ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΒΕΝΘΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΣΤΑΣΗ ΑΠΟ ΚΛΩΒΟΥΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ

9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΤΗΣ ΒΕΝΘΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑΣ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΣΤΑΣΗ ΑΠΟ ΚΛΩΒΟΥΣ ΙΧΘΥΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Φοδελιανάκης Σ., Παπαγεωργίου Ν., Λαδουκάκης Ε., Καρακάσης Ι. Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, sfodel@edu.biology.uoc.gr,, bio755@edu.biology.uoc.gr,, ladoukakis@biology.uoc.gr, karakassis@biology.uoc.gr Περίληψη Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της μεταβολής της σύστασης της βενθικής μικροβιακής βιοκοινότητας εξαιτίας της επίδρασης της ιχθυοκαλλιέργειας με χρήση της ηλεκτροφόρησης σε διαβάθμιση αποδιατακτικών μέσων σε πήκτωμα πολυακριλαμίδης (Detergent Gradient Gel Electrophoresis ή DGGE). Αρχικά έγινε εξαγωγή ολικού DNA από δείγματα ιζήματος του ανώτερου στρώματος (0-5 cm) σε συγκεκριμένες αποστάσεις από κλωβούς ιχθυοκαλλιέργειας από δύο διαφορετικές τοποθεσίες. Ακολούθησε PCR με γενικούς (universal) βακτηριακούς εκκινητές και nested PCR με άλλο ζεύγος εσωτερικών γενικών εκκινητών. Τα προϊόντα διαχωρίστηκαν με βάση την αλληλουχία τους μέσω DGEE έτσι ώστε να εκτιμηθεί η μικροβιακή βιοποικιλότητα του κάθε δείγματος. Τα πρώτα αποτελέσματα της μεθόδου, δείχνουν ότι η μικροβιακή βιοποικιλότητα μεταβάλλεται με την απόσταση του δείγματος από τον κλωβό της ιχθυοκαλλιέργειας. Τα πρότυπα μεταβολής της βενθικής μικροβιακής ποικιλότητας φαίνεται επίσης να εξαρτώνται και από το ρυθμό του οργανικού εμπλουτισμού από την ιχθυοκαλλιέργεια. Λέξεις κλειδιά: DGGE, υδατοκαλλιέργεια, περιβαλλοντική μικροβιολογία. BENTHIC MICROBIAL DIVERSITY CHANGE WITH DISTANCE FROM FISH FARMS Fodelianakis S., Papageorgiou N., Ladoukakis.E., Karakasis I. Biology Department, University of Crete, sfodel@edu.biology.uoc.gr, bio755@edu.biology.uoc.gr, ladoukakis@biology.uoc.gr, karakassis@biology.uoc.gr Abstract In the present study we examined the effect of aquaculture on the microbial benthic community. Sediment samples were collected from different distances from the fish cages in two different aquaculture sites. Total DNA was extracted from sediments of the upper layer (0-5cm) and PCR was performed using universal bacterial primers. A nested PCR followed using universal internal bacterial primers and the products were separated according to their nucleotide sequence by Detergent Gradient Gel Electrophoresis (DGEE). Preliminary results show that microbial diversity is affected by aquaculture. The pattern of microbial diversity change also seems to depend on the density of organic loading from the fish farm. Keywords: DGGE, aquacultures, environmental microbiology. 1. Εισαγωγή Αρκετές μελέτες έχουν δημοσιευθεί οι οποίες αφορούν στις επιπτώσεις που έχει η επιβάρυνση του θαλάσσιου περιβάλλοντος εξαιτίας οργανικού εμπλουτισμού στη σύνθεση και τα χαρακτηριστικά βενθικών βιοκοινοτήτων όπως η μακροβενθική (Pearson & Rosenberg, 1978), συνθέτοντας ένα συγκεκριμένο πρότυπο διαδοχής κατά μήκος της διαβάθμισης του οργανικού φορτίου. Οι μεταβολές αυτές αφορούν στη διάρθρωση της μακροπανιδικής βιοκοινωνίας, στη μεταβολή των επιπέδων βιομάζας, αφθονίας και ποικιλότητας και σε κάποιες περιπτώσεις στην πλήρη απουσία μακροπανίδας. Τόσο ο τύπος του υποστρώματος όσο και τα υδρολογικά και γεωμορφολογικά χαρακτηριστικά της κάθε περιοχής, καθώς και ο βαθμός επιβάρυνσης του θαλάσσιου περιβάλλοντος καθορίζουν το βαθμό της επίδρασης στις βενθικές βιοκοινότητες. Λίγα είναι γνωστά για τις επιπτώσεις των διαφόρων τύπων οργανικού εμπλουτισμού στις θαλάσσιες μικροβιακές βενθικές βιοκοινότητες. Αυτού του είδους οι βιοκοινότητες αποτελούν ένα -1113-

9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ πολύ σημαντικό τμήμα του υδάτινου οικοσυστήματος, αφού ένα αρκετά μεγάλο ποσοστό της πρωτογενούς παραγωγής στηρίζεται στη φωτοσυνθετική δραστηριότητα των προκαρυωτικών οργανισμών. Επίσης πολυάριθμες μικροβιακές ομάδες κατέχουν θέσεις-κλειδιά σε σημαντικούς κύκλους θρεπτικών όπως αυτούς του άνθρακα, του αζώτου, του σιδήρου και του θείου (Brock Biology of Microorganisms, 2003). Μια τυπική περίπτωση επιβάρυνσης του θαλάσσιου περιβάλλοντος λόγω οργανικού εμπλουτισμού αποτελούν οι κλωβοί ιχθυοκαλλιεργειών. Η επίδραση της ιχθυοκαλλιέργειας στη μικροβιακή ποικιλότητα αποτελεί ένα ταχέως αναπτυσσόμενο επιστημονικό πεδίο στο οποίο έχουν επιστρατευθεί μοριακές τεχνικές (Brandon et al., 2007; Bissett et al., 2006; Bissett et al. 2007; Girvan et al., 2005; Kawahara et al., 2009; Vezzulli et al., 2002). Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της ποικιλότητας της μικροβιακής βενθικής βιοκοινότητας σε σχέση με την απόσταση από την θέση ιχθυοκαλλιέργειας, μέσω της μεθόδου Ηλεκτροφόρησης σε Διαβάθμιση Αποδιατακτικών μέσων σε Πήκτωμα Πολυακριλαμίδης (Detergent Gradient Gel Electrophoresis ή DGGE) (Muyzer et al., 1993). 2. Υλικά και Μέθοδοι Τα δείγματα βυθού τα οποία μελετήθηκαν προέρχονταν από δύο διαφορετικά ιχθυοτροφεία σε θέσεις που είχαν διαφορετικά χαρακτηριστικά (τύπο υποστρώματος, βάθος κλωβών, ρεύματα, ρυθμός λειτουργίας σταθμού). Συγκεκριμένα, η πρώτη περιοχή που επιλέχθηκε βρίσκεται στη θαλάσσια περιοχή του Σουνίου στις νότιες ακτές της Αττικής. Η δεύτερη βρίσκεται στη βορειοανατολική Κρήτη κοντά στη Μονή Τοπλού στο νομό Λασιθίου. Οι δειγματοληψίες έγιναν κατά τη θερινή περίοδο του 2006. Για κάθε ένα από τα δύο ιχθυοτροφεία έγινε δειγματοληψία σε τέσσερις διαφορετικές θέσεις οι οποίες απείχαν 0, 5, 10 και 25 μέτρα από έναν τυχαίο κλωβό κατά τη φορά των ρευμάτων της περιοχής. Επίσης προστέθηκε κι ένα δείγμα ελέγχου από μια θέση που δεν επηρεάζεται από τους κλωβούς και βρίσκεται αρκετά μακριά από αυτούς. Σε κάθε θέση συλλέχθηκαν 5 δείγματα από το ανώτερο στρώμα του ιζήματος, ένα για κάθε ένα από τα πρώτα 5 cm του ιζήματος. Για κάθε ιχθυοτροφείο η δειγματοληψία έγινε σε τρεις διαφορετικούς κλωβούς για να υπάρχουν τρεις επαναλήψεις για κάθε περιοχή. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν στην επιφάνεια με τη βοήθεια ενός ειδικά προσαρμοσμένου μεταφορέα δειγμάτων (adapted core-carrier) και καταψύχθηκαν αμέσως μετά τη συλλογή τους. Η εξαγωγή του ολικού DNA από τα δείγματα του ιζήματος έγινε με το Ultra Clean Soil DNA Extraction kit (ΜΟΒΙΟ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μήκος, η ποιότητα και η ποσότητα του εξαχθέντος DNA ελέγχθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% w/v. Για όλα τα δείγματα υπήρχε επαρκής συγκέντρωση (>100ng/λ) καλής ποιότητας μεγαλομοριακού DNA. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την αρχική αντίδραση PCR ήταν οι παρακάτω: 27f: 5 - AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3 1492r: 5 -ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3 Οι εκκινητές, οι συνθήκες της αντίδρασης και οι συγκεντρώσεις των αντιδραστηρίων ήταν σύμφωνα με τους Webster et al. 2006, ενώ η ποσότητα του μητρικού DNA διαφοροποιούταν ανάλογα το δείγμα. Για τις ανάγκες της μεθόδου (Muyzer et al., 1993) ήταν απαραίτητος ο πολλαπλασιασμός μικρότερου τμήματος από τον ίδιο γενετικό τόπο, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα 1μl από το προϊόν της πρώτης αντίδρασης αραιωμένο 1/100. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι παρακάτω: GC357f: 5 CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGGGGGGCGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 3 518r: 5 ATTACCGCGGCTGCTGG-3-1114-

9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Οι εκκινητές, οι συνθήκες της αντίδρασης και οι κύκλοι ήταν σύμφωνα με τους Webster et al. 2006. Το προϊόν της Nested PCR αντίδρασης, το οποίο ουσιαστικά αποτελεί μείγμα πολλών διαφορετικών σε αλληλουχία, αλλά όμοιων σε μήκος κομματιών DNA, ηλεκτροφορήθηκε σε υδρόπηγμα πολυακριλαμίδης με διαβάθμιση συγκέντρωσης αποδιατακτικών μέσων ουρίας και φορμαμίδιου (DGGE) προκειμένου να διαχωριστούν τα διαφορετικής αλληλουχίας προϊόντα. Το υδρόπηγμα εμβαπτιζόταν σε SybrGold για 15-30 λεπτά και φωτογραφίζονταν με κάμερα με το κατάλληλο φίλτρο κάτω από λάμπα UV. Τέλος οι ζώνες της φωτογραφίας καταμετρούνταν με το μάτι και τα δεδομένα υπό τη μορφή παρουσίας/απουσίας ζωνών αναλύονταν στατιστικά με το πρόγραμμα Primer. Οι συνθήκες/αντιδραστήρια αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 1: Συνθήκες και αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για το DGGE. Ακρυλαμίδη Buffer Θερμ/σία Διαβάθμιση [UF] Χρόνος/Τάση 37.5:1 TAE 60 C 40-60% 18h/80V Loading buffer Product loaded Staining method Promega Green 20λ SybrGold 3. Αποτελέσματα Αρχικά πολλαπλασιάσαμε με PCR και προσπαθήσαμε να αναλύσουμε μέσω της μεθόδου DGGE ένα μεγάλο τμήμα του γενετικού τόπου 12S rdna μήκους ~1.5kb. Κάτι τέτοιο όμως, όπως αποδείχθηκε, υπερβαίνει τις αναλυτικές ικανότητες της μεθόδου η οποία λειτουργεί καλύτερα με μικρά τμήματα DNA. Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως μητρικό DNA το αρχικό προϊόν PCR (μήκους 1.5kb) κι ένα ζεύγος εσωτερικών εκκινητών. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται nested PCR. Με αυτήν πολλαπλασιάστηκε ένα τμήμα 198bp του αρχικού γενετικού τόπου. Αυτό το προϊόν χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί με DGGE. Σημαντικό ρόλο για τον επιτυχή διαχωρισμό των προϊόντων της PCR φάνηκε να παίζει το loading buffer. Όταν χρησιμοποιήθηκε το βιβλιογραφικά προτεινόμενο loading buffer (Bromophenol Blue), τα αποτελέσματα στην απεικόνιση των πηκτωμάτων DGGE δεν ήταν ικανοποιητικά, με τις ζώνες να φαίνονται πολύ αχνές και ο θόρυβος (background noise) να είναι πολύ μεγάλος. Στις επόμενες προσπάθειες, αντικαθιστώντας το διάλυμα φόρτωσης με Promega Green, ο διαχωρισμός των ζωνών ήταν αρκετά ικανοποιητικός. Μια τυπική φωτογραφία DGGE για τα δυο ιχθυοτροφεία παρουσιάζεται στην Εικόνα 1. -1115-

9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Εικ. 1: Φωτογραφία DGGE για τα δείγματα από τα δύο ιχθυοτροφεία. Αναγράφονται η προέλευση του κάθε δείγματος όπως και η απόστασή του από τον κλωβό. Το C αντιστοιχεί στα δείγματα ελέγχου για κάθε ιχθυοτροφείο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1 υπάρχει αρκετά μεγάλος αριθμός ζωνών σε κάθε ένα από τα δείγματα, γεγονός που δείχνει ότι οι μικροβιακές βιοκοινότητες είναι πλούσιες,διότι με βάση την αρχή της μεθόδου, όσο περισσότερες ζώνες εμφανίζονται σε ένα δείγμα τόσο πιο πλούσια είναι η βιοκοινωνία. Παράλληλα παρατηρούνται διαφορετικές ζώνες στα δείγματα από τα δύο ιχθυοτροφεία. Με βάση τη στατιστική ανάλυση MDS, η οποία πραγματοποιήθηκε από τα δεδομένα των φωτογραφιών υπό μορφή μήτρας παρουσίας/απουσίας ζωνών, οι δύο περιοχές δειγματοληψίας διαφοροποιούνται μεταξύ τους (Εικ. 2). Εικ. 2: MDS δύο διαστάσεων για τα δεδομένα από την ανάλυση DGGE των δειγμάτων των δύο ιχθυοτροφείων υπό τη μορφή παρουσίας/απουσίας ζωνών. Με St συμβολίζονται τα δείγματα από τη Σητεία ενώ με Sn αυτά από το Σούνιο. Σε σχέση με την απόσταση των δειγματοληπτικών θέσεων από τον κλωβό η εικόνα διαφέρει στα δύο ιχθυοτροφεία. Στο Σούνιο φαίνεται ότι η ιχθυοκαλλιέργεια επηρεάζει τη μικροβιακή βιοκοινότητα σε κοντινές αποστάσεις από τον κλωβό (0, 5 και 10 μέτρα), ενώ αντίθετα σε απόσταση 25 μέτρων το δείγμα ομοιάζει περισσότερο με το control. Στη Σητεία αντίθετα φαίνεται το control ότι -1116-

9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ βρίσκεται σε μεγαλύτερη διαφοροποίηση σε σχέση με όλα τα δείγματα που λήφθηκαν στα πρώτα 25 μέτρα από τον κλωβό. 4. Συζήτηση Στην παρούσα εργασία το εύρος της διαβάθμισης των αποδιατακτικών μέσων επιλέχθηκε να είναι από 40-60% w/v ακρυλαμίδης όπου διαπιστώθηκε ο καλύτερος διαχωρισμός και απεικόνιση των προϊόντων. Στις βιβλιογραφικές αναφορές χρησιμοποιείται είτε μεγαλύτερη διαφορά στη διαβάθμιση των μέσων αυτών (20-80% [Bissett et al., 2006]) είτε μικρότερη (45-60% [Brandon et al., 2007]). Επίσης διαπιστώθηκε ότι το ευρέως χρησιμοποιούμενο διάλυμα φόρτωσης (BPhB) δεν απέδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα στην παρούσα εργασία. Αντίθετα, το διάλυμα φόρτωσης Promega Green έδωσε καθαρές εικόνες με μικρό θόρυβο. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν επιλέχτηκαν βιβλιογραφικά. Οι εκκινητές αυτοί, όταν συγκριθούν με βακτηριακές βάσεις δεδομένων (Brandon et al., 2007; Webster et al., 2006) παρουσιάζουν ποσοστό ομολογίας μεγαλύτερο του 98%. Πολλαπλασιάζουν δηλαδή με επιτυχία τμήμα του 12SrDNA βακτηριακού γενετικού τόπου για παραπάνω από το 98% των βακτηριακών τάξων. Σε πραγματικούς πληθυσμούς όμως δεν πολλαπλασιάζεται το 98% των βακτηριακών τάξων αλλά σημαντικά λιγότερα. Αυτό συμβαίνει διότι η PCR είναι μια αντίδραση που εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από τις αρχικές αναλογίες των υποστρωμάτων εφόσον ο πολλαπλασιασμός γίνεται εκθετικά (Polz et al., 1998). Δηλαδή με την PCR θα πολλαπλασιαστούν κυρίως τα πιο αντιπροσωπευτικά βακτηριακά τάξα. Έτσι, οι αλλαγές στη δομή μιας μικροβιακής βιοκοινότητας που είναι παρατηρήσιμες με τη χρήση της μεθόδου αυτής αποτελούν πολύ σημαντικές αλλαγές διότι αλλάζουν οι συσχετισμοί των κυρίαρχων μικροβιακών ταξινομικών ομάδων, οι οποίες επηρεάζουν σε πολύ μεγάλο βαθμό τη λειτουργία όλης της βιοκοινότητας (Bissett et al. 2007). Τα πρώτα αποτελέσματα από την παρούσα έρευνα δείχνουν ότι η ιχθυοκαλλιέργεια επηρεάζει σημαντικά τη δομή της μικροβιακής βιοκοινότητας, όπως έχει ήδη παρατηρηθεί και στο παρελθόν (Bissett et al., 2006; Bissett et al., 2007; Girvan et al., 2005; Kawahara et al., 2009). Η παρατηρούμενη αύξηση των ζωνών στην ανάλυση DGGE ακριβώς κάτω από τους κλωβούς σε σχέση με το δείγμα ελέγχου αρχικά θα θεωρούνταν μη αναμενόμενη λόγω των απότομων αλλαγών στις οποίες υπόκειται ο βυθός εκεί. Εντούτοις, οι αλλαγές αυτές φαίνεται να αυξάνουν τον αριθμό των βακτηριακών τάξων τα οποία γίνονται επικρατή/κυρίαρχα. Μια κοινώς αποδεκτή θεωρία για την εξήγηση του φαινομένου αυτού είναι ότι η συσσώρευση του οργανικού άνθρακα που φτάνει στο υπόστρωμα σε μορφή σωματιδίων από τους κλωβούς δημιουργεί νέους οικολογικούς θώκους οι οποίοι καταλαμβάνονται τυχαία από οπορτουνιστικά βακτηριακά είδη (Bissett et al., 2007). Ο ρυθμός με τον οποίο συσσωρεύεται ο οργανικός άνθρακας θα καθορίσει ουσιαστικά το αν τα προϋπάρχοντα είδη θα συνυπάρξουν με τα οπορτουνιστικά ή αν σε αρκετά υψηλούς ρυθμούς συσσώρευσης- τα οπορτουνιστικά είδη θα παραγκωνίσουν τα προϋπάρχοντα. Στην ανάλυση που πραγματοποιήσαμε μέσω DGGE το μέτρο εκτίμησης των βακτηριακών ειδών που προϋπήρχαν είναι τα δείγματα ελέγχου. Όσον αφορά το ιχθυοτροφείο της Σητείας φαίνεται ξεκάθαρα από τη φωτογραφία ότι υπάρχει μια ομάδα ζωνών -οι κατώτερες- οι οποίες ενώ υπάρχουν στο δείγμα ελέγχου απουσιάζουν από το δείγμα ακριβώς κάτω από τον κλωβό. Παράλληλα, μια άλλη ομάδα ζωνών οι ανώτερες- απουσιάζει από το δείγμα ελέγχου ενώ υπάρχει σε όλα τα ενδιάμεσα δείγματα αλλά και στο μηδενικό. Με βάση τα παραπάνω λοιπόν θα περιμέναμε ο ρυθμός συσσώρευσης του οργανικού άνθρακα στο ιχθυοτροφείο αυτό να είναι αρκετά υψηλός, αφού φαίνεται ξεκάθαρα μια τάση αντικατάστασης των προϋπαρχόντων βακτηριακών τάξων από τα οπορτουνιστικά όσο πλησιάζουμε προς τον κλωβό. Κάτι τέτοιο όντως ισχύει, αφού γνωρίζουμε ότι το συγκεκριμένο ιχθυοτροφείο λειτουργούσε εντατικά και τα ρεύματα δεν ήταν ισχυρά. Έτσι -1117-

9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ ο ρυθμός συσσώρευσης οργανικού άνθρακα κάτω από τον κλωβό έφτανε σε πολύ υψηλά επίπεδα λόγω μηδαμινής εξάπλωσης. Για τα δείγματα από το ιχθυοτροφείο του Σουνίου κάτι τέτοιο δεν παρατηρείται. Πρακτικά όλες οι ζώνες που υπάρχουν στο δείγμα ελέγχου και αποτελούν τα προϋπάρχοντα βακτήρια υπάρχουν και σε όλα τα άλλα δείγματα, ακόμη και στο δείγμα ακριβώς κάτω από τον κλωβό. Παράλληλα, υπάρχει μια ομάδα ζωνών οι ανώτερες- η οποία δεν υπάρχει στο δείγμα ελέγχου και στο δείγμα σε απόσταση 25 μέτρων από τον κλωβό αλλά υπάρχει στα τρία κοντινότερα στον κλωβό δείγματα. Προφανώς η ομάδα αυτή απαρτίζεται από οπορτουνιστικά βακτήρια τα οποία ευνοούνται από τον οργανικό εμπλουτισμό. Στην περίπτωση του Σουνίου λοιπόν θα περίμενε κανείς ο ρυθμός του οργανικού εμπλουτισμού να είναι μικρότερος αφού δεν υπάρχει αντικατάσταση τάξων αλλά συνύπαρξη. Κάτι τέτοιο ισχύει εφόσον ο σταθμός αυτός δε λειτουργεί τόσο εντατικά όσο ο αντίστοιχος της Σητείας. Τέλος στην περιοχή επικρατούν ρεύματα τα οποία συμβάλλουν στην εξάπλωση του οργανικού άνθρακα σε μεγαλύτερη επιφάνεια, μειώνοντας έτσι τον ρυθμό συσσώρευσής του κάτω από τον κλωβό. Πρέπει να επισημανθεί ότι η παρούσα έρευνα βρίσκεται σε αρχικά στάδια. Βρισκόμαστε στην πορεία μελέτης μεγαλύτερου αριθμού δειγμάτων και ιχθυοκαλλιεργητικών θέσεων έτσι ώστε να τεκμηριωθεί ασφαλέστερα η ορθότητα των παρατηρήσεων αυτής της εργασίας καθώς και η συσχέτιση των μετρήσεων της μικροβιακής ποικιλότητας με άλλες βιογεωχημικές μεταβλητές. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Pearson, T.H. & Rutger Rosenberg, 1978, Macrobenthic succession in relation to organic enrichment and pollution of the marine environment, Oceanogr. Mar. Biol. Ann. Rev, 16:229-311. Madigan, M.T., Martinko, J.M. & Parker, J., 2003.Brock Biology of Microorganisms/ Tenth Edition, Pearson Education Inc., 614-632 pp.yoza, B. A., Harada, R. M., Nihous, G. C., Li, Q. X., Masutani, S. M., 2007. Impact of mariculture on microbial diversity in sediments near open ocean farming of Polydactylus sexfilis, Ecological Indicators 7 108 122. Bissett, A., Bowman, J, & Burke, C., 2006 Bacterial diversity in organically-enriched fish farm sediments, FEMS Microbiol Ecol 55 48 56. Bissett, A., Burke, C., Cook, P. L.M. & Bowman, J. P., 2007. Bacterial community shifts in organically perturbed sediments, Environmental Microbiology 9(1), 46-60. Girvan, M.S., Campbell, C.D., Killham, K., Prosser, J.I. & Glover, L.A., 2005 Bacterial diversity promotes community stability and functional resilience after perturbation, Environmental Microbiology 7(3), 301-313. Kawahara. N., Shigematsu, K., Miyadai,T. & Kondo,R., 2009. Comparison of bacterial communities in fish farm sediments along an organic enriched gradient, Aquaculture 287 107-113. Vezzulli, L., Chelossi, E., Riccardi, C. & Fabiano, M., 2002. Bacterial community structure and activity in fish farm sediments of the Ligurian Sea (Western Mediterranean), Aquaculture International 10: 123-141. Muyzer, G., De Waal, E. C. & Uitterlinden, A. G., 1993. Profiling of Complex Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rrna, Applied And Environmental Microbiology, P. 695-700, Vol. 59, No. 3. Webster G., Parkes, R. J., Cragg, B. A., Newberry, C. J., Weightman1, A. J. & Fry, J. C., 2006. Prokaryotic community composition and biogeochemical processes in deep subseafloor sediments from the Peru Margin, FEMS Microbiol Ecol 58 65 85. Polz, M.F. & Cavanaugh, C. M., 1998. Bias in Template-to-Product Ratios in Multitemplate PCR, Applied and Environmental Microbiology, p. 3724-3730, Vol. 64, No. 10. -1118-