ΚΛΙΝΙΚΟ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ Η Μοριακή Επιδημιολογία στην Κλινική Μικροβιολογία και τη Μικροβιολογία της Δημόσιας Υγείας: Σταφυλόκοκκοι Ίρις Σπηλιοπούλου Καθηγήτρια Εργαστήριο Μικροβιολογίας Εθνικό Κέντρο Αναφοράς Σταφυλοκόκκων Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών
Διάσπαρτα περιστατικά λοιμώξεων/επιδημικών εξάρσεων: πώς θα συνδεθούν;; Επιδημιολογική μελέτη-καθορισμός κλώνων: εύρεση της πηγής διασποράς Ο ρόλος του Κέντρου Αναφοράς??? Ο γονότυπος πρέπει να συμβάλλει και στην κατανόηση της εξέλιξης των βακτηρίων και στην ταξινόμησή τους
MLST, SCCmec, spa typing, agr typing, τοξίνες S. aureus Carbamate kinase (arcc) Shikimate dehydrogenase (aroe) Glycerol kinase (glpf) Guanylate kinase (gmk) Phosphate acetyltransferase (pta) Triosephosphate isomerase (tpi) Acetyl coenzyme A acetyltransferase (yqil) www.mlst.net SCCmec I-XIΙ Spa: ανάλυση αλληλουχίας και πολυμορφισμός της περιοχής Χ του γονιδίου Γονίδια τοξινών Agr: accessory gene regulator system
Τύποι SCCmec I-ΧII
Ποια είναι η σχέση μεταξύ στελεχών MRSA που απομονώνονται στο νοσοκομείο και στην κοινότητα; CA-MRSA Κοινότητα Ζώα LA-MRSA: Livestock- Associated Nοσοκομείο Παραγωγή HA-MRSA Παράγοντες ανάπτυξης και αντιβιοτικά χορηγούμενα στα ζώα
Μελέτη σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων με: PFGE, MLST, spa typing SmaI
Διαχωρισμός στελεχών που ανήκουν στον ίδιο τύπο MLST (A) και διαχωρισμός στελεχών που ανήκουν στον ίδιο τύπο PFGE (B) JCM:40:3764
Επιλογή μεθόδου Σε περιορισμένη έκταση: PCR Σε μεγαλύτερη περιοχή: PCR και PFGE Διεθνώς: ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πολλαπλών γονιδίων.
1. Προβληματισμοί Αύξηση σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων στο διάστημα 2006-2010 Νοσοκομεία: ΠΓΝΠ, ΠΓΝΛ, ΠΓΝΙ, ΚΝΠΠ, ΑΚΠΝ, ΠΓΝΠ. Συλλογή 4 614 στελέχη MRSA 2001-2012 Πιθανή επιδημική έξαρση; Υπάρχει γενετική σχέση των στελεχών; Διαφορετικές περιοχές της χώρας. Τι αντιμετωπίζουμε;
MRSA στην Ελλάδα: 6 νοσοκομεία 2001-2012
Φορεία τοξινών των CA-MRSA και HA-MRSA 2001-2012 100,00% 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 90,42% 53,96% 19,42% 0,59% 5,03% 8,15% PVL TSST-1 egc CA-MRSA HA-MRSA
Κλώνοι MRSA MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 MWM Kb 485.0 388.0 291.0 242.5 194.0 145.5 97.0 A A A A B B B B C C C C E E E E F F F F G G G G PVL-θετικά
Δενδρόγραμμα
Κλώνοι HΑ-MRSA από το 2001-2012 στην Ελλάδα (6 νοσοκομεία*) HA-MRSA 6,06% 4,92% 4,55% 53,03% 24,24% *ΠΓΝΠ, ΚΝΠ, ΠΓΝΛ, ΠΓΝΙ, ΑΚΠΝ, ΝΠΠ ST30 ST80 ST121 ST239 ST377 ST770 ST1 ST5 ST22 ST7 ST97 ST217 ST225 ST585
Κλώνοι CΑ-MRSA από το 2001-2012 στην Ελλάδα (6 νοσοκομεία)
STs σε ενήλικες/παιδιά και CA-MRSA/HA-MRSA Ενήλικες (25 κλώνοι) ST1-IV, ST5-IV, ST7-IV, ST8-IVc, ST10-V, ST22-IV, ST30-IV, ST80-IV, ST97-V, ST217-IV, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST583-IVc, ST585-III, ST714-IV, ST728-IVc, ST770- NT, ST842-NT, ST935-V, ST1659-II, ST1713-III, ST2092- NT, ST2486-IV, ST2487-IV CA- MRSA (23 κλώνοι) ST1-IV, ST5-IV, ST7- IV, ST8-IVc, ST10-V, ST22-IV, ST30-IV, ST80-IV, ST97-V, ST121-V, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST461-NT, ST583- IVc, ST728-IVc, ST842-NT, ST935-V, ST1659-II, ST1713- III, ST2092-NT, ST2486-IV, ST2487- IV Παιδιά (9 κλώνοι) ST7-IV, ST22-IV, ST30-IV, ST80-IV, ST121-V, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST461-NT HA- MRSA (15 κλώνοι) ST1-IV, ST5-IV, ST7- IV, ST22-IV, ST30- IV, ST80-IV, ST97-V, ST217-IV, ST225-II, ST239-III, ST377-V, ST585-III, ST714-IV, ST770-NT, ST1713- III
ST377 Κλωνικά σύμπλοκα S. aureus ST239 CC22 CC30 CC5 CC8 CC80 CC25
Ποια είναι τα συμπεράσματα; Επικράτηση και διασπορά του PVL-θετικού κλώνου ST80-IV (61.6% στο σύνολο και 88.8% στα CA-MRSA) Αίτιο και HA-MRSA λοιμώξεων Επιδημική έξαρση; Αίτιο HA-MRSA λοιμώξεων ο κλώνος ST239-III, πολυανθεκτικός (22.5% στο σύνολο και 60.8% στα HA-MRSA) Ο ST30-IV φέρει τα γονίδια της PVL σπάνια (1.8%), και πιο συχνά την tst (16.8%). Ο ST8-IV (USA300), μόνο σποραδικά κρούσματα
2. Προβληματισμοί Τι συμβαίνει με τα ζώα συντροφιάς στην Ελλάδα;;; Μπορεί να αποτελούν πηγή διασποράς στελεχών S. aureus/mrsa???? Ο κίνδυνος εμφάνισης λοίμωξης στους φορείς S. aureus είναι 24 φορές μεγαλύτερος σε σχέση με τους μη-φορείς Συνεργασία με την Κτηνιατρική Σχολή ΑΠΘ και την Κλινική Ζώων Συντροφιάς
Τι συμβαίνει στα ζώα συντροφιάς; Επιδημία το 1988 από γάτα σε οίκο ευγηρίας. Το 1994 αίτιο λοιμώξεων σε σκύλους Διασπορά σε ανθρώπους και κτηνιάτρους Κλώνοι ανθρώπινης προέλευσης Γερμανία HA-MRSA κλώνος ST22-IV Σπάνια κλώνοι ζωικής Γαλλία CC398 Χρήση αντιβιοτικών
Φαινότυποι αντοχής στα αντιμικροβιακά: 60 S. aureus
30 40 50 60 70 80 90 100 Δενδρόγραμμα αντιπροσωπευτικών προτύπων ζωνών της PFGE των απομονωμένων στελεχών S. aureus και των αντίστοιχων τύπων MLST και spa Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] COMPANION ANIMALS COMPANION ANIMALS 48.1 44.3 61.1 90.9 93.8 P14H P18H P86N P96H P100H P52N DOG DOG DOG DOG DOG CAT B D Q Q M M 109 254 8 8 88 88 t034 t094 t5559 t034 t2049 t629 60 στελέχη:16 MRSA (26.7%), 12 mecα (+), 4 mecc(+) 15 διαφορετικοί τύποι 57.8 P14N DOG U 15 t034 38.3 100 P44H P49H DOG DOG U U 15 15 t011 t011 83.8 94.1 C4 P13N HUMAN DOG C C 80 80 t044 t053 38.2 77.6 96.8 C15 C17 C5 HUMAN HUMAN HUMAN C C C 80 80 80 t5559 t114 t053 Παλαιοί και νέοι τύποι 33.5 54.5 100 P98H P99N P78N DOG DOG DOG S S Z 45 45 80 t094 t7558 t5559 58.8 88 P79N P88N DOG DOG Y Y 102 102 t240 t018 29.7 40.8 90.9 P89N C16 P13S DOG HUMAN DOG X A A 8 30 30 t5559 t095 t094 48 92.9 P75H P97H DOG DOG V V 328 109 t2516 t7558 33.6 39 91.7 P79H C3 P77H DOG HUMAN DOG T G G 80 15 15 t094 t5559 t5559 C8 HUMAN W 15 t094
Μοριακή διερεύνηση: καθορισμός κλώνων 13 STs 7 CCs 20 ST80 13 ST15 MRSA: ST80-IV: 5/16 (31.3%), meca, 4 Tet ST398-XI: 4/16 (25%), mecc, 2 Tet MSSA: ST80: 15/44 (34%), 6 Tet ST15: 11/44 (25%), 1 MDR 2 Fus 2 Kan spa types: t5559 (9 στελέχη)/ t7558 (10 στελέχη)
Γενετική ομοιογένεια στελεχών PVL(+): 30/44 MSSA (68.2%) και 8/16 MRSA (50%)
Ταυτοποίηση και μοριακός χαρακτηρισμός στελεχών S. aureus που απομονώθηκαν από άτομα του κτηνιατρικού προσωπικού και των κατοικιδίων ζώων τους Στέλεχος Είδος Γένος S. aureus Α/Μ MRSA meca mecc MLST PFGE spa PVL Ομοιότητα C14 Άνθρωπος Θ A - - - - - - - - - P32 Σκύλος Α A - - - - - - - - - C16 Άνθρωπος Θ Θ Α A A A ST30 A t095 Θ - P94 Σκύλος Α A - - - - - - - - - C17 Άνθρωπος Α Θ Α A A A ST80 C t114 Θ - P102 Σκύλος Θ A - - - - - - - - - C18 Άνθρωπος Θ A - - - - - - - - - P103 Γάτα Α A - - - - - - - - - C15 Άνθρωπος Θ Θ Α A A A ST80 C t5559 Θ Μη P74 Σκύλος Α Θ Μ A A A ST15 U t7558 A συσχετιζόμενα Θ Α A A A ST328 V t053 A
Ποια είναι τα συμπεράσματα; PVL-θετικοί S. aureus έχουν αποικίσει και σπανιότερα αποτελούν αίτιο λοιμώξεων στα κατοικίδια, με αρκετά ανθεκτικά στα αντιμικροβιακά στελέχη. Η πλειονότητα των PVL-θετικών στελεχών και στα ζώα συντροφιάς ανήκει στον κλώνο ST80 (agr3/pfge-c). Tα ζώα έχουν αποικιστεί με στελέχη ανθρώπινης προέλευσης. Η μετάδοση γίνεται κυρίως στο περιβάλλον της Κλινικής
3. Προβληματισμοί: Αγοράκι 6 ετών με επανειλημμένες λοιμώξεις δέρματος (δοθιήνες). Λήψη δείγματος από τις βλάβες Λήψη δειγμάτων από ρώθωνες και φάρυγγα του παιδιού Έλεγχος φορείας S. aureus και στα μέλη της οικογένειας: μητέρα, πατέρας, μεγαλύτερη αδελφή.
Αποτελέσματα καλλιεργειών: Από το αγόρι απομονώθηκε από τις βλάβες και το ρινικό S. aureus, cefoxitin-ευαίσθητος και ανθεκτικός σε fusidic acid, mupirocin (MIC>1024 mg/l), penicillin. Οι καλλιέργειες φορείας ήταν αρνητικές για τη μητέρα και θετικές από τον πατέρα και τη μεγαλύτερη αδερφή Τα στελέχη είχαν τον ίδιο φαινότυπο αντοχής στα αντιμικροβιακά.
Γενετική ανάλυση στελεχών: PCR για γονίδια τοξινών, agr typing, fusb, mupa. PFGE, MLST Όλα τα στελέχη ήταν fusb και mupa-θετικά Όλα τα στελέχη έφεραν τα γονίδια της PVL Όλα τα στελέχη ανήκαν στον τύπο agriv
PFGE: type MSSA1. MLST: ST121 Ερωτήσεις: 1. Ήταν απαραίτητη η PFGE?? 2. Ήταν απαραίτητη η MLST?? 3. Πώς θα αντιμετωπίσετε τα περιστατικά;; 4. Χρειάζεται θεραπεία εκρίζωσης;;
Livestock-associated MRSA: LA-MRSA 1972 και 1975: μαστίτιδα σε ζώα (Βέλγιο) Εκτροφεία παραγωγικών ζώων (φάρμες) στην Κ. Ευρώπη Μη τυποποιήσιμα με PFGE (SmaI) Ανήκουν στο σύμπλοκο CC398, CC9 (Ασία), ST49, CC97 με MLST Διαφορετικοί τύποι SCCmec (mecc) Πολυανθεκτικά σε μεγάλο εύρος αντιβιοτικών Η πλειονότητα των στελεχών δεν φέρει γονίδια τοξινών Μετάδοση σε εκτροφείς και κτηνιάτρους
PFGE S. aureus: SmaI MWM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 MWM Kb 485.0 388.0 291.0 242.5 194.0 145.5 97.0 A A A A B B B B C C C C E E E E F F F F G G G G PVL-θετικά?
ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ CO-HA-MRSA, HA-MRSA, CΑ-MRSA ανθρωπονόσος ΚΟΙΝΟΤΗΤΑ LA-MRSA Ζώα-διατροφική αλυσίδα ζωονόσος
Συμπεράσματα O S. aureus εξελίσσεται συνεχώς! Υπάρχει κλωνική διασπορά των MRSA! Μετάδοση ανθρώπινων κλώνων (ST80) σε ζώα συντροφιάς Ανάδυση νέων κλώνων στα παραγωγικά ζώα (ST398) Επιλογή ανθεκτικού πληθυσμού S. aureus υπό την πίεση των αντιβιοτικών? Ανάδυση ή μετάδοση των ζωικής προέλευσης στελεχών στους ανθρώπους Άγνωστο το ποσοστό φορείας στα ζώα αποθηκευτικοί ξενιστές;;
4. Προβληματισμοί: Οι πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι έχουν αναδειχθεί ως σημαντικό αίτιο λοιμώξεων, ιδιαίτερα σε ειδικές κατηγορίες ασθενών: Ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς Πρόωρα Ασθενείς που φέρουν προσθετικά υλικά (ενδαγγειακοί καθετήρες, καθετήρες παροχέτευσης, βηματοδότες, ορθοπεδικά εμφυτεύματα )
ΔΥΝΗΤΙΚΑ ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ CNS S. epidermidis ---------- S. haemolyticus -------- S. lugdunensis ---------- S. saprophyticus ------- Τραύματα, ενδονοσοκομειακές λοιμώξεις (προσθετικά υλικά) Φυσικές βαλβίδες καρδιάς, 2 ο αίτιο ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων (προσθετικά υλικά) Ενδοκαρδίτιδα, λοιμώξεις δέρματος/ μαλακών μορίων Λοιμώξεις ουροποιητικού S. hominis -----------------Βακτηριαιμία, πνευμονία + S. capitis, S. warneri, S. caprae, S. cohnii, S. schleiferi, S. pasteurii, S. xylosus
BIOFILM Οργανωμένη κοινότητα μικροβίων, που είναι προσκολλημένα σε μία επιφάνεια και περιβάλλονται από ένα εξωκυττάριο στρώμα που παρέχει προστασία. Αποτελεί προσομοίωση μικρής πόλης, όπου τα βακτηριακά κύτταρα, μήκους 1-2 μm, σχηματίζουν πύργους >100 μm. Οι δρόμοι ανάμεσα στους πύργους είναι σαν υγρά κανάλια, που μεταφέρουν θρεπτικά συστατικά για την διατήρηση της κοινότητας.
Βακτηριαιμίες ΠΓΝΠ: έξαρση στη Μονάδα Νεογνών-προώρων, ΜΕΝΝ;;
168 S. epidermidis 58 S. haemolyticus 100 Βακτηριαιμίες (BSIs) 126 Λοιμώξεις προσθετικών υλικών (PDAIs) Προσθετικά υλικά S. epidermidis S. haemolyticus Σύνολο Περιφερικοί καθετήρες 33 15 48 Υποκλείδιοι 25 7 32 Ορθοπεδικά υλικά 21 1 22 Περιτοναϊκοί καθετήρες 6-6 Καθετήρες παροχέτευσης 1 5 6 Ομφαλικοί καθετήρες 3-3 Σφαγιτιδικοί καθετήρες 2 1 3 Βηματοδότες 2-2 Νεφρολογικοί καθετήρες 1-1 Σπιράλ 1-1 Billau 1-1 Ουροκαθετήρες 1-1 97 29 126
Χαρακτηρισμός κλώνων S. epidermidis S. epidermidis μεγάλη γενετική ποικιλομορφία 67 PFGE τύποι 2 κύριοι κλώνοι a και b (51,2 % του πληθυσμού)
Τρεις κύριοι Sequence Types (STs) ST2 --- PFGE type a (50 στελέχη) ST5, ST16 --- PFGE type b (36 στελέχη)
S. epidermidis PFGE τύποι Τύπος a N= 50 (%) Τύπος b N= 36 (%) P-value Παραγωγή biofilm 22 (44) 18 (50) 0.663 ica 46 (92) 26 (72.2) 0.019 100 80 60 40 80 26 70 50 ica(+) ica(-) 20 0 biofilm(+) biofilm(-) Τα biofilm(+) στελέχη φέρουν συχνότερα το οπερόνιο ica (P=0.007)
ΦΟΡΕΙΑ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΡΟΣΚΟΛΛΗΤΙΝΩΝ PFGE τύποι Τύπος a N= 50 (%) S. epidermidis Τύπος b N= 36 (%) P-value aap 22 (44) 24 (66.7) 0.049 atle 46 (92) 36 (100) 0.136 fbe 44 (88) 33 (91.7) 0.729 bap 11 (22) 10 (27.8) 0.614 fnba 19 (38) 13 (36.1) 1.000
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η πλειοψηφία των στελεχών S. epidermidis ήταν ανθεκτικά στην methicillin (MR-CNS) και πολυανθεκτικά. Η παραγωγή biofilm στα στελέχη S. epidermidis σχετίζεται με την φορεία του οπερονίου ica. Διαπιστώθηκε κλωνική διασπορά στη ΜΕΝΝ με την επικράτηση δύο κύριων PFGE τύπων στα στελέχη S. epidermidis που αποτελούσαν το 51.2% του συνολικού πληθυσμού. Ο κύριος τύπος a ταυτοποιήθηκε ως ST2 με MLST, ενώ τα στελέχη του τύπου b ανήκαν στους τύπους ST5 και ST16. Στον πληθυσμό S. epidermidis, τα στελέχη του τύπου a έδειξαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στα αντιμικροβιακά, ενώ τα στελέχη του τύπου b έφεραν συχνότερα το γονίδιο aap.
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Επιδημιολογικές μελέτες σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων περιορισμένης έκτασης μπορούν να βασισθούν σε μεθόδους PCR και PFGE Η PFGE έχει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα Σύγκριση με διεθνή δεδομένα και ευρείες μελέτες (σε εθνικό επίπεδο) βασίζονται σε αναλύσεις αλληλουχίας του γονιδιώματος
Ε. Δρούγκα Α. Φωκά Ν. Γιορμέζης Φ. Κολονίτσιου Ε. Λεμπέση Α. Δουδουλακάκης Ε. Πετεινάκη Ε.Δ. Αναστασίου Και όλους τους συναδέλφους που έχουμε συνεργαστεί και μας έχουν βοηθήσει στη συλλογή των στελεχών!!!