Γονιδίωμα / Genome. πλήρης σειρά αλληλουχιών DNA σύνολο της γενετικής πληροφορίας ενός οργανισμού (στατικό)

Γονιδίωμα / Genome πλήρης σειρά αλληλουχιών DNA σύνολο της γενετικής πληροφορίας ενός οργανισμού (στατικό)

Γονιδίωμα είδους / species Genome σύνολο γονιδιωμάτων των ατόμων ενός είδους (ή πληθυσμού) (γενετικοί πολυµορφισµοί) Γονιδίωμα ατόμου / individual Genome γονιδίωμα συγκεκριμένου ατόμου ενός είδους (ή πληθυσμού) (φυσική χαρτογράφηση)

Γονιδίωμα είδους / species Genome σύνολο γονιδιωμάτων των ατόμων ενός είδους (ή πληθυσμού) (γενετική χαρτογράφηση) Θέσεις πολυμορφισμού / polymorphic loci «θέσεις» επί του γονιδιώματος όπου υπάρχει γενετική «αστάθεια» (δηλ. αλλαγές σε >1% του είδους ή πληθυσμού) Όλα τα γονιδιώματα των ατόμων ενός είδους (individual genomes) διαμορφώνουν, ως μέρη ενός συνόλου, την έννοια του γονιδιώματος του είδους (species genome)

Έννοιες του γονιδιώματος Γονιδίωμα / Genome σύνολο γονιδιωμάτων όλων των ειδών έμβιων οργανισμών (εξέλιξη) Γονιδίωμα είδους / species Genome σύνολο γονιδιωμάτων των ατόμων ενός είδους (ή πληθυσμού) (γενετικοί πολυµορφισµοί) Γονιδίωμα ατόμου / individual Genome γονιδίωμα συγκεκριμένου ατόμου ενός είδους (ή πληθυσμού) (φυσική χαρτογράφηση)

Το γονιδίωμα μας «μιλάει» για την Εξέλιξη Το γονιδίωμα μας «επιτρέπει» συστηματικές «διαγνωστικές» ή «διορθωτικές» παρεμβάσεις Βιοϊατρική Βιοτεχνολογία

Προγράμματα Γονιδιώματος Εντοπισμός και ανάλυση γονιδίων Εφαρμογές στην Ιατρική Βιολογία www.ncbi.nlm.nih.gov/genome//seq

Τι μας χρειάζονται οι αναλύσεις γονιδιώματος;

Καταρχήν μας ενδιαφέρει το εκφραζόμενο τμήμα του γονιδιώματος (γονίδια) Ωστόσο,... το γονιδίωμα (DNA) δεν είναι μόνο γονίδια

1. Συνολική εικόνα (όχι μόνο τα γονίδια) 2. Συνολικό κωδικό δυναμικό (όλα τα γονίδια) 3. Γονιδιακές οικογένειες (πώς εξελίσσονται τα γονίδια) 4. Γενετικοί πολυμορφισμοί (πώς τα γονίδια συνδέονται με ασθένειες)

Τι είναι το Human Genome Project?

Initial sequence and analysis of the human genome (Feb( 2001) GENOME PROJECT

Η ατζέντα του Human Genome Project 14 Apr 2003 The Human Genome Project announces completion of the DNA reference sequence of Homo sapiens. e Press releases: NIH Sanger Institute Whitehead Institute 15 Feb 2001 Initial analysis of the human working draft sequence was published in a special issue of Nature and accompanied by several related research articles and commentary.

H. sapiens chromosome 20

Year 2005 : bp number# 100,000,000,000 (GeneBank,( EBI, DBJL, etc.) Γονιδίωµα: Human Genome Project Βιοπληροφορική: Μετα-γονιδιωµατικές αναλύσεις

Lessons from the «Human» Genome Project

Μεγάλο μέρος ενός γονιδιώματος μπορεί να εμφανίζεται σε πολλά αντίγραφα

Μεγάλο μέρος ενός γονιδιώματος μπορεί να μην αντιστοιχεί σε γονίδια

Ο αριθμός γονιδίων δεν αναλογεί πάντοτε με το μέγεθος του γονιδιώματος

Στα Βακτήρια, υπάρχει γραμμική σχέση Αριθμός γονιδίων Μέγεθος γονιδιώματος (Mb) Όχι όμως και στα Ευκάρυα

Γιατί υπάρχουν σχετικά λιγότερα γονίδια στα Ευκάρυα; βακτήριο C. elegans άνθρωπος N. tabacum γονίδια κυρ. επαναλαµβανόµενο DNA Εξωγονιδιακό DNA βακτήριο μύκητας άνθρωπος 1 kb Γονιδιακές οικογένειες domains Ιντρόνια γονιδίων

Yeast (S. cerevisiae)

Πώς γίνεται η χαρτογράφηση του γονιδιώματος;

Πώς έγινε αρχικά η χαρτογράφηση του γονιδιώματος (κατά Sanger) 3 Gb 50-250 Mb 100 kb 1 kb

Πώς γίνεται η χαρτογράφηση του γονιδιώματος 1: Library 2: Contigs 3: Sequence

Ανασύνθεση της πλήρους αλληλουχίας 3: Sequence 3: Shotgun sequencing

Η χαρτογράφηση δεν είναι μόνο αλληλούχιση

ΧΑΡΤEΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ / GENOME MAPS Γενετικοί δείκτες = «θέσεις» πολυμορφισμού Χαρτογραφικοί δείκτες Εντοπιστικοί δείκτες = θέσεις μοριακής αναφοράς Γενετική χαρτογράφηση (cm) Φυσική χαρτογράφηση (bp) π.χ. Μικροδορυφορικό DNA / microsatellites (SSRs = simple sequence repeats) Πολυμορφισμοί του ενός νουκλεοτιδίου / SNPs (= single nucleotide polymorphisms) π.χ. Δείκτες εκφραζόμενων αλληλουχιών (=εξωνίων) / ΕSΤs Νησίδια CpG (CG dinucleotide enriched) (=δείκτες 5 UTR ενεργώς μεταγραφόμενων γονιδίων) / CpG islands Αλληλούχιση (sequencing, 1 bp)

Πώς γίνεται σήμερα η χαρτογράφηση του γονιδιώματος ( next generation protocols)

Personalized Genome Sequencing The genome of J.D. Watson 3.3 X 10 6 SNPs, 10654 coding, 12 disease loci Wheeler et al., Nature 452, 872-876 876 (2008)

Πώς και γιατί καταγράφονται οι πολυμορφισμοί;

Γονοτυπο ειδική ανάπτυξη φαρμάκων

Σε ποιες θέσεις του γονιδιώματος εντοπίζονται πολυμορφισμοί; n x 10 6 SNPs ~ 1 / 100 bp n x 10 5 indels n x 10 4 VNTRs ~ 8 % Levy & Strausberg, Nature 456, 49-50 (2008)

SNPs (snips) : Single Nucleotide Polymorphisms Αξία της συστηματικής καταγραφής των SNPs; (α) Ανάλυση γενετικών τύπων κατά άτομο (SNP profile genotyping) (β) Κατανόηση των πολυγονιδιακώνπολυπαραγοντικών γενετικών νόσων και, πιθανόν, ανάλυση της γενετικής προδιάθεσηςπροςασθένειες (γ) Μελέτη της γενετικής βάσης της απόκρισης σε φάρμακα (drug response) με προοπτική εφαρμογής σε «εξατομικευμένους» σχεδιασμούς φαρμάκων στρατηγικών θεραπείας (personalized medicine) H. sapiens estimate: 1 per 100-150 bp (30 million SNPs)

Πώς εντοπίζονται τα γονίδια;

Πώς εντοπίζονται τα γονίδια; DNA in silico, ORFs exon/intron gene families DNA in vitro, zoo blotting CpGislands ESTs mrna in vitro, Northern blot cdna exon trapping Strategy Positional cloning vs Functional cloning (use of genetic markers as well)

Examples (DNA level) In silico splice sites In vitro Zoo blotting

In vitro Exon trapping Examples (RNA level)

Examples (protein level) Κατανοµή των γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώµατος,...... ως προς την οµοιότητά τους µε άλλα γονίδια... ως προς τις λειτουργίες τους

Πόσα γονίδια έχει το γονιδίωμα του H. sapiens;

17 18 19

Γιατί είναι δύσκολος ο εντοπισμός γονιδίων σταμεγάλαγονιδιώματατωνευκαρυωτών; Ι. Αραιή κατανομή των γονιδίων ΙΙ. Μεθοδολογία χαρτογράφησης

Assembly of sequences to contigs Assembly of contigs to larger contigs Assembly of contigs to scaffolds 1-kb 5-kb 100-kb contigs Paired-end sequencing n-mb scaffold

Πόσαγονίδιαυπάρχουνστονάνθρωπο; 25 με 25 χιλιάδες

Πόσαγονίδιαυπάρχουνστονάνθρωπο; 25 με 25 χιλιάδες Πόσες πρωτεΐνες αντιστοιχούν στα γονίδια αυτά; 60 με 70 χιλιάδες Γιατί αυτή η διαφορά; 1. Φαινόμενα εναλλακτικού ματίσματος (alternative splicing) 2. Σύνθετη αρχιτεκτονική των πρωτεϊνών (domains)

Τα ανθρώπινα γονίδια έχουν πολλά & μεγάλα ιντρόνια Μέσο τυπικό γονίδιο

Ιντρόνια γονιδίων : Splicing

New domain combinations arise by alternative splicing!!! Ιντρόνια γονιδίων : Splicing Alternative splicing increases functional complexity in higher Eukarya (60% of H. sapiens genes predicted to conform to alternative splicing)

Λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση

Μεταγραφική έκφραση των γονιδίων (μικροσυστοιχίες)

Προφίλ έκφρασης των γονιδίων σε καρκίνο, καρδιαγγειακές νόσους, κλπ.

Ευελιξία της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών Προσδιορισμός επιπέδων mrna (μεταγραφική έκφραση) Προσδιορισμός πολυμορφισμών (SNPs) Προσδιορισμός επαναλήψεων ελλείψεων (reverse FISH) Πρωτεϊνικές μικροσυστοιχίες TYPICAL TECHNOLOGY OF POST GENOMIC ERA High throughput analysis Global approach / Bioinformatics

Πρωτέωμα (πρωτεΐνωμα) / Proteome σύνολο πρωτεϊνών που κωδικεύονται από ένα γονιδίωμα (δυναµικό) απαρτιωμένη λειτουργική έκφραση του γονιδιώματος (γονιδιακά προϊόντα)

Why Proteomics? 2 DE MS databases Πραγματικός αριθμός των γονιδίων Επίπεδα έκφρασης Πρωτεϊνική λειτουργία Μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις Πρωτεϊνική στόχευση (targeting) Πρωτέωμα αλληλεπιδράσεων (interactome)

Shevchenko et al., PNAS 93, 14440 (1996) Λειτουργική έκφραση των προϊόντων των γονιδίων (πρωτεωμική) first global gene product profile (S.( cerevisiae)

from 2 hybrid to IP to MS; global interactome analysis

Σχεδιασμός και ανάπτυξη φαρμάκων Structure-Activity Relations (SAR) Antibody-antigen analysis Ligand analysis Binding site mapping Drug design & development

Η λειτουργική γονιδιωματική ανάλυση αναθεωρεί τις μεθόδους διάγνωσης θεραπείας

Πώς εντοπίζονται γονίδια που συνδέονται με ασθένειες;

Εντοπισμός γονιδίων συνδεόμενων με ασθένειες Dystrophin (1986) Μυϊκή δυστροφία Duchenne CFTR (1989) Κυστική ίνωση

ΧΑΡΤEΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ / GENOME MAPS Γενετικοί δείκτες Χαρτογραφικοί δείκτες = πολυμορφικές «θέσεις» Γενετικοί χάρτες (cm) Cross talk (interplay) Εντοπιστικοί δείκτες = θέσεις μοριακής αναφοράς Φυσικοί χάρτες (bp) Εντοπιστική κλωνοποίηση γονιδίου / positional cloning εντοπισμός γονιδίου που συνδέεται με συγκεκριμένο φαινότυπο ή ασθένεια χωρίς προηγούμενη λειτουργική ένδειξη για το γονίδιο αυτό α. γενετική χαρτογράφηση (linkage disequilibrium analysis) β. φυσική χαρτογράφηση (disease susceptibility loci) γ. εντοπισμός υποψηφίων γονιδίων (candidate genes) δ. μοριακή διαγνωστική μελέτη (phenotype/mutation screening) και παραγωγή πειραματικών συστημάτων «επαλήθευσης» (in vitro, in vivo)

Παραδείγµατα γονιδίων ασθενειών που ταυτοποιήθηκαν µε εντοπιστική κλωνοποίηση (positional cloning) έτος γενετική ασθένεια γονίδιο 1986 Μυϊκή δυστροφία Duchenne (DMD) δυστροφίνη 1989 Κυστική ίνωση (CF) CFTR (Cl - pump) [ F508] 1990 Νευρωϊνοµάτωση (NF) NF1 1991 Σύνδροµο fragile-x (FRAXA) FMR-1 [(CGG) n repeats] 1993 Νόσος του Huntington (HD) IT-15 [(CAG) n repeats] 1994 Πολυκυστική νεφρική νόσος (PKD) PKD-1 1995 Νωτιαία µυϊκή ατροφία (SMA) SMN (surv. motoneuron) [Τροποποιηµ. από Strachan and Read (1997) Human Molecular Genetics, Table 14.1]

Παραδείγµατα γονιδίων ασθενειών που ταυτοποιήθηκαν µε εντοπιστική κλωνοποίηση (positional cloning) έτος γενετική ασθένεια γονίδιο 1990 Retinitis pigmentosa (RP) ροδοψίνη 1995 Σύνδροµο Marfan (MFS) fibrillin (FBN1) 1995 Καρκίνωµα µαστού (BC) BCRA2 1995 Alzheimer's apoe [late-onset], APP PS2 (presenilin) [early-onset] 1997 Νόσοι βιογένεσης υπεροξεισωµάτων PEX1 1999 Νόσος Darier (DD) ATP2A2 (Ca 2+ -ATPάση) 1999 Σπονδυλοεπιφυσική δυσπλασία SEDL 2000 Επιληπτική νόσος GEFS+ SCN1A (Na + channel) 2000 Χονδροδυστροφική µυοτονία (SJS1) perlecan (major basement membr. proteoglycan) [Τροποποιηµ. από Strachan and Read (1997) Human Molecular Genetics, Table 14.2, και Genome Sequencing Consortium (2001), Nature 409, 860-921]

From diseases to genes

From diseases to genes Μονογονιδιακές ή πολυγονιδιακές ασθένειες 1. Γενετική χαρτογράφηση Εντοπιστική κλωνοποίηση 2. Μοριακή ιαγνωστική µελέτη SNPs 2A. Συνολικά πρότυπα έκφρασης γονιδίων (µικροσυστοιχίες) 2Β. Λειτουργική έκφραση αλληλεπιδράσεις (πρωτεωµική ανάλυση) 3. Πειραµατικά συστήµατα in vitro και/ή in vivo 4. Αλίευση µορίων-στόχων ως δεικτών διάγνωσης-πρόγνωσης-θεραπείας 5. Σχεδιασµοί θεραπείας µεχειρισµό (α) γονιδίων, (β) φαρµάκων Μονογονιδιακές ασθένειες, 1 γονίδιο εντοπιστική κλωνοποίηση, µοριακή διαγνωστική ανάλυση, προσδιορισµός τύπων SNP, µελέτη γονιδιακής θεραπείας -µελέτη ανάπτυξης φαρµάκων Πολυγονιδιακές ασθένειες >1 γονίδια >1 «υποψήφιες» θέσεις ευπάθειας, µελέτη γονιδιακής έκφρασης, προσδιορισµός τύπων SNP, µελέτη αλληλεπίδρασης γονιδιακών προϊόντων

From genes to diseases

Gene targeting Γονιδιακή στόχευση In vivo models Mario Cappechi, 1980 Transgenes: Nobel, 2007

διαγονίδια ιαγονιδιακά ζώα (γονιδιακή στόχευση) [το διαγονίδιο µεταφέρεται σε κύτταρα ES σε καλλιέργεια] Blastocyst from 3.5-4.5 d postcoitum embryo (inner cell mass); in vitro culture of embryonic stem (ES) cells; gene-targeting; inject selected (targeted) ES into blastocyst; reimplant into foster female; chimeric offspring (2-species ES) Transgene (=gene-targeted construct) integrates into chromosome of the (omnipotent) ES at specific loci, based on homologous recombination; selection yield mosaically transgenic mice (chimeras); backbreeding; fully transgenic mice (from transgene germline cells of chimera) ES

Αυξητική ορμόνη, 1982 Reporter β γαλακτοσιδάσης Μυική δυστροφία DMD, 1992 GFP mouce GFP: Nobel, 2008