Протеини и полипептиди

Протеини и полипептиди Протеини и полипептиди су полимери који се састоје од специфичног распореда (секвенције) L-аминокиселина које су међусобно повезане ковалентном пептидном (амидном) везом. Тих двадесет аминокиселина се међусобно разликују по својим бочним ланцима. Слика 1 Структура полипептида са приказаним угловима ротације φ и ψ. Планарне пептидне везе приказане су дебелом линијом. Полипептидни ланци у протеинима састоје се од 50 до 500 аминокиселинских остатака. Пошто је средња релативна молекулска маса аминокиселина око 100, протеини имају РММ од 5000 до 500000 (5-500 kda). На крајевима полипептидног лананца налазе се слободне амино и карбоксилне групе, тако да у првом случају говоримо о N-терминусу, а у другом о С-терминусу. По функцији полипептиди и протеини се грубо могу поделити на ензиме (биолошке катализаторе), антитела, хормоне, рецепторе и структурне. Чак и полипетиди са веома кратким ланцем могу имати биолошку функцију. Такви су на пример окситоцин (хормон, 9 аминокиселинских остатака,лучи га хипофиза), брадикинин (9 аминокиселинских остатака, инхибиција запаљенских процеса у ткивима), аманитин (3 аминокиселинска остатак, отров у печуркама). Од већих полипептида са релативно кратким ланцем могусе издвојити субјединице инсулина (21 и 30 аминокиселинских остатака). Екстрем представља потеин титин (улази у састав мишића код кичмењака), чије се полипептидне јединице састоје од око 27000 а.к. остатака, тако да је његова молекулска маса око 3 MDa. Већина протеина који се налазе у природи сачињени су од јединица које садрже мање од 2000 а. к. остатака. Хемијска структура и молекулска конформација протеина се обично описују помоћу четири нивоа огранизације: Примарна структуре која представља распоред аминокиселина у полипептидним ланцима. Она је јединствена за сваки протеин и примарно је одређена генетском информацијом записаном у одговарајућем гену смештеном у молекулу DNK. KVFERCELAR TLKRLGMDGY RGISLANWMC LAKWESGYNT RATNYNAGDR STDYGIFQIN SRYWCNDGKT PGAVNACHCS ASALLQDNIA DAVACAKRW RDPQGIRAWV AWRNRCQNRD VRQYVQGCGV Слика 2. Примарна стриктура полипептида састављеног од 130 аминокиселинских остатака (хумани лизозим), где је свака од аминикиселина означена једним словом 1

аланин А глутаминска киселина E леуцин L серин S аргинин R глутамин Q лизин K треонин T аспарагин N глицин G метионин M триптофан W аспарагинска киселина D хистидин H фенилаланин F тирозин Y цистеин C изолеуцин I пролин P валин V Табела 1. Једнословно означавање аминокиселина Секундарна структура која се састоји од регуларно распоређених, понављајућих структура као што су α-хеликс и β набрана структура (β плочица) и делова пептидног ланаца без одређене структуре. Терцијарна структура представља тродимензионални распоред елемената секундарне структуре који дефинише конформацију подјединица или, уколико се ради о протеину састављеном од једног полипептидног ланца, целукопног протеина. Квартенарна структура представља тродимензионални рапоред подјединица у сложеном протеину. а) б) в) г) Слика 3. Нивои структурне организације протеина: а) примарна структура, б) секундарна структура (овде је представљен α хеликс), в) терцијарна структура и г)квартернарна структура Осим протеина који су састављени од једног полипептидног ланца, постоје они који се састоје од више полипетидних ланаца који су нековалентно повезани - вишејединични протеини. Јединице у овим протеинима могу бити исте или различите. Ако су бар две јединице исте такав протеин називамо олигомерним. Понављање истих φ /ψ углова од једне до друге аминокиселине доводи до правилних елемената секундарне структуре, од којих су α хеликс и β раван најзаступљеније. У овим 2

структурама φ /ψ углови се понављају на такав начин да омогућавају формирање водоничних веза између различитих група у пептиду и самим тим стабилисање структуре. Многи структурни елементи као што су петље, завоји или други облици који одређују терцијарну структуру протеина немају регуларни образац понављања φ /ψ углова и стога су јединствени. α хеликс представља најједноставније уређење које полипетидни ланац може заузети са својим ригидним пептидним везама. То је структура облика завојнице у којој је костур полипептидног ланца уско намотан око замишљене осе провучене дуж средишта хеликса, док су бочне групе аминокиселина усмерене ка спољашњости. α хеликс је релативно честа структура, што се може објаснити оптималном дистрибуцијом водоничних веза које је стабилишу; у њему свака пептидна веза (осим оних на оба краја ланца) учествује у водоничном везивању. Експерименти су показали да се α хеликс може наградити и од L- и од D- аминокиселина и то само од једног стереоизомера - увођење D- изомера у завојницу састављену од L- аминокиселина нарушило би његову структуру. Природно присутне аминокиселине могу формирати десне или леве α хеликсе, при чему последњи у протеинима имају релативно кратак низ. β раван (плочица, структура) је дужа од α хеликса и сачињавају је цик-цак распоређени полипептидни ланци који су међусобно повезани водоничним везама. Могу имати паралелну или антипаралелну оријентацију, што се односи на међусобни распоред терминуса полипептидних ланаца (С-N и N-С антипаралелни, С-С и N- N паралелни). Због флексибилилности ротација у полипептидном ланцу, првенствено око N-C α (φ) и C α C (ψ) веза постоји велики број могућих конформација који полипептид може да има. За разлику од синтетичких полимера, протеини имају могућност увијања (под одговарајућим условима) у специфичне конформације (структуре) од којих потичу њихове специфичне особине. Остаје нејасно како протеини налазе одговарајућу активни облик. Уколико узмемо у обзир да сваки од углова φ и ψ може да има (у грубој апроксимацији) три могуће вредности, долазимо до броја од 3х3=9 могући конформера за сваки пептид. Уколико се у обзир узму конформери бочних ланаца, то за релативно мали полипептид од 100 чланова, даје 9 100 могућих конформација, од којих је само мали сет или само једна функционална. Ако претпоставимо да се промена конформације одвија на фемтосекундној (10 '-15 s) скали било би потребно 10 73 година за претрагу кроз све могућности. То значи да ма како моћан рачунар није у могућности да предвиди праву конформацију. Ово се назива Левинталовим парадоксом, по научнику који је први разматрао овај проблем. Ипак протеини се јако брзо увијају и налазе праву конформацију. То указује на постојање кинетичких путања и реакционих механизама који воде систем у одговарајуће стање. Још једна од битних особина датог протеина је да сви његови молекули имају исту конформацију са малим варијацијама услед термалних флуктуација. Умотани протеини су релативно нестабилни и могу се лако одмотати (денатурисати), посебно са повећањем/снижењем температуре, ph или додавањем хемијских денатуришућих средстава као што су уреа, хуанидин хидрохлорис или алкохоли. Денатурисани протеини губе своју терцијарну и квартернарну структуру али могу задржати неке карактеристике секундарне структуре. Врло ретко имају праву насумичну структуру. Денатурисани протеини су јако лепљиви и имају теденцију агрегације са другим денатурисаним протеинима и лепљења за површине. Својствена лепљивост протеина у овом облику једна је од узрока настанка амилоидних плакова код неуродегенеративних болести 3

као што је нпр. Алцхајмерова болест. Ензими Ензими су катализатори који повећавају брзину биохемијске реакције, а да се при том не мењају. Свака биохемијска реакција у живим органозмима, па чак и реакција разлагања угљене киселине на воду и угљен диоксид, катализована је специфичним ензимом. Изузеци од овог правила су ретки и тада се ради о мултифункционалним ензимима са неколико каталитичких дејстава на истом молекулу или вишеензимским комплексима. Као и други катализатори ензими не утичу на промену слободне енергије ( G), а самим тим ни на положај равнотеже у реакцији, већ доводе до смањења њене енергије активације. Слика 4 а) енергија активације и промена слободне енергије у катализованој реакцији, б) смањење енергије активације и формирање комплекса суспстрат-катализатор у ензимски катализованој реакцији Ензими су молекули протеина (са ретким изузецима када RNK каталише реакцију) и углавном имају велику молекулску масу. Мали ензими имају масу око 10 kda, док је она код великих око 10 5. Полипептидни ланци су увијени на специфичан начин тако да формирају активни центар, који је тако обликован да формира тродимензионални џеп у који се једињење које учествује у реакцији (супстрат) уклапа. Супстрат је за активно место везан помоћу вишеструких нековалентних веза. То за последицу има: 10 14 ). позиционирање супстрата у најповољнију позицију за одигравање реакције. активно место у потпутности одговара, не сусптрату у његовом основном стању, већ прелазном стању које је интермедијер између молекула реактанта и производа. Последње доводи до редукције у енергији активације, што за више редова величине (10 7 - Кинетика ензимске реакције се прати инкубацијом супстрата и одговарајућег на одговарајућој температури и ph и мерењем концентрације производа са временом. Брзина овакве реакције опада са временом, што се догађа због смањења концентрације супстрата и/или 4

инхибиције ензима због нагомилавања производа. Да би се поуздано одредила брзина ове реакције неопходно је вршити мерења док се није наградила значајна количина производа (метода почетних брзина). Михаелис и Ментен су предложили модел кинетике ензимске реакције у случају да се ради о једном супстрату E S ES E P При ниским концентрацијама супстрата, кинетика ензимске реакције је одређена брзином формирања комплекса ензим-супстрат (ES), па је његова концентрација ниска. Како концентрација S расте, расте и брзина формирања комплекса. При великим концентрацијама супстрата прва реакција није више лимитирајући фактор, већ то постаје конверзија комплекса у производ. Тада се каже да ензим постаје засићен супстратом и говоримо о максималној брзини реакције v max. Зависност брзине ензимске реакције од концентрације супстрата дата је на слици 5. Слика 5. а) зависност брзине ензимске реакције од монцентрације супстрата, б) одређивање Михаелисове константе. Једначина која описује зависност брзине ензимске реакције дата је Михаелис-Ментен једначином v = [S ]v max [S ] K m где је К m Михаелисова константа која је мерило афинитета ензима према супстратуи представља концентрацију супстрата при брзини реакције која је упола мања од v max. Да би се одредили параметри једначине конструише се зависност 1/v = f(1/[s]) (слика 5б). Одсечак на ординати представља реципрочну вредност максималне брзине, док је одсечак на апциси негативна реципрочна вредност Михаелисове константе. Важна класа ензима која се не покорава Михаелис-Ментен кинетици су алостерни ензими, чија је активност регулисана хемијским сигналима из ћелије. 5

Фактори који утичу на активност ензима Стабилност ензима, а самим тим и његова активност одређена је стањем његових група које су подложне јонизацији. На ово директно утиче ph раствора:ензими су максимално активни у неутралној средини (изузетак је пепсин који је најактивнији на ph=2), док њихова активност опада са снижењем и нешто брже са повећањем ph. Као и за ph, ензими показују максималну активност на одређеној температури. При повишењу температуре долази до инактивације ензима; температуре изнад 50 о С су обично деструктивне за ензиме. Активност ензима може се смањити у присуству инхибиторних једињења, чије дејство може бити реверзибилно или иреверзибилно. У последњем случају се ради о ковалентном везивању инхибитора за ензим. Инхибиција може бити компетитивна и некомпетитивна, при чему у првом случају долази повећања константе К m (види слике 6а и 6б) Слика 6 а) Компетитивна инхибиција, б) некомпетитивна инхибиција 6