ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥΣ

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΤΗΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑ Η oικoλoγία τωv μικρoβίωv είvαι έvας καιvoύργιoς επιστημovικός κλάδoς, πoυ έχει πρόσφατα κερδίσει έδαφoς, λόγω της αvαγvώρισης ότι oι μικρoβιακές διαδικασίες παίζoυv σπoυδαίo ρόλo σε όλα τα oικoσυστήματα και τελικά στη διατήρηση τoυ περιβάλλovτoς στov πλαvήτη μας. Είναι γνωστό ότι μικροοργανισμοί έχουν απομονωθεί σε ένα ευρύ φάσμα βιοτόπων ως το έδαφος, ο αέρας, το ύδωρ και ότι υπάρχουν μικροοργανισμοί σε κάθε περιβάλλον. Ο ρόλoς των μικρoβίωv σχετίζεται άμεσα με τη γεvετική μεταβoλή στo περιβάλλov και τη σύγκρoυση πoυ έχει στηv εξέλιξη, στηv επιβίωση τωv oργαvισμώv και στη σταθερότητα τωv oικoσυστημάτωv. Η γνώση της oικoλoγίας τωv μικρoβίωv είvαι χρήσιμη στη βιoτεχvoλoγία και στη βιoμηχαvική μικρoβιoλoγία. Κάθε περιβάλλον αποτελεί ένα μικρο-οικοσύστημα που αποικείται από μικροοργανισμούς ως φυσιολογική χλωρίδα.η χλωρίδα αυτή προέρχεται από τον περιβάλλοντα χώρο στον οποίο εκτίθεται το οικοσύστημα αυτό, ήτοι έδαφος, ατμόσφαιρα, υδάτινο σύστημα. Κάθε τροποποίηση συνθηκών του οικοσυστήματος αυτού πχ, μεταφορά μικροβίων ανθρώπινες παρεμβάσεις, υγρασία, ph, φυσικοχημικοί παράγοντες, επιβαρύνει και διαταράσσει το οικοσύστημα. Στην περίπτωση των τροφίμων και των φαρμάκων,όπως θα εξηγηθεί εμπεριστατωμένα δια μέσω αυτού του βιβλίου δημιουργούνται επικίνδυνες αλλοιώσεις που ενέχουν κίνδυνο για την δημόσια υγεία. ΤΡΟΦΙΜΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΤΟΥΣ Τα τρόφιμα που τρώμε είναι σπάνια στείρα μικροοργανισμών. Φέρουν τη μικροβιακή χλωρίδα που η σύνθεση της είναι πολύ διαφορετική από το ένα τρόφιμο στο άλλο. Οι παρόντες μικροοργανισμοί προέρχονται είτε από τη φυσική μικροχλωρίδα της πρώτης ύλης είτε εισάγονται κατά τη διάρκεια της συγκομιδής, της σφαγής, της επεξεργασίας, της αποθήκευσης και της διανομής των τροφίμων. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα τρόφιμα καταναλώνονται χωρίς καμία συνέπεια. Σε άλλες περιπτώσεις, οι μικροοργανισμοί φανερώνουν την παρουσία τους με τους ακόλουθους τρόπους: (α) με την πρόκληση της αλλοίωσης των τροφίμων, (β) με την πρόκληση της τροφογενούς λοίμωξης ή (γ), μπορούν να μετασχηματίσουν τα τρόφιμα με έναν ευεργετικό τρόπο, που καλείται ζύμωση τροφίμων. 66

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Αλλοίωση τροφών και συντήρηση Είναι γνωστό ότι γίνεται συστηματικά αποθήκευση των ξηρών καρπών, άλλων καρπών και των σιτηρών για τους χειμερινούς μήνες τόσον από τα θηλαστικά, όσον και από τον άνθρωπο. Με την πρόοδο στη γεωργία, η ασφαλής αποθήκευση της παραγωγής πλεονάσματος είναι μεγάλης σπουδαιότητας. Οι μικροβιολογικές αρχές αναπτύχθηκαν εμπειρικά από τους ανθρώπους για να συλλάβουν ή να καθυστερήσουν τη φυσική διαδικασία της αποσύνθεσης. Πολλές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για αυτόν το λόγο. Η συντήρηση τροφίμων εξαρτήθηκε κατά ένα μεγάλο μέρος από τη μείωση δραστηριοποίησης ύδατος (water activity) υπό μορφή ηλιακής ξήρανσης, αλατίσματος, συμπυκνωμένων ζαχαρωδών προϊόντων ή καπνίσματος στη φωτιά. Το αποτέλεσμα της εκθετικής ανάπτυξης του πληθυσμού και της αριθμητικής ανάπτυξης της γεωργικής παραγωγικότητας θα ήταν υπερπληθυσμός και μαζικός λιμός. Τον 19 αιώνα η ανάπτυξη των βιομηχανιών συντήρησης τροφίμων άρχισε. Η συστηματική βιομηχανοποιημένη κατάψυξη, κονσερβοποίηση και συντήρηση επέτρεψε την ευρεία και ασφαλή μεταφορά των τροφίμων από απομακρυσμένους παραγωγούς. Σήμερα, υπάρχουν αρκετά τρόφιμα για να θρέψουν τον παγκόσμιο πληθυσμό. Παρά τη γενική επάρκεια, αναγνωρίζεται ότι ένα μεγάλο ποσοστό του πληθυσμού είναι υποσιτιζόμενο. Αυτό υπολογίζεται στο 1/5 του παγκόσμιου πληθυσμού. Οι σημαντικότερες απώλειες τροφίμων εμφανίζονται ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες κατά την προ - και την μετά - συγκομιδή περίοδο. Η απώλεια αυτή έχει υπολογιστεί σε 10% για τα δημητριακά, 20% για τα λαχανικά και περισσότερο από 25% για τα ιδιαίτερα ευαίσθητα στην αλλοίωση προϊόντα όπως τα ψάρια. Επίσης, έχει υπολογιστεί ότι οι απώλειες στα δημητριακά και τα λαχανικά στις αναπτυσσόμενες χώρες ανέρχονται σε 100 εκατομμύρια τόνους και θα ήταν αρκετές να θρέψουν 300 εκατομμύρια ανθρώπους. Είναι σαφές ότι η μείωση τέτοιων απωλειών θα συμβάλει ουσιαστικά στη συμβολή της σίτισης του πληθυσμού. Ο αγροτροφικός τομέας είναι σημαντικής σπουδαιότητας για την ευρωπαϊκή και διεθνή οικονομία. Η οικονομική σημασία και η πανταχού παρουσία των τροφίμων στη ζωή μας συντείνουν στην ασφάλεια του κοινωνικού συνόλου, και ειδικότερα των δημόσιων αρχών και των παραγωγών. Συμπερασματικά είναι κατανοητό ότι είναι αναγκαίες οι απλές, χαμηλού κόστους, αποτελεσματικοί μέθοδοι για την αποθήκευση και τη συντήρηση τροφίμων. Ασφάλεια τροφίμων Οι τροφές έχουν μια μακροχρόνια σχέση με τη μετάδοση των τροφογενών λοιμώξεων. Οι ειδικοί κανονισμοί σχετικά με την υγιεινή τροφίμων πρέπει να τηρηθούν. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (WHO,1992) αναφέρει ότι: Η τροφική ασθένεια είναι ίσως το πιο διαδεδομένο πρόβλημα υγείας στο σύγχρονο κόσμο και μια σημαντική αιτία της μειωμένης οικονομικής παραγωγικότητας. 67

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων Εικόνα 7. Σακχαρώδες τρόφιμο προς πώληση σε υπαίθρια αγορά Η καθιέρωση μιας ανεξάρτητης ευρωπαϊκής αρχής τροφίμων θεωρείται από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή η πιο κατάλληλη απάντηση στην ανάγκη να εγγυηθεί ένα υψηλό επίπεδο ασφάλειας τροφίμων. Αυτή η αρχή θα επιφορτιζόταν με διάφορους βασικούς στόχους που περικλείουν τις ανεξάρτητες επιστημονικές συμβουλές για όλες τις πτυχές σχετικά με την ασφάλεια τροφίμων (Εικόνα 7), τη λειτουργία γρήγορων και άγρυπνων συστημάτων, την επικοινωνία και το διάλογο με τους καταναλωτές στα ζητήματα ασφάλειας και εξυγίανσης τροφίμων καθώς επίσης και τη δικτύωση με τις εθνικές αντιπροσωπείες και τους επιστημονικούς οργανισμούς. Η ευρωπαϊκή αρχή τροφίμων θα παράσχει στην Επιτροπή την απαραίτητη ανάλυση. Μετά από το έγγραφο της Επιτροπής για το νόμο τροφίμων [ τελικό COM(97)176 ], και τις μετέπειτα διαβουλεύσεις, ένα νέο νομικό πλαίσιο θα προταθεί. Αυτό θα καλύψει το σύνολο της τροφικής αλυσίδας, συμπεριλαμβανομένης της παραγωγής ζωικών τροφών, καθιερώνει ένα υψηλό επίπεδο προστασίας της υγείας του καταναλωτή και αποδίδει σαφώς την αρχική ευθύνη για την ασφαλή παραγωγή τροφίμων στη βιομηχανία, τους παραγωγούς και τους προμηθευτές. Ο αποδοτικός έλεγχος των επιμολύνσεων και των υπολειμμάτων στα τρόφιμα είναι μια ουσιαστική συμβολή στη συντήρηση ενός υψηλού επιπέδου προστασίας καταναλωτών στην Ευρωπαϊκή Ένωση. Τα τρόφιμα ζωικής και φυτικής προέλευσης μπορούν να παρουσιάσουν τους εγγενείς κινδύνους, λόγω μικροβιολογικής επιμόλυνσης. Για να προστατεύσει τους καταναλωτές από τους μικροβιολογικούς κινδύνους στα τρόφιμα, η κοινοτική νομοθεσία καθορίζει τα πολυάριθμα μέτρα υγιεινής (οι βασισμένες στο HACCP αρχές, ο συστηματικός έλεγχος κρέατος κ.λπ...) αποκαλούμενα μικροβιολογικά κριτήρια. Τα μικροβιολογικά κριτήρια είναι εργαλεία που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην αξιολόγηση της ασφάλειας και της ποιότητας των τροφίμων. Ζύμωση τροφών Τα μικρόβια μπορούν εντούτοις να διαδραματίσουν κάποιο θετικό ρόλο στα τρόφιμα. Μπορούν να επηρεάσουν τα τρόφιμα αλλάζοντας τις ιδιότητές τους με έναν ευεργετικό τρόπο. Το πιο γνωστό παράδειγμα είναι ο Lactobacillus που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία του γιαουρτιού. Η διαδικασία αυτή καλείται ζύμωση τροφίμων. 68

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΟΙΚΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ, ΦΑΡΜΑΚΩΝ & ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΩΝ Είναι γνωστό ότι στον άνθρωπο ανευρίσκονται περί τους 10.14 με 10.16 μικροοργανισμοί που είναι κατανεμημένοι σε διαφόρους οικοτόπους ως το δέρμα, το πεπτικό σύστημα,η στοματική κοιλότητα, η κολπική κοιλότητα. Η χλωρίδα των ανωτέρω οικοσυστημάτων αποτελείται από σαπρόφυτους μικροοργανισμούς, που σε ορισμένες περιπτώσεις συνυπάρχουν με παθογόνα μικρόβια η άλλους μικροοργανισμούς σε υγιείς φορείς μικροβίων. Στο δέρμα συνυπάρχουν αερόβιοι και αναερόβιοι μικροοργανισμοί. Συχνότερα απομονώνονται οι P.acnes, Staphylococcus και σπανιότερα οι Pseudomonas, Enterobacteriaceae.Είναι γεγονός ότι η χλωρίδα των χεριών στον άνθρωπο είναι ιδιαίτερα επιβαρυμένη σε μικροοργανισμούς λόγω επαφής μας με τις χειρολαβές, πόρτες,κουπαστή σκάλας κ.α. Η παρουσία των μικροοργανισμών της χλωρίδας αυτής πραγματοποιείται με καλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό υλικό σε τριβλία. Στην στοματική κοιλότητα παρατηρούνται 10.7-10.8 αερόβιοι και αναερόβιοι μικροοργανισμοί/ml.οι συνηθέστερα απαντώμενοι είναι κόκκοι Gram (+) και Gram (-) και βάκιλοι Gram (+) και Gram (-). Παθογόνοι μικροοργανισμοί ανευρίσκονται στο ρινοφάρυγγα, όπως Staphylococcus aureus και Neisseria meningitidιs. Το δέρμα και το τριχωτό της κεφαλής επιβαρύνεται με αιωρούμενους μικροοργανισμούς. Η πλουσιότερα σε μικροοργανισμούς χλωρίδα είναι η εντερική χλωρίδα χλωρίδα του παχέος εντέρου φέρει αφθονία μικροοργανισμών,ήτοι 10.8-10.10 μικροοργανισμοί/g κοπράνων. Στην εντερική χλωρίδα απομονώνονται σαπρόφυτοι και παθογόνοι μικροοργανισμοί. Ο χαρακτηριστικός εκπρόσωπος της εντερικής χλωρίδας είναι τα αερόβια, κυρίως Enterobacteriaceae. Ενίοτε απομονώνονται οι παθογόνοι μικροοργανισμοί Pseudomonadaceae. Οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί φαίνεται σαφέστατα ότι υπερτερούν των αερόβιων (1000x) στην χλωρίδα του παχεος έντερου. Οι συνηθέστερα απαντώμενοι μικροοργανισμοί περιλαμβάνουν Clostridium;C.perfringens και Bacteroides;B.fragilis. Πλην όμως του ανθρώπου και τα ζώα μπορούν να αποτελέσουν πηγές μικροοργανισμών που προέρχονται από το πεπτικό τους σύστημα η την επιδερμίδα τους, και επομένως να επιμολύνουν φάρμακα, τρόφιμα, καλλυντικά. Οι μύγες μεταφέρουν σημαντικό αριθμό μικροοργανισμών (25.10.6 μικροοργανισμοί) τόσον με τα κόπρανα αλλά και τα πόδια τους. 69

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων Οι μολυσμένοι από τους υπονόμους και από την επαφή τους με το έδαφος ποντικοί και αρουραίοι μεταφέρουν μικροοργανισμούς με την επιδερμίδα(γούνα)και στην χλωρίδα των κοπράνων τους.σε περίπτωση επαφή τους με φάρμακα, τρόφιμα, καλλυντικά η τον άνθρωπο μπορούν να επιβαρύνουν με τραγικές συνέπειες τα οικοσυστήματα αυτά. Πρέπει λοιπόν να γίνεται συστηματικός έλεγχος σε όλα τα επίπεδα και συστήματα που επιβαρύνονται μικροβιακά, ήτοι σωληνώσεις, δοχεία, τουρμπίνες, αναδευτές, δοχεία αποθήκευσης, τοίχοι, πάτωμα, σκούπες, βούρτσες, έτσι όπως επιβάλλεται από την νομοθεσία ανάλογα με τις ιδιαιτερότητες και προδιαγραφές του χώρου, αλλά και τον βαθμό της απαιτουμένης ασηψίας. Ως παράδειγμα αναφέρεται ότι η μεγίστη ασηψία απαιτείται στον χώρο των χειρουργείων. Οι συνηθέστερα απαντώμενοι μικροοργανισμοί που επιβαρύνουν τρόφιμα,φάρμακα και καλλυντικά είναι (Πίνακας 10): Συνηθέστεροι μικροοργανισμοί σε τρόφιμα,φάρμακα και καλλυντικά Alcaligenes Alteromonas Bacillus Enterobacteriaceae, ήτοι Ε. coli, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Serratia, Morganella, Hafnia, Edwardsiella, Providencia, Proteus, Yersinia Flavobacterium Micrococcaceae, ήτοι Micrococcus και Staphyloccus: S.aureus, S.epidermidis, S.saprophyticus Streptococcaceae, ήτοι Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Gemella Peptococcaceae, ήτοι Ρeptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Sarcina, Coprococcus Pseudomonas, ήτοι P.aeruginosa, P.fluorescens, P.putida, P.alcaligeneς P.cepacia, P.pseudoalcaligenes Xanthomonas Πίνακας 10. Συνηθέστεροι μικροοργανισμοί σε τρόφιμα,φάρμακα και καλλυντικά Υπάρχουν όμως μικροοργανισμοί που προκαλούν σπανιότερα επιμολύνσεις στα ανωτέρω οικοσυστήματα και αναφέρονται ως ασυνήθεις επιμολύνσεις από μικροοργανισμούς (Πίνακας 11). 70

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Ασυνήθεις μικροοργανισμοί σε τρόφιμα,φάρμακα και καλλυντικά Βάκιλοι Gram (+) μη σπορογόνοι, ήτοιlisteria, Erysipelothrix, Propionibacterium acnes,mycobacterium,streptococcus αιμολυτικοί Βάκιλοι Gram (+) σπορογόνοι, ήτοιβacillus anthracis, Clostridium perfringens, Clostridium tetani Βάκιλλοι Gram (-), ήτοιsalmonella, Brucella, Pasteurella, Yersinia Πίνακας 11. Ασυνήθεις μικροοργανισμοί σε τρόφιμα,φάρμακα και καλλυντικά Πρέπει να σημειωθεί ανάλογα με την προέλευση η ενδεχόμενη μικροβιακή επιβάρυνση του τελικού προϊόντος είναι διαφορετική. πχ. υπάρχουν φάρμακα και καλλυντικά φυτικής προέλευσης η άλλα που περιέχουν συστατικά ζωικής προέλευσης ως πλακούντα, ορό, αμνιακό υγρό. Δεν πρέπει να υποτιμάται το γεγονός ότι η μικροβιακή επιβάρυνση μπορεί να επέλθει μετά την παρασκευή και αποστείρωση του προϊόντος. Η διαδικασία εφαρμογής του καλλυντικού/φαρμάκου,η βρώση του τροφίμου/φαρμάκου, αν δεν τηρηθούν βασικοί κανόνες υγιεινής είναι κρίσιμες για την επιμόλυνση του προϊόντος. Η παθογόνος όμως δράση στον άνθρωπο εξαρτάται από ορισμένους παράγοντες, που είναι η μικροβιακή ικανότητα στην δράση(virulence),ο βαθμός προσκόλλησης (Adherence)και ενδεχομένως διείσδυσης( Invasion) του μικροοργανισμού. Η πύλη εισόδου παίζει σημαντικό ρόλο διότι άλλοι μικροοργανισμοί εισέρχονται κατόπιν λύσης της συνεχείας του δέρματος και άλλοι από τους βλεννογόνους. Το μικροβιακό φορτίο είναι επίσης ουσιώδες στην έναρξη της λοίμωξης. π.χ. Ένας μόνον σπόρος B.anthracis, C.tetani, Brucella, αλλά περισσότερα κύτταρα Salmonella είναι απαραί-τητα για την λοίμωξη. Τέλος, μεγάλη σημασίας είναι η σύνθεση και η ποιότητα του ιδίου του προϊόντος. Ορισμένα τρόφιμα και καλλυντικά (Εικόνα 8)δεν ευνοούν την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών λόγω συντηρητικών η άλλων ανασταλτικών ουσιών που εγκλείουν. Εικόνα 8. Καλλυντικά Σπορογόνοι αναερόβιοι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτυχθούν σε σφραγισμένη αεροστεγώς συσκευασία συσκευασία που ευνοεί την αναεροβίωση. Εικόνα 8. Καλλυντικά Σπορογόνοι αναερόβιοι μικροοργανισμοί μπορούν να αναπτυχθούν σε σφραγισμένη αεροστεγώς συσκευασία συσκευασία που ευνοεί την αναεροβίωση. 71

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΣΤΑ ΠΛΑΙΣΙΑ ΤΟΥ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Είναι γεγονός ότι έχει αναγνωρισθεί επίσημα η ανάγκη τα τρόφιμα,τα φάρμακα και τα καλλυντικά να πληρούν συγκεκριμένες προδιαγραφές κατά τη διάθεσή τους στην αγορά (σύνθεση, βάρος, θρεπτικά συστατικά κ. άλλα).για το λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί συστήματα διασφάλισης ποιότητας και υγιεινής με συγκεκριμένα πρωτόκολλα μεθοδολογιών (Εικόνα 9) σε Διεθνές επίπεδο με σκοπό την εναρμόνιση των διαδικασιών για την παροχή συγκρίσιμων μεγεθών και ποιότητας. Εικόνα 9. Πoιοτικός έλεγχος Διεθνώς αναγνωρισμένες μεθοδολογίες έχουν θεσπισθεί από αναγνωρισμένους φορείς για διαφορετικά προϊόντα και υπηρεσίες. Περαιτέρω, αναφέρονται ενδεικτικά ορισμένες γνωστές βάσεις πληροφοριών σε διαφορετικούς τομείς. AOAC Official Methods of Analysis, 18th Ed, Revision 1, 2006 Standard Methods for the examination of water and wastewater, 21st Ed, 2005 Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 2004 Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods Bergey s Manual of Determinative Bacteriology Codex Alimentarius ISO guides & EU Directives Pharmacopeae, Directives Οι βάσεις αυτές αφορούν τόσο τον έλεγχο των τροφίμων, των γαλακτοκομικών προϊόντων, των υδάτινων συστημάτων και του πόσιμου ύδατος.,των φαρμάκων, των καλλυντικών. Η παραγωγή των φαρμάκων, καλλυντικών και ειδικών τροφικών σκευασμάτων και προϊόντων υγιεινής διέπεται από τις οδηγίες της Φαρμακοποιίας. Εικόνα 10. Παρασκευή φαρμάκων 72

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Οι διαδικασίες επίσης ταυτοποίησης και τυποποίησης των μικροοργανισμών στο επίπεδο γένους, είδους, υπο-είδους, βιοτύπων, οροτύπων κα. στην κλινική εργαστηριακή διαγνωστική διέπονται από σειρά διαπιστευμένων διαδικασιών. Ειδικότερα, έχουν θεσπιστεί εργαστήρια διαπιστευμένα για κλινικές αναλύσεις φυματίωσης (Mycobacterium tuberculosis), βάκιλλου του άνθρακος (Bacillus anthracis), Kλωστηριδίου της αλλαντίασης (Clostridium botulinum), Ιού Ανοσοεπάκειας του Ανθρώπου (AIDS). Σε σχέση με τα πόσιμα και εμφιαλωμένα νερά έχουν θεσπιστεί μικροβιολογικοί και χημικοί παράμετροι που διασφαλίζουν την ποιότητα και ασφάλεια του νερού για τον καταναλωτή. Οι εξετάσεις αυτές γίνονται από ειδικά εργαστήρια,τα οποία οφείλουν να είναι διαπιστευμένα για τις υπηρεσίες τους. Περαιτέρω, παρατίθενται αναλύσεις που αφορούν τον ελεγχο των ποσίμων και εμφιαλωμένων νερών (Πίνακας 12,13). Μικροβιολογικές αναλύσεις ποσίμων και εμφιαλωμένων νερών Ολικά κολοβακτηριοειδή Κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή Κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι Κλωστηρίδια Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Μεσόφιλη Ολική χλωρίδα στους 22οC Ολική μικροβιακή χλωρίδα στους 37οC Vibrio sp. Salmonella sp. Aeromonas Πίνακας 12. Μικροβιολογικές αναλύσεις ποσίμων και εμφιαλωμένων νερών. Φυσικο - χημικές αναλύσεις ποσίμων και εμφιαλωμένων νερών Οσμή Χρώμα ph Νιτρικά Νιτρώδη Αμμώνιο Χλωριούχα Αγωγιμότητα Σίδηρος 73

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων Μαγγάνιο Θειικά άλατα Νάτριο Γεύση Θολότητα Σκληρότητα Φθόριο Πίνακας 13. Φυσικο-χημικές αναλύσεις ποσίμων και εμφιαλωμένων νερών. Όπως, ήδη προείπαμε η ανάγκη θέσπισης και εναρμόνισης συγκεκριμένων διαδικασιών στην παραγωγική αλυσίδα εμφανίστηκε πρωταρχικά στην βιομηχανία τροφίμων. Στα πλαίσια της ποιοτικής παραγωγής τροφίμου και της διαφύλαξης της δημόσιας υγείας, τα τρόφιμα υπόκεινται σταθερά σε δοκιμασίες ελέγχου. Οι πλέον κοινές αναλύσεις ελέγχου τροφίμων συνοψίζονται κατωτέρω. Πρέπει όμως να σημειωθεί ότι υπάρχουν και αναλύσεις ελέγχου ποιότητας που αφορούν ειδικά μόνον ορισμένα τρόφιμα και δεν εφαρμόζονται στο σύνολο των τροφίμων (Πίνακες 14,15). Μικροβιολογικές αναλύσεις ελέγχου τροφίμων Ολικά κολοβακτηριοειδή Κοπρανώδη κολοβακτηριοειδή Κoκοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι Κλωστηρίδια Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Ολική Μικροβιακή Χλωρίδα (ΟΜΧ)στους 22 C Ολική Μικροβιακή Χλωρίδα(ΟΜΧ)στους 37 C Bacillus cereus Salmonella sp. Aeromonas sp. Campylobacter sp. Staphylococcus aureus Listeria sp. Brucella sp. Yersinia enterocolitica Πίνακας 14. Μικροβιολογικές αναλύσεις ελέγχου τροφίμων 74

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Χημικές αναλύσεις ελέγχου τροφίμων Προσδιορισμός οξύτητας ελαιολάδου ή άλλων φυτικών ελαίων Αριθμός Υπεροξειδίων Ελαιολάδου Ειδικοί συντελεστές απορρόφησης Ελαιολάδου (μέτρηση Κ232, Κ270) Αριθμός ιωδίου ελαιολάδου Αριθμός σαπωνοποίησης ελαιολάδου Προσδιορισμός υγρασίας σε τρόφιμα Τέφρα σε τρόφιμα Νάτριο Νιτρικά Πίνακας 15. Χημικές αναλύσεις ελέγχου τροφίμων Όσον αφορά τον έλεγχο των γαλακτοκομικών προϊόντων, πλην του μικροβιολογικού ελέγχου, οι ακόλουθοι χημικοί παράμετροι οφείλουν να ελέγχονται(πίνακας 16) Χημικές αναλύσεις ελέγχου γαλακτοκομικών προιόντων Λιπαρά Υγρασία Ολικά στερεά Πίνακας 16. Χημικές αναλύσεις ελέγχου γαλακτοκομικών προιόντων. Όσον αφορά την ανάλυση των ποτών,ειδικές προδιαγραφές ποιότητας πρέπει να τηρούνται,καθώς επίσης να γίνεται έλεγχος νοθείας από προσμίξεις (Πίνακας 17). Χημικές αναλύσεις ποιοτικού ελέγχου ποτών Ανάλυση αιθανόλης Ανάλυση πτητικών οξέων Απομόνωση καθαρής καλλιέργειας σακχαρομυκήτων Προσδιορισμός περιεκτικότητας κυττάρων σε ζυμούμενο γλεύκος (κατασκευή πρότυπης καμπύλης) Μέτρηση πυκνότητας γλεύκους (αρχικού ή ζυμούμενου) σε obe Προσδιορισμός οξύτητας γλεύκους Προσδιορισμός οξύτητας Προσδιορισμός Θειώδους οξέος Πίνακας 17. Χημικές αναλύσεις ελέγχου ποτών 75

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων Όσον αφορά τα τρόφιμα που καταναλώνονται είναι γνωστό ότι σπάνια είναι στείρα μικροοργανισμών. Τα προιόντα που εξέρχονται από την βιομηχανία, φέρουν τη μικροβιακή τους χλωρίδα που η σύνθεσή της είναι πολύ διαφορετική από το ένα προιόν στο άλλο. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ/ΥΔΑΤΩΝ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Όπως ήση συζητήθηκε στο βιβλίο αυτό η κατανομή των μικροοργανισμών στα τρόφιμα δεν είναι ομοιογενής.για το λόγο αυτό το υπό εξέταση δείγμα πρέπει να ομογενοποιηθεί,έτσι ώστε στο δείγμα να απομονώνεται το σύνολο των μικροοργανισμών που αποικούν το τρόφιμο στην εξωτερική του επιφάνεια και στο εσωτερικό του. Το νερό και γενικότερα τα υγράς μορφής τρόφιμα ανακινούνται ικανοποιητικά για να επιτευχθεί η ομοιογένεια του δείγματος. Στα στερεά τρόφιμα η προιόντα,η ομοιογένεια του δείγματος επιτυγχάνεται με πολτοποίηση με τους ακόλουθους τρόπους : 1. Πολτοποίηση με μίξερ(blender) Εικόνα 11 Συγκεκριμένη ποσότητα τροφής τοποθετείται σε αποστειρωμένο μίξερ(blender)(εικόνα 11 ) και αναδεύεται με αποστειρωμένο αραιωτικό υγρό (συνήθως 10g τροφίμου με 90 ml υδατικό διάλυμα πεπτόνης 0.1%(w/v). Διαφόρου τύπου μίξερ χρησιμοποιούνται για την διαδικασία,αλλά η πολτοποίηση δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 3 λεπτά. 2. Πολτοποίηση σε ιγδίο(γουδί) Εικόνα 12 76

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Συγκεκριμένη ποσότητα τροφής τοποθετείται σε αποστειρωμένο ιγδίο (γουδί η συναφές)[pestle,mortar] (Εικόνα 12 ) και πολτοποιείται με επαναλαμβανόμμενη κίνηση (κοπάνισμα).κατόπιν το πολτοποιημένο τρόφιμο αραιώνεται ως ανωτέρω. 3. Πολτοποίση σε Stomacher Εικόνα 13 Συγκεκριμένη ποσότητα τροφής τοποθετείται σε αποστειρωμένη ειδικό ασκό πολτοποίησης (Εικόνα 14) που εν συνεχεία τοποθετείται με τη σειρά της στη συσκευή πολτοποίησης Stomacher (Εικόνα 13). Εικόνα 14. Ασκοί πολτοποίησης τροφών Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση τροφίμων και νερών είναι τυποποιημένες και διαπιστευμένες σε Εθνικό και Διεθνές επίπεδο (ΙSΟ). Πραγματοποιούνται ταυτόχρονα ποσοτικές και ποιοτικές αναλύσεις, οι οποίες επιτρέπουν τόσον την εκτίμηση του ολικού μικροβιακού φορτίου στο τρόφιμο,όσον και την αναζήτηση του υπεύθυνου αλλιογόνου μικροοργανισμού. Η παρουσία των κοπρανώδων μικροοργανισμών βεβαιώνει μόλυνση κοπρανώδους προέλευσης,ενώ η ανίχνευση των παθογόνων μικροοργανισμών Staphylococcus aureus και Salmonella αποδεικνύει μη ορθή υγιεινή πρακτική.τέλος,η ανίχνευση θειο-αναγωγικών αναεροβίων μικροοργανισμών, ως Clostridium μας θέτει την υποψία μόλυνσης εντερικής προέλευσης η επαφής με την τελλούριο χλωρίδα. Στην συνήθη μικροβιολογική ανάλυση τροφίμων πραγματοποιούνται 6 αναλύσεις (Πίνακας 18 ). 77

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων Αναζήτηση και αρίθμηση Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας (ΟΜΧ) Αναζήτηση και αρίθμηση Ολικών κολοβακτηριοειδών Αναζήτηση και αρίθμηση θερμοανθεκτικών κοπρανώδων κολοβακτηριοειδών Αναζήτηση παθογόνων σταφυλοκόκκων Αναζήτηση σαλμονελλών Αναζήτηση και αρίθμηση θειο-αναγωγικών αναεροβίων μικροοργανισμών Πίνακας 18. Συνήθεις μικροβιολογικές αναλύσεις τροφίμων Τα αποτελέσματα εκτιμώνται σύμφωνα με τα κριτήρια αποδοχής που ορίζονται από την νομοθεσία και κανονιστικές διατάξεις και σύμφωνα με την φύση του προιόντος. Στα τρόφιμα μπορούν να πραγματοποιηθούν αναλύσεις για λιγότερο συχνά ανευρισκόμενους μικροοργανισμούς, ως Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, θερμοανθεκτικά Campylobacter. Η νομοθεσία επιβάλει ως προαναφέρθηκε συγκεκριμένες αναλύσεις και μεθοδολογίες για το πόσιμο ύδωρ. Οι συνήθεις αναλύσεις που εφαρμόζονται για να χαρακτηρισθεί το νερό ασφαλές ως πόσιμο περιγράφονται κατωτέρω (Πίνακας 19). Αναζήτηση και αρίθμηση Ολικής Μεσόφιλης Χλωρίδας (ΟΜΧ) Αναζήτηση και αρίθμηση Ολικών κολοβακτηριοειδών Αναζήτηση και αρίθμηση θερμοανθεκτικών κοπρανώδων κολοβακτηριοειδών Αναζήτηση και αρίθμηση θειο-αναγωγικών αναεροβίων μικροοργανισμών Πίνακας 19. Συνήθεις αναλύσεις πόσιμου ύδατος Οι συνήθεις αναλύσεις που εφαρμόζονται για να χαρακτηρισθεί το νερό ασφαλές ως πόσιμο περιγράφονται κατωτέρω (Πίνακας 19). Επίσης μπορούν να πραγματοποιηθούν αναλύσεις για Salmonella, Staphylococcus, Enterovirus, Enterococcus, Pseudomonas aeruginosa, κοπρανώδεις Streptococcus και βακτηριοφάγους. Σύμφωνα με την νομοθεσία,τα κριτήρια αποδοχής του πόσιμου ύδατος είναι: Δεν πρέπει να περιέχει παθογόνους μικροοργανισμούς, ήτοι Salmonella (σε 5lt νερού), Staphylococcus(σε 100ml νερού ), Enterovirus(σε 10 lt νερού ). 95% των δειγμάτων δεν πρέπει να περιέχει κολοβακτηριοειδή σε 100ml νερού. Δεν πρέπει να περιέχονται θερμοανθεκτικά κολοβακτηριοειδή και κοπρανώδεις Streptococcus σε 100ml νερού. 78

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Δεν πρέπει να περιέχει περισσότερο από ένα σπόρο θειο-αναγωγικών αναεροβίων μικροοργανισμών σε 20ml νερού. Δεν πρέι να περιέχει κοπρανώδεις βακτηριοφάγους σε 50ml νερού. Συμπληρωματικά,για ορισμένες κατηγορίες νερού: Λιγότερα από 20 αερόβια βακτήρια στους 37 C σε 1 ml νερού. Λιγότερα από 100 αερόβια βακτήρια στους 22 C σε 1 ml νερού. Απουσία Pseudomonas aeruginosa σε 100ml νερού Η Ευρωπαική κανονιστική διάταξη (98/83/CE) θέτει όρια για τις ελάχιστες τιμές των μικροβιολογικών παραμέτρων στα νερά για να είναι ασφαλή και κατάλληλα για τον άνθρωπο, ήτοι: Απουσία Escherichia coli σε 100ml νερού Απουσία Enterococcus σε 100ml νερού ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΝΑΕΡΟΒΙΩΝ ΘΕΙΟ-ΑΝΑΓΩΓΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΕ ΝΕΡΑ ΚΑΙ ΤΡΟΦΙΜΑ Στο τμήμα αυτό συζητάται και επεξηγείται η μέθοδος αναζήτησης των θειο-αναγωγικών μικροοργανισμών σε υδάτινο περιβάλλον. ΟΙ υπόλοιποι μικροβιολογικοί παράμετροι,ως ΟΜΧ,κοπρανώδη κολοβακτηρίδια και ολικά κολοβακτηρίδια επεξηγούνται στο τμήμα ανάλυσης των τροφίμων,όπως οι δοκιμασίες αυτές είναι αντίστοιχες για νερά,τρόφ ιμα,καλλυντικά,φάρμακα με διαφορές μόνον ως προς την ποσότητα και τον τρόπο επεξεργασίας του δείγματος,καθώς και στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων. Στην κατηγορία των θειο-αναγωγικών βακτηρίων υπάγονται τα αναερόβια Clostridium που είναι Gram(+) μικροοργανισμοί.ως αναερόβιοι μικροοργανισμοί απομονώνονται από περιβάλλοντα που υπολείπονται σε οξυγόνο,ως συσκευασίες κενού,κονσερβοποιημένα τρόφιμα,αφυδατωμένες τροφές.οι μικροοργανισμοί απομονώνονται επίσης στο υδάτινο περιβάλλον. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον ενέχει το είδος Clostridium perfringens διότι είναι ευρύτατα διαδεδομένο στη φύση. Συγκεκριμένα απαντάται στο έδαφος, στη λάσπη των ποταμών και λιμνών, στους υπονόμους, στη θάλασσα, στη σκόνη, στα ρούχα, στους θαλάμους, στα χειρουργεία των νοσοκομείων και τέλος,αποτελεί φυσιολογικό ένοικο στο γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώπου και όλων σχεδόν των ζώων και ψαριών. Ο μικροοργανισμός απαντάται σε φυτική ή σπορογόνο μορφή, ανάλογα με τον οικότοπο παρουσίας του.η ύπαρξη βλαστικών μορφών του C. perfringens στο έδαφος, σηματοδοτεί το γεγονός ότι ο μικροοργανισμός μπορεί και πολλαπλασιάζεται ενεργά σε αυτό και ότι το έδαφος αποτελεί πραγματικά την κύρια αποθήκη του μικροβίου στο περιβάλλον.η οικολογική κατανομή των σπόρων έχει γεωγραφική ποικιλία και σχετίζεται με διάφορες παραμέτρους, όπως ο αντιγονικός τύπος του C. perfringens και οι περιβαλλοντικές συνθήκες. 79

Yγιεινή Βιομηχανιών τροφίμων & φαρμάκων Στο υδάτινο περιβάλλον επικρατεί ένας μεγάλος αριθμός αναερόβιων βακτηρίων, ιδιαίτερα στο θαλάσσιο περιβάλλον και στα βαθύτερα επίπεδα ύδατος λιμνών (υπολίμνιων) και ευτροφικών συλλογών υδάτων. Σημαντικό ρόλο ενέχουν το Chlorodium, Desulphovibrio και πολλά είδη Clostridium. Οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί συμμετέχουν επίσης σε διαδικασίες διάβρωσης, σήψης και σημειώνουν ένα βασικότατο ρόλο στην παραγωγή του μεθανίου.οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί των υδάτων συμμετέχουν στη διάβρωση του σιδήρου, του χαλκού, του αλουμινίου και άλλων ουσιών και στοιχείων. Η αναερόβια διάβρωση συχνά οφείλεται σε αναγωγείς των θεϊκών, όπως το Desulphovibrio desulphuticans που παράγουν H2S που αντιδρά με το σίδηρο. Είδη Thiobacillus κατέχουν επίσης σημαντικό οξειδωτικό ρόλο σε υδάτινα οικοσυστήματα ποταμών, λιμνών και παρακτίων υδάτων. Οξύφιλα Thiobacillus έχουν την ικανότητα να παράγουν θεϊκό οξύ κατόπιν οξείδωσης με αποτέλεσμα να διαβρώνουν συστήματα οχετών, αγωγών και σωληνώσεων ύδατος. Οι αναερόβιοι μικροοργανισμοί έχουν επίσης την ικανότητα να αναπτύσσονται σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες, π.χ. ph, θερμοκρασία, ατμόσφαιρα, αλατότητα. Σύμφωνα με τις περιβαλλοντικές προτιμήσεις τους διακρίνονται στις ακόλουθες ομάδες: 1. Θερμόφιλα (Thermophiles) 2. Οξύφιλα / αλκαλόφιλα (Acidophiles / Alcaliphiles) 3. Αλοαναερόβια (Haloanaerobes) 4. Συντροφικά αναερόβια (Syntrophic anaerobes) 5. CO-αναερόβια ή αναερόβια προκαλούνται αποαλογόνωση (CO-utilizing και dehalo genating anaerobes Το C. perfringens έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς ως δείκτης κοπρανώδους μόλυνσης σε υδάτινα συστήματα και ως ένας επαρκώς μελετηθείς δείκτης παλιάς μόλυνσης (remote origin) που μπορεί να σκιαγραφήσει την πορεία μεταφοράς μεγάλων μαζών αποβλήτων από συστήματα αποχετεύσεων και το πιθανό σημείο εναπόθεσής τους. H παρουσία του C. perfringens στην ενδογενή πανίδα του βυθού θαλασσών αποτελεί έναν εναλλακτικός δείκτη αντανάκλασης της μικροβιολογικής κατανομής και πιθανώς δείκτη βιολογικού αντίκτυπου από την μόλυνση των υδάτων από απόβλητα ανθρώπου και ζώων. Είναι γνωστό ότι το νερό είναι απαραίτητο στοιχείο αφ ενός για τη λειτουργία του ανθρώπινου σώματος και αφ ετέρου για τη φύση. Υπάρχουν διάφορα είδη νερών που η ποιότητά τους πρέπει να ελέγχεται (π.χ. πόσιμο νερό, νερό πισίνας, νερό εδάφους, νερό οχετών). Στα πλαίσια του ποιοτικού ελέγχου εκτός από τις άλλες παραμέτρους του νερού που μελετώνται σκληρότητα, ανίχνευση ρυπαντών, ραδιολογική ποιότητα, επιβάλλεται και η μικροβιολογική εξέταση του νερού, ειδικότερα γιατί μπορεί να αποτελέσει μέσο μεταφοράς νοσημάτων. Οσον αφορά το πόσιμο νερό έχουμε ήδη κάνει αναφορά στο παρόν βιβλίο. 80

Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Οι συνηθέστεροι μικροοργανισμοί που απομονώνονται σε στάσιμα νερά και νερά ποταμών είναι Pseudomonas, Achromobacterium, Flavobacterium, Micrococci, Enterobacteriaceae και Streptomycetes. Σε νερά οχετών περιέχονται κυρίως σιδηρόφιλα βακτήρια,ενώ στα νερά των ποταμών έχουμε σιδηρόφιλα βακτήρια και βακτήρια που ανάγουν το θείο. Μεγάλη σημασία πρέπει να δοθεί στη συλλογή του νερού ανάλογα με τη προέλευσή του, αλλά επίσης και στη μεταφορά των δειγμάτων στο εργαστήριο καθώς και στην έγκαιρη επεξεργασία τους. Καλό είναι να μελετώνται περισσότερα του ενός δείγματα από το ίδιο σημείο. Για τη μικροβιολογική αυτή εξέταση του νερού χρησιμοποιούνται διάφορες δοκιμασίες που αναφέρονται ως δείκτες ανεύρεσης και αρίθμησης κοινών μικροοργανισμών. Ο έλεγχος καταλληλότητας του νερού περιλαμβάνει σαν δείκτη την ΟΜΧ,την ομάδα των κολοβακτηριοειδών κοπράνων και των ολικών κολοβακτηριοειδών ως προαναφέρθει. Ενας ακόμη δείκτης νερού έχει προστεθεί,ο δείκτης κοπρανωδών στρεπτοκόκκων. Ο έλεγχος του νερού περιλαμβάνει επίσης τον έλεγχο των Σταφυλόκοκκων, Ψευδομονάδων και άλλων μικροοργανισμών. Εκτός όμως από τους παραπάνω αερόβιους μικροοργανισμούς, και το Clostridium perfringens αποτελεί δείκτη καταλληλότητας του νερού, ιδιαίτερα, διότι ο μικροοργανισμός αυτός αποτελεί μέρος της ανθρώπινης φυσιολογικής χλωρίδας του εντέρου, με μεγαλύτερη συχνότητα τα νεογνά. Οι παθογόνοι αναερόβιοι μικροοργανισμοί στα νερά είναι Clostridium sp,ήτοι C. perfringens,c. botulinum,c. tetani,c. septicum,c. novyi Bacteroides,ήτοι B. fragilis Eubacterium,ήτοι E. nitrogenes,e. multiforme,e. butayi,e. combesii Oι μέθοδοι προσδιορισμού αναεροβίων μικροοργανισμών στο νερό μπορεί να είναι : Ποσοτικός προσδιορισμός Ποιοτικός προσδιορισμός Oι μέθοδοι επίσης εφαρμόζονται με θέρμανση των αραιώσεων δειγμάτων στους 80 C επί 10mιn για ανίχνευση παρουσίας σπορογόνων μορφών. Πρέπει επίσης να λαμβάνεται υπόψη,η ιδιαιτερότητα του δείγματος για την ανάλυση. Οσον αφορά τα εμφιαλωμένα νερά πρέπει να επωάζονται επί 72 ώρες διότι τα μικρόβια εμφανίζουν μεγαλύτερο χρόνο πολλαπλασιασμού. (α) Ποσοτικός προσδιορισμός Καλλιέργειες Ο ποσοτικός προσδιορισμός επιτυγχάνεται σε αραιωμένα δείγματα ύδατος,τα οποία με την μέθοδο της ενσωμάτωσης καλλιεργούνται σε Plate count agar στους 30 C επί 48 ώρες σε αναερόβια ατμόσφαιρα (Σχήμα 5 ). 81