Tabelul 1. Enzime utilizate în calitate de markeri în timpul fracționării țesuturilor/celulelor Componenta Marker Componenta Marker Nucleu

2. Purificarea și caracterizarea enzimelor 2.1. Alegerea sursei enzimatice Enzimele sunt catalizatori biochimici responsabili pentru metabolismul celular. Din acest motiv celulele din diferite surse au fost, sunt și continuă să fie o sursă principală pentru enzime. Acești catalizatori naturali pot fi produși de către orice organism și pot fi extrași din celule sau exsudatele celulare. Din punct de vedere al localizării acestora, enzimele se clasifică în două categorii: - enzime solubilizate în diferite lichide biologice (sânge, urină, lichid cerebrospinal, lichid interstițial, lichid seminal, salivă, citoplasmă, mediu de cultură al microorganismelor etc); - enzime fixate pe diverse structuri tisulare și subcelulare Majoritatea enzimelor se găsește în mai multe organite subcelulare, țesuturi, organe și respectiv lichide biologice. Există însă și enzime localizate exclusiv într-o formațiune subcelulară - enzime indicator (marker). Principalele enzime indicator sunt prezentate în tabelul 1. Tabelul 1. Enzime utilizate în calitate de markeri în timpul fracționării țesuturilor/celulelor Componenta Marker Componenta Marker Nucleu ADN polimeraza ARN polimeraza NAD pirofosforilaza Peroxizomi Peroxidaza Membrana celulară Mitocondria Lizozomi Citozol 5 -nucleotidaza Leucin-aminopeptidaza Fosfodiesteraza alcalină ATP-aza (Mg 2+ ) Nucleotid trifosfataza Adenilat ciclaza Succinat dehidrogenaza Citocrom oxidaza Glutamat dehidrogenaza Monoaminoxidaza Citocrom c oxidoreductaza Fosfataza acidă Aril-sulfataza c Fosfodiesteraza II β-glucuronidaza Aldolaza Fosfoglucomutaza Hexokinaza Glioxizomii Corpii Golgi Cloroplaste Reticulul endoplasmatic Catalaza Oxidaza acidului uric Glicolat oxidaza Glioxilat reductaza UDP galactoza:n-acetil glucozamin galactozil transferaza Sialil transferaza Ribuloz difosfat carboxilaza 6-Glucoz-fosfataza NADPH-citocrom c reductaza Țesuturile plantelor și organele animalelor au constituit cele mai importante surse de enzime (aproximativ 70%) la începutul biotehnologiei enzimatice. Treptat majoritatea enzimelor industriale au fost produse folosind surse microbiene. În zilele noastre enzimele din plante și animale, majoritatea proteaze, sunt prezente pe piață și se disting prin importanța comercială. Catalaza din ficat; lipaza, chimotripsina și tripsina din pancreas; renina din stomacul vițeilor sunt cele mai relevante enzime animale folosite în industria alimentară, farmaceutică sau pielăriei. Enzimele derivate din plante, papaina și bromelaina, sunt de asemenea importante din punct de vedere industrial. Papaina, una din cele mai utilizate enzime, izolată din latexul de papaya, este des folosită la frăgezirea cărnii, limpezirea berii, îndepărtarea petelor și în componența cosmeticelor sau produselor medicale (sub formă purificată). 1

Enzimele microbiene, produse prin fermentație în condiții controlate, constituie o opțiune în industrie. Sușele microbiene nu pot produce numai enzimele proprii codate de informația genetică pe care o dețin ci și enzime produse prin expresia genelor străine sub forma unor proteine recombinate. Unele enzime (cum ar fi glicoenzimele) nu pot fi produse la fel de ușor în microorganisme și din acest motiv se apelează în acest caz la culturi de celule vegetale sau animale. În prezent există mai multe modalități de cultivare a microorganismelor, în fermentatoare de diverse tipuri, în funcţie de microorganismul selectat. Majoritatea enzimelor microbiene sunt produse în medii de cultură lichide în condiții controlate. Se pot obține enzime și prin cultivarea microorganismelor filamentare pe medii solide (creștere pe suprafață). Prin fermentația pe mediu solid se pot obține enzime ieftine (pentru degradarea lignocelulozei, amilaze, proteaze, fitaze). Cea mai tradițională formă de fermentație lichidă este aceea care se realizează în bioreactoare în care a fost introdus în prealabil mediu de cultură. După sterilizarea mediului de cultură și acomodarea incintei la temperatura propice pentru dezvoltarea microorganismelor se inoculează o precultură. Microorgansimele introduse se vor dezvolta până la stagiul în care se produce o cantitate maximă de enzimă. Ulterior celulele sunt distruse pentru a extrage enzima (dacă aceasta este intracelulară) sau sunt separate de mediul de cultură și faza lichidă rezultată conține enzima de interes (pentru enzimele extracelulare). Unele enzime sunt intracelulare într-un organism și extracelulare în altul. De exemplu, invertaza este în mare parte intracelulară în Saccharomyces, iar în Candida și Streptomyces este secretată în mediu de cultură. β-galactozidaza este o enzimă extracelulară în mucegaiuri și intracelulară în drojdie. Enzimele intracelulare pot fi transformate în enzime extracelulare prin inginerie genetică și ingineria proteinelor. Activitatea specifică (unități enzimă/unități masă microorganism) este un parametru important în producerea enzimelor prin fermentație. O activitate specifică mare nu reduce doar costul fermentației ci și costurile unor operații preliminare. O creștere semnificativă a activității specifice poate fi realizată prin alegerea adecvată a mediului de cultură pentru cultivarea microorganismelor și optimizarea unor parametri de operare (temperatura, ph, agitare și rată de aerare / nivelul de oxigen dizolvat). Stabilitatea genetică și siguranța producerii sușei microbiene constituie aspecte relevante care trebuie luate în considerare în cazul producerii enzimelor. Un caz particular este producerea enzimelor recombinante datorită instabilității structurale și segregaționiste a vectorului folosit în clonare. În funcție de aplicația enzimei trebuie să fie aleasă sușa considerată sigură pentru acea aplicație. 2.2. Prepararea unui extract enzimatic Majoritatea enzimelor intracelulare sunt localizate în citoplasmă și obținerea acestora presupune ruperea sau permeabilizarea celulei. Metodele dedicate recuperării enzimelor intracelulare se pot divide în metode care produc ruptura celulară prin forțe mecanice și cele care induc permeabilizarea celulară prin distrugerea membranelor. Ruperea membranelor celulare se poate realiza prin: a) ultrasonicare; b) omogenizarea la presiuni ridicate; c) folosirea ciclurilor înghețare-dezghețare; d) distrugerea enzimatică a membranei celulare. 2

Ultrasonicarea este o tehnică populară pentru distrugerea celulară a unor cantități reduse de celule (de obicei rezultate din 1-8 L de cultură celulară). Celulele sunt distruse prin cavitație (ADN-ul celular suferă o serie de modificări în timpul sonicării). Una din problemele principale este aceea de a controla temperatura. Pentru cantități mici de celule (care sunt suspendate în primă instanță într-o soluție tampon) suspensia este menținută pe gheață și se aplică pulsuri de scurtă durată (5-10 secunde) cu pauze (10-30 secunde) pentru a micșora temperatura extractului. Pentru cantități celulare care depășesc 50 g metoda este mai puțin recomandată deoarece temperatura este mai greu de menținut (datorită folosirii unei forțe de sonicare mai mare) și din acest motiv sunt necesari timpi de răcire mai lungi. Omogenizatoarele la presiuni înalte Omogenizatoarele sunt aparatele cele mai frecvent folosite pentru distrugerea bacteriilor. Acestea presurizează suspensia celulară după care rapid descresc presiunea. Astfel rezultă un lichid de forfecare capabil să realizeze distrugerea membranelor celulare. Presiunile de operare pentru sistemele clasice, presa franceză și omogenizatorul de tip Manton-Gaulin, sunt de 6000-10,000 psi. De obicei sunt necesare 2-3 cicluri de operare pentru a avea o eficiență maximă de distrugere a membranelor. Operarea la presiuni mari are dezavantajul creșterii temperaturii. Din acest motiv celulele presurizate sunt în prealabil răcite (4 C). În plus, alături de controlul temperaturii măsuri suplimentare trebuie luate pentru a evita inactivarea enzimelor datorită spumării extractului. Folosirea ciclurilor înghețare-dezghețare O metodă alternativă constă în înghețarea directă a celulele în azot lichid și mojararea (într-un recipient care a fost în prealabil răcit în aceleași condiții) celulelor înghețate pentru a obține o pudră. Solidul rezultat poate fi stocat la -80 0 C pe o perioadă extrem de mare și lizatul celular poate fi preparat prin suspendarea pudrei într-un volum de circa 5 ori de soluție tampon. Operația de înghețare-dezghețare se poate repeta de 2-3 ori, iar la final suspensia obținută este supusă centrifugării, iar supernatantul (faza lichidă) rezultat este folosit în următoarele etape (de purificare, caracterizare sau determinarea activității enzimatice). Distrugerea enzimatică a membranei celulare Liza enzimatică constă în clivarea stratului peptido-glicanic al celulei bacteriene de către lizozimă. Bacteriile gram-negative posedă o membrană externă care trebuie permeabilizată pentru a putea accesa stratul peptido-glicanic. Tris, unul din cele mai folosite sisteme tampon pentru liza celulară, are capacitatea de a permeabiliza membrana externă. Acest efect poate fi potențat de folosirea unui agent de chelatare (EDTA 1 mm). Acest agent complexează ionii de Mg 2+ care stabilizează membranele. În decursul lizei celulare se eliberează o cantitate importantă de ADN care induce o creștere a vâscozității extractului. Din acest motiv se pot folosi si ADN-aze (1 g/ml). Liza enzimatică nu este rentabilă la scară mare datorită costurilor ridicate pe care le au enzimele utilizate. În această situație este preferată sonicarea. 2.3. Metode de concentrare / separare fizică a enzimelor Agenți de precipitare ai enzimelor Daca enzimele fibroase sunt aproape insolubile în apă, celelalte enzime (solubile) pot fi precipitate în soluții cu concentrații mari de sare (sulfat de amoniu sau de sodiu) 3

sau în prezența solvenților organici. Solubilitatea este determinată atât de forțele care țin moleculele grupate în stare solidă cât și de interacțiunile cu moleculele solventului sărurile sau alte molecule de solvent. Enzimele au în general grupări încărcate pozitiv sau negativ la suprafață. În situația în care sarcinile pozitive (negative) predomină în molecula unei enzime, particulele vor exercita forțe de repulsie fapt care va permite menținerea moleculelor în soluție. Oricum, în vecinătatea punctului izoelectric (pi), phul la care sarcina netă totală este zero, solubilitatea enzimelor este minimă. ph-ul unui extract (țesut) poate fi ajustat la pi corespunzător enzimei de interes, fapt care va permite precipitarea moleculelor care posedă un pi asemănător. Precipitatul poate fi colectat prin centrifugare și redizolvat într-o cantitate minimă de soluție tampon. Concentrațiile mici de sare determină în general o creștere a solubilității enzimelor deoarece ionii sărurilor interacționează cu grupările încărcate de pe suprafața enzimelor și interferă cu forțele dintre acestea (din precipitat). Unele săruri (CaCl2 si NaSCN) interacționează cu enzimele și contribuie astfel la solubilizarea acestora. Folosirea unei concentrații mari de sare determină precipitarea majorității enzimelor în soluții apoase (ionii sării interacționează mai puternic decât enzimele cu solventul fapt care va determina interacțiuni electrostatice enzimă-enzimă). Enzimele sunt adesea stabilizate la concentrații mici ale alcoolilor sau cetonelor, la concentrații mari ale polihidroxialcoolilor (glicerina) sau zaharozei și în prezenta unor polimeri sintetici (polietilen glicol, PEG, de obicei cu grad de polimerizare între 2000 și 20000). Ultimii sunt adesea utilizați drept agenți de precipitare datorită tendinței mărite de hidratare. A. Precipitarea cu sulfat de amoniu Sulfatul de amoniu este una dintre sărurile cele mai des utilizate datorită eficienței sale de precipitare, a domeniului de ph utilizat, solubilității mari și a prețului redus. Precipitarea cu sulfat de amoniu este una dintre etapele premergătoare cromatografiei de excludere sau dializei. Dat fiind faptul că majoritatea enzimelor precipită la o concentrație de sulfat de amoniu de 55%, o precipitare maximă se obține la o concentrație de sare de circa 80-85%. Există și proteine (S-100, proteină cu masă moleculară mică ce leagă ioni de calciu) care nu pot fi precipitate la concentrații mari de sulfat de amoniu. Tehnica poate fi folosită la stabilizarea enzimelor în soluție sau la îndepărtarea acizilor nucleici din extractul inițial. B. Precipitarea cu solvenți organici Solvenții organici (acetona, etanolul) au efecte similare cu cele ale sărurilor (sulfatului de amoniu). Dat fiind faptul că enzimele pot fi denaturate la temperaturi mai mari de 10 0 C (datorită flexibilității structurii polipeptidelor moleculele de solvent organic pătrund în interiorul enzimei și se atașează la catena laterală a aminoacizilor hidrofobi) precipitarea cu solvenți organici trebuie efectuată la temperaturi mici (0-5 0 C). Creșterea concentrației unui solvent organic miscibil cu apa într-o soluție apoasă care conține enzima de interes (hidrofilă) schimbă puterea de solvatare a apei. Enzimele cu mase moleculare mari (> 10 20 KDa) precipită în soluții care conțin 50% solvent organic. Este cunoscut faptul că moleculele de enzimă ce posedă o masă moleculară mare necesită o concentrație mai mică de solvent organic. Deoarece acetona este utilizată în procente mai mici și prezintă o volatilitate mai mare acest solvent este preferat la temperaturi mai mici. 4

Dializa și ultrafiltrarea Îndepărtarea sărurilor (sau solvenților organici) din extractele enzimatice precipitate se poate realiza prin dializă. În cadrul dializei se folosesc membrane semipermeabile (celuloza, celofan sau colodion) care au dimensiunea porilor mai mică (1-10 nm) decât a enzimelor și permit difuzia sărurilor sau a altor molecule de dimensiuni mici. Soluția de extract enzimatic este introdusă într-un sac de dializă (sac ai cărui pereți sunt reprezentați de către membrana semipermeabilă) închis la ambele capete. Sacii de dializă trebuie tratați în prealabil (fierbere timp de 30 min într-o soluție de concentrație 10 mm de bicarbonat de sodiu ce conține 1 mm EDTA urmată de clătire cu apă distilată) pentru îndepărtarea contaminanților (ionii metalelor grele etc) ce rămân în membrană în timpul procesului de fabricație. Sacul de dializă este introdus într-un recipient care conține o soluție tampon de concentrație mică. Porii membranelor au dimensiuni mai mici decât ai enzimelor din soluția aflată în sacul de dializă, permițând trecerea prin difuzie a moleculelor cu mase moleculare mici (săruri, peptide, ioni metalici, cofactori legați necovalent). Echilibru se stabilește în cel puțin 4 ore. De obicei, dializa se repetă de încă 3-4 ori timp de 4 ore în scopul schimbării totale a mediului în care se află enzima. Tăria ionică a soluției din recipientul în care se realizează dializa se poate verifica cu ajutorul unui conductometru. Ultrafiltrarea permite separarea macromoleculelor pe baza dimensiunilor, formei sau încărcării acestora. Sub acțiunea forțelor externe soluția supusă separării trece printro membrană. Aceste membrane (acetat de celuloză, nylon, poliviniliden) sunt atașate pe un suport inert și permit înlocuirea soluției tampon sau clarificarea soluției enzimei (de exemplu membrana de 0,45 µm folosită la sterilizarea soluțiilor utilizate în biologia moleculară sau a probelor care sunt sensibile la temperatură). Tehnica este de obicei mai rapidă (2-3 ore) decât dializa. Pentru separarea volumelor mari se folosesc incinte de 100, 250 sau 1000 ml prevăzute cu membrane rezistente la presiune (concentratoare, Figura 1). Sub acțiunea presiunii gazului (azot, argon) moleculele mai mici trec prin membrană iar cele mari rămân în incintă. N 2 (presiune) Solutia de proteina supusa concentrarii Sticla sinterizata Magnet pentru agitare Membrana Agitator magnetic Ultrafiltrat Figura 1. Reprezentarea schematică a ultrafiltrării, procedeu utilizat la concentrarea unui extract (50-500 ml) ce conține enzima de interes 5

Centrifugarea Centrifugarea este o metodă folosită atât pentru prepararea probelor cât și analiza acestora. Metoda are la bază separarea moleculelor sub acțiunea unor forțe (rezultate la rotirea probei cu viteze mari). Deplasarea moleculelor depinde de mărimea, forma și densitatea macromoleculelor sau a soluției în care se află acestea. Principiul metodei Particulele din soluție/suspensie sunt supuse forței centrifuge, F, definită prin ecuația următoare: unde: F = m 2 r m masa efectivă a particulei; viteza unghiulară de rotație (rad/s); r distanța particulei de la axa centrală de rotație. Masa efectivă a particulei este definită astfel: m = m 0 m 0 v unde: m0 masa actuală a particulei; v volumul specific parțial modificarea de volum ce intervine când particula este aflată într-un volum mare de solvent densitatea solventului (mediului). Combinând primele două ecuații se obține următoarea dependență: F = m 0 (1 v ) 2 r Forța centrifugă este contracarată de o altă forță numită forță de frecare (Ff) definită astfel: Ff = fv unde: f = coeficientul de frecare (depinde de mărimea și forma particulei sau de vâscozitatea solventului); v = viteza de sedimentare a particulei. Forța de frecare crește cu viteza de sedimentare a particulei pănă la o valoare constantă, moment în care cele două forțe (F si Ff) se echilibrează. m 0 (1 v ) 2 r = fv = f dr dt Din această relație se poate deduce viteza de sedimentare: v = s = dr dt v 2 r = = m 0 (1 v ) 2 r f Coeficientul de sedimentare, s, o caracteristică fizică utilizată pentru clasificarea macromoleculelor și organitelor celulare este dat de expresia: m 0 (1 v ) f 6

Unitatea de măsură utilizată pentru coeficienții de sedimentare este Svedbergul (1S = 1 10-13 s). Dacă hemoglobina umană are coeficientul de sedimentare 4,5 S, complecșii biologici (ribozomul, virușii) sunt caracterizați de valori mari ale acestui coeficient (Figura 2). Figura 2. Reprezentarea schematică a coeficienților de sedimentare a biomoleculelor (proteinelor, acizilor nucleici, polizaharurilor) sau organitelor celulare în funcție de densitate Cele mai frecvent dispozitive destinate centrifugării operează până la viteze de rotație de 6000 rpm și sunt prevăzute cu un sistem de ajustare a temperaturii (între 4 C și temperatura camerei). Aceste centrifuge sunt destinate sedimentării particulelor mai mari (nucleu, perete celular de alte organite) sau celulelor roșii. În urma acestui proces se formează doua faze distincte: faza solidă se află la partea inferioară a tubului și faza lichidă (supernatantul) ce poate fi îndepărtată prin centrifugare sau cu ajutorul unei pompe de vid (de exemplu în cazul precipitării cu acid tricloroacetic sau sulfat de amoniu enzimele se colectează sub forma de solid în urma operației de centrifugare). Ultracentrifugarea Dacă centrifugarea la viteze mici și medii este folosită în special în scopuri preparative, ultracentrifugele (centrifuge care operează la temperaturi mici și la presiune joasă) pot fi folosite și în scopuri analitice. O ultracentrifugă este un dispozitiv capabil să genereze forțe de rotație mari. Astfel, unui rotor (dispozitivul pentru tuburi) i se poate imprima o viteză de până la 65.000 rpm (rotații pe minut) valoare care corespunde cu 300.000 g (g-accelerația gravitațională). Aceste dispozitive pot fi folosite la sedimentarea organitelor mai ușoare (ribozomi). În aceste condiții macromoleculele au tendința de a sedimenta datorită densității mai mari a acestora comparativ cu cea a soluției (pentru enzime se folosesc în general soluții tampon). O ultracentrifugă poate fi folosită pentru determinarea valorii Mr pe baza vitezei de sedimentare sau a echilibrului de sedimentare. Ultracentrifugele analitice moderne 7

sunt prevăzute cu un sistem de monitorizare (măsurare a absorbanței sau a indicelui de refracție) al sedimentarii în decursul centrifugării. Viteza de sedimentare Ultracentrifuga este folosită la viteze mari pentru generarea unor forțe de centrifugare suficient de intense pentru a sedimenta unele organite celulare sau complecși macromoleculari (Figura 3). Figura 3. Reprezentarea schematică a centrifugării diferențiale care permite separarea organitelor celulare Sedimentarea unei enzime poate fi monitorizată la o anumită lungime de undă (280 nm) și astfel poate fi determinat coeficientul de sedimentare, s. Acest coeficient este măsura vitezei de sedimentare dintr-o unitate de câmp gravitațional. Masa moleculară a enzimei poate fi calculată cu formula: RTs M r = unde: R - constanta a gazelor; T - temperatura D (1-v ) v - volumul specific parțial; D - coeficient de difuzie - densitatea soluției. Echilibru de sedimentare Daca viteza rotorului nu este suficient de mare pentru o sedimentare completă după un timp se stabilește un echilibru în care tendința unei macromolecule de a sedimenta este in balanță cu tendința de difuzie a particulei. Masa moleculară a enzimei poate fi calculată pe baza relației: 2RT dlnc unde: M r = c - concentrația macromoleculei; (1-v ) 2 dr 2 r distanța parcursă de macromoleculă în tub; - viteza unghiulară (rad/s). 8