ΑΡΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΑΡΩΜΑΤΙΚΟ ΦΥΤΟ SATUREJA THYMBRA (ΘΡΟΥΜΠΙ)

ΑΡΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΒΙΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΑΡΩΜΑΤΙΚΟ ΦΥΤΟ SATUREJA THYMBRA (ΘΡΟΥΜΠΙ) Κατερίνα Παρασκευοπούλου, Ανδρέας Μπιµπίλας, Δηµήτρης Τσιµογιάννης, Βασιλική Ωραιοπούλου Εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων, Σχολή Χηµικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μελετήθηκε η ανάκτηση βιοδραστικών συστατικών από το είδος Satureja thymbra, γνωστό ως θρούµπι, η οποία διακρίθηκε σε δύο κύρια στάδια. Στο πρώτο στάδιο, µελετήθηκε η διεργασία της παραλαβής του αιθέριου ελαίου µε την τεχνική της υδρο-ατµοαπόσταξης κατά τη διάρκεια της οποίας πραγµατοποιήθηκε κινητική µελέτη της ανάκτησης των µεµονωµένων συστατικών του αιθερίου ελαίου µε χρήση GC-MS. Διαπιστώθηκε η δυνατότητα ανάκτησης του βασικότερου συστατικού, της καρβακρόλης, σε κλάσµα υψηλότερης καθαρότητας. Με βάση τα αποτελέσµατα αυτά, κατέστη δυνατή η παραλαβή κλάσµατος υψηλής περιεκτικότητας καρβακρόλης (78 %), που αντιστοιχούσε στο 1/3 του ολικού ελαίου, απόδοσης 4,3 %. Στο δεύτερο στάδιο, µελετήθηκε η δυνατότητα ανάκτησης των πολυφαινολών από το απελαιωµένο θρούµπι µε εκχυλίσεις χρησιµοποιώντας υδατικό διάλυµα ΚΟΗ. Στα πλαίσια της αριστοποίησης εξετάστηκαν οι παράµετροι: συγκέντρωση ΚΟΗ, λόγος φυτόµαζας προς µέσο εκχύλισης, χρόνος εκχύλισης και χρήση υπερήχων. Η συγκέντρωση των πολυφαινολών προσδιοριζόταν µε τη µέθοδο Folin-Ciocalteau. Διαπιστώθηκε πως ο χρόνος αποτελεί τη βασική παράµετρο που επηρεάζει την βελτιστοποίηση της εκχύλισης. Για λόγους σύγκρισης, πραγµατοποιήθηκαν παράλληλα και συµβατικές εκχυλίσεις Soxhlet σε ξηρά και κονιοποιηµένα δείγµατα του απεσταγµένου φυτού. Προσδιορίστηκαν οι ολικές φαινόλες και η ικανότητα δέσµευσης ριζών µε τη µέθοδο DPPH, ενώ τα κύρια συστατικά ταυτοποιήθηκαν µε LC-MS/MS. Τα πειράµατα απέδειξαν ότι το θρούµπι αποτελεί µια πλούσια πηγή βιοδραστικών ενώσεων. Η επιπλέον αξιοποίησή του, πέρα της παραλαβής αιθέριου ελαίου, είναι εφικτή καθώς µπορεί να οδηγήσει σε αποδόσεις ανάκτησης ουσιών έως και 25 %. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ελληνική γη αποτελεί µια από της πιο γόνιµες περιοχές της Μεσογείου για την ανάπτυξη των αρωµατικών φυτών, µε καταγεγραµµένα περίπου 2000 αυτοφυή είδη. Τα τελευταία χρόνια έχει ξεκινήσει η συστηµατική καλλιέργειά τους στην Ελλάδα, όµως η µεταποίησή τους παραµένει σε πολύ πρωταρχικό στάδιο. Ουσιαστικά, η ξήρανση και η απόσταξη των αιθέριων ελαίων αποτελούν τις µοναδικές µεταποιητικές διεργασίες των αρωµατικών φυτών που βρίσκουν εφαρµογή στη χώρα µας, πλην ελαχίστων εξαιρέσεων. Τα απελαιωµένα αρωµατικά φυτά χρησιµοποιούνται περαιτέρω, στην καλύτερη περίπτωση, µόνο ως ζωοτροφές. Συνεπώς ένας πλούτος συστατικών παραµένουν ανεκµετάλλευτα. Η αυξανόµενη ζήτηση της αγοράς για φυσικά εκχυλίσµατα, επιβάλει τη συστηµατική µελέτη της ανάκτησης των µη αξιοποιηµένων συστατικών. Στο παραπάνω πλαίσιο, η αριστοποίηση των διεργασιών ανάκτησης ουσιών από τα αρωµατικά φυτά είναι αναγκαία ώστε να αξιοποιηθεί εµπορικά το µέγιστο των συστατικών τους. Η παρούσα εργασία αφορά σε ένα πολύ διαδεδοµένο φυτό σε όλη την ελληνική επικράτεια. Πρόκειται για το είδος Satureja thymbra, γνωστό ως θρούµπι. Η κύριες ουσίες του αιθέριου ελαίου από θρούµπι είναι το γ-τερπινένιο και η καρβακρόλη ενώ σε ορισµένους χηµειότυπους αντί καρβακρόλης ανιχνεύεται η θυµόλη [1, 2]. Το αιθέριο έλαιο έχει µελετηθεί µόνο ως προς την ακαρεοκτόνο δράση [2] µε σηµαντικά αποτελέσµατα. Όσον αφορά τα δύο κύρια συστατικά του S. thymbra, το γ-τερπινένιο έχει αποδειχθεί αδρανές έναντι του στελέχους σαλµονέλας S. typhimurium [3, 4], όµως η καρβακρόλη έχει εµφανίσει σηµαντικές αντιµικροβιακές ιδιότητες σε πλήθος ερευνητικών εργασιών [4, 5, 6, 7, 8]. Η δράση της αποδίδεται στην ικανότητα της ουσίας να καταστρέφει την εξωτερική µεµβράνη των βακτηρίων [4]. Η καρβακρόλη έχει µελετηθεί και ως αντιµικροβιακός παράγοντας ενεργού συσκευασίας τροφίµων [9] και τέλος έχει αξιοποιηθεί βιοµηχανικά για την αντικατάσταση συµβατικών κτηνοτροφικών αντιβιοτικών. Η παραγωγή αιθέριων ελαίων πλούσιων σε καρβακρόλη αποτελεί σηµαντικό ζητούµενο για την βιοµηχανική αξιοποίηση τους. Το είδος και η ποικιλία των καλλιεργούµενων αρωµατικών φυτών καθώς και οι εδαφοκλιµατολογικές συνθήκες αποτελούν παράγοντες µελέτης για τη µεγιστοποίηση της περιεκτικότητας σε καρβακρόλη στα αρωµατικά φυτά. Στην παρούσα µελέτη πραγµατοποιήθηκε µια διαφορετική προσέγγιση µε πρώτη ύλη το θρούµπι διερευνήθηκε η δυνατότητα αποµόνωσης κλάσµατος πλούσιου σε καρβακρόλη µε την βιοµηχανική διεργασία της ατµοαπόσταξης, η οποία θα ήταν άµεσα εφαρµόσιµη µε την υπάρχουσα υποδοµή των ελληνικών βιοτεχνικών/βιοµηχανικών µονάδων παραγωγής αιθέριων ελαίων, χωρίς να απαιτείται

τροποποίηση του εξοπλισµού. Στα πλαίσια της συγκεκριµένης προσέγγισης εφαρµόστηκε η τεχνική της υδροατµοαπόσταξης σε εργαστηριακό άµβυκα οφέλιµης χωρητικότητας 10 L και συλλέχθηκε το αιθέριο έλαιο. Κατά τη διάρκεια της απόσταξης πραγµατοποιήθηκε κινητική µελέτη της ανάκτησης των µεµονωµένων συστατικών του αιθερίου ελαίου µε χρήση GC-MS και εξετάστηκαν οι κινητικές ανάκτησης των επιµέρους ουσιών. Το θρούµπι εκτός από υψηλή συγκέντρωση σε αιθέριο έλαιο περιέχει πλήθος πολυφαινολών µε σηµαντικές βιοδραστικές ιδιότητες. Περιέχει καφεϊκό και ροσµαρινικό οξύ, καθώς και πιο σύνθετα φαινολικά οξέα, όπως το σαλβιανολικό οξύ Α και το λιθοσπερµικό οξύ Α. Το ροσµαρινικό οξύ εµφανίζει µια σειρά από ενδιαφέρουσες βιολογικές δραστηριότητες όπως αντι-ιική, αντιβακτηριακή, αντιφλεγµονώδη, που έχουν οδηγήσει σε ένα ευρύ φάσµα εφαρµογών, από τη συντήρηση τροφίµων, έως τα καλλυντικά προϊόντα. Μελέτες έχουν αποδείξει πως το ροσµαρινικό οξύ εµφανίζει µεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση από τη βιταµίνη Ε, ενώ παρουσιάζει αντιαλλεργικές, αντιθροµβωτικές και αντικαρκινογόνες ιδιότητες. Σήµερα, πολλά προϊόντα φαρµάκων, καλλυντικών και τροφίµων έχουν ως συστατικό το ροσµαρινικό οξύ [10, 11, 12]. Το σαλβιανολικό οξύ Α είναι ένα υδατοδιαλυτό φαινολικό οξύ, το οποίο έχει εµφανίσει έντονη βιοδραστικότητα, συµπεριλαµβανοµένης της προστασίας από εγκεφαλικές βλάβες, και τη βελτίωση της µνήµης. Χαρακτηριστική είναι επίσης η αντιαιµοπεταλιακή και αντιθροµβωτική του δράση [13]. Αποτελέσµατα µελετών µαρτυρούν πως το σαλβιανολικό οξύ Α συµβάλλει στην αναστολή της οξείδωσης των λιπιδίων µικροσωµάτων ήπατος ζωντανών οργανισµών [14]. Επιπλέον, το θρούµπι περιέχει φλαβονοειδή οι Skoula et al.[15] έχουν ταυτοποιήσει φλαβονοειδείς αγλυκόνες που ανήκουν στις κατηγορίες των φλαβανονών και φλαβονών. Οι ουσίες που προσδιορίστηκαν σε υψηλότερες περιεκτικότητες είναι φλαβανόνες ναρινγκενίνη και εριοδικτυόλη και οι µέθοξυ-φλαβόνες λαντανεΐνη και ο 7,3,4 -τριµεθυλ-αιθέρας της 6-υδροξυλουτεολίνης. Δεδοµένου του πλούτου των φαινολικών ουσιών, σε επόµενο στάδιο µελετήθηκε η δυνατότητα ανάκτησής τους από το απελαιωµένο θρούµπι, ώστε να καταστεί αξιοποιήσιµο και το παραπροϊόν του πρώτου σταδίου. Στα πειράµατα χρησιµοποιήθηκε απευθείας νωπή απελαιωµένη φυτόµαζα για τις διεργασίες των εκχυλίσεων, χωρίς καµία ενδιάµεση κατεργασία, όπως ξήρανση και κονιοποίηση, ώστε να καταστεί όσο το δυνατόν πιο απλή και οικονοµική η αλληλουχία των διεργασιών. Οι εκχυλίσεις πραγµατοποιήθηκαν µε υδατικό διάλυµα ΚΟΗ και στα πλαίσια της αριστοποίησης εξετάστηκαν οι παράµετροι: συγκέντρωση ΚΟΗ, λόγος φυτόµαζας προς µέσο εκχύλισης, χρόνος εκχύλισης και χρήση υπερήχων. Η συγκέντρωση των πολυφαινολών προσδιοριζόταν µε τη µέθοδο Folin-Ciocalteau. Για λόγους σύγκρισης, παράλληλα πραγµατοποιήθηκαν και συµβατικές εκχυλίσεις Soxhlet σε ξηρά και κονιοποιηµένα δείγµατα του απεσταγµένου φυτού. Προσδιορίστηκαν οι ολικές φαινόλες και η ικανότητα δέσµευσης ριζών µε τη µέθοδο DPPH, ενώ τα κύρια συστατικά ταυτοποιήθηκαν µε LC- MS/MS. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Απόσταξη αιθέριου ελαίου Η ατµοαπόσταξη αποτελεί την πιο συνήθη µέθοδο παραλαβής αιθέριων ελαίων, και βασίζεται στη συναπόσταξη δύο µη αναµιγνυόµενων υγρών, δηλαδή του νερού και του αιθέριου ελαίου. Ενα µίγµα δύο υγρών ενώσεων που δεν αναµιγνύονται µεταξύ τους βράζει σε χαµηλότερη θερµοκρασία από τα σηµεία ζέσεως του κάθε συστατικού. Η τάση των ατµών του µίγµατος είναι µεγαλύτερη από ότι ο νόµος Raoult προβλέπει, και αυτό έχει σαν συνέπεια το χαµηλότερο σηµείο ζέσεως. Το σηµείο ζέσεως µιγµάτων που αποστάζουν µε υδρατµούς είναι χαµηλότερο απο το σηµείο ζέσεως του νερού (100 C), όπως επίσης και από το σηµείο ζέσεως του άλλου συστατικού που αποστάζει. Οσο µεγαλύτερο είναι αυτό το σηµείο ζέσεως, τόσο το σηµείο ζέσεως του µίγµατος θα προσεγγίζει τους 100 C, αλλά δεν θα τους υπερβαίνει. Αυτή είναι µια σχετικά χαµηλή θερµοκρασία, και έτσι αποφεύγεται η αποσύνθεση που µπορεί να λάβει χώρα σε υψηλότερες θερµοκρασίας µε µια απλή απόσταξη. Εκτός από το σηµείο ζέσεως του µίγµατος και η σύσταση του αποστάγµατος παραµένει σταθερή κατά τη διάρκεια µιας απόσταξης µε υδρατµούς. Στην περίπτωση της συναπόσταξης νερού µε σύνθετα µίγµατα µη υδατοδιαλυτών ουσιών, όπως τα αιθέρια έλαια η σύσταση του αποστάγµατος δεν παραµένει σταθερή κατά τη διάρκεια της απόσταξης, δεδοµένου ότι τα επιµέρους συστατικά των αιθέριων ελαίων έχουν σηµαντικές διαφορές ως προς τα σηµεία ζέσεως. Συνεπώς, κατά τη διάρκεια µιας ατµοαπόσταξης, η σύσταση του παραγόµενου αιθέριου ελαίου ενδέχεται να διαφοροποιείται σηµαντικά. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, εφαρµόστηκε η τεχνική της υδρο-ατµοαπόσταξης για την παραλαβή του αιθέριου ελαίου από θρούµπι σε εργαστηριακό άµβυκα οφέλιµης χωρητικότητας 10 L. Το αιθέριο έλαιο συλλεγόταν σε βαθµονοµηµένο συλλέκτη, οπότε παρακολουθήθηκε η κινητική ανάκτησής του. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στο Σχήµα 1 παρατηρείται ότι η διεργασία διήρκησε 263 min και η τελική απόδοση ανήλθε σε 4,3 ml/100 g φυτού. Ο ρυθµός ανάκτησης δεν παρέµεινε σταθερός κατά τη διάρκεια της απόσταξης. Όπως προκύπτει από το Σχήµα 1, ο ρυθµός παραγωγής αιθέριου ελαίου µειώνεται σηµαντικά µέχρι χρόνου 20 min οπότε έχει αποστάξει το 51 % του συνολικά ανακτώµενου ελαίου. Στα επόµενα 243 min ο ρυθµός παραµένει σε ένα σταθερά χαµηλό επίπεδο και ανακτάται το 49 % του αιθέριου ελαίου.

1.5 5.0 ρυθµός παραλαβής αιθέριου ελαίου (ml/min) 1.2 0.9 0.6 0.3 ρυθµός παραλαβής απόδοση 4.0 3.0 2.0 1.0 απόδοση (ml/100 g φυτού) 0.0 0 50 100 150 200 250 300 t απόσταξης (min) Σχήµα 1. Ο ρυθµός παραλαβής του αιθέριου ελαίου και η απόδοση της υδρο-ατµοαπόσταξης. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζονται οι ουσίες που ταυτοποιήθηκαν στο τελικό αιθέριο έλαιο, οι δείκτες ανάσχεσης (Retention Index, RI) καθώς και οι ποσοστιαίες επιφάνειες των κορυφών. Το γ-τερπινένιο και η καρβακρόλη κυριαρχούν καθώς συνιστούν αντίστοιχα το 36,5 % το 34,5 %. Ως δευτερεύοντα συστατικά χαρακτηρίζονται το p-κυµένιο (10,3 %), το trans-καρυοφυλλένιο (7,4 %) και το α-τερπινένιο (3,4 %), ενώ τα υπόλοιπα συστατικά βρίσκονται σε ίχνη. Οι παραπάνω πέντε ουσίες συνιστούν το 92 % της ολικής επιφάνειας των κορυφών. Πίνακας 1. Οι ουσίες που ταυτοποιήθηκαν στο αιθέριο έλαιο του φυτού Satureja thymbra και στο κλάσµα πλούσιο σε καρβακρόλη. α/α Ουσία RI sd σύσταση αιθέριου sd σύσταση κλάσµατος sd ελαίου (%) καρβακρόλης (%) 1 α-θουγιένιο 928 0.0 1.60 0.03 0.08 0.00 2 α-πινένιο 936 0.1 0.85 0.01 0.04 0.00 3 καµφένιο 951 0.0 0.21 0.01 0.01 0.01 4 β-πινένιο 980 0.1 0.36 0.01 0.02 0.01 5 β-µυρκένιο 990 0.1 1.30 0.05 0.08 0.03 6 Ι-φελλανδρένιο 1008 0.0 0.30 0.01 0.04 0.02 7 α-τερπινένιο 1020 0.0 3.43 0.01 0.42 0.01 8 p-κυµένιο 1028 0.2 10.29 0.07 1.59 0.01 9 dl-λιµονένιο 1032 0.0 0.83 0.03 0.07 0.05 10 γ-τερπινένιο 1062 0.1 36.47 0.50 7.09 0.04 11 γιναλοόλη L 1101 0.3 0.26 0.00 0.15 0.09 12 1-βορνεόλη 1176 1.3 0.20 0.17 0.15 0.21 13 4-τερπινεόλη 1184 0.0 0.21 0.09 0.32 0.01 14 ανισόλη 1248 0.1 1.11 0.01 0.91 0.04 15 m-θυµόλη 1296 0.5 0.01 0.05 0.19 0.00 16 καρβακρόλη 1307 3.0 34.51 0.47 77.77 0.33 17 trans-καρυοφυλλένιο 1437 0.6 7.41 0.09 9.84 0.34 18 α-χουµουλένιο 1471 0.0 0.19 0.03 0.52 0.00 19 οξείδιο του καρυοφυλλενίου 1607 1.4 0.01 0.00 0.70 0.05 Κατά τη διάρκεια της απόσταξης λαµβάνονταν δείγµατα αιθέριου ελαίου όγκου 2 µl, αραιώνονταν σε 10 ml εξάνιο (200 ppm) και τα συστατικά τους αναλύονταν µε GC-MS. Παρατηρήθηκε ότι όσον αφορά το γ- τερπινένιο και τις περισσότερες ουσίες, η συγκέντρωσή τους στο αιθέριο έλαιο µειωνόταν µε την πάροδο του χρόνου, ενώ στην περίπτωση της καρβακρόλης και του trans-καρυοφυλλενίου υπήρχε αύξηση. Στο Σχήµα 2Α φαίνονται οι µεταβολές των συγκεντρώσεων του γ-τερπινενίου και της καρβακρόλης στο αιθέριο έλαιο, εκφρασµένες ως η % σύσταση µε βάση τα εµβαδά των κορυφών, κατά τη διάρκεια του χρόνου απόσταξης. Διαπιστώνεται ότι το γ-τερπινένιο παρουσιάζει µέγιστη τιµή της % περιεκτικότητας στο µίγµα του αιθέριου ελαίου στα 10-20 min, ενώ στη συνέχεια µειώνεται διαρκώς. Η συγκεκριµένη µείωση αποτελεί ένδειξη ότι η ανάκτηση του γ-τερπινενίου ολοκληρώνεται σε σχετικά σύντοµο χρονικό διάστηµα µετά την έναρξη της 0.0

απόσταξης και στη συνέχεια απλά αραιώνεται στο µίγµα του αιθέριου ελαίου από την συνεχιζόµενη απόσταξη της καρβακρόλης. % Total Area 100 80 60 40 20 0 gamma-terpinene carvacrol (TIC*10^6)/Kgherb 2400 2000 1600 1200 gamma-terpinene carvacrol 800 A 400 y = 12,216x - 59,954 R² = 0,9931 B 0 0 100 200 300 0 100 200 300 tdistillation (min) tdistillation (min) Σχήµα 2. Η µεταβολή του γ-τερπινενίου και της καρβακρόλης στο αιθέριο έλαιο ως προς το χρόνο απόσταξης µε βάση την % σύσταση σύµφωνα µε τα εµβαδά των κορυφών (A) και η ανάκτηση των δύο ουσιών ανά µονάδα µάζας φυτού (Β). Στο Σχήµα 2Β δίνεται η ανάκτηση των δύο ουσιών µε αναγωγή στη µονάδα µάζας του φυτού κατά τη διάρκεια της απόσταξης. Διαπιστώνεται ότι το γ-τερπινένιο αποστάζει ταχύτατα µέχρι τα 50 min της απόσταξης, οπότε και έχει παραληφθεί το 94 % της ολικά ανακτώµενης ουσίας, ενώ το υπόλοιπο 6 % παραλαµβάνεται στα επόµενα λεπτά της απόσταξης. Αντίστοιχο προφίλ εµφάνισαν και οι περισσότερες ουσίες πλην καρβακρόλης και trans-καρυοφυλλένιου. Όπως φαίνεται στο σχήµα 2Β µέχρι χρόνου t 100 min, παρατηρείται γραµµική αύξηση της ανάκτησης µε το χρόνο. Με βάση τα παραπάνω, πραγµατοποιήθηκε απόσταξη ξηρής δρόγης και το αιθέριο έλαιο συλλέχθηκε σε δύο κλάσµατα. Το πρώτο κλάσµα περιέλαβε την ποσότητα αιθέριου ελαίου που απέσταξε µέχρι t=50 min και το δεύτερο κλάσµα όλη την υπόλοιπη ποσότητα αιθέριου ελαίου, µέχρι το τέλος της απόσταξης. Η σχέση όγκων των δύο κλασµάτων ήταν V 1 /V 2 =2 και εµφάνισαν σηµαντικές διαφορές ως προς τη σύσταση. Στον Πίνακα 1 φαίνεται η σύσταση του δεύτερου κλάσµατος, όπου η καρβακρόλη κυριαρχεί και η περιεκτικότητά της ανέρχεται σε 77,8 %. Ο λόγος γ-τερπινένιο/καρβακρόλη ενώ στο συνολικό αιθέριο έλαιο ισούται µε 1:1, στο κλάσµα προσδιορίζεται σε 1:11. Εκχύλιση απελαιωµένης φυτόµαζας A. Εκχύλιση Soxhlet Όσον αφορά τις εκχυλίσεις της απελαιωµένης S. thymbra, σε πρώτη φάση πραγµατοποιήθηκαν συµβατικές Soxhlet ώστε να προσδιοριστούν οι µέγιστες επιµέρους αποδόσεις και να ταυτοποιηθούν τα συστατικά. Η φυτόµαζα ξηράνθηκε, κονιοποίηθηκε (d<0,5 mm) και εκχυλίστηκε µε διαλύτες αυξανόµενης πολικότητας. Χρησιµοποιήθηκαν πετρελαϊκός αιθέρας, ακετόνη, και αιθανόλη, µε την συγκεκριµένη αλληλουχία. Κατά την εκχύλιση µε πετρελαϊκό αιθέρα, αποµακρύνθηκαν τα κηρώδη συστατικά και τα υπολείµµατα του αιθέριου ελαίου και στη συνέχεια παραλήφθηκαν οι φαινολικές ουσίες σε δύο κλάσµατα ανάλoγα µε την πολικότητα των συστατικών. Κατά την εκχύλιση µε ακετόνη, παραλήφθηκαν οι ουσίες ροσµαρινικό οξύ, σαλβιανολικό οξύ A, και µεθοξυ-φλαβόνες, ενώ στην εκχύλιση µε αιθανόλη παραλήφθηκαν οι ουσίες ροσµαρινικό οξύ, και σαλβιανολικό οξύ A. Παρατηρώντας τις αποδόσεις αθροιστικά, είναι εµφανής η ανάκτηση συστατικών σε ποσοστό 25% της αρχικής µάζας του φυτού. Δεδοµένου ότι έχει πραγµατοποιηθεί παραλαβή και του αιθέριου ελαίου, το ποσοστό αυτό λαµβάνει µεγαλύτερη τιµή. Πίνακας 2. Οι αποδόσεις και οι τιµές αντιριζικής δράσης των εκχυλισµάτων Satureja thymbra. Εκχύλισµα Απόδοση διεργασίας (%) EC 50 (g extr /kg DPPH ) Πετρελαϊκού αιθέρα (PE S ) 2,40±0,04 3404 Ακετόνης (AC S ) 3,37±0,09 286 Αιθανόλης (Ε S ) 14,1±0,4 271 Υδατικό (W s ) 4,5±0,2 457

Στη συνέχεια τα εκχυλίσµατα µελετήθηκαν ως προς την ικανότητα δέσµευσης ριζών µέσω της ικανότητάς τους να δεσµεύουν την ελεύθερη ρίζα DPPH. Η ικανότητα δέσµευσης ριζών από τα εκχυλίσµατα ποσοτικοποιήθηκε µέσω της παραµέτρου EC 50. Η παράµετρος EC 50, εκφράζει την ποσότητα ξηρού εκχυλίσµατος (g) που απαιτείται για να ανάγει το 50% µιας ποσότητας ρίζας 1 kg. Πλησιέστερη τιµή EC 50 στο µηδέν, συνεπάγεται µεγαλύτερη αποτελεσµατικότητα αντιοξειδωτικού. Με βάση τα παρακάτω αποτελέσµατα διαπιστώνεται ότι µικρότερο EC 50 εµφάνισε το εκχύλισµα αιθανόλης, στο οποίο και ταυτοποιήθηκαν το ροσµαρινικό και το σαλβιανολικό οξύ A στην υψηλότερη περιεκτικότητα, γεγονός που µαρτυρά πως οι συγκεκριµένες ουσίες εµφανίζουν έντονη αντιοξειδωτική δράση. Το εκχύλισµα AC S, χαρακτηρίζεται περίπου ισοδύναµο µε το Ε S ενώ το W S, στο οποίο οι ουσίες εντοπίστηκαν σε χαµηλότερες περιεκτικότητες, παρουσίασε χαµηλότερη δράση. Τέλος, όπως αναµενόταν, ως ασθενέστερο εκχύλισµα αποδείχθηκε το PE S καθώς τα περιεχόµενα συστατικά του έχουν πολύ χαµηλή αντιριζική δράση. Β. Εκχύλιση µε υδατικά δ/τα ΚΟΗ Μια εναλλακτική τεχνική αποτελεί η εκχύλιση που πραγµατοποιείται σε αλκαλικό περιβάλλον, και συγκεκριµένα παρουσία υδροξειδίου του καλίου. Με αυτόν τρόπο, είναι δυνατή η παραλαβή του ολικού φαινολικού φορτίου του απεσταγµένου φυτού. Οι πολυφαινόλες δρουν ως ασθενή οξέα, εποµένως, προσθήκη διαλύµατος KOH συνεπάγεται την αντίδραση όλων των πολυφαινολών, υδατοδιαλυτών και µη, και παραγωγή των αντίστοιχων αλάτων. GAE (ppm) επί ξηρής βάσης φυτού 120000 100000 80000 60000 40000 20000 0 εκχύλι ση µε 5% ΚΟΗ υπό απλή ανάδευση εκχύλι ση µε 3% ΚΟΗ υπό απλή ανάδευση εκχύλι ση µε 1% ΚΟΗ υπό απλή ανάδευση εκχύλιση µε 0.5% ΚΟΗ υπό απλή ανάδευση εκχύλιση µε Η2O υπό απλή ανάδευση 0 50 100 150 200 tεκχύλισης (min) Σχήµα 3. Η ανάκτηση των ολικών φαινολών από απεσταγµένο θρούµπι µε απλή ανάδευση σε υδατικό µέσο ως προς το χρόνο εκχύλισης και την περιεκτικότητα σε ΚΟΗ. Πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα σε δοχείο πλήρους ανάδευσης, µε αναλογία ξηρής φυτόµαζας:µέσο εκχύλισης 40:1, ώστε να µελετηθεί η επίδραση της συγκέντρωσης υδροξειδίου του καλίου και του χρόνου εκχύλισης. Σε συγκεκριµένη ποσότητα απεσταγµένου φυτού, προστέθηκε διάλυµα υδροξειδίου του καλίου σε διάφορες συγκεντρώσεις κάθε φορά (0,5 %, 1 %, 3 %, 5 %) και πραγµατοποιηθήκε εκχύλιση µε απλή ανάδευση για διάφορα χρονικά διαστήµατα (7 min, 20 min, 40 min, 60 min, 120 min, 140 min). Στη συνέχεια, το µίγµα διαχωρίσθηκε µε φυγοκέντρηση και προσδιορίσθηκε το φαινολικό περιεχόµενο στο ανακτηθέν υγρό µε τη µέθοδο Folin-Ciocalteu. Τα αποτελέσµατα σε απόδοση ολικών παραλαµβανόµενων φαινολών επί ξηρής φυτόµαζας παρουσιάζονται στο Σχήµα 3. Διαπιστώθηκε αύξηση της απόδοσης µε αύξηση της συγκέντρωσης του ΚΟΗ από 0 σε 1 %, ενώ περαιτέρω αύξηση της συγκέντρωσης ΚΟΗ οδηγήσε σε µικρή ή καθόλου αύξηση. Επίσης η εκχύλιση προχωρά µε ταχείς ρυθµούς αρχικά, ενώ προσεγγίζει την ισορροπία µετά από 70-80 min. Πίνακας 3. Ανεξάρτητες µεταβλητές (Χ 1, Χ 2, Χ 3 ) και οι τιµές τους στο BBD Variables Level -1 0 1 Συγκέντρωση ΚΟΗ (X 1, %) 0,5 1 1,5 Χρόνος (X 2, min) 20 40 60 Λόγος φυτόµαζας προς το µέσο εκχύλισης (Χ 3 ) 1:20 1:30 1:40

Στη συνέχεια µελετήθηκε η εκχύλιση µε χρήση υπερήχων. Μελετήθηκε η επίδραση τριων παραµέτρων: της συγκέντρωσης διαλύµατος υδροξειδίου του καλίου, του χρόνου εκχύλισης και του λόγου φυτόµαζας προς το µέσο εκχύλισης. Χρησιµοποιήθηκε πειραµατικός σχεδιασµός Box Beckhen (BBD) και οι κωδικοποιηµένες και πραγµατικές τιµές των παραµέτρων δίνονται στον Πίνακα 3. Για την βελτιστοποίηση της εκχύλισης πραγµατοποιήθηκαν συνολικά 17 πειράµατα από τα οποία τα 5 είναι δοκιµές του µηδενικού σηµείου. Η σειρά των πειραµάτων είναι τυχαία, προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί το σφάλµα [16]. Σχήµα 4: Γραφήµατα επιφάνειας απόκρισης για την επίδραση της συγκέντρωσης KOH, του χρόνου εκχύλισης και του όγκου φυτόµαζας προς το µέσο εκχύλισης, στην απόδοση της εκχύλισης, (α) επίδραση συγκέντρωσης ΚΟΗ (Χ 1 ) και χρόνου εκχύλισης (Χ 2 ), (β) επίδραση συγκέντρωσης ΚΟΗ (Χ 1 ) και όγκου φυτόµαζας προς µέσο εκχύλισης (Χ 3 ), (γ) επίδραση χρόνου εκχύλισης (Χ 2 ) και όγκου φυτόµαζας προς µέσο εκχύλισης (Χ 3 ). Με βάση τα αποτελέσµατα, καταστρώθηκαν τρισδιάστατες γραφικές παραστάσεις, µε τη βοήθεια του προγράµµατος Statistica, µε σκοπό να εξεταστούν οι αλληλεπιδράσεις των µεταβλητών και να προσδιοριστεί η επίδραση που έχει η κάθε µεταβλητή στην µέγιστη απόκριση. Σηµαντικός παράγοντας εµφανίστηκε ο χρόνος εκχύλισης µε βέλτιστη τιµή τα 40 min, ενώ οι υπόλοιπες δυο παράµετροι φάνηκε πως δεν επηρέασαν ιδιαίτερα την απόδοση, για το συγκεκριµένο εύρος τιµών τους που επιλέχθηκε κατά τον πειραµατικό σχεδιασµό. Τέλος, η χρήση υπερήχων, µείωσε αρκετά τον χρόνο εκχύλισης, συγκριτικά µε τον χρόνο εκχύλισης υπό απλή ανάδευση. Συµπερασµατικά, το θρούµπι αποτελεί µία πολύ σηµαντική πηγή βιοδραστικών ενώσεων. Το αιθέριο έλαιο εµφανίζει µεγάλη περιεκτικότητα σε ανακτίσιµα συστατικά, όπως είναι η καρβακρόλη και το γ-τερπινένιο, τα οποία αξιοποιούνται σε διάφορους τοµείς της βιοµηχανίας, λόγω των αντιβακτηριακών και αντιµικροβιακών ιδιοτήτων τους. Τα φαινολικά συστατικά, όπως το καφεϊκό και το ροσµαρινικό οξύ, καθώς και πιο σύνθετες φαινολικές ενώσεις, εµφανίζουν ενδιαφέρουσες βιολογικές ιδιότητες, και βρίσκουν εφαρµογή σε διάφορους τοµείς όπως στη συντήρηση τροφίµων και στα καλλυντικά προϊόντα. Για τους λόγους αυτούς, στην παρούσα εργασία µελετήθηκαν οι τεχνικές που βελτιστοποιούν την παραλαβή αυτών των ουσιών από το θρούµπι, µε στόχο την περαιτέρω αξιοποίησή τους.

10ο ΠΑΝΕΛΛΗΝΙΟ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟ ΣΥΝΕΔΡΙΟ ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ, ΠΑΤΡΑ, 4-6 ΙΟΥΝΙΟΥ, 2015. H παρούσα ερευνητική εργασία πραγµατοποιήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού προγράµµατος BioActiveHealth (Bioactive essential oils and other beneficial substances isolated from Greek and Chinese endemic species with health promoting properties, κωδικός προγράµµατος 12CHN409), το οποίο συγχρηµατοδοτήθηκε από την Ελλάδα και την Ευρωπαϊκή Ένωση, ΕΠΑΝ II, ΕΣΠΑ 2007-2013. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Karousou R., Koureas D.N., Kokkini S., Phytochemistry 66:2668-2673 (2005) [2]. Cetin H., Cilek J.E., Oz E., Aydinc L., Deveci O., Yanikoglua A., Vet. Parasitol. 170:287-290 (2010) [3]. Juven B.J., Kanner J., Schved F., Weisslowicz H., J. Appl. Bacteriol. 76: 626-631 (1994) [4]. Burt S., Int. J. Food Microbiol. 94: 223-253 (2004) [5]. Kim J., Marshall M.R., Wei C.-I., J. Agric. Food Chem. 43: 2839 2845 (1995) [6]. Cosentino S., Tuberoso C.I.G., Pisano B., Satta M., Mascia V., Arzedi E., Palmas F., Lett. Appl. Microbiol. 29: 130-135 (1999) [7]. Lambert R.J.W., Skandamis P.N., Coote P., Nychas G.-J.E., J. Appl. Microbiol. 91: 453-462 (2001) [8]. Pol I.E., Smid E.J., Lett. Appl. Microbiol. 29: 166-170 (1999) [9]. Ramos M., Beltran A., Valdes A., Peltzer M.A., Jimene1 A., Garrigosand M.C., Zaikov G.E., J Bioequiv Availab. 5:4 (2013) [10]. Shekarchi, M., Hajimehdipoor, H., Saeidnia, S., Gohari, A. R., & Hamedani, M.P., Pharmacogn. Mag. 8:37-41 (2012) [11]. Dhiraj A.V., Ghaedian R., Kalidas Shetty, Asia Pac J., Clin. Nutr. 14:120-130 (2005) [12]. Park S.U., Uddin M.R., Xu H., Kim Y.K., Lee S.Y., AJOL 7:4959-4965 (2008) [13]. Fan H. Y, Fu F. H.,Yang M. Y., Xu H., Zhang A. H., Liu K., Thromb. Res. 126: 17-22 (2010) [14]. Liu G.-T., Zhang T.-M., Wang B.-E., Wang Y.-W., Biochem. Pharmacol. 43:147-152 (1992) [15]. Skoula M., Grayerc R.J., Kitec G.C., Biochem. Syst. Ecol. 33:541-544 (2005) [16]. Zou T.-B., Jia Q., Li H.-W., Wang C.-X., Wu H.-F., Mar. Drugs 11:1644-1655 (2013)