PROGRAMUL 4 PARTENERIATE IN DOMENIILE PRIORITARE 2007-2013 SECTIUNEA 1 RAPORTUL STIINTIFIC SI TEHNIC (RST) Acronim proiect: NOSITEC Contract nr: 41-017/2007 Titlu proiect: NOI SISTEME TERAPEUTICE DONOARE DE OXID DE AZOT CU ELIBERARE CONTROLATA FAZA DE EXECUTIE NR. I SISTEME TERAPEUTICE CU ELIBERARE CONTROLATA DONOARE DE OXID DE AZOT STADIUL ACTUAL AL CUNOSTINTELOR IN DOMENIU 1
CUPRINS OBIECTIVE GENERALE 5 OBIECTIVELE FAZEI DE EXECUTIE 6 REZUMATUL FAZEI 7 DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA 9 Activitatea I.1. Studiu bibliografic privind sistemele terapeutice donoare de oxid de azot 9 Capitolul I. monoxidul de azot 9 I.1. Biosinteza monoxidului de azot 10 I.2. Mecanism de actiune 11 I.3. Chimia speciilor reactive de azot 13 I.4. Efecte biologice 14 Capitolul II. Donori de monoxid de azot 15 II. 1. Monoxid de azot exogen 17 II.2. Donori O-NO 17 II.3. Donori S-NO (S-nitrozotioli) 19 II.4. Donori N-NO 25 II.5. Donori C-NO 32 II.6. Donori heterociclici de NO 33 II.7. Alti donori de NO 37 II.7. Complecşi metal-no 42 Capitolul. III. Donori bifunctionali de monoxid de azot 43 III.1. Antiinflamatoare nesteroidiene donoare de NO 44 III.2. Glucocorticoizi donori de NO 61 III.3. Donori de NO inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei 62 III.4. Donori de NO blocanti ai canalelor de calciu 64 III.5. Antagonisti alpha 1 /beta adrenergici donori de NO 66 III.6. Agonisti beta adrenergici donori de NO 70 III.7. Inhibitori ai fosfodiesterazei donori de NO 71 III.8. Antagonisti H 1 donori de NO 72 III.9. Antagonisti H 2 donori de NO 73 III.10. Inhibitori ai HMG-CoA reductazei donori de NO 74 III.11. Chimioterapice donoare de NO 76 III.12. Cefalosporine donoare de NO 79 2
Activitatea I.2. Studiu bibliografic al sistemelor cu eliberare controlata 81 Capitolul I. Clasificarea sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor 82 I.1. Sisteme polimerice cu eliberare controlată a agenţilor terapeutici 84 Capitolul II. Principalele căi de administrare/transport a medicamentelor 93 Capitolul III. Generalitati asupra cineticii de eliberare 97 III.1. Cinetica de eliberare controlată prin difuzie 103 III.2. Cinetica eliberării din sisteme de control prin membrane 105 III.3. Sisteme controlate de pătrunderea apei 108 III.4. Sisteme de eliberare reglate din exterior 114 III.5. Sisteme de eliberare autoreglabile 121 Capitolul IV. Factorii care influenţează cinetica eliberării principiilor active 129 IV.1. Coeficientul de difuzie 130 IV.2. Membrana şi matricea 131 IV.3. Coeficientul de partiţie 131 IV.4. Solubilitatea medicamentului în polimer 132 IV.5. Vâscozitatea şi concentraţia 132 Capitolul V. Exemple de sisteme de eliberare a principiilor active 133 Activitatea I.3. Realizarea de sisteme cu eliberare controlata. Instalatii si tehnici de obtinere a nano si microparticulelor, filmelor si membranelor ce contin agenti terapeutici 138 Capitolul I. Evaluarea metodelor de obtinere a sistemelor cu eliberare controlata 138 Capitolul II. Metode pentru prepararea nanoparticulelor polimer-medicament 141 Capitolul III. Tehnici de obtinere a microparticulelor cu eliberare controlata 157 III.1.Tehnici de obtinere pe cale fizica a microparticulelor cu eliberare controlata 157 III.2.Tehnici de obtinere, pe cale chimica, a microparticulelor cu eliberare 159 controlata III.3. Procesul de micro şi nanoîncapsulare 161 Capitolul IV.Tehnici de obtinere a filmelor si membranelor ce contin agenti terapeutici 164 Capitolul V. Dispozitive şi aparate care pot fi utilizate la obtinerea micro si nanoparticulelor realizate in laborator 168 3
Capitolul VI. Tehnici de obtinere a filmelor si membranelor cu agenti terapeutici 173 Capitolul VII. Exemple de realizare a micro si nanoparticulelor cu teofilina 174 Capitolul VIII. Exemple de realizare a micro si nanoparticulelor cu paracetamol 178 Activitatea I.4. Studii cinetice preliminare privind eliberarea controlata. Elaborarea metodelor si tehnicilor de eliberare 182 Capitolul I. Sisteme de eliberare a medicamentelor din matrici pe bază de alginaţi 182 Capitolul II. Sisteme de eliberare a medicamentelor pe bază de chitosan 185 Capitolul III. Metode de preparare a lipozomilor şi de încărcare cu substanţă activă Capitolul IV. Cinetica eliberarii controlate a teofilinei din diferite tipuri de formulari Capitolul V. Cinetica eliberarii controlate a paracetamolului din diferite tipuri de formulari 188 193 213 Activitatea I.5. Experimentari preliminare 240 Capitolul I. Metode de inglobare si studiu cinetic a medicamentelor 240 Capitolul II. Cinetica eliberării ketoprofenului din matricea pe bază de chitosan 242 Capitolul III. Microparticule polimeri naturali principiu activ 246 CONCLUZII 252 BIBLIOGRAFIE 255 4
OBIECTIVE GENERALE Explorarea posibilităţilor de realizare de noi sisteme terapeutice cu eliberare controlata Derivatizarea teofilinei si caracterizarea fizico-chimica si farmacotoxicologica a compusilor obtinuti Studiul cineticii eliberarii controlate a compusilor obtinuti prin derivatizarea teofilinei Functionalizarea compusilor obtinuti prin derivatizarea teofilinei prin grefarea unei grupari donoare de oxid de azot (NO) Caracterizarea fizico-chimica si farmaco-toxicologica a compusilor donori de NO Studiul cineticii eliberarii controlate a compusilor donori de NO Analiza comparativa a rezultatelor obtinute OBIECTIVELE FAZEI DE EXECUTIE I SISTEME TERAPEUTICE CU ELIBERARE CONTROLATA DONOARE DE OXID DE AZOT STADIUL ACTUAL AL CUNOSTINTELE IN DOMENIU Explorarea posibilităţilor de realizare de noi sisteme terapeutice donoare de oxid de azot cu eliberare controlata 5
REZUMAT Efectele terapeutice ale monoxidului de azot sunt cunoscute de multã vreme, în principal prin intermediul nitrovasodilatatorilor (nitroglicerinã, isosorbid dinitrat, isosorbid mononitrat etc.), utilizaţi cu efecte benefice, de mai bine de 100 de ani, în patologia vascularã. Efortul ştiiţific deosebit, menit sã clarifice funcţiile fiziologice şi patologice ale monoxidului de azot (NO), este ilustrat prin cele peste 50000 de articole de specialitate. Rezultatul acestui numãr impresionant de studii l-a constituit sinteza de noi potenţiali donori de NO, precum şi îmbunãtãţirea profilului farmacologic şi farmacocinetic al celor deja utilizaţi în terapeuticã (ex. nitraţi organici). La ora actualã, pe plan mondial se deruleazã ample programe de cercetare ce au drept scop obţinerea de donori bifuncţionali de NO, mulţi dintre aceştia promiţând a deveni în viitor valoroşi agenţi terapeutici. Cele mai intense studii sunt derulate în clasa antiinflamatoarelor nesteroidiene, dar de curând cercetãrile s-au lãrgit incluzând şi modificarea altor grupe terapeutice - bronhodilatatoare, anti-hipertensive, antihistaminice, antiulceroase, antitumorale, antivirale, antibacteriene etc. Lucrarea prezinta un amplu studiu, din literature de specialitate, privind sistemele terapeutice donoare de oxid de azot cu eliberare controlatã, precum si experimentari preliminare de obtinere a micropaticulelor polimeri naturali principiu activ. Sunt prezentate importanta monoxidului de azot ca molecula endogena (biosinteza, mecanism de actiune, implicatii fiziologice si fiziopatologice) si principalele clase de donori de monoxid de azot (donori O-NO, donori S- nitrozotioli, donori N-NO, donori C-NO, donori heterociclici de NO, etc.). O importanta deosebita prezinta donorii bifunctionali de NO obtinuti prin ataşarea la molecula unui medicament clasic a unei grupãri capabile de a elibera în organism NO. Eficacitatea clinicã a unui donor de NO este în mare parte influenţatã de proprietãţile sale chimice. Un donor de NO ideal ar trebuie sã prezinte urmãtoarele caracteristici: stabilitate crescutã, de parcursul conservãrii dar sã aibã capacitatea de a elibera spontan NO in vivo; caracter lipofil ridicat pentru a asigura traversarea membranei celulare; o bunã biodisponibilitate la administrare oralã; duratã mare de acţiune; sa fie lipsit de toxicitate; sã poatã fi obţinut prin sintezã în grad de puritate avansat. Biodisponibilitatea medicamentelor este imbunatatita prin utilizarea sistemelor de transport controlat, acestea asigurand un nivel terapeutic optim al 6
medicamentului in organism timp indelungat existand in acelasi timp posibilitatea eliberării la ţintă a componentei active. In acest context este prezentata clasificarea sistemelor terapeutice cu eliberare controlata a medicamentelor, caile de administrare si transport, si se sumarizeaza un numar mare de sisteme care au fost studiate pana in prezent, mentionandu-se daca ele se afla sau nu pe piata. Lucrarea descrie de asemeni mecanismelor implicate in eliberarea controlata a principiilor active. Pentru fiecare tip de mecanism de eliberare sunt prezentate ecuatiile cinetice, modul de incarcare a suportului cu medicament si metodele moderne de studiu a cineticii de eliberare in vitro si in vivo, insistandu-se asupra studiilor pentru doi intermediari de baza ai medicamentelor donoare de oxid nitric si anume paracetamolul si teofilina. Sunt prezentate o serie de metode si tehnici utilizate la obtinerea sistemelor cu eliberare controlata, sub forma de nano- si microparticule, filme si membrane ce contin agenti terapeutici precum si tehnicile si metodele optime de realizare a sistemelor cu eliberare controlata pe baza de polimeri naturali/sintetici si principii active care fi vor aplicate, in cadrul proiectului, in fazele urmatoare S-au realizat studii cinetice preliminare privind eliberarea controlata, descriindu-se metodelor si tehnicilor de eliberare. Sunt descrise mai intai tipuri de matrici similare cu cele care se intentioneaza a fi utilizate in prezentul proiect adica a celor pe baza de polizaharide care ofera avantajul ca sunt biocompatibile, biodegradabile si receptive la actiunea stimulilor externi. Apoi este elaborata instalatia experimentala pentru efectuarea studiilor cu un anumit debit de fluid de testare si folosind un medicament model sunt efectuate primele teste de eliberare controlata in vitro a medicamentelor. S-a insistat asupra descrierii celor doua etape ce urmeaza sa fie efectuate si anume: I) incarcarea matricei cu medicament si II) studiul eliberarii propriu zise in diferite medii in principal simuland conditiile din organismele vii pentru alegerea solutiei celei mai convenabile in studiul medicamentelor donoare de oxid nitric. S-au realizat instalatii proprii, de laborator pentru obtinerea de micro- si nanaoparticule. S-au efectuat incercari preliminare privind obtinerea de sisteme cu eliberare controlata, sub forma de microparticule, din polimeri naturali (Xantan, Chitosan) si Teofilina (precursor pentru sistemele donoare de oxid de azot). Dimensiunea medie a particulelor obtinute pentru sistemul Xantan-Teofilina este de 50μm. Prezenta Teofilinei in complecsii rezultati a fost pusa in evidenta prin analize spectrofotometrice FTIR si de calorimetrie diferentiala DSC. Studiul cinetic privind eliberarea in vitro a teofilinei din complexul Xantan-Teofilina s-a efectuat in conditii similare de ph intilnite in mediul fiziologic. S-a constatat ca la ph 2,0 teofilina este eliberata in aproximativ 10 ore. 7
DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA CONCLUZII Activitatea I.1. Studiul bibliografic privind sistemele terapeutice donoare de oxid de azot Efectele terapeutice ale monoxidului de azot sunt cunoscute de multã vreme, în principal prin intermediul nitrovasodilatatorilor (nitroglicerinã, isosorbid dinitrat, isosorbid mononitrat etc.), utilizaţi cu efecte benefice, de mai bine de 100 de ani, în patologia vascularã. Efortul ştiiţific deosebit, menit sã clarifice funcţiile fiziologice şi patologice ale monoxidului de azot (NO), este ilustrat prin cele peste 50000 de articole de specialitate. Rezultatul acestui numãr impresionant de studii l-a constituit sinteza de noi potenţiali donori de NO, precum şi îmbunãtãţirea profilului farmacologic şi farmacocinetic al celor deja utilizaţi în terapeuticã (ex. nitraţi organici). La ora actualã, pe plan mondial se deruleazã ample programe de cercetare ce au drept scop obţinerea de donori bifuncţionali de NO, mulţi dintre aceştia promiţând a deveni în viitor valoroşi agenţi terapeutici. Eficacitatea clinicã a unui donor de NO este în mare parte influenţatã de proprietãţile sale chimice. Un donor de NO ideal ar trebuie sã prezinte urmãtoarele caracteristici: stabilitate crescutã, de parcursul conservãrii dar sã aibã capacitatea de a elibera spontan NO in vivo; caracter lipofil ridicat pentru a asigura traversarea membranei celulare; o bunã biodisponibilitate la administrare oralã; duratã mare de acţiune; sa fie lipsit de toxicitate; sã poatã fi obţinut prin sintezã în grad de puritate avansat. Deşi la ora actualã terapeutica nu dispune de un donor bifuncţional de NO, cercetãrile sunt extrem de avansate şi cu siguranţa în viitorul apropiat vom beneficia de avantajele acestei noi clase de medicamente. Cele mai intense studii sunt derulate în clasa antiinflamatoarelor nesteroidiene, dar de curând cercetãrile s-au lãrgit incluzând şi modificarea altor grupe terapeutice - bronhodilatatoare, anti-hipertensive, antihistaminice, antiulceroase, antitumorale, antivirale, antibacteriene etc. Antiinflamatoarele nesteroidiene donoare de NO (AINS-NO) reprezintã nu numai o nouã clasã de antiinflamatoare nesteroidiene ci constituie prima dovadã a importantului rol pe care îl are NO în protejarea mucoasei gastro-intestinale. Efortul ştiinţific realizat este ilustrat de încurajatoarele rezultatele obţinute, numeroşi candidaţi terapeutici aflându-se în diferite faze de studiu clinic. 8
Astfel, compusul NCX-4016 (nitroximetil esterul aspirinei) se aflã în faza a II-a de studiu clinic pentru afecţiuni cardiovasculare şi diabet zaharat tip 2, iar Naproxen-NO (AZT-3582) a intrat deja în faza a III-a de studiu clinic pentru tratamentul osteoartritei. Donorii bifuncţionali de monoxid de azot au mari şanse sã devinã valoroşi agenţi terapeutici în afecţiunile inflamatorii şi patologia cardiovascularã (hipertensine arterialã, aterosclerozã, profilaxia infarctului de miocard şi a accidentelor vasculare cerebrale) dar şi ca agenţi antiastmatici, chimioterapici şi nu în ultimul rând citostatici. Activitatea I.2. Studiu bibliografic al sistemelor cu eliberare controlata Administrarea/Transportul controlat al unui medicament se realizează atunci când matricea polimerică naturală sau sintetică este combinată cu un medicament sau alt agent activ în aşa fel încât componenta activă să fie eliberată din sistem întru-un mod prestabilit Printre avantajele folosirii sistemelor cu transport controlat se pot include: Menţinerea unui nivel terapeutic optim al medicamentului Utilizarea optimă a medicamentului Posibilitatea eliberării la ţintă a componentei active. Pentru a fi folosit cu succes în obţinerea sistemelor de transport controlat al medicamentelor un material trebuie să fie inert chimic şi fără impurităţi. De asemenea, trebuie să aibă o structură fizică potrivită, cu îmbătrânire minimă şi să fie uşor prelucrabil. Câteva materiale sintetice care sunt curent folosite sau studiate pentru transportul controlat al medicamentelor sunt: poli(metacrilatul de 2-hidroxietil), poli(nvinil pirolidona) pentru uşurinţa cu care realizează suspensii, poli(metacrilatul de metil) pentru rezistenţa fizică şi transparenţa, poli(alcool vinilic) pentru hidrofilie şi rezistenţă, poli(etilenglicol), poliacrilamidă, poliuretani pentru elasticitate, poli(siloxani) sau siliconi pentru capacitatea de izolare, poli(etilena) pentru elasticitate şi lipsa umflării. [4] În ultimul timp în domeniul eliberării controlate se testează o serie de polimeri sintetizaţi special pentru aplicaţii biomedicale. Multe din aceste produse au fost proiectate pentru a se degrada în interiorul corpului, între care menţionăm: polilactide(pla), polianhidride, poliortoesteri, poliglicolide(pga). [5] Marele avantaj al polimerilor degradabili este acela că se fracţionează în molecule acceptate biologic care sunt metabolizate şi îndepartate din corp pe cale naturală din organism. Aceste produse de degradare dorite sau nedorite trebuie să fie testate corect, deoarece există factori care vor afecta biodegradarea materialelor iniţiale. Matricile polimerice sunt cele mai adecvate deoarece prin varierea conditiilor de obtinere se poate regla atat durata cat si tinti locul de tratat. Matricile continand un polimer natural ofera numeroase avantaje deoarece se pot crea sisteme biocompatibile, bioerodabile si asimilabile de catre organismele vii. Incorporarea sau utilizarea polizaharidelor ca atare sau modificate in obtinerea de sisteme cu eliberare controlata ofera pe langa avantajele mentionate si cel al caracterului multi-receptiv la actiunea factorilor din mediul ambiant. 9
Activitatea I.3. Realizarea de sisteme cu eliberare controlata. Instalatii si tehnici de obtinere a nano si microparticulelor, filmelor si membranelor ce contin agenti terapeutici S-a prezentat un studiu documentar, din literatura de specialitate, privind metodele de realizare a sistemelor cu eliberare controlata precum si instalatii si tehnici de obtinere a nano si microparticulelor, filmelor si membranelor ce cuprind agenti terapeutici in scopul proiectarii, pentru faza de laborator, a metodelor de obtinere a sistemelor cu eliberare controlata ce contin derivati de teofilina. S-au prezentat citeva exemple de obtinere a medicamentelor cu eliberare controlata pe baza de teofilina sau paracetamol, semnalate de literature de specialitate. In scopul obţinerii de micro- şi nano-particule, cu medicament incorporat, în cadrul proiectului de faţă am optat pentru utilizarea unor complecşi polimerici polianionit/policationit pe baza de precursori polimeri naturali cu biocompatibilitate şi biodegrdabilitate recunoscută. Ca metodă de obţinere a complecşilor se poate folosi precipitarea prin reacţie chimică directă între componenta anionică şi cationică a complecşilor dizolvaţi în solvenţi adecvaţi sau metoda precipitarii directe a complexului format polimer-medicament prin schimbarea ph-ului solutiei Activitatea I.4. Studii cinetice preliminare privind eliberarea controlata. Elaborarea metodelor si tehnicilor de eliberare Studiile cinetice de eliberare controlata implica doua etape pentru oricare dintre sistemele studiate: - studiul incarcarea matricei cu medicament si - studiul eliberarii propriu zise in diferite medii in principal simuland conditiile din organismele vii S-a prezentat un studiu documentar, din literatura de specialitate privind cinetica de eliberare a medicamentelor din matrici de baza de alginati si chitosan, sisteme de eliberare controlata pe baza de chitosan. S-au prezentat metode de preparare a lipozomilor, de incarcare cu subtante active, precum si un amplu studiu cinetic de eliberare controlata a teofilinei si paracetamolului din diferite tipuri formulari. 10
Activitatea I.5. Experimentari preliminare S-au efectuat incercari preliminare privind realizarea unor sisteme cu eliberare controlata pe baza de polimeri naturali si teofilina si s-au obtinut complexi Xantan- Teofilina si Chitosan-Teofilina prin metoda schimbului ionic sau coprecipitarii. Produsele rezultate au fost caracterizate prin analize de: distributie dimensionala a particulelor, spectroscopie FTIR si calorimetrie diferentiala DSC. Dimesiunea medie a diametrelor particulelor este de 50 m. Spectrele FTIR ale complecsilor confirma intercalarea teofilinei in suporturile polimerice, prin prezenta benzilor de absorbtie a medicamentului in structura produselor analizate. In termograma DSC pentru complexul Xantan-Teofilina apare o deplasare a benzilor de tranzitie datorata legarii teofilinei de suportul polizaharidic. Studiul cinetic privind eliberarea in vitro a teofilinei din complexul Xantan- Teofilina s-a efectuat in conditii similare de ph intilnite in mediul fiziologic. S-a constatat ca la ph 2,0 teofilina este eliberata in aproximativ 10 ore. 11