Equation Chapter (Next) Section 1 Είδαμε στο κεφ. 6 ότι μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε ένα συγκλίνοντα φακό για να παρατηρήσουμε ένα αντικείμενο σε μεγέθυνση. Όσο εύκολος κι αν είναι στη χρήση ο μεγεθυντικός φακός, έχει όρια στο πόσο μπορεί να μεγεθύνει ένα αντικείμενο. Με ένα μικροσκόπιο (microscope) μικρο-σκοπούμε, παρατηρούμε ένα αντικείμενο, συνήθως μικρό, το οποίο βρίσκεται κοντά. Το είδωλο, όπως παρατηρείται μέσα από το μάτι ή την κάμερα που το καταγράφει, έχει μεγέθυνση αρκετά μεγαλύτερη της μονάδας. Για να το πετύχουμε όμως αυτό, χρειαζόμαστε τη συνδυαστική δράση δύο ομάδων φακών, και γι αυτό το λόγο το λέμε και σύνθετο μικροσκόπιο (compound microscope). Οι ομάδες φακών στο μικροσκόπιο είναι το αντικειμενικό και το προσοφθάλμιο σύστημα. Το πρώτο σύστημα, το αντικειμενικό (objective) είναι κοντά στο αντικείμενο και δημιουργεί ένα πραγματικό είδωλο με μια πρωτογενή μεγέθυνση. Αυτό το ενδιάμεσο είδωλο είναι το αντικείμενο του δεύτερου συστήματος, του προσοφθάλμιου (eyepiece), μέσω του οποίου παρατηρούμε. Σχήμα 9-1: (α) Το σύνθετο μικροσκόπιο του Janssen (1595) στο Middleburg Museum (β) Το μικροσκόπιο του van Leeuwenhoek (1670). Η εφεύρεση του σύνθετου μικροσκοπίου έχει τις ρίζες του στους τεχνίτες οπτικούς στην Ολλανδία στα τέλη του 16 ου αιώνα, και συνδέεται με την εφεύρεση του τηλεσκόπιου, την ίδια περίπου εποχή. Τη φήμη του εφευρέτη του μικροσκοπίου διεκδικεί ένας παραχαράκτης, ο Ζαχαρίας Ιωαννίδης ή Janssen, από οικογένεια φυγάδων από την Κωνσταντινούπολη μετά την άλωσή της. Το πρώτο αυτό μικροσκόπιο είχε για προ-
Οπτικά Όργανα Απεικόνισης σοφθάλμιο έναν αμφίκυρτο φακό στο ένα άκρο ενός συρόμενου σωλήνα, και για αντικειμενικό έναν επιπεδόκυρτο στο άλλο άκρο. Η εστίαση γινόταν με μετακίνηση του σωλήνα. Πλήρως εκτεταμένο, το μικροσκόπιο αυτό μπορούσε να πετύχει μεγέθυνση 10. Zaccharias Janssen (1580-1638) Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) Hans Lippershey (1570-1619) Η επιτυχία διεκδικείται και από τον συντοπίτη του Hans Lippershey, αν ο δεύτερος πιστώνεται μάλλον με την εφεύρεση του τηλεσκοπίου. Την ίδια εποχή, και οι Ιταλοί τεχνίτες της εποχής επίσης ασχολήθηκαν με το τι μπορούμε να πετύχουμε με δύο φακούς στη σειρά και από αυτούς άκουσε τα νέα ο Galileo Galilei, που ήταν ο πρώτος που παρατήρησε κάτι αξιοσημείωτο με το τηλεσκόπιό του το 1610. Ένας ακόμα Ολλανδός, ο Antoni van Leeuwenhoek, απέδειξε πόσο πολύτιμο μπορεί να είναι ένα απλό και πολύ μικρό, με τα σημερινά δεδομένα, μικροσκόπιο. Κατάφερε, με δύο κοχλίες να πετύχει πολύ ακριβή εστίαση μικροσκοπικών δειγμάτων. Ήταν ο πρώτος που πέτυχε μεγεθύνσεις της τάξης του 100, και να ανοίξει έτσι τον κόσμο της εξερεύνησης στο μικρόκοσμο. Ο Leeuwenhoek θεωρείται ο πατέρας της μικροσκοπίας. Σχήμα 9-2: Τα μικροσκόπια των Robert Hooke (1670) και Powell & Lealand (1850). Τέσσερα βραβεία Nobel έχουν απονεμηθεί για εργασίες που σχετίζονται με τη μικροσκοπία: το 1925 στον Richard Zsigmondy για το υπερ-μικροσκόπιο, το 1953 στον Frits Zernike για το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (phase-contrast microscope), και το 1986 στους Ernst Ruska για το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, και Gerd Binnig και Heinrich Rohrer για το σαρωτικό μικροσκόπιο σήραγγας (scanning tunneling microscope). 142
9. Μικροσκόπιο 9.1. ΟΠΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟΥ 9.1.1. Αρχιτεκτονική Μικροσκοπίου και Μεγέθυνση Αν και πολύπλοκο οπτικό όργανο, η λειτουργία του βασίζεται σε ένα σύστημα δύο θετικών φακών. Κοντά στο αντικείμενο είναι ο αντικειμενικός (εστιακή απόσταση f o) και κοντά στο μάτι ο προσοφθάλμιος (f e), που απέχουν απόσταση d = f o+l+f e, δηλαδή οι εσωτερικές τους εστίες απέχουν L. Η απόσταση L λέγεται οπτικό μήκος σωλήνα (optical tube length), και είναι τυπικά 16-20 cm. Η απόσταση d η απόσταση αντικειμενικού-προσοφθάλμιου- λέγεται μηχανικό μήκος σωλήνα (mechanical tube length). Σχήμα 9-3: Αρχιτεκτονική σύνθετου μικροσκοπίου. Το αντικείμενο βρίσκεται στη θέση x o = -(x + f o) μπροστά από τον αντικειμενικό, και το αρχικό του είδωλο σχηματίζεται στη θέση x i, που φροντίζουμε να είναι πολύ κοντά στην εστία του προσοφθάλμιου, δηλαδή x i L+f o. (Έτσι, οι ακτίνες από το είδωλο εξέρχονται παράλληλες από τον προσοφθάλμιο.) Εφαρμόζουμε τη σχέση του Νεύτωνα (1.9) -(x o + f o)(x i - f o) = f 2 o, και για x i -f o L, έχουμε x = -(x o+f o) f 2 o /L. Αυτό το ενδιάμεσο είδωλο είναι μεγεθυμένο, πραγματικό, αντεστραμμένο, και σχηματίζεται στην εστία του προσοφθάλμιου. Η μεγέθυνση που αντιστοιχεί σε αυτό το είναι η μεγεθυντική ισχύς του αντικειμενικού (objective magnifying power): Η ΜΕΓΕΘΥΝΣΗ ΤΗΣ ΜΕΓΕΘΥΝΣΗΣ Το μικροσκόπιο βασίζεται στη μεγέθυνση ενός μεγεθυμένου ειδώλου, και έτσι η συνολική μεγέθυνση είναι το γινόμενο των δύο επιμέρους μεγεθύνσεων, του πρωτογενούς, από τον αντικειμενικό, και του δευτερογενούς, από τον προσοφθάλμιο. xi L+ fo L Mo = = x x+ f f o Η παραπάνω σχέση προκύπτει αντικαθιστώντας στον παρονομαστή x = f 2 o /L. Με τον προσοφθάλμιο παρατηρούμε αυτό το αρχικό είδωλο. Όπως και σε ένα μεγεθυντικό φακό 143 o o (9.1)
Οπτικά Όργανα Απεικόνισης ΤΟ ΑΝΤΕΣΤΡΑΜΜΕΝΟ ΦΑΝΤΑΣΤΙΚΟ Το είδωλο στο μικροσκόπιο είναι φανταστικό, και δεν μπορεί να σχηματιστεί ( 6.2.), για μέγιστη μεγέθυνση το τελικό είδωλο σχηματίζεται στο κοντινό σημείο ( 25 cm), και πάνω σε μια επιφάνεια. για πιο άνετη παρατήρηση (χωρίς προσαρμογή) Φαίνεται να αιωρείται στο χώρο πέρα στο οπτικό άπειρο (όταν το πρωτογενές είδωλο από τον προσοφθάλμιο, και αρκετές φορές σχηματίζεται αρκετά έξω από το ίδιο σχηματίζεται στην εστιακή απόσταση του προσοφθάλμιου). Αν εκφράσουμε την εστιακή απόσταση το όργανο, ακόμα και στο άπειρο. f e σε cm, η δευτερογενής μεγέθυνση είναι: M e 25cm = + 1 f e 25cm ή (9.2) f (είδωλο στα 25 cm) e (είδωλο στο άπειρο) Η συνολική μεγέθυνση, που είναι το γινόμενο των δύο μεγεθύνσεων, γράφεται: M L 25cm = MM o e = f o f e (9.3) Σχήμα 9-4: Οπτικό διάγραμμα σε σύνθετο μικροσκόπιο. Η κόρη εισόδου είναι ίση με την περιφέρεια του αντικειμενικού, και η κόρη εξόδου με την κόρη του οφθαλμού. Το τελικό είδωλο είναι αντεστραμμένο σε σχέση με το αρχικό αντικείμενο, όπως μας λέει το αρνητικό πρόσημο στη μεγέθυνση. Είναι όμως ένα φανταστικό είδωλο, δηλαδή μπορεί να παρατηρηθεί μόνο με το μάτι ή με έναν άλλο φακό. Επειδή η μεγέθυνση είναι γινόμενο δύο μεγεθύνσεων, μπορούμε είναι μεγάλη. Με πρωτογενή μεγέθυνση 20 (αντικειμενικού) και ένα 10 προσοφθάλμιο, η μεγέθυνση είναι 200. Για μέγιστη μεγέθυνση πρέπει να έχουμε όσο το δυνατό μεγάλο διαχωρισμό (L) φακών, μικρή εστιακή απόσταση (f o) αντικειμενικού, και μικρή εστιακή απόσταση (f e) προσοφθάλμιου. Σχήμα 9-5: Ο αντικειμενικός φακός έχει μικρή εστιακή απόσταση. Το αντικείμενο είναι πολύ κοντά στο φακό. 144
9. Μικροσκόπιο 9.1.2. Διακριτική Ικανότητα Μικροσκοπίου Βασιζόμενοι στα παραπάνω μπαίνουμε στον πειρασμό να χρησιμοποιήσουμε ένα σύστημα φακών με πολύ μικρές εστιακές αποστάσεις (μεγάλη οπτική ισχύ) και μεγάλο διαχωρισμό, και να αυξήσουμε έτσι τη μεγέθυνση κατά βούληση. Όμως η διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου θέτει όριο στο πόσο μπορούμε να μεγεθύνουμε, που εξαρτάται από το αριθμητικό άνοιγμα της κόρης εισόδου (περιφέρεια του αντικειμενικού). Εδώ, η ακτίνα δίσκου Airy = 0.61 λ /Ν.Α. μεγεθύνεται κατά Μ, τη μεγέθυνση του οργάνου. Έτσι, το διακριτικό όριο στην έξοδο του προσοφθάλμιου είναι: Διακριτικό όριο μικροσκοπίου: M ( F ) λ 1.22 λ # = M 0.61 (9.4) ΝΑ.. Αυτό το όριο πρέπει να γίνει αντιληπτό από το μάτι. Γνωρίζουμε ότι ( 5.1.2), διακρίνουμε δύο σημεία όταν η γωνία όρασης είναι τουλάχιστο 1 = 0.3 mrad. Στην ελάχιστη απόσταση ευκρινούς όρασης (25 cm) το διακριτικό όριο του ματιού είναι: Διακριτικό όριο ματιού: 0.3 mrad 0.25 m = 0.075 mm απόσταση ευκρινούς όρασης (9.5) Η ωφέλιμη ή χρήσιμη μεγέθυνση Μ χρήσιμη (useful magnification) είναι η τιμή της μεγέθυνσης που μεγεθύνει τα είδωλα τόσο, ώστε η απόστασή τους να αντιστοιχεί στο διακριτικό όριο του ματιού. Συνδυάζοντας τις δύο παραπάνω σχέσεις έχουμε: λ Mχρήσιμη 0.61 = 0.3 mrad 0.25 m (9.6) ΝΑ.. Έτσι, η χρήσιμη μεγέθυνση μικροσκοπίου για λ = 0.5 μm εκφράζεται προσεγγιστικά: Mχρήσιμη ΝΑ (9.7) 200.. αντικειμενικού και στην πράξη μπορεί να γίνει δεκτή έως 400 Ν.Α. π.χ. για παρατήρηση με μπλε ακτινοβολία ή μεγαλύτερη κόρη ματιού. Για παράδειγμα, με τυπική σκοτοπική κόρη στα 7 mm, το διακριτικό όριο του ματιού είναι 0.05 mrad, που επιτρέπει μεγαλύτερη τιμή μεγέθυνσης. Πέρα από αυτό το όριο η μεγέθυνση του μικροσκοπίου δεν έχει νόημα να μεγαλώσει περισσότερο, γιατί ξεφεύγουμε από τη βασική αποστολή ενός μικροσκοπίου, που εί- ΤΑ ΟΡΙΑ ΣΤΗ ΜΕΓΕΘΥΝΣΗ Ο βασικός σκοπός ενός μικροσκοπίου είναι η παρατήρηση μικρών λεπτομερειών ενός δείγματος και όχι τόσο να το μεγεθύνει. Υπάρχει όριο στο πόσο χρήσιμη είναι η μεγέθυνση σε ένα μικροσκόπιο, που επιβάλλεται από τη διακριτική του ικανότητα. ναι η ανάλυση μικρών λεπτομερειών ενός δείγματος και όχι τόσο η μεγέθυνσή του. Παράδειγμα: Κατασκευάζουμε ένα μικροσκόπιο με τον αντικειμενικό φακό Plan Fluor της Nikon, 20, Ν.Α. = 0.5. Η 145
Οπτικά Όργανα Απεικόνισης χρήσιμη μεγέθυνση είναι 100-200. Συνδυάζουμε στον αντικειμενικό φακό έναν προσοφθάλμιο με ισχύ 20. Αυτός είναι ένας κακός συνδυασμός, γιατί ενώ δίνει μεγέθυνση 400, η χρήσιμη μεγέθυνση είναι μικρότερη. Για τον συγκεκριμένο αντικειμενικό φακό καλύτερα είναι να επιλέξουμε έναν προσοφθάλμιο 10, που δίνει μεγέθυνση 200, πιο κοντά στη χρήσιμη μεγέθυνση. 9.2. ΕΠΙΜΕΡΟΥΣ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Ανάλογα με τη χρήση, το σύστημα φωτισμού σε ένα μικροσκόπιο μπορεί να είναι μέσα από το οπτικό σύστημα του αντικειμενικού είτε εξωτερικά. Έτσι έχουμε το διασκοπικό μικροσκόπιο (diascopic): παρατηρεί ένα λεπτό αντικείμενο, που βρίσκεται πάνω σε μια καλυπτρίδα (microscope cover slide) και το φως διέρχεται μέσα από αυτό, εστιάζει με τον αντικειμενικό και μετά στον προσοφθάλμιο. Έτσι είναι το κλασικό βιολογικό μικροσκόπιο. Η άλλη κατηγορία είναι το επισκοπικό (episcopic): παρατηρεί επιφανειακό αντικείμενο, και το φώς διέρχεται μέσα από Σχήμα 9-6: Λεπτομερειακός χάρτης μικροσκοπίου. τον αντικειμενικό, και ανακλάται από την επιφάνεια του αντικειμένου. 9.2.1. Αντικειμενικοί Φακοί Μικροσκοπίου Ένα καλό μικροσκόπιο ξεκινά με έναν καλό αντικειμενικό φακό. Άλλωστε ο αντικειμενικός είναι το διάφραγμα ανοίγματος του οπτικού συστήματος, και καθορίζει, όπως είδαμε, τη διακριτική ικανότητα του μικροσκοπίου. Το είδωλό του, μέσα από τον προσοφθάλμιο, είναι η κόρη εξόδου του συστήματος. Γνωρίσαμε ότι ο αντικειμενικός φακός σε ένα μικροσκόπιο πρέπει να έχει: μικρή εστιακή απόσταση (f o) για μεγάλη μεγέθυνση, και μεγάλο αριθμητικό άνοιγμα (Ν.Α.) για να είναι η μεγέθυνση χρήσιμη. Οι αντικειμενικοί φακοί στο μικροσκόπιο πρέπει επιπλέον να είναι απλανητικοί, να εί- 146 ΦΑΚΟΣ Ή ΣΥΣΤΗΜΑ? Τόσο ο αντικειμενικός, όσο και ο προσοφθάλμιος σπάνια είναι απλός φακός, στην πραγματικότητα πρόκειται για ένα σύστημα φακών.
9. Μικροσκόπιο ναι δηλαδή, απαλλαγμένοι από σφαιρικό σφάλμα και κόμη. Αυτό όμως απαιτεί μικρό Ν.Α., και έρχεται σε αντίθεση με την ανάγκη για μεγάλη διακριτική ικανότητα, για την οποία θέλουμε μεγάλο Ν.Α. Συνεπώς οι απαιτήσεις για το αντικειμενικό σύστημα είναι εξαιρετικές και οι αντικειμενικοί φακοί κατασκευάζονται από συστήματα φακών που αποδίδουν μόνο αν το αντικείμενο βρίσκεται σε συγκεκριμένη απόσταση παρατήρησης (working distance). Θυμίζουμε ότι το αριθμητικό άνοιγμα δίνεται από τη σχέση (4.1.), Ν.Α. = n sin(φ/2), όπου n ο δείκτης διάθλασης του μέσου που διαδίδονται οι ακτίνες που προέρχονται από το αντικείμενο και φ το γωνιακό άνοιγμα του φακού. Αν ο φακός είναι στον αέρα (n 1), πρακτικά το Ν.Α. δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερο από 0.95, επειδή το ημίτονο δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερο της μονάδας. Σχήμα 9-7: (α) Αρχή λειτουργίας καταδυτικού φακού. (β) Αντικειμενικοί φακοί μικροσκοπίου. Διακρίνονται οι τιμές για Ν.Α. και μεγέθυνση φακού. Ο φακός με Ν.Α. 1.25 και 90 είναι καταδυτικός. Για να αυξηθεί το αριθμητικό άνοιγμα γίνεται χρήση καταδυτικών φακών (immersion lens). Ο φακός λέγεται έτσι γιατί γεμίζουμε το χώρο μεταξύ φακού και καλυπτρίδας με ειδικό λάδι, κεδρέλαιο, που έχει δείκτη διάθλασης ίδιο με αυτό του φακού. Έτσι οι ακτίνες δεν διαθλώνται στη διαχωριστική επιφάνεια καλυπτρίδας-κεδρελαίου, και αέρα-φακού, και μεγαλώνει το αριθμητικό άνοιγμα (μέχρι και 1.65), λόγω αύξησης και του n και του φ. Με αυτούς τους φακούς η μεγέθυνση μπορεί να φτάσει την τιμή 100x, που συγκρίνεται με την τιμή 40 που μπορεί να φτάσει ένας φακός αέρος (dry lens). Ένα μικροσκόπιο μπορεί να έχει σετ (σε περιστρεφόμενη βάση) από αντικειμενικούς με διαφορετικές μεγεθύνσεις. Το πρώτο σετ, το χαμηλής ισχύος (low power) έχει μεγεθύνσεις από 2 ως 25, και είναι χρήσιμο στην πρώτη επισκόπηση μεγάλων περιοχών, και εντοπισμό σημείου ενδιαφέροντος. Αποτελείται συνήθως από δύο ζεύγη αχρωματικών φακών. Το δεύτερο σετ, το υψηλής ισχύος (high power) δίνει μεγεθύνσεις από 25 ως 100. Είναι, ασφαλώς, εξειδικευμένοι, και ακριβοί, και απαιτούν πολύ μικρές αποστάσεις αντικειμένου (~ 0.2 mm). Είναι συνήθως καταδυτικοί φακοί. 147
Οπτικά Όργανα Απεικόνισης 9.2.2. Προσοφθάλμιοι Φακοί Μικροσκοπίου Η βασική αποστολή του προσοφθάλμιου είναι να: απεικονίσει το είδωλο που σχηματίζει ο αντικειμενικός, σχηματίσει το δυνατό παραλληλισμένη δέσμη προς τον οφθαλμό, καθορίσει την κόρη εξόδου του συστήματος για να είναι ίση με την κόρη εισόδου του οφθαλμού. Για μικρές μεγεθύνσεις (5x-10x) χρησιμοποιούνται οι προσοφθάλμιοι Huygens. Για μεγάλες μεγεθύνσεις (25x) χρησιμοποιούνται αντισταθμιστικοί Huygens, και ορισμένες φορές τύπου Kellner λόγω της μεγάλης ανακούφισης που διευκολύνει τους διοπτροφόρους. Αρκετά μικροσκόπια έχουν δύο προσοφθάλμιους για διόφθαλμη παρατήρηση. 9.2.3. Συλλέκτης Φακός Το φως του αντικειμένου κατανέμεται στην επιφάνεια του ειδώλου, που είναι αρκετά μεγαλύτερη, με αποτέλεσμα να χρειάζεται ισχυρός φωτισμός στο αντικείμενο. Για μεγάλες μεγεθύνσεις και αριθμητικά ανοίγματα πρέπει οι ακτίνες που έρχονται από το αντικείμενο να πληρούν όλη τη γωνία φ. Γι αυτό χρησιμοποιείται ένας συλλέκτης ή συμπυκνωτής φακός (condenser lens) που δίδει ισχυρά συγκλίνουσα δέσμη στην εστία του, που είναι και η θέση του προς παρατήρηση αντικειμένου. Σχήμα 9-8: Συλλέκτης φακός μικροσκοπίου (α) τύπου Abbe, (β) απλανατικός. (γ) Κώνος φωτός από συλλέκτη φακό. Είναι σημαντικό να θυμόμαστε ότι η ανάλυση ενός σύνθετου μικροσκοπίου εξαρτάται επίσης από τα χαρακτηριστικά και τη σχετική θέση όλων των οπτικών στοιχείων, και όχι μόνο ενός συγκεκριμένου. Για παράδειγμα, ένα μικροσκόπιο με εξαιρετικούς αντικειμενικούς και συλλέκτη φακό θα έχει φτωχή απόδοση, αν το εστιακό επίπεδο του συλλέκτη δεν είναι εστιασμένο με το πίσω εστιακό επίπεδο του αντικειμενικού. Με άλλα λόγια, πρέπει το πίσω εστιακό σημείο του αντικειμενικού και το πρόσθιο εστιακό σημείο του συλλέκτη να είναι οπτικά συζυγή. 148