1 Τίτλος: Καταλληλότητα της χαρτογραφικής συνάρτησης Kosambi για την εφαρμογή μοριακής βελτίωσης στα δασικά δένδρα μέσω της απεικόνισης της γονιδιωματικής οργάνωσης Συγγραφέας: Φ. Α. Αραβανόπουλος Διεύθυνση: Εργαστήριο Δασικής Γενετικής και Βελτιώσεως Δασοπονικών Ειδών, ΤΘ 38, Τμήμα Δασολογίας και Φυσικού Περιβάλλοντος, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Tηλ. 99778 1
Περίληψη Η μοριακή βελτίωση στα δασικά δένδρα βασίζεται στη καλύτερη δυνατή προσέγγιση της πραγματικής απόστασης μεταξύ δύο γονιδίων (συνήθως ενός γονιδίου που ελέγχει ποσοτικό γνώρισμα οικονομικού ενδιαφέροντος και ενός γονιδίου-δείκτη), μέσω της εκτίμησης της αντίστοιχης χαρτογραφικής απόστασης. Η πιο σημαντική παράμετρος που συνυπολογίζεται για την εκτίμηση της χαρτογραφικής απόστασης είναι η χιασματική παρεμπόδιση. Η χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi, έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη γενετική και βελτίωση για την εκτίμηση της απόστασης μεταξύ δύο, ή περισσοτέρων γονιδίων και την απεικόνιση των γονιδιακών σχέσεων στο γονιδίωμα, ωστόσο η εφαρμογή της περιορίζεται ως ένα βαθμό από την εξ' ορισμού θεώρηση ενός συγκεκριμένου επιπέδου χιασματικής παρέμβασης. Η χρήση του συντελεστή Kosambi για τη διερεύνηση καταλληλότητας της συνάρτησης αυτής, απαιτεί την ύπαρξη κριτικών διασταυρώσεων με διαχωρισμό σε τουλάχιστον τρεις αλληλοδιαδεχόμενους γενετικούς δείκτες και γνωστή γονιδιακή διάταξη στους γονείς. Όμως στην πλειονότητα των δασικών ειδών, κριτικές διασταυρώσεις δεν υφίστανται, ούτε είναι γνωστή η πατρική διάταξη. Στην εργασία αυτή περιγράφεται μεθοδολογία σύμφωνα με την οποία είναι δυνατή η εκτίμηση του συντελεστή ανεξάρτητα της ύπαρξης των παραπάνω προαπαιτούμενων. Το πρότυπο που προτείνεται ισχύει για ψευδό-αναδιασταυρώσεις και ειδικές ετερομεικτικές διασταυρώσεις, εισαγάγει τιμή κατωφλίου για τη χιασματική παρεμπόδιση και λαμβάνει υπόψη τον αριθμό των δυνατών κλάσεων συνδυασμών γονιδίων με άγνωστη πατρική διάταξη, ο οποίος είναι εξ' ορισμού περιορισμένος. Μια πολύ σημαντική εφαρμογή της προτεινόμενης μεθοδολογία είναι η βέλτιστη εκτίμηση της απόστασης μεταξύ γονιδίων-δεικτών και γονιδίων ποσοτικών γνωρισμάτων. Γενικά, η προτεινόμενη μεθοδολογία διευκολύνει την εφαρμογή μοριακής βελτίωσης και γονιδιωματικής. Λέξεις κλειδιά: χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi, χιασματική παρεμπόδιση, γονιδιωματική, μοριακή βελτίωση 1. Εισαγωγή Η χαρτογράφηση γονιδίων αποτελεί τη βάση για τη δημιουργία γενετικών χαρτών. Η δημιουργία γενετικών χαρτών έχει εξαιρετικά μεγάλη σημασία στη γενετική βελτίωση των δασικών ειδών καθώς αυτοί συμβάλλουν: (α) στην απεικόνιση της κατανομής των διαθέσιμων γονιδιακών θέσεων στα χρωμοσώματα, (β) στην εύρεση γονιδίων που ελέγχουν γνωρίσματα οικονομικού ενδιαφέροντος, όπως τα γονίδια που ελέγχουν ποσοτικά γνωρίσματα (quantitative trait loci, ή QTL), (γ) στην εύρεση γονιδίων-δεικτών που είναι στενά συνδεδεμένα με QTL, (δ) στην εύρεση συντηρημένων περιοχών μεταξύ γονιδιωμάτων συγγενών ειδών, (ε) στην εύρεση ορθόλογων γονιδίων-δεικτών ή ορθόλογων QTL και (στ) στην ανάλυση της γονιδιωματικής οργάνωσης διειδικών υβριδίων, ενώ διαμορφώνουν το πλαίσιο για τον εντοπισμό μη
3 χαρτογραφημένων γονιδίων στο γονιδίωμα (Aravanopoulos 001α, Cervera κ.α. 000, Tanksley 1993). Οι προσπάθειες της κλασσικής γενετικής βελτίωσης να παράσχει απαντήσεις στα παραπάνω ερωτήματα είχαν πολύ περιορισμένα αποτελέσματα και έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά χρονοβόρες και περίπλοκες (Wright 1976). Η ανάγκη δημιουργίας γενετικών χαρτών και χαρτογράφησης QTL ενισχύεται από το ότι κάθε διαδικασία αναμενόμενης αντίδρασης σε επιλογή (response to selection) περιλαμβάνει πρότυπα αντίδρασης (norms of reaction) συνδεδεμένων ομάδων γονιδίων. Έχει δειχθεί δε, ότι η συμπεριφορά ομάδων συνδεδεμένων γονιδίων δεν είναι δυνατόν να προβλεφθεί από τις θεωρητικές εκτιμήσεις που αφορούν μοναδιαίες γονιδιακές θέσεις (Lewontin 1974). H πλέον χρησιμοποιούμενη χαρτογραφική συνάρτηση για την δημιουργία γενετικών χαρτών είναι η συνάρτηση Kosambi (Kosambi 1944). Η καταλληλότητα της ωστόσο, δεν είναι δεδομένη για κάθε πείραμα γονιδιακής σύνδεσης και χαρτογράφησης. Η διερεύνηση της καταλληλότητας της απαιτεί την ύπαρξη διασταυρώσεων και αναδιασταυρώσεων προχωρημένων γενεών, οι οποίες δεν υφίστανται για πολλούς οργανισμούς. Στην περίπτωση αυτή περιλαμβάνεται σχεδόν το σύνολο των δασικών ειδών. Μια λύση στο πρόβλημα αυτό επιχειρεί να παράσχει η παρακάτω προσέγγιση.. Χαρτογραφικές συναρτήσεις του γονιδιώματος και χιασματική παρεμπόδιση Στη χαρτογράφηση γονιδίων χρησιμοποιούνται μεθοδολογίες γενετικής ανάλυσης με σκοπό να αναδειχθεί η συσχέτιση μεταξύ των φυσικών φαινομένων της δημιουργίας του χιάσματος και της ανταλλαγής γενετικού υλικού με τα στατιστικά δεδομένα των καταμετρημένων ανασυνδιασμών. Σκοπός είναι να υπολογιστεί η πραγματική απόσταση μεταξύ δυο γονιδίων. Κατά τη διάρκεια της μείωσης μετά το διπλασιασμό και τη σύναψη των ομολόγων χρωμοσώμων δημιουργείται η τετράδα των χρωματίδων και λαμβάνει χώρα το φαινόμενο της χιασματυπίας. Πρόκειται για μια από τις βασικότερες βιολογικές διεργασίες για τη δημιουργία νέας γενετικής ποικιλότητας καθώς διασπά τη σύνδεση (δηλ. τη συνύπαρξη των γονιδίων που οριοθετούνται σε ένα χρωμόσωμα). Κάθε χίασμα περιλαμβάνει δύο χρωματίδες διαφορετικών χρωμοσώμων (μη αδελφές χρωματίδες). Η χαρτογραφική (γενετική) απόσταση σε μονάδες Morgan (M) μεταξύ δύο γονιδίων του ιδίου χρωμοσώματος είναι ο μέσος αριθμός χιασματυπιών μεταξύ των γονιδίων αυτών κατά τη διάρκεια της μείωσης που αφορούν μια χρωματίδα. Καθώς οι χιασματυπίες δεν είναι άμεσα ορατές, απαιτείται μια χαρτογραφική συνάρτηση έτσι ώστε να εκτιμάται η γενετική απόσταση από την παρατηρούμενη συχνότητα ανασυνδιασμού ως πιθανότητα ανασυνδιασμού εντός διαστήματος χαρτογραφικής απόστασης D. Εάν n γονιδιακές θέσεις ανήκουν στην ίδια ομάδα σύνδεσης οι n(n-1)/ συχνότητες ανασυνδιασμών Θ μετατρέπονται σε n-1 διαστήματα χαρτογράφησης μέσω μιας κατάλληλης χαρτογραφικής συνάρτησης w=f(θ). Η γενική χαρτογραφική συνάρτηση έχει τη μορφή: 3
4 w=[p(p-1)(1-4p)ln(1-θ)+16p(p-1)(p-1)tan -1 (Θ)+p(1-p)(8p+)tanh -1 (Θ)+ 6(1-p)(1-p)(1-4p)Θ]/6 όπου w: χαρτογραφική απόσταση, Θ: συχνότητα ανασυνδιασμών και p: χαρτογραφική παράμετρος που καταγράφει τη χιασματική παρεμπόδιση (Rao κ.α. 1977). Ως χιασματική παρεμπόδιση ορίζεται η αλληλεπίδραση μεταξύ χιασμάτων έτσι ώστε η ύπαρξη μιας ανταλλαγής μεταξύ ομολόγων χρωμοσώμων να μειώνει (θετική παρεμπόδιση), ή να αυξάνει (αρνητική παρεμπόδιση) την πιθανότητα δημιουργίας άλλου χιάσματος στη γειτονική του περιοχή. Η χιασματική παρεμπόδιση είναι ως επί το πλείστον θετική αν και οι τιμές που λαμβάνει ποικίλουν μεταξύ ειδών (Copenhaver 005, Zhao και Speed 1996), ακόμη και μεταξύ χρωμοσώμων του ιδίου είδους, όπως έχει βρεθεί στον άνθρωπο (Lin κ.α. 001) και στο ρύζι (Esch 005). Στους περισσότερους οργανισμούς στα σημεία του γονιδιώματος όπου τα ομόλογα χρωμοσώματα ανασυνδιάζονται ελαττώνεται σημαντικά η πιθανότητα επιπλέον σημείων ανασυνδιασμών στην ίδια περιοχή. Το φαινόμενο αυτό βαθμιαία μειώνεται καθώς η απόσταση από το χίασμα αυξάνεται (Zhao και Speed 1996). Επίσης είναι γνωστό ότι η χιασματική παρεμπόδιση αυξάνεται εντός μιας σταθερής χρωμοσωμικής απόστασης όταν τα σημεία που την ορίζουν μετακινούνται από το κεντρομερές προς την άκρη του χρωμοσώματος (Bailey 1961). Η χιασματική παρεμπόδιση πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη κατά τον υπολογισμό των χαρτογραφικών αποστάσεων. Η επίδραση της χιασματικής παρεμπόδισης μπορεί να εκτιμηθεί με τη χρήση που συντελεστή συμπτώσεως (C), ο οποίος ορίζεται ως ο λόγος μεταξύ της παρατηρηθήσης και της αναμενόμενης συχνότητας διπλών ανταλλαγών. Εάν 0<C<1 τότε η παρεμπόδιση είναι θετική, ενώ για τιμές μεγαλύτερες της μονάδος η παρεμπόδιση είναι αρνητική για τα δύο γονίδια στα οποία αναφέρεται. Εάν C=1 δεν υφίσταται χιασματική παρεμπόδιση, ενώ εάν C=0 η παρεμπόδιση είναι πλήρης. Για να εκτιμηθεί ο συντελεστής συμπτώσεως απαιτείται η ύπαρξη τριών ή περισσοτέρων αλληλοδιαδοχικών ετεροζύγωτων συνδεδεμένων γονιδιακών θέσεων. Ο συντελεστής συμπτώσεως είναι σύμφωνα με τον Bailey (1961): 1+ - C = 1 που Θ 1 είναι η συχνότητα ανασυνδιασμών ενός διαστήματος A-B σε τρία αλληλοδιαδοχικά γονίδια Α, Β, Γ, Θ είναι η συχνότητα ανασυνδιασμών του διαστήματος Β-Γ τριών αλληλοδιαδοχικών γονιδίων Α, Β, Γ και Θ 1+ είναι η συχνότητα ανασυνδιασμών του τμήματος Α-Γ σε τρία αλληλοδιαδοχικά γονίδια Α, Β, Γ. Η διακύμανση του συντελεστή συμπτώσεως είναι (Bailey 1961): 1+ 4
5 ( Var(C) = 1+ - ) v1+ 1( 1+ - 1 ) v 4 4 4 1 + 1 v όπου τα Θ 1, Θ, Θ 3 ορίζονται όπως παραπάνω και v 1, v, v 1+, είναι οι αντίστοιχες εκτιμήσεις διακύμανσης (v) για κάθε τιμή συχνότητας ανασυνδιασμού αντίστοιχα. 3. Η χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi Η εκλογή συνάρτησης χαρτογράφησης η οποία δύναται να προσεγγίσει με τον καλύτερο δυνατό τρόπο την πραγματική απόσταση μεταξύ δύο γονιδίων, σε μεγάλο βαθμό εξαρτάται από τον τρόπο με τον οποίο η συνάρτηση αυτή συνεκτιμά την ύπαρξη χιασματικής παρεμπόδισης. Από τις χαρτογραφικές συναρτήσεις που έχουν προταθεί κατά καιρούς (π.χ. Carter και Falconer 1951, Felsenstein 1979, Haldane 1919, Rao κ.α. 1977), η χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi (1944) χρησιμοποιείται σχεδόν αποκλειστικά σήμερα στη χαρτογράφηση των ανώτερων φυτών (Aravanopoulos 1998, 001α, 001β, Aravanopoulos κ.α 004, Cervera κ.α. 000, Esch 005, Garcia κ.α. 006, Gomez κ.α 003, Tanksley 1993). Ο Kosambi (1944) θεώρησε ότι ο συντελεστής σύμπτωσης ισούται με το διπλάσιο της συχνότητας ανασυνδιασμών (Θ), επομένως p=½. Τότε η γενική χαρτογραφική συνάρτηση λαμβάνει τη μορφή: tanh -1 ( ) w= Η εκτεταμένη χρήση της χαρτογραφικής συνάρτησης Kosambi (1944), οφείλεται κατά κύριο λόγο στο γεγονός ότι τα γενικά επίπεδα τιμών χιασματικής παρεμπόδισης που είναι σήμερα γνωστά, υποστηρίζουν τη χρήση της ως καλύτερης προσέγγισης για την εκτίμηση των χαρτογραφικών αποστάσεων, σε σχέση με άλλες διαθέσιμες συναρτήσεις (Aravanopoulos 001α, Esch 005, Esch και Weber 00, Swanson κ.α. 1981). Η απόσταση μεταξύ δύο συνδεδεμένων γονιδίων κατά Kosambi (1944) εκτιμάται από τη σχέση: 1+ 100+ D = 5ln ( 100 - ) όπου Θ είναι η συχνότητα ανασυνδιασμών (0 Θ<50) και η απόσταση D εκτιμάται σε centi-morgans (cm). Το αντίστοιχο τυπικό σφάλμα δίνεται από τη σχέση: 5
6 500s = 500 - ( sd όπου s είναι το τυπικό σφάλμα της συχνότητας ανασυνδιασμών και Θ είναι η συχνότητα ανασυνδιασμών. Η τιμή s D δίνεται επίσης σε cm (Owen 1950). 4. Καταλληλότητα της συνάρτησης Kosambi για χαρτογράφηση του γονιδιώματος Η χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi (Kosambi 1944) έχει σημαντικές και εξαιρετικά χρήσιμες εφαρμογές στη χαρτογράφηση γονιδίων και τη σύναξη γενετικών χαρτών, ωστόσο η χρήση της περιορίζεται ως ένα βαθμό από το γεγονός ότι καθορίζει ένα συγκεκριμένο βαθμό χιασματικής παρεμπόδισης. Η εκτίμηση της χιασματικής παρεμπόδισης επιτρέπει τη σύγκριση μεταξύ του επιπέδου χιασματικής παρεμπόδισης, που υπολογίζεται από πειραματικά δεδομένα σύνδεσης σε ένα είδος, και της τιμής παρεμπόδισης που αντιστοιχεί εξ ορισμού στη χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi. Ωστόσο, ο συντελεστής συμπτώσεως, από τον οποίο θα μπορούσε να εκτιμηθεί η πραγματική χιασματική παρεμπόδιση, εξ ορισμού παρουσιάζει το μειονέκτημα της εξάρτησης από τις τιμές συχνοτήτων ανασυνδιασμών συγκεκριμένων χρωμοσωμικών τμημάτων, καθώς οι περιπτώσεις τουλάχιστον τριών αλληλοδιαδοχικών στενά συνδεδεμένων γονιδίων ενδέχεται να μην υφίστανται σε όλους τους χρωμοσωμικούς βραχίονες, ούτε να είναι κατανεμημένες με κανονικό τρόπο κατά μήκος ενός χρωμοσώματος και του γονιδιώματος εν γένει. Ο Owen (1950) βασιζόμενος στην ασυμφωνία μεταξύ των θεωρητικών και των πραγματικών τιμών χιασματικής παρεμπόδισης, ανέπτυξε μια διαδικασία, η οποία δύναται να δείξει κατά πόσον η συνάρτηση Kosambi είναι κατάλληλη για τα δεδομένα στα οποία εφαρμόζεται. Ο Owen (1950) όρισε ένα δείκτη τον οποίο ονόμασε συντελεστή Kosambi (K). Στην ειδική περίπτωση όπου η πραγματική παρεμπόδιση βρίσκεται πλησίον της τιμής που ορίζει η συνάρτηση Kosambi τότε η τιμή του συντελεστή (K) είναι η μονάδα. Θεωρώντας τρεις αλληλοδιαδοχικά συνδεδεμένες γονιδιακές θέσεις οι οποίες ορίζουν δύο διαστήματα ο συντελεστής Kosambi είναι: Κ = 1,00 ενώ η διακύμανση αυτού ορίζεται ως: 1 5 1 1 4 8 1 K Var(K) = K ( + - - - - ) 1 1+ 1+ 1 + 1 n n ) όπου: n=αριθμός δείγματος που μελετήθηκε α 1=συχνότητα ανασυνδυασμών στο διάστημα I α =συνχνότητα ανασυνδιασμών στο διάστημα II 6
7 α 1=συχνότητα ανασυνδιασμών στα διαστήματα I και II ταυτόχρονα (Owen 1953, Bailey 1961). Η στατιστική δοκιμή της απόκλισης του συντελεστή K από τη μονάδα γίνεται με εφαρμογή της παρακάτω δοκιμής X (Owen 1953): (K -1) = Var(K) όπου η διακύμανση Var(K) υπολογίζεται όπως παραπάνω, η τιμή K ισούται με τη μονάδα και η δοκιμή έχει ένα βαθμό ελευθερίας. 5. Αδυναμία εφαρμογής του συντελεστή Kosambi στα δασικά δένδρα και προσέγγιση επίλυσης Η παραπάνω διαδικασία αναπτύχθηκε από τον Owen (1953) και έχει εφαρμογή στην περίπτωση που τα διαθέσιμα δεδομένα προέρχονται από κριτική διασταύρωση στην οποία η διάταξη σύνδεσης των γονιδίων (ομόπλευρη ή ετερόπλευρη) είναι γνωστή. Δυστυχώς στη μεγάλη πλειονότητα των σχετικών δεδομένων που προέρχονται από δασικά δένδρα η διάταξη σύνδεσης των γονιδίων είναι άγνωστη, ενώ η ύπαρξη κριτικών διασταυρώσεων σπανίζει. Το φαινόμενο αυτό είναι απότοκος της δυσκολίας που υπάρχει στα δασικά δένδρα για τη διενέργεια ελεγχόμενων διασταυρώσεων και του μεγάλου χρόνου που πρέπει να παρέλθει για την αναπαραγωγική ωρίμανση των δασικών δένδρων. Η ύπαρξη κριτικής διασταύρωσης προϋποθέτει την προτεραία δημιουργία F 1 γενεάς, έτσι ώστε να προκύψουν στη συνέχεια άτομα κριτικής διασταύρωσης κατάλληλα για γενετική ανάλυση. Επομένως, απαιτείται χρονικό διάστημα που δύναται να υπερβαίνει κατά πολύ τη δεκαετία, ή ακόμα και την εικοσαετία. Επιπλέον η χρήση ειδικών αλγορίθμων πολυγονιδιακών προτύπων για τον ακριβή υπολογισμό της χιασματικής παρεμπόδισης δεν είναι δυνατή στα δασικά δένδρα, καθώς δεν υπάρχουν διαθέσιμα δεδομένα ανάλυσης τετράδας (Browning 003). Η ένδεια κατάλληλων δεδομένων καθιστά ανεφάρμοστη τη χρήση του συντελεστή Kosambi. Για την αντιμετώπιση του προβλήματος αυτού προτείνεται μια απλή διαδικασία με την οποία είναι δυνατόν να εκτιμηθούν οι τιμές K και Var(K) και με την εφαρμογή της δοκιμής X να εξαχθεί συμπέρασμα σχετικά με την καταλληλότητα της χαρτογραφικής συνάρτησης Kosambi για συγκεκριμένα πειραματικά δεδομένα δασικών ειδών, ακόμα και όταν η γονιδιακή διάταξη των γονέων είναι άγνωστη και δεν υπάρχουν κριτικές διασταυρώσεις. Η διαδικασία αυτή είναι εφαρμόσιμη σε ενδοειδικές ή δυειδικές διασταυρώσεις οιασδήποτε τάξεως, οι οποίες δύναται να θεωρηθούν ως ισοδύναμες της κριτικής διασταύρωσης, δηλαδή περιπτώσεις όπου οι αναμενόμενες αναλογίες κοινού διαχωρισμού (joint segregation) ακολουθούν τη μορφή 1:1:...:1. Μπορούν επομένως να εφαρμοστούν σε όλες τις περιπτώσεις όπου ο σχεδιασμός χαρτογράφησης γονιδίων ακολουθεί τη στρατηγική της χαρτογράφησης ψευδοκριτικής διασταύρωσης (pseudotestcross mapping 7
8 strategy, Grattapaglia και Sederoff 1994) και τη στρατηγική χαρτογράφησης σύμφωνα με το πρότυπο ετερομεικτικών διασταυρώσεων (outbred model mapping strategy, Sewell κ.α. 1999). Παρακάτω παρουσιάζεται η προτεινόμενη διαδικασία για την περίπτωση τριών αλληλοδιαδοχικών συνδεδεμένων γονιδιακών θέσεων, οι οποίες αναδεικνύουν τέσσερις κλάσεις κοινού διαχωρισμού, αν και η διαδικασία αυτή είναι δυνατό να αναχθεί σε μεγαλύτερο αριθμό κλάσεων. Τα πιθανά αποτελέσματα για τέσσερις κλάσεις όπως ορίστηκαν παραπάνω για ελεγχόμενη διασταύρωση ισοδύναμη της κριτικής παρουσιάζονται στον Πιν. 1. Οι πιθανοί συνδυασμοί γονιδιακών θέσεων αφορούν την πρώτη γονιδιακή θέση σε συνδυασμό με τη δεύτερη και τη δεύτερη σε συνδυασμό με την τρίτη στην αλληλουχία τριών συνδεδεμένων γονιδιακών θέσεων. Δύο πιθανές περιπτώσεις διάταξης διακρίνονται για κάθε γονιδιακή θέση και όταν δύο διαδοχικά ζεύγη γονιδιακών θέσεων λαμβάνονται υπόψη υπάρχουν τέσσερις πιθανές διατάξεις για τις γονιδιακές θέσεις του ετεροζύγωτου γονέα: ομόπλευρη / ομόπλευρη, ομόπλευρη / ετερόπλευρη, ετερόπλευρη / ομόπλευρη και ετερόπλευρη / ετερόπλευρη. Όλοι οι απόγονοι είναι δυνατό να κατηγοριοποιηθούν ως ανασυνδιασμένοι ή μη ανασυνδιασμένοι, σύμφωνα με τη διαδικασία που παρουσιάζεται στον Πίνακα 1, όπου περιλαμβάνονται και οι δύο περιπτώσεις πατρικής διάταξης. Όταν και οι δύο γονιδιακές θέσεις αναλύονται συγχρόνως τότε είναι δυνατό να εκτιμηθούν οι παράμετροι α 1, α, και α 1. Στην πράξη δεν υπάρχει ανάγκη να γίνουν τέσσερις ανεξάρτητες διαδικασίες εκτιμήσεων των παραμέτρων ανάλογα με την θεώρηση της ορθής πατρικής γονιδιακής διάταξης. Έστω ότι β 1, β, β 3, και β 4, οι τιμές που έχουν καταγραφεί για την διάταξη «ομόπλευρη / ομόπλευρη». Για κάθε άλλη διάταξη οι καταγεγραμμένες τιμές αποτελούν αναδιευθετήσεις των αρχικών και παρουσιάζονται στον Πίνακα. Θεωρητικά, όλες οι εν δυνάμει διευθετήσεις πατρικών διατάξεων και κατηγοριών ανασυνδιασμών είναι δυνατόν να διερευνηθούν, αν και μόνο μια είναι η ορθή. Ωστόσο στους περισσότερους οργανισμούς περιλαμβανομένης και της πλειονότητας των ανώτερων φυτών η χιασματική παρεμπόδιση έχει βρεθεί θετική (C<1), η ελαφρά αρνητική (1<C<1,5; Browning 003, Esch 005, Garcia κ.α. 006, Rao κ.α. 1977, Strauss και Conkle 1986, Swanson κ.α. 1981, Zhao και Speed 1996). Ισχυρή αρνητική χιασματική παρεμπόδιση (C>5) έχει βρεθεί μόνο σε ορισμένους μύκητες (Esch 005, Swanson κ.α. 1981). Σύμφωνα με τα παραπάνω επίπεδα χιασματικής παρεμπόδισης κάθε υψηλή τιμή της παραμέτρου α 1 του τύπου του Owen τεκμαίρεται ότι δεν πρέπει να λαμβάνεται υπόψη για περαιτέρω διερεύνηση ως βιολογικά ασύμβατη. Για τον λόγο αυτό προτείνεται να μη λαμβάνονται υπόψη όλες οι περιπτώσεις στις οποίες ο αριθμός των διπλών ανταλλαγών υπερβαίνει το άθροισμα του αριθμού των απλών ανταλλαγών, επομένως να εισαχθεί μια τιμή κατωφλίου κατά τη χρήση του τύπου του Owen της μορφής α 1<α 1+α. Υπάρχουν τέσσερις πιθανές δοκιμές που πρέπει να διερευνηθούν: (1) β 4<β +β 3, () β <β 4+β 1, (3) β 3<β 1+β 4 και (4) β 1<β 3+β (Πιν. ). Μετά την απόρριψη αυτών που υπερβαίνουν την τιμή 8
9 κατωφλίου, οι υπόλοιπες περιπτώσεις μπορούν να διερευνηθούν με τον τύπο του Owen και να ακολουθήσει η ο έλεγχος σημαντικότητας με τη σχετική δοκιμή X κατά περίπτωση. Η καταλληλότητα της χαρτογραφικής συνάρτησης Kosambi μπορεί να θεωρηθεί δεδομένη στην περίπτωση που όλες οι δοκιμές X είναι μη σημαντικές. Στην περίπτωση που οι δοκιμές είναι όλες στατιστικά σημαντικές η χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi πρέπει να θεωρηθεί ως ακατάλληλη. Στις περιπτώσεις κατά τις οποίες οι δοκιμές X δίνουν αποτελέσματα κατά πλειοψηφία, τότε αντίστοιχα η χαρτογραφική συνάρτηση Kosambi πρέπει να προτείνεται ή να μην προτείνεται αντιστοίχως, με επιφύλαξη. Η προσέγγιση που παρουσιάστηκε παραπάνω δίνει μια λύση στο πρόβλημα της εκλογής της χρήσης της χαρτογραφικής συνάρτησης Kosambi, συνεκτιμώντας τα επίπεδα χιασματικής παρεμπόδισης των διαθέσιμων δεδομένων. Η προτεινόμενη λύση έχει εφαρμογή ειδικά στη μοριακή βελτίωση κωνοφόρων και πολυετών ξυλωδών αγγειοσπέρμων λόγω των ιδιαίτερων χαρακτηριστικών που παρουσιάζουν τα δεδομένα γενετικής σύνδεσης στα δασικά δένδρα. Βιβλιογραφία Aravanopoulos, F.A., 001α. Analysis of genetic linkage and genome mapping. In: Tsaftaris, A.S. and A.N. Polidoros (eds). Genome Sequencing and Comparative Analysis, University Studio Press, Thessaloniki, pp. 9-6. Aravanopoulos, F.A., 001β. Genetic linkage analysis in Salix eriocephala suggests linkage conservation above the species level. Forest Genetics 8(): 145-149. Aravanopoulos, F.A., 1998. Analysis of genetic linkage in Salix exigua Nutt. Silvae Genetica 47(-3): 17-131. Aravanopoulos, F.A., Manescu, C., Maios C., Hamamouch N., Harfouche A. and A. Doulis 004. Molecular linkage mapping in Cupressus sempervirens L. based on RAPD, SCAR and morphological markers. Acta Physiologiae Plantarum 6 (3, Suppl.): 30. Bailey, N.T.J., 1961. Introduction to the mathematical theory of genetic linkage. Clarendon Press, Oxford. 99 pp. Browning, S., 003. Pedigree data analysis with crossover interference. Genetics 164: 1561-1566. Carter, T.C. and D.S. Falconer 1951. Stocks for detecting linkage in the mouse and the theory of their design. J. Genet. 50:307-33. Cervera, M.T., C. Plomion and C. Malpica 000. Molecular markers and genome mapping in woody plants. In: Jain, S.M. and S.C. Minocha (eds). Molecular Biology of Woody Plants, Kluwer, Vol. 1: 375-394. Copenhaver, G.P., 005. Plant genetics: when not to interfere. Curr. Biol. 15: R90-R91. Esch, E., 005. Estimation of gametic frequencies from F populations using the EM algorithm and its application in the analysis of crossover interference 9
10 in rice. Theor. Appl. Genet. 111: 100-109. Esch, E. and W.E. Weber 00. Investigation of crossover interference in barley (Hordeum vulgare L.) using the coefficient of coincidence. Theor. Appl. Genet. 104: 786-796. Felsenstein, J., 1979. A mathematically traceable family of genetic mapping functions with different amounts of interference. Genetics 91: 769-775. Garcia, A.A.F., Kido E.A. and A.N. Meza 006. Development of an integrated genetic map of a sugarcane (Saccharum spp.) commercial cross, based on a maximum-likelihood approach for estimation of linkage and linkage phases. Theor. Appl. Genet. 11: 98-314. Gomez, A., Aravanopoulos, F.A., Bueno M.A. and R. Alia 003. Linkage of random amplified polymorphic DNA markers in Pinus halepensis Mill. Silvae Genetica 51(5-6): 196-01. Grattapaglia, D. and R. Sederoff 1994. Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and E. urophylla using a pseudotestcross: mapping strategy and RAPD markers. Genetics 137: 111-1137. Haldane, J.B.S., 1919. The combination of linkage values and the calculation of distances between the loci of linked factors. J. Genet. 8:99-309. Kosambi, D.D., 1944. The estimation of map distances from recombination values. Ann. Eugen. Lond. 1: 17-175. Lewontin R.C. 1974. The genetic basis of evolutionary change. Columbia University Press, New York. 346pp. Lin, S., Cheng R. and F.A. Wright 001. Genetic crossover interference in the human genome. Ann. Hum. Genet. 65: 79-93. Mather, K. 1963. The measurement of linkage in heredity. Methuen and Co. Ltd. London. 149 pp. Owen, A.R.G., 1950. The theory of genetic recombination. Adv. Genet. 3: 117-157. Rao, D.C., Morton N.E., Lindsten J., Hulten M. and J. Yee 1977. A mapping function for man. Hum. Hered. 7:99-104. Sewell, M.M., Sherman B.K. and D.B. Neale 1999. A consensus map for loblolly pine (Pinus taeda L.). I. Construction and integration of individual linkage maps from two outbred three generation pedigrees. Genetics 15: 31-330. Strauss, S.H. and M.T. Conkle 1986. Segregation, linkage and diversity of allozymes in knobcone pine. Theor. Appl. Genet. : 417-434. Swanson, C.P., T. Merz and W.J. Young 1981. Cytogenetics. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs, New Jersey. 577 pp. Tanksley, S. D., 1993. Mapping polygenes. Ann. Rev. Genet. 7: 05-33. Wright, J.W. 1976. Introduction to forest genetics. Academic Press. New York, San Francisco, London. 463pp. Zhao, H. and T.P. Speed 1996. On genetic map functions. Genetics 14: 1369-1377. 10
11 11
1 On the suitability of the Kosambi mapping function for the application of molecular breeding in forest trees via the demonstration of genomic organization F.A. Aravanopoulos Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Department of Forestry and Natural Environment, P.O. Box 38, Aristotle University of Thessaloniki, 54006, Thessaloniki, Greece, E-mail: aravanop@for.auth.gr Abstract Molecular breeding in forest trees relies on the best possible approximation of the distance between two loci (usually a QTL and a marker locus) in base pairs, through the estimation of genetic mapping distance. The most important parameter in achieving such approximation is the incorporation of crossover interference in the calculation of mapping distance. The estimation of interference levels in an organism permits a comparison with the fixed levels of interference that the usually applied Kosambi mapping function assumes. An approach known as Owen s formula can indicate if the Kosambi function is appropriate for the data it has been applied to. It is based on the concordance of the actual and postulated interference levels. This approach has been developed for the special case of triple backcrosses with known parental phases. Because of these prerequisites, the value of this approach in forest genetics and breeding is very limited, since backcrosses and high order filial generations are non-existent. This paper presents a statistical procedure which can indicate if the Kosambi function is appropriate for the data it has been applied to even when parental phases are unknown and for intercrosses equivalent to backcrosses. Keywords: Kosambi mapping function, chromosomal interference, genomics, molecular breeding 1
13 Πίνακας 1. Απόγονοι πατρικών τύπων και απόγονοι ανασυνδιασμών ελεγχόμενης διασταύρωσης ισοδύναμης της κριτικής για ένα ζεύγος γονιδιακών θέσεων βασιζόμενη στην πατρική διάταξη του ετεροζύγωτου. Αλληλoμορφική συγκρότηση απόγονοι διπλά ετεροζύγωτοι ή ομοζύγωτοι Γονέας σε ομόπλευρη διάταξη μη ανασυνδιασμένοι Γονέας σε ετερόπλευρη διάταξη ανασυνδιασμένοι απόγονοι ετεροζύγωτοι ανασυνδιασμένοι μη ανασυνδιασμένοι Πίνακας. Αναδιευθετήσεις των τιμών της διάταξης «αμφότερες ομόπλευρες» για όλες τις διαθέσιμες πατρικές γονιδιακές διατάξεις και κατηγορίες ανασυνδιασμών. Πατρική διάταξη ανά Κατηγορία ανασυνδιασμών Σύνολο διάστημα καμία 1 ο ο αμφότερα διάστημα διάστημα διαστήματα αμφότερες ομόπλευρες β 1 β β 3 β 4 n 1 η ομόπλευρη/ η β 3 β 4 β 1 β n ετερόπλευρη 1 η ετερόπλευρη/ η β β 1 β 4 β 3 n ομόπλευρη αμφότερες β 4 β 3 β β 1 n ετερόπλευρες τύπος του Owen α 0 α 1 α α 1 n 13