ΚΛΩΝΟΠΟΙΗΣΗ Κλώνος: ένας πληθυσμός γενετικά ταυτόσημων οργανισμών ή κυττάρων που έχουν προκύψει από ένα μοναδικό αρχικό οργανισμό ή κύτταρο Παραδείγματα Πληθυσμός γενετικά όμοιων μικροοργανισμών σε καλλιέργειες Σύνολο αντιγράφων ενός μορίου DNA (υποκλωνοποίηση, μέσω της εισαγωγής τους σε βακτήρια που πολλαπλασιάζονται) Κλώνοιεμβρυικώνβλαστικώνκυττάρων Μονοζυγωτικά δίδυμα (προκύπτουν από το ίδιο ωάριο) Μεταφύτευση φυτών Κλωνοποίηση θηλαστικών
Μέθοδοι κλωνοποίησης σε θηλαστικά 1. Διαχωρισμός εμβρύου 2. Πυρηνική μεταφορά
Διαχωρισμός εμβρύου (embryo clonning, splicing) Διαχωρισμός των δύο ενωμένων κυττάρων που προκύπτουν από την πρώτη διαίρεση του ήδη γονιμοποιημένου ωαρίου Δεν μπορεί να εφαρμοστεί για την δημιουργία αντιγράφων ενήλικων ατόμων Τα πανομοιότυπα έμβρυα μπορούν να εμφυτευθούν στην μήτρα μιας φέρουσας μητέρας ή να καταψυχθούν
Πυρηνική μεταφορά σωματικού κυττάρου Δημιουργία εμβρύων με σύντηξη ενός σωματικού κυττάρου με ένα ωάριο από το οποίο έχει αφαιρεθεί ο πυρήνας Remove nucleus Cultured adult cells Egg Electrofuse One Cell Embryo Blastocyst Embryo
Γονιμοποίηση έναντι Πυρηνικής μεταφοράς
Ιστορική Αναδρομή 1938: προτάθηκε για πρώτη φορά 1952: επιτεύχθηκε σε αμφίβια (δότης: εμβρυικά βλαστομερή) 1962: Xenopus (δότης: επιθηλιακά κύτταρα) 1986: Πρόβατο (δέκτης: απύρηνο ωοκύτταρο μετάφασης ΙΙ, δότης:έμβρυο 8 16κυτ.) 1987: Αγελάδα 1989: Χοίρος 1996: Dolly (δότης: κύτταρο από ενήλικο οργανισμό) 1999: Ποντίκι
Στάδια πυρηνικής μεταφοράς Παραγωγή ενός κατάλληλου κυττάρου δέκτη Επιλογή και καλλιέργεια ενός κατάλληλου κυττάρου δότη Ανασύσταση εμβρύου Ενεργοποίηση και καλλιέργεια Εμφύτευση σε φέρουσα μητέρα
Παραγωγή ενός κατάλληλου κυττάρου δέκτη Κυτταρικός τύπος: ωάριο (ή ζυγωτό) που μπορούν να επαχθούν in vitro ή in vivo Το ωάριο έχει την μοναδική ιδιότητα να δημιουργεί ένα έμβρυο με ολοδύναμο γονιδίωμα (από 2 γονιδιώματα διαφοροποιημένων γαμετών) όπου θα επιτευχθεί ένα σωστό πρότυπο έκφρασης γονιδίων για την δημιουργία ενός πλήρους οργανισμού In vivo ωρίμανση: αυξάνεται την ποιότητα των ωαρίων Υπερωρρηξία: μπορεί να δράσει ανασταλτικά στην ανάπτυξη του εμβρύου. Σε σπάνια είδη μπορεί να χρησιμοποιηθούν ωάρια από ένα συγγενικό είδος
Επιλογή και προετοιμασία του ωαρίου Αφαίρεσητουπυρήναμετογενετικόυλικό(enucleation) 1. Εμπειρικά απομακρύνεται το 1 ο πολικό σωμάτιο και η περιοχή κάτω από αυτό σε ωοκύτταρα σταδίου μετάφασης ΙΙ (πρόβλημα: σε πολλές περιπτώσεις το γενετικό υλικό δεν βρίσκεται στην θέση αυτή. Επίσης με την μέθοδο αυτή συνήθως αφαιρείται 1/3 του κυτταροπλάσματος κάτι που μπορεί να επηρεάσει την ικανότητα για επιγενετικό επαναπρογραμματισμό του μεταφερόμενου πυρήνα) 2. Χρώση των ωοκυττάρων με φθορίζουσα ουσία ειδική για το DNA και ανίχνευση του γενετικού υλικού έπειτα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία και παρατήρηση σε μικροσκόπιο (πρόβλημα: καταστροφή γενετικού υλικού των μιτοχονδρίων) 3. Αφαίρεση του γενετικού υλικού ενεργοποιημένων ωοκυττάρων που βρίσκονται σε στάδιο τελόφασης ΙΙ, με αφαίρεση του 2 ου πολικούσωματίουκαιτουυποκείμενου κυτταροπλάσματος 4. Χημική επεξεργασία
ΜΕΙΩΣΗ 2n ΜΙΤΩΣΗ Ομόλογος ανασυνδιασμός 4n Πρόφαση Ι Μετάφαση ΙΙ 2n n
Αφαίρεση πυρήνων σε διάφορες φάσεις του κύκλου των ωαρίων Stage of enucleation *Anaphase telophase first meiosis (AI-TI) Metaphase of second meiosis (MII) Telophase of second meiosis (TII) Pronuclear zygote (PN) Double nuclear transfer first NT-MII second NT-PN Two cell embryo. Species Sheep Sheep Cattle Pig Cat Rabbit Mule Horse Rat Cattle Mouse (chemically induced) Goat Mouse Cattle Pig Mouse Pig Mouse Reference Lee and Campbell (2004) Campbell et al. (1996a), Schnieke et al. (1997), Wilmut et al. (1997) (Barnes et al. (1993), Delhaise et al. (1995), Du et al. (1995), Cibelli et al. (1998), Wells et al. (1999a,b, 2003, Zakhartchenko et al. (1999b, 2001, Kato et al. (2000), Do et al. (2001) Betthauser et al. (2000), Onishi et al. (2000) Shin et al. (2002b) Chesne et al. (2002) Woods et al. (2003) Galli et al. (2003) Zhou et al. (2003) Bordignon and Smith (1998) Gasparrini et al. (2003) Baguisi et al. (1999) McGrath and Solter (1983); McGrath and Solter (1984), Kwon and Kono (1996) Prather and First (1990) Prather et al. (1989) Kwon and Kono (1996); Ono et al. (2001) Polejaeva et al. (2000) Tsunoda et al. (1987) *Live offspring not yet reported.
Επιλογή και καλλιέργεια ενός κατάλληλου δότη γενετικού υλικού Εμβρυικά κύτταρα (εμβρυικά βλαστικά κύτταρα) Σωματικά κύτταρα ποικίλων ιστών από ζώα διαφορετικών ηλικιών Καλλιέργεια των κυττάρων σε χαμηλές συγκεντρώσεις θρεπτικών συστατικών ώστε ο κυτταρικός τους κύκλος να εισέλθει στη φάση στάσης (αδράνειας) και να συγχρονιστεί με το αντίστοιχο ρολόι του ωαρίου
Ανασύσταση εμβρύου, ενεργοποίηση και καλλιέργεια Ανασύσταση: Συγχώνευση κυττάρων με ηλεκτρικό πεδίο Το κύτταρο του οργανισμού δότη μπορεί να εισαχθεί στο ωάριο με τη βοήθεια μιας μικροπιπέτας Ενεργοποίηση: ηλεκτρικό πεδίο ή με χημικό τρόπο, αναπαράγοντας τεχνητά ορισμένα από τα φυσιολογικά φαινόμενα που επάγονται από την είσοδο του σπερματοζωαρίου στο ωάριο Διάλυση του πυρηνικού φακέλου του σωματικού κυττάρου Αντικατάσταση ιστονών του σωματικού κυττάρου από ειδικές ιστόνες ωαρίου Δημιουργία ατράκτου Δημιουργία 2 ψευδοπροπυρήνων Καλλιέργεια εμβρύων μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης και εμφύτευση
Οι κλωνοποιημένοι οργανισμοί έχουν την βιολογική ηλικία του κυττάρου δότη? Γερνάνε νωρίτερα? Πεθαίνουν νωρίτερα? Δεν έχει αποδειχθεί Μηχανισμός τελομεράσης (Νόμπελ Ιατρικής 2009)
Τελομεράση: γαμέτες, βλαστικά κύτταρα, γαμετικά κύτταρα
Oι οργανισμοί που προκύπτουν είναι γενετικά πανομοιότυποι? Οι οργανισμοί που προκύπτουν από πυρηνική μεταφορά δεν είναι γενετικά πανομοιότυποι αλλά διαφέρουν στο 1 2% του DNA τους Λόγω της παρουσίας γενετικού υλικού εκτός του πυρήνα και σε μιτοχόνδρια που είναι κυτταροπλασματικά οργανίδια με ενεργειακό ρόλο και υπάρχουν σε μεγάλους αριθμούς στο αγονιμοποίητο ωάριο Επίδραση περιβαλοντικών παραγόντων Επίδραση επιγενετικών παραγόντων (Μεθυλίωση DNA=παύση της έκφρασης γονιδίων)
Εφαρμογές κλωνοποίησης 1. Για Αναπαραγωγικούς σκοπούς Παραγωγή αντιγράφων κτηνοτροφικών ζώων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά Διάσωση ειδών που κινδυνεύουν προς εξαφάνιση 2. Για Θεραπευτικούς σκοπούς Δημιουργία ιστών που είναι ανοσολογικά απόλυτα συμβατοί με τον πάσχοντα ώστε να χρησιμοποιηθούν σε μεταμοσχεύσεις
Θεραπευτική Κλωνοποίηση
Επιτρέπεται η κλωνοποίηση του ανθρώπου? Ηθικό πρόβλημα: καταστροφή εμβρύων Πρακτικό πρόβλημα: η παραγωγή τεράστιου αριθμού ωαρίων (για την θεραπεία 17εκ. Διαβητικών στις ΗΠΑ χρειάζονται ωάρια από 85 170εκ. γυναίκες) Υπάρχουν ενδείξεις ότι οι ιστοί που προέρχονται από την Διαδικασία της κλωνοποίησης μπορεί να απορριφθούν από τον δότη
Πότε αρχίζει η υπόσταση του ανθρώπου?
Βιοηθική Υπόσταση του εμβρύου Κίνδυνοι για την υγεία Κοινωνική Δικαιοσύνη Άλλες πηγές βλαστικών κυττάρων
Ιδιότητες Βλαστικών Κυττάρων Αυτο ανανέωση Διαφοροποίηση
Τύποι βλαστικών κυττάρων Ολοδύναμα (Totipotent): Δίνουν όλους τους κυτταρικούς τύπους Πλειοδύναμα (pluripotent): Μπορούν να δώσουν όλους τους κυτταρικούς τύπους εκτός των εξωεβρυικών μεμβρανών. Πολυδύναμα (Multipotent): Μπορούν να δώσουν συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους Μονοδύναμα (Unipotent): Δίνουν έναν μόνο κυτταρικό τύπο
Που βρίσκονται τα Βλαστικά Κύτταρα; Εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα πλειοδύναμα Εμβρυικοί ιστοί πλειοδύναμα ή πολυδύναμα Αίμα ομφαλιαίας αρτηρίας πολυδύναμα Ιστοί ενήλικων πολυδύναμα ή μονοδύναμα
Εμβρυονικά Βλαστικά Κύτταρα Εμβρυονικά Βλαστικά Κύτταρα
Εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα Πλειοδύναμα Εκτόδερμα, ενδόδερμα, μεσόδερμα
Καλλιέργεια Εμβρυονικών Βλαστικών Κυττάρων Πρέπει να διατηρούνται αδιαφοροποίητα Παρουσία αυξητικών παραγόντων (LIF, FGF) Αναπτύσσονται σε μία στοιβάδα εμβρυικών ινοβλαστών Έκφραση μεταγραφικών παραγόντων OCT4, Nanog, SOX2 Πρέπει να διαφοροποιούνται παρουσία κατάλληλων παραγόντων
Εφαρμογές Εμβρυονικών Βλαστικών κυττάρων Γονιδιακήστόχευσηστοποντίκι Κυτταρική θεραπεία
Γονιδιακή κατασκευή neo tk Εισαγωγή του DNA στα ES με ηλεκτροπαλμό Επιλογή ανθεκτικών ES κλώνων Tεχνολογία κατευθυνόμενης γονιδιακής στόχευσης Καλλιέργεια ES κλώνων και εντοπισμός των ανασυνδιασμένων ES κλώνων Εισαγωγή των ανασυνδιασμένων ΕSC κλώνων σε βλαστοκύστεις Εμφύτευση των βλαστοκύστεων σε θετές μητέρες ημιουργία χιμαιρικών ποντικών και διασταύρωσή τους για την μεταβίβαση του τροποποιημένου γονιδίου ημιουργία ετερόζυγων ποντικών και διασταύρωσή τους ημιουργία και μελέτη των ομόζυγων ποντικών
Κυτταρική Θεραπεία με Διαφοροποιημένα ΕΒΚ
Ηθικό δίλλημα Καταστροφή ανθρώπινων εμβρύων Υπόσταση του εμβρύου Κίνδυνοι για την υγεία Κοινωνική Δικαιοσύνη Άλλες πηγές βλαστικών κυττάρων Περιορισμός στην έρευνα των ανθρώπινων ΕΒΚ
Βλαστικά Κύτταρα Ενηλίκων
Βλαστικά Κύτταρα Μυελού των Οστών
Αιμοποιητικά Βλαστικά Κύτταρα CD34+
Μεσεγχυματικά Βλαστικά Κύτταρα
Βλαστικά Κύτταρα Ιστών
Πλεονεκτήματα χρήσης Βλαστικών κυττάρων ενηλίκων Αυτομεταμόσχευση
Ιστική μηχανική
Ιστική μηχανική
Μεταμόσχευση τραχείας με βλαστικά κύτταρα 1 Trachea is removed from dead donor patient 2 It is flushed with chemicals to remove all existing cells 3 Donor trachea "scaffold" coated with stem cells from the patient's hip bone marrow. Cells from the airway lining added 4 Once cells have grown (after about four days) donor trachea is inserted into patient's bronchus
Εφαρμογές σε ζώα
Επαγόμενα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα Induced pluripotent stem cells ips Nobel Ιατρικής 2012
Μοντέλο δημιουργίας ips κυττάρων
Επαγόμενα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα Induced Pluripotent Stem cells ips Αποδιαφοροποίηση σωματικών κυττάρων και επαναπρογραμματισμός σε πλειοδύναμα κύτταρα
Επαγόμενα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα Induced pluripotent stem cells ips Πλεονεκτήματα Κυτταρική θεραπεία (αυτομεταμόσχευση) Έλεγχος φαρμάκων Μοντελοποίηση ασθενειών Βιοηθική Ασθένειες Διαβήτης Huntington s Μυική δυστροφία Προσοχή Δεν πρέπει να μεταφέρονται ips σε ασθενείς (ογκογένεση) Κλινικές δομικές: όχι ακόμα