φαινυλοξαζολ-2-υλ) βενζένιο (ΡΟΡΟΡ), (0.04% w/v). Tα δείγµατα µετρήθηκαν σε µετρητή υγρού σπινθηρισµού σωµατιδίων β (του τµήµατοςβιοχηµείαςτου Χηµικού Τµήµατοςκαι του τµήµατος ΦαρµακολογίαςτηςΙατρικήςΣχολής). 2.6 Αλκυλίωση των σουλφυδρυλικών οµάδων των κυστεϊνών µε τα αντιδραστήρια NEM και MTSES Τα κυτταρικά δείγµατα που είχαν ολική συγκέντρωση πρωτεΐνης0.7 mg/ml, επωάστηκαν µε ή χωρίςµη ραδιενεργή ξανθίνη (cold xanthine) (η επώαση µε το πρόσδεµα έγινε για 5 min στους25 0 C, τελική συγκέντρωση 1 mm) και στη συνέχεια µε ΝΕΜ (σε συγκεντρώσειςαπό 0.01 mm έως2 mm) ή µε MTSES (σε συγκέντρωση 0.2 mμ) για χρόνουςαπό 0 έως30 min σε υδατόλουτρο στους25 0 C. Ο τερµατισµός τηςαντίδρασηςέγινε µε διθειοθρεϊτόλη (DTT) (σε µοριακή περίσσεια 10Χ έναντι του µηλεϊµιδίου). 21

Στα πειράµατα που δεν έγινε επώαση µε κάποιο πρόσδεµα, ακολούθησε δοκιµασία διαµεµβρανικήςµεταφοράς. Στα πειράµατα που έγινε επώαση µε µη ραδιενεργή ξανθίνη, για την αποµάκρυνση από το κάθε δείγµα τηςπερίσσειαςαυτήςκαθώςκαι των ΝΕΜ, MTSES και DTT έγινε αραίωση σε 40 ml ρυθµιστικού διαλύµατοςκp i (0.1 M, ph 7.5) και φυγοκεντρική ανάκτηση των κυττάρων (6000 rpm, 10 min). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 40 ml του ίδιου διαλύµατοςκαι ακολούθησε νέα φυγοκέντρηση (6000 rpm, 10 min). Το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος, τοποθετήθηκε σε µικροσωληνάρια τύπου eppendorf και ακολούθησαν τρειςφυγοκεντρήσειςσε επιτραπέζια φυγόκεντρο eppendorf (13000 rpm, 1 min). Η τελική επαναιώρηση έγινε σε 0.6 ml. Τα δείγµατα φωτοµετρήθηκαν στα 420 nm και η συγκέντρωση τηςπρωτεΐνηςρυθµίστηκε πάλι ώστε το κυτταρικό εναιώρηµα να έχει τιµή απορρόφησης10. Ακολούθησε δοκιµασία διαµεµβρανικήςµεταφοράς. Η επώαση µε το ραδιενεργό υπόστρωµα έγινε παρουσία µεθοσουλφονικού φαιναζινίου (phenazinemethosulphate, PMS) σε τελική συγκέντρωση 0.2 mm και ασκορβικού καλίου σε τελική συγκέντρωση 20 mm. 2.7 Παρασκευή κλάσµατος µεµβρανών Τα κύτταρα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν κύτταρα E.coli του στελέχουςτ184 και η µέθοδοςπου εφαρµόσθηκε περιελάµβανε οσµωτικό σοκ, επώαση µε EDTA/ λυσοζύµη και κατεργασία µε υπέρηχους(konings et al., 1971 ; Frillingos et al., 1994). Αναλυτικότερα, έγινε υγρή καλλιέργεια (37 0 C, 16 h) µε τιςκατάλληλες συνθήκεςεπιλογής(βλ. ανωτέρω) στα κύτταρα που περιείχαν τα προςµελέτη πλασµίδια. Εν συνεχεία, 1 ml καλλιέργειαςαραιώθηκε µε προσθήκη 9 ml θρεπτικού υλικού και αναπτύχθηκε στους37 0 C έωςότου τα κύτταρα φθάσουν στο µέσο της λογαριθµικήςφάσηςανάπτυξης(2 h). Ακολούθησε επαγωγή των διαπερασών µε προσθήκη ισοπροπυλ-β-d-θειογαλακτοσιδίου (IPTG) (σε τελική συγκέντρωση 0.5 mm) και ανάπτυξη στους37 0 C για ακόµη 2 h. Μετά από φυγοκέντρηση στην υπερφυγόκεντρο Heraus (κεφαλή 3360 4 ) (6000 rpm, 10 min), το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 10 ml διαλύµατος επαναιώρησης,(tris-hcl50mm,ph8,nacl 22

100 mm, Na 2 EDTA 1mM) (Konings et al., 1971 ; Frillingos et al., 1994) και ακολούθησε νέα φυγοκέντρηση (6000 rpm, 10 min, 4 0 C). Το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml του ίδιου διαλύµατοςκαι µεταφέρθηκε σε µικροσωληνάρια τύπου eppendorf. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο eppendorf (13000 rpm, 2 min) και το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml διαλύµατος σακχαρόζης(tris-hcl 25 mm, ph 8, Sucrose 45%, Na 2 EDTA 1 mm). Μετά από επώαση στους4 0 C για 20 min έγινε νέα φυγοκέντρηση (13000 rpm, 1 min), το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 800 µl dd H 2 O και επωάστηκε για 10 min στους4 0 C. Ακολούθησε προσθήκη λυσοζύµης (τελική συγκέντρωση 0.125 mg/ml) και επώαση στους4 0 C για 30 min. Στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε οµοιογενοποίηση σε συσκευή υπερήχων. Εφαρµόσθηκαν 2 ώσεις διάρκειας15 sec, σε ένταση 40%. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν εκ νέου (13000 rpm, 2 min) και συλλέχθηκαν τα υπερκείµενα, τα οποία υποβλήθηκαν σε υπερφυγοκέντρηση (Beckmann, κεφαλή ΜLA 130) (90000 rpm, 10 min, 4 0 C). Το ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 40 µl dd H 2 O και τα δείγµατα φυλάχτηκαν στους4 0 C. Οι συγκεντρώσειςτων µεµβρανικών κλασµάτων προσδιορίστηκαν (βλ. Παράγραφο 2.9) και η συγκέντρωση ολικήςπρωτεΐνηςήταν από 2 mg/ml έως4 mg/ml. 2.7.1 οκιµασία αλκυλίωσης µε το πράσινο µηλεϊµίδιο του Oregon (Oregon Green Maleimide) Τα κύτταρα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν κύτταρα E.coli του στελέχουςτ184. Τα κύτταρα που περιείχαν τα προςµελέτη πλασµίδια αναπτύχθηκαν, επάχθηκαν µε IPTG και εκπλύθηκαν όπωςπεριγράφεται στην Παράγραφο 2.5. Η τελική επαναιώρηση των κυττάρων έγινε σε 1 ml. Ακολούθησε µέτρηση τηςοπτικής πυκνότηταςστα 420 nm και τα δείγµατα αραιώθηκαν µε προσθήκη κατάλληλου όγκου ρυθµιστικού διαλύµατοςkpi έτσι ώστε η τελική τιµή τηςοπτικήςπυκνότητας στα 420 nm να είναι 20. Η τιµή αυτή αντιστοιχεί σε συγκέντρωση πρωτεΐνης1.4 mg/ml σύµφωνα µε πρότυπεςκαµπύλεςπαλαιότερων πειραµάτων (Karatza and Frillingos, 2005). Στη συνέχεια 1 ml κυττάρων τοποθετήθηκε σε µικροσωληνάρια τύπου eppendorf και ακολούθησε αντίδραση µε OGM στους25 0 C για 15 min (τελική συγκέντρωση 40 µm). Ο τερµατισµόςτηςαντίδρασηςέγινε µε διθειοθρεϊτόλη (DTT) 23

(σε µοριακή περίσσεια 10Χ έναντι του OGM). Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο eppendorf (13000 rpm, 2 min), το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml διαλύµατοςπλυσίµατος(50 mm MOPS-K, ph 7) (Ye et al., 2001) και ακολούθησαν τρειςφυγοκεντρήσεις(13000 rpm, 1 min). Το κυτταρικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 1 ml διαλύµατοςεπαναιώρησης, (Tris-HCl 50 mm, ph 8, NaCl 100 mm, Na 2 EDTA 1 mm) (Konings et al., 1971 ; Frillingos et al., 1994). Ακολούθησε νέα φυγοκέντρηση στιςίδιεςσυνθήκεςκαι ανδιάλυση σε 1 ml διαλύµατοςσακχαρόζης(tris-hcl 25 mm, ph 8, Sucrose 45%, Na 2 EDTA 1 mm). Ακολούθησε επώαση µε λυσοζύµη, κατεργασία µε υπερήχουςκαι µια σειρά φυγοκεντρήσεων όπωςπροηγουµένως(βλ. Τµήµα 2.7). Το τελικό ίζηµα επαναιωρήθηκε σε 40 µl διαλύµατοςεξισορρόπησης (50 mm NaP i ph 7.5, 100 mm NaCl) και τα δείγµατα φυλάχθηκαν στους4 0 C. Οι συγκεντρώσειςτων µεµβρανικών κλασµάτων προσδιορίστηκαν και βρέθηκε ότι ήταν από 2 mg/ml έως4 mg/ml. Τα µεµβρανικά κλάσµατα διαλυτοποιήθηκαν µε διάλυµα n-δωδεκυλο-β-d- µαλτοπυρανοσιδίου (DDM) (2% w/v) για 5 min. Το εκχύλισµα αναµίχθηκε µε ακινητοποιηµένη µονοµερή αβιδίνη που είχε εξισορροπηθεί µε διάλυµα 50 mm KPi (ph 7.5), 100 mm NaCl, 0.02% DDM (w/v) (Consler et al., 1993). Μετά από επώαση 20 min στους4 0 C έγιναν τέσσεριςεκπλύσειςµε 1 ml διaλύµατος εξισορρόπησηςκαι οι βιοτινυλιωµένεςδιαπεράσεςεκλούσθηκαν µε 80 µl διαλύµατοςέκλουσης, δηλαδή διάλυµα εξισσορόπησηςπου περιείχε 5 mm d-βιοτίνη. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση επί πήγµατοςπολυακρυλαµιδίου δωδεκυλοθειϊκού νατρίου και ανοσοαποτύπωση. 2.8 Ανοσοαποτύπωση (Western blotting) Τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν επί πήγµατοςπολυακρυλαµιδίου δωδεκυλοθειϊκού νατρίου (Sodium Dodecyl Sulphate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) (SDS-PAGE). To πήγµα διαχωρισµού ήταν 12% σε ακρυλαµίδιο και το πήγµα επιστοίβαξης5%. Ωςδείκτηςπρότυπων µοριακών βαρών χρησιµοποιήθηκε ο Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range τηςεταιρείαςbio-rad Laboratories (Hercules, California). Μετά τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό των πρωτεϊνών, έγινε ηλεκτροφορική µεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνη πολυβινυλιδενικού φθοριδίου (PVDF) (Pall Corporation, Ann Arbor, Missouri) και ανοσοαποτύπωση. 24

Χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα έναντι του C- τελικού επιτόπου (BabCo) σε αραίωση 1:50000. Ωςδεύτερο αντίσωµα χρησιµοποιήθηκε η πρωτεΐνη Α συνδεδεµένη µε το ένζυµο υπεροξειδάση (HRP-labeled protein A) σε αραίωση 1:50000. Επιπλέον, για την ανοσοαποτύπωση των βιοτινυλιωµένων διαπερασών χρησιµοποιήθηκε το σύζευγµα αβιδίνης-υπεροξειδάσης (avidin-hrp) σε αραίωση 1:100000. Το αντίσωµα έναντι του µηλεϊµιδίου OGM χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:3000, και ωςδεύτερο αντίσωµα χρησιµοποιήθηκε η πρωτεΐνη Α συνδεδεµένη µε το ένζυµο υπεροξειδάση (HRP-labeled protein A) σε αραίωση 1:50000. Η ανίχνευση του σήµατοςέγινε µε τη µέθοδο τηςενισχυµένηςχηµειοφωταύγειας(ecl) (Amersham). 2.9 Προσδιορισµός ολικής πρωτεΐνης Ο προσδιορισµόςτηςολικήςπρωτεΐνηςτων δειγµάτων έγινε µε βάση το πρωτόκολλο BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce). Το πρωτόκολλο βασίζεται στο συνδυασµό τηςαναγωγήςτου Cu +2 σε Cu +1 σε ένα αλκαλικό περιβάλλον, µε την υψηλήςευαισθησίαςχρωµατοµετρική ανίχνευση του κατιόντοςχαλκού (Cu +1 ) (στα 562 nm) χρησιµοποιώνταςδισ-κιγχονινικό οξύ (bicinchoninic acid). 25

3. Αποτελέσµατα 26

3.1 Μεταλλαξιγένεση σάρωσης κυστεϊνών των καταλοίπων 315 340 της διαπεράσης YgfO Έχονταςωςπειραµατικό εργαλείο τη διαπεράση YgfO χωρίςκανένα κατάλοιπο εγγενών κυστεϊνών (YgfO-Cys-less), η οποία εκφράζεται σε παρόµοια επίπεδα µε τη διαπεράση YgfΟ φυσικού τύπου και έχει παρόµοια ενεργότητα µε αυτή (Π. Καρατζά, αδηµοσίευτα αποτελέσµατα), προχωρήσαµε σε µεταλλαξιγένεση σάρωσηςκυστεϊνών για την περιοχή καταλοίπων 315 έως340. Η περιοχή αυτή περιλαµβάνει µια χαρακτηριστική αλληλουχία αµινοξέων (motif) που είναι υψηλά συντηρηµένη ανάµεσα στα µέλη τηςοικογενείαςµεταφορέων NAT/NCS2 και φαίνεται να είναι σηµαντική για την αναγνώριση και την µεταφορά του υποστρώµατος(diallinas et al., 1998; Amillis et al., 2001). Προχωρήσαµε στην κατασκευή 26 διαπερασών µοναδικήςκυστεΐνης(single- Cys YgfOs) µεταλλάσσονταςτα κατάλοιπα 315 340 τηςδιαπεράσηςµε τη χρήση αλυσιδωτήςαντίδρασηςπολυµεράσηςδυο σταδίων (βλ. Υλικά και Μέθοδοι). Τα προϊόντα τηςαντίδρασηςεισήχθησαν στον κατάλληλο φορέα µε αντικατάσταση περιοριστικών θραυσµάτων και ακολούθησε έλεγχοςτηςαλληλουχίαςτου DNA τους ανάµεσα στιςπεριοριστικέςθέσειςbamhi HpaI (Εικόνα 3). Εν συνεχεία, προχωρήσαµε στον έλεγχο τηςέκφρασηςκαι τηςλειτουργίαςτων διαπερασών. 3.1.1 Έκφραση των single-cys YgfOs Η έκφραση ελέγχθηκε µε ανοσοαποτύπωση σε µεµβρανικά κλάσµατα των διαπερασών τόσο µε τη χρήση του συζεύγµατοςαβιδίνης-υπεροξειδάσηςέναντι της βιοτυνυλιωµένης in vivo περιοχήςδέσµευσηςβιοτίνης(εικόνα 4Α) όσο και µε τη χρήση αντισώµατοςέναντι του C-τελικού επιτόπου (Εικόνα 4Β). Παρατηρούµε ότι οι 21 από τις26 single-cys διαπεράσεςεκφράζονται σε επίπεδα παρόµοια µε αυτά της YgfO-Cys-less. Για 3 διαπεράσες(l317c, I329C, T332C) τα επίπεδα έκφρασηςείναι υψηλά αλλά σαφώςµειωµένα σε σχέση µε αυτά του YgfO-Cys-less. Τέλος, οι διαπεράσεςp318c και G340C εκφράζονται σε πολύ χαµηλά σχεδόν αµελητέα επίπεδα. 27

Εικόνα 4. Έκφραση των διαπερασών µοναδικής κυστεΐνης. Παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών από κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τιςαντίστοιχεςδιαπεράσεςκαι δείγµατά που περιείχαν 70 µg ολικήςπρωτεΐνηςαναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου 12%. Ακολούθησε µεταφορά σε µεµβράνη PVDF και ανοσοαποτύπωση µε δυο τρόπους : Α) Με τη χρήση του συζεύγµατος αβιδίνης υπεροξειδάσης. Β) Με τη χρήση αντισώµατος έναντι του C- τελικού επιτόπου. Τα µοριακά βάρη που φαίνονται στην αριστερή πλευρά των εικόνων προέρχονται από το δείκτη πρότυπων µοριακών βαρών Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Η πειραµατική διαδικασία περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. 3.1.2 Ενεργότητα των single-cys YgfOs Έχονταςελέγξει την έκφραση των κατασκευών στη µεµβράνη των κυττάρων, προχωρήσαµε στο λειτουργικό χαρακτηρισµό τους (Εικόνες 5 και 6). Από τις26 διαπεράσεςπου εξετάστηκαν, 10 εµφανίζουν αρχική ταχύτητα µεγαλύτερη από 65% σε σχέση µε τη YgfO-Cys-less (Εικόνα 5, Εικόνα 6Α) µε τα µέγιστα επίπεδα συσσώρευσηςπου παρατηρούµε µεταξύ 1 και 10 min να είναι µεγαλύτερα του 70% (Εικόνα 5, Εικόνα 6Β). Επιπλέον, 5 διαπεράσεςµεταφέρουν ξανθίνη µε χαµηλότερες, αλλά σαφώς σηµαντικές, αρχικές ταχύτητες (35%-65% του YgfO-Cys-less) µε τα επίπεδα µέγιστηςσυσσώρευσηςνα είναι στο 40%-70%. 28

Για 10 διαπεράσεςτα επίπεδα αρχικήςταχύτηταςκαι µέγιστηςπρόσληψης υποστρώµατοςείναι χαµηλότερα του 20%. Από αυτές, 4 διαπεράσες(t320c, T321C, I329C και T332C) εµφανίζουν ενεργότητα από 5% έως20% σε σχέση µε το YgfO- Cys-less κάτι που για τιςδιαπεράσεςi329c και T332C σχετίζεται και µε τα ελαφρώςχαµηλότερα επίπεδα έκφρασήςτους(εικόνα 4). Εξάλλου, η διαπεράση L317C αν και εµφανίζει αρχική ταχύτητα στα επίπεδα του 20% τηςygfo-cys-less, επιτυγχάνει υψηλά επίπεδα µέγιστηςπρόσληψης(40%-50%), κάτι που επίσης σχετίζεται µε τα χαµηλά επίπεδα έκφρασηςτης(εικόνες4 και 6). Οι υπόλοιπες6 διαπεράσες(p318c, F322C, Q324C, N325C, N326C, G340C) εµφανίζουν ενεργότητα και επίπεδα µέγιστηςπρόσληψηςχαµηλότερα του 5%, κοντά στα επίπεδα του αρνητικού µάρτυρα. Τα επίπεδα ενεργότητας2 εξ αυτών (F322C, N325C), διαφέρουν στατιστικά σηµαντικά από τα επίπεδα του αρνητικού µάρτυρα και µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε προκαταρκτικά πειράµατα αναστολής (βλ. παρακάτω, Παράγραφο 3.3). Αντίθετα, εντελώςµηδενική ενεργότητα, αν και εκφράζεται σε κανονικά επίπεδα, εµφανίζει η διαπεράση Q324C. Τέλος, µηδενική ενεργότητα (Εικόνα 6), αλλά και αµελητέα επίπεδα έκφρασης (Εικόνα 4) εµφανίζουν οι διαπεράσεςp318c και G340C. Πρόσληψη [ 3 Η] ξανθίνης (nmol/mg) 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 10 Χρόνος (min) Cys-less G315C G327C T321C Q324C pt7-5 Εικόνα 5. Καµπύλες πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1µM) σε σχέση µε το χρόνο από διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης (Single-Cys YgfOs) µε υψηλή ( ), ενδιάµεση ( ), χαµηλή ( ) και µηδενική ενεργότητα ( ). Ο έλεγχοςέγινε σε κύτταρα T184 που εκφράζουν τιςδιαπεράσεςµοναδικήςκυστεΐνης ή τη διαπεράση YgfΟ-Cys-less ( ) ή έχουν µετασχηµατιστεί µε κενό φορέα pt7-5 ( ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν και δοκιµάστηκαν για την ικανότητα µεταφοράςξανθίνηςόπωςαναφέρεται στη λεζάντα τηςεικόνας6 και στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. 29

A) 140 120 100 80 60 40 20 0 Cys-less pt7-5 G315C S316C L317C P318C L319C T320C T321C F322C A323C Q324C N325C N326C G327C V328C I329C Q330C M331C T332C G333C V334C A335C S336C R337C Y338C V339C G340C Αρχική ταχύτητα (% Cys-less) B) 120 100 80 60 40 20 0 Cys-less pt7-5 G315C S316C L317C P318C L319C T320C T321C F322C A323C Q324C N325C N326C G327C V328C I329C Q330C M331C T332C G333C V334C A335C S336C R337C Y338C V339C G340C Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης (% Cys-less) Εικόνα 6. Έλεγχος πρόσληψης [ 3 Η] ξανθίνης (1µM) από κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τις διαπεράσες µοναδικής κυστεΐνης (single-cys YgfOs) ή τη διαπεράση YgfO-Cys-less. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 0 C και δείγµατα (50 µl), των εναιωρηµένων σε διάλυµα 0.1 Μ KP i (ph 7.5) κυττάρων, δοκιµάστηκαν για την ικανότητα διαµεµβρανικής µεταφοράς όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Α) Αρχική ταχύτητα πρόσληψης. Η τιµή για τη διαπεράση YgfO-Cys-less ήταν 2.06 ± 0.57 nmol mg 1 min -1 (µέσοςόρος6 πειραµάτων). Η τιµή για τον αρνητικό µάρτυρα (pt7-5) ήταν 0.04 ± 0.02 nmol mg 1 min -1 (n=6). Οι τιµέςγια τιςsingle-cys διαπεράσεςεκφράζονται ωςεπί τοιςεκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών του Cys-less στο ίδιο πείραµα και είναι ο µέσοςόροςµεταξύ των ποσοστών για τουςχρόνουςτων 15 και 30 sec µε την τυπική απόκλιση που φαίνεται. Β) Μέγιστα επίπεδα συσσώρευσης. Η τιµή για τη διαπεράση YgfO-Cys-less ήταν 0.95 ± 0.04 nmol mg 1 (n=6). Η τιµή για τον αρνητικό µάρτυρα (pt7-5) ήταν 0.02 ± 0.01 nmol mg 1 (n=6). Οι τιµέςγια τιςsingle- Cys διαπεράσεςεκφράζονται ωςεπί τοιςεκατό ποσοστά των αντίστοιχων τιµών του YgfO-Cys-less στο ίδιο πείραµα και είναι ο µέσοςόροςτων τιµών για τουςεπιλεγµένουςχρόνουςµε την τυπική απόκλιση που φαίνεται. Οι χρόνοι που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό επιλέχθηκαν από καµπύλεςπαρόµοιεςµε αυτέςτηςεικόνας 5. 30

Προκειµένου να διερευνηθεί το αν η θερµοκρασία διαδραµάτιζε κάποιο ρόλο στη χαµηλή ενεργότητα των διαπερασών, προχωρήσαµε σε πειράµατα πρόσληψης ξανθίνηςστους37 0 C για τιςδιαπεράσεςq324c, N325C, N326C (δεδοµένα που δεν δείχνονται). Σε αυτή τη θερµοκρασία η ενεργότητα τηςn325c είναι στο 13% της YgfO-Cys-less ενώ η ενεργότητα τηςστους25 0 C είναι στο 3%. Παρ όλα αυτά, η ενεργότητά τηςπαραµένει σε χαµηλά επίπεδα. Η ενεργότητα των υπόλοιπων διαπερασών δεν διαφοροποιείται µε την αλλαγή τηςθερµοκρασίας. Κατά την κατασκευή των single-cys YgfOs, και µετά από την πλήρη αλληλούχιση (MWG-Biotech. A.G, Ebersberg, Germany) µιαςεκτενούςσειράς αποµονωµένων κλώνων, προέκυψαν και κάποιεςδιαπεράσεςπου είχαν και µια δεύτερη απροσδόκητη µετάλλαξη προφανώςλόγω τυχαίων σφαλµάτων που εισήγαγε η αντίδραση PCR. Η έκφραση των διαπερασών αυτών παρουσιάζεται στην Εικόνα 4 ενώ η ενεργότητα και τα δεδοµένα που µπορεί κανείςνα αντλήσει από εκεί, παρουσιάζονται στο Παράρτηµα. 3.2 Περαιτέρω µεταλλαξιγένεση των καταλοίπων Pro318, Phe322, Gln324, Asn325, Asn326, Gly340 Προκειµένου να ερευνηθεί εκτενέστερα ο ρόλοςκαι η σηµασία των καταλοίπων που η µεταλλαξιγένεση σάρωσηςκυστεϊνών έδειξε πωςεπηρεάζουν την ενεργότητα τηςδιαπεράσηςygfo (Εικόνα 6), προχωρήσαµε σε περαιτέρω µεταλλαξιγένεση σηµειακήςστόχευσηςαυτών των καταλοίπων. Τα κατάλοιπα µεταφέρθηκαν σε φυσικού τύπου υπόστρωµα (YgfO-BAD) και αντικαταστήθηκαν είτε µε Cys (βλ. 3.2.1) είτε µε άλλα αµινοξέα (βλ. 3.2.2). Σκοπόςαυτήςτηςσειράς πειραµάτων ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο η πολύ χαµηλή ενεργότητα των single- Cys YgfOs P318C, F322C, Q324C, N325C, N326C και G340C θα µπορούσε να συσχετισθεί µε την έλλειψη των εγγενών Cys ή µε την µεγάλη αλλαγή πλευρικής οµάδαςπου προκάλεσε η µετάλλαξη των συγκεκριµένων καταλοίπων σε Cys. Προχωρήσαµε στην κατασκευή των διαπερασών P318G(wt), F322C(wt), Q324C(wt), Q324N(wt), N325C(wt), N325Q(wt), N326C(wt), N326Q(wt), G340C(wt), G340A(wt) (Πίνακας1B) µε τη χρήση αλυσιδωτήςαντίδρασης πολυµεράσης2 σταδίων και αντικατάσταση περιοριστικών θραυσµάτων όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Μετά την επιβεβαίωση της 31

αλληλουχίαςανάµεσα στιςθέσειςbamhi HpaI προχωρήσαµε στο λειτουργικό τους έλεγχο. 3.2.1 Μεταλλαξιγένεση σηµειακής στόχευσης µε Cys σε φυσικού τύπου υπόστρωµα για τα κατάλοιπα Phe322, Gln324, Asn325, Asn326, Gly340 Αρχικά ελέγξαµε την έκφραση των διαπερασών F322C(wt), Q324C(wt), N325C(wt), N326C(wt) και G340C(wt) (Εικόνα 7) και εν συνεχεία προχωρήσαµε στον έλεγχο τηςενεργότητάςτους. Στην Εικόνα 8Α βλέπουµε ότι η διαπεράση F322C(wt) παρουσιάζει ενεργότητα από 60% (αρχική ταχύτητα) έως80% (µέγιστα επίπεδα συσσώρευσης) σε σχέση µε τη διαπεράση YgfO-BAD. Ακόµη, η διαπεράση G340C(wt) παρουσιάζει ενεργότητα παρόµοια µε αυτή του αρνητικού µάρτυρα (pt7-5) (µικρότερη του 5% του YgfO-BAD), κάτι που συνάδει και µε τα χαµηλά επίπεδα έκφρασήςτης(εικόνα 7). Εικόνα 7. Έκφραση των διαπερασών που κατασκευάστηκαν σε υπόστρωµα φυσικού τύπου (YgfΟ-BAD). Παρασκευάσθηκαν κλάσµατα µεµβρανών από κύτταρα Τ184 που εκφράζουν τις αντίστοιχεςδιαπεράσεςκαι δείγµατα που περιείχαν 70 µg ολικήςπρωτεΐνηςαναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE σε πήγµα πολυακρυλαµιδίου 12%. Ακολούθησε µεταφορά σε µεµβράνη PVDF και ανοσοαποτύπωση µε δυο τρόπους : A) Με τη χρήση συζεύγµατος αβιδίνηςυπεροξειδάσης Β) Με τη χρήση αντισώµατος έναντι του C-τελικού επιτόπου. Τα µοριακά βάρη που φαίνονται στην αριστερή µεριά των εικόνων προέρχονται από το δείκτη πρότυπων µοριακών βαρών Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). 32