Έκφραση των CTGF και TNFa στα κυψελιδικά μακροφάγα ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση προ και μετά θεραπείας με αζαθειοπρίνη και ιντερφερόνη-γ-1b

Transcript

1 Πρωτότυπη Εργασία Έκφραση των CTGF και TNFa στα κυψελιδικά μακροφάγα ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση προ και μετά θεραπείας με αζαθειοπρίνη και ιντερφερόνη-γ-1b Aρετή Ξυφτέρη 1, Φώτης Δρακοπαναγιωτάκης 1, Aργύρης Tζουβελέκης 4, Eυάγγελος Tσιάμπας 2, Aνδρέας Kαραμέρης 2, Kατερίνα Tσακανίκα 3, Βλάσης Πολυχρονόπουλος 1, Δημοσθένης Μπούρος η Πνευμονολογική Κλινική, Σισμανόγλειο ΓΝΑ, Αθήνα, Αττική 2 Παθολογοανατομικό Τμήμα Νοσοκομείο 417 NIMTΣ 3 Μονάδα Βρογχοκυψελιδικού Εκπλύματος, Σισμανόγλειο ΓΝΑ, Αθήνα, Αττική 4 Πνευμονολογική Κλινική Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αλεξανδρούπολης Λέξεις- Κλειδιά: - ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση, - αζαθειοπρίνη, - ιντερφερόνη-γ-1b, - βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BALF), - CTGF, - TNFα, - κυψελιδικά μακροφάγα Αλληλογραφία: Δημοσθένης Μπούρος Καθηγητής Πνευμονολογίας Πνευμονολογική Κλινική Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αλεξανδρούπολης Αλεξανδρούπολη Tel./Fax: douros@med.duth.gr Περiληψη Η Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση (ΙΠΙ) είναι μια πνευμονική νόσος, αγνώστου αιτιολογίας, με κακή πρόγνωση, για την οποία δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία. Έχει αναφερθεί ότι ο αυξητικός παράγων του συνδετικού ιστού (CTGF) και ο παράγων νέκρωσης όγκων -άλφα (TNFα) συμμετέχουν σημαντικά στην παθογένεια της νόσου. Ο ρόλος των κυψελιδικών μακροφάγων στην έκφραση των κυτταροκινών αυτών παραμένει αδιευκρίνιστος. Υλικό & Μέθοδος: Τα δείγματα του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (BALF) ελήφθησαν από 20 νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ΙΠΙ προ και μετά από εξάμηνη θεραπεία είτε με ιντερφερόνη (IFN-γ-1b) και πρεδνιζολόνη (n=10 ασθενείς) ή με αζαθειοπρίνη (AZA) και πρεδνιζολόνη (n=10 ασθενείς). Επίσης δείγματα BALF από 10 φυσιολογικά άτομα (ομάδα μαρτύρων) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης των CTGF και TNFα στα κυψελιδικά μακροφάγα. Επιπλέον έγινε αξιολόγηση της επίδρασης των θεραπειών αυτών στις εξετάσεις πνευμονικής λειτουργίας (FEV 1, FVC, DLCO), και στα αέρια αίματος (PaO 2 και PaCO 2) των ασθενών με ΙΠΙ. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκε μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης του CTGF στους ασθενείς με ΙΠΙ συγκριτικά με την ομάδα μαρτύρων (p=0.001). Η έκφραση του TNFα σε ασθενείς με ΙΠΙ δεν διέφερε από την ομάδα των φυσιολογικών ατόμων. Καμία από τις θεραπείες δεν επηρέασε την πρωτεϊνική έκφραση των παραγόντων αυτών, ούτε τις παραμέτρους της πνευμονικής λειτουργίας. Συμπέρασμα: Τα ευρήματα της μελέτης υποδηλώνουν ότι τα κυψελιδικά μακροφάγα δεν είναι η κύρια πηγή των παραγόντων CTGF και TNFα στην ΙΠΙ. Επιπλέον, φάνηκε ότι η θεραπευτική παρέμβαση με AZA ή με IFN-γ-1b δεν είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική αλλαγή της πρωτεϊνικής έκφρασης των παραγόντων αυτών. Πνεύμων 2011, 24(2):

2 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 2ο, Τόμος 24ος, Απρίλιος - Ιούνιος ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ΙΠΙ είναι η πιο συχνή ιδιοπαθής διάμεση πνευμονοπάθεια η οποία οδηγεί σε αναπνευστική ανεπάρκεια και θάνατο, με ένα μέσο προσδόκιμο επιβίωσης 2,5 3,5 ετών 1,2. Παθολογοανατομικά η νόσος χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό ινοβλαστών, εναπόθεση εξωκυττάριας ουσίας και προοδευτικό σχηματισμό ουλώδους ιστού στον πνεύμονα 3. Για πολλά χρόνια θεωρείτο ότι η ΙΠΙ οφείλεται σε μη ελεγχόμενη δημιουργία ουλώδους ιστού, σαν αποτέλεσμα εμμένουσας φλεγμονής. Παρόλα αυτά νέες σημαντικές θεωρίες προέκυψαν από πρόσφατες μελέτες που δείχνουν ότι η επαναλαμβανόμενη βλάβη του κυψελιδικού επιθηλίου και των παρόντων μακροφάγων οδηγεί στην υπερέκφραση των προϊνωτικών κυτταροκινών και των αυξητικών παραγόντων, ανεξαρτήτως της φλεγμονής, οδηγώντας σε ίνωση 4,5. Διάφοροι μηχανισμοί έχουν ενοχοποιηθεί για τη δημιουργία της ίνωσης συμπεριλαμβανομένων των κυτταροκινών, των αυξητικών παραγόντων, των χημειοκινών και των διαμεσολαβητών απόπτωσης 6. Ο CTGF είναι ένας αυξητικός και χημειοτακτικός παράγων των ινοβλαστών, ο οποίος έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε διάφορες ινωτικές παθήσεις των πνευμόνων, του παγκρέατος και των νεφρών και επιδρά στην ενεργοποίηση του μετατρεπτικού αυξητικού παράγοντα β (TGFβ), μεσολαβώντας σε προïνωτικές δραστηριότητες 7. Έχει βρεθεί αυξημένος στον πνευμονικό ιστό ασθενών με ΙΠΙ και έχει εντοπισθεί κυρίως στα κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα τύπου II και στους ενεργοποιημένους ινοβλάστες 8. Ο παράγων TNFα είναι μια σημαντική κυτταροκίνη, που είναι γνωστό ότι αυξάνεται στην ΙΠΙ και επάγει τη φλεγμονή και περιορισμένου βαθμού ίνωση 2,9. Παράγεται κυρίως από μονοκύτταρα/μακροφάγα και λεμφοκύτταρα. Είναι μια κυτταροκίνη πρώιμης απάντησης που συμμετέχει στην εξέλιξη του καταρράκτη των ινωτικών και προφλεγμονωδών κυτταροκινών 10. Είναι γνωστό ότι επάγει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών μέσω της δράσης του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων, αλλά επίσης αναστέλλει την επαγόμενη από τον TGFβ παραγωγή των ινοβλαστών από τα προκολλαγόνα τύπου I και τύπου III 11. Ο TNFα μπορεί να ενεργοποιήσει αλλά και να αναστείλει την εξέλιξη της πνευμονικής ίνωσης 12. Αυξημένη έκφραση του TNFα έχει βρεθεί σε μοντέλα ζώων που πάσχουν από τη νόσο αυτή 11. Όσον αφορά στη θεραπεία της ΙΠΙ, έπειτα από τα απογοητευτικά αποτελέσματα των κορτικοστεροειδών, ανοσοκατασταλτικοί παράγοντες, όπως η αζαθειοπρίνη και αντιϊνωτικοί παράγοντες όπως η ιντερφερόνη, η οποία επίσης έχει αντί-πολλαπλασιαστικές και ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες, έχουν προταθεί Παρόλα αυτά, η νόσος δεν απαντά στη θεραπεία και κανένα φάρμακο δεν έχει αποδειχθεί αποτελεσματικό 17. Έτσι η μόνη θεραπεία σήμερα που μπορεί να παρατείνει το προσδόκιμο επιβίωσης είναι η μεταμόσχευση πνεύμονα 18,19. Τα μακροφάγα είναι μια σημαντική πηγή κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων που εμπλέκονται στην ΙΠΙ. Τα κυψελιδικά μακροφάγα (AM) παρουσιάζουν δύο πολωμένους φαινότυπους, τα M 1 και M 2 κυψελιδικά μακροφάγα, τα οποία μπορούν να ενεργοποιηθούν από τις T-helper 1 (Th1) και T-helper 2 (Th2) κυτταροκίνες αντίστοιχα 20,21. Οι Th2 κυτταροκίνες έχουν συσχετισθεί με την παθογένεια της ΙΠΙ 6,22,23. Τα M 1 μακροφάγα προωθούν τη διαμεσολαβούμενη από την IL-2 Th1 απάντηση και υπερπαράγουν φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως η IL-6 και ο TNFα, ενώ τα M 2 μακροφάγα υποστηρίζουν ένα ινωτικό μικροπεριβάλλον, εκκρίνοντας αυξητικούς παράγοντες όπως ο TGFβ και Th2 κυτταροκίνες, όπως η IL Επομένως, φαίνεται ότι τα μακροφάγα έχουν ένα σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΙΠΙ. Ο σκοπός της μελέτης ήταν να καθοριστεί ο ρόλος των κυψελιδικών μακροφάγων που ελήφθησαν από το BALF ασθενών με ΙΠΙ στην έκφραση του CTGF και του TNFα συγκριτικά με τα φυσιολογικά άτομα. Επίσης στόχος ήταν η αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της AZA έναντι της IFN-γ-1b σε αυτούς τους δείκτες στα κυψελιδικά μακροφάγα του BALF ασθενών με ΙΠΙ, όπως και στην πνευμονική λειτουργία και των αερίων αίματος. Υλικό Μέθοδος Στη μελέτη περιελήφθησαν 20 ασθενείς με πρωτοδιαγνωσθείσα ΙΠΙ. Η διάγνωση της ΙΠΙ τέθηκε με χειρουργική βιοψία πνεύμονος (ιστολογικό πρότυπο Συνήθους Διάμεσης Πνευμονοπάθειας) σε 9 ασθενείς και με τα κριτήρια σύμφωνα με τις θέσεις ομοφωνίας ATS/ERS (εκπλήρωση όλων των μειζόνων και 3 τουλάχιστον από τα ελάσσονα κριτήρια) σε 11 ασθενείς. Μείζονα κριτήρια: Αποκλεισμός διάγνωσης γνωστής αιτιολογίας διάμεσης πνευμονοπάθειας (τοξικότητα φαρμάκων, περιβαλλοντική έκθεση, αυτοάνοσο κολλαγονικό νόσημα), παθολογικές λειτουργικές αναπνευστικές δοκιμασίες με εικόνα περιοριστικού συνδρόμου και διαταραχή της ανταλλαγής αερίων (αύξηση κυψελιδοτριχοειδικής διαφοράς για το PaO 2 στην ηρεμία ή κατά την άσκηση, ευρήματα στην HRCT τυπικά της ΙΠΙ, BAL ή διαβρογχική βιοψία που δεν συνηγορούν υπέρ άλλης πνευμονικής νόσου. Ελάσσονα κριτήρια: ηλικία άνω των 50 ετών, βραδεία επιδείνωση δύσπνοιας στην άσκηση, διάρκεια νόσου μεγαλύτερης

3 144 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 2ο, Τόμος 24ος, Απρίλιος - Ιούνιος 2011 των 3 μηνών, αμφοτερόπλευροι εισπνευστικοί τρίζοντες ρόγχοι. Δέκα υγιή άτομα, 3 γυναίκες και 7 άνδρες, με μέσο όρο ηλικίας τα 61 έτη, οι οποίοι υπεβλήθησαν σε βρογχοσκόπηση και λήψη βογχοκυψελιδικού εκπλύματος λόγω βήχα, ιστορικού αιμόπτυσης ή βράγχους φωνής, περιελήφθησαν επίσης στη μελέτη ως ομάδα ελέγχου. 3 άτομα ήταν καπνιστές, 3 πρώην καπνιστές και 4 άτομα ήταν μη καπνιστές. Κανένα από τα άτομα της ομάδας ελέγχου δεν είχε χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, κακοήθη ή διάμεση πνευμονοπάθεια. Σχεδιασμός μελέτης Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Βιοηθικής του Σισμανογλείου Νοσοκομείου και οι συμμετέχοντες έδωσαν έγγραφη συγκατάθεση. Οι 20 ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν σε 2 ομάδες με βάση το θεραπευτικό σχήμα: η πρώτη ομάδα έλαβε συνδυασμό ιντερφερόνης-γ (200μg x 3/ wk sc) και κορτικοειδών (πρεδνιζολόνη 0,5mg/kg/d x 4wk 0.25/kg/d x 8wk 0.125/kg/d) ενώ η δεύτερη ομάδα έλαβε συνδυασμό αζαθειοπρίνης (150 mg/d po) και κορτικοειδών (πρεδνιζολόνη 0,5mg/kg/d x 4wk 0.25/ kg/d x 8wk 0.125/kg/d). Βρογχοκυψελιδικό έκλπυμα (BAL) Πραγματοποιήθηκε βρογχοσκόπηση και λήψη βρογχοκυψελιδικού εκλπύματος σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες 27,28 στους ασθενείς πριν την έναρξη και 6 μήνες μετά τη χορήγηση της θεραπείας. Τα άτομα της ομάδας ελέγχου, επίσης, υπεβλήθησαν σε βρογχοσκόπηση και λήψη βρογχοκυψελιδικού εκλπύματος. Βρογχοκυψελιδική έκλπυση πραγματοποιήθηκε στο μέσο λοβό ή τη γλωσσίδα, ανάλογα με τα ευρήματα της αξονικής τομογραφίας υψηλής ευκρίνειας. Έγινε έγχυση 60ml φυσιολογικού ορού μέσω του βρογχοσκοπίου και το έκπλυμα συλλέχθηκε με αναρρόφηση. Ο μέσος όγκος υγρού του βρογχοκυψελιδικού εκλπύματος ήταν 180ml. Τα κύτταρα διαχωρίστηκαν από το υγρό του βρογχοκυψελιδικού εκλπύματος με κυτταροφυγοκέντρηση στα 300g επί 5 λεπτά και εκπλύθηκαν 3 φορές με minimal essential medium (MEM) περιέχον 25Μm διάλυμα Hepes. Ο αριθμός των κυττάρων καθορίστηκε με τη χρήση πλάκας Neubauer και εκφράστηκε ως ο συνολικός αριθμός κυττάρων ανά ml αναρροφώμενου υγρού. Πραγματοποιήθηκαν χρώσεις May-Grunwald- Giemsa και Παπανικολάου και ο αριθμός των κυττάρων ποσοστικοποιήθηκε μετά τη μέτρηση 1000 κυττάρων. Λειτουργικές αναπνευστικές δοκιμασίες Πραγματοποιήθηκαν λειτουργικές αναπνευστικές δοκιμασίες (FEV 1, FVC, DLCO) και μετρήσεις του PaO 2 και PaCO 2 πριν την έναρξη και 6 μήνες μετά τη χορήγηση θεραπείας. Αντισώματα και ανοσοϊστοχημεία Επιλέχθηκαν και εφαρμόστηκαν για την ανοσοϊστοχημική χρώση τα αντισώματα: anti-ctgf goat polyclonal (L-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) σε αραίωση 1:100, και anti-tnfa mouse monoclonal (clone , Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) σε αραίωση 1:100. Τα πλακίδια με τα προς εξέταση δείγματα του BAL αρχικά εμποτίζονταν σε διάλυμα ακετόνης και στη συνέχεια εφαρμοζόταν η δοκιμασία EN Vision (DAKO, Denmark) assay με τη χρήση ενός αυτοματοποιημένου συστήματος χρώσης (I 6000 Biogenex, USA) και σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκεκριμένη δοκιμασία βασίζεται σε ένα διαλυτό σύστημα πολυμερούς δεξτράνης το οποίο εμποδίζει την ενδογενή αντίδραση βιοτίνης και ενισχύει την ποιότητα των χρωσμένων πλακιδίων. Εν συντομία, τα πλακίδια μετά την εξουδετέρωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης επωάζονταν με τον πρωτογενές αντίσωμα επί 30 έως 40 λεπτά ανάλογα με το αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάζονταν με Horseradish peroxidase labeled polymer-hrp LP επί 30 λεπτά. Η αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος γινόταν ορατή με τη χρήση του χρωμογόνου υποστρώματος 3-3 diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) ακολουθούσε επίστρωση των πλακιδίων με αιματοξυλίνη επί 30 δευτερόλεπτα, τα πλακίδια αφυδατώνονταν και καλύπτονταν με καλυπτρίδα. Στα πλακίδια αρνητικού ελέγχου τα πρωτογενή αντισώματα είχαν παραλειφθεί. Για τον CTGF αποδεκτή είναι η κυτταρομεμβρανική ανοσοχρώση, ενώ για τον TNFα είναι η υπομεμβρανική κυτταροπλασματική ανοσοχρώση. Υπολογιστική μορφομετρία Η ποσοτική μέτρηση των ανοσοχρωσμένων κυτταρικών χαρακτηριστικών πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή Ημιαυτόματου Συστήματος Ανάλυσης Εικόνας με τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: α) hardware: Intel Pentium IV, Sony Camera (resolution of 800x600), Μicroscope Olympus BX-50. Β) software: Windows XP/Image Pro Plus version 3.0-Media Cybernetics Η μέτρηση της πρωτεϊνικής έκφρασης των ανασοϊστοχημικών δεικτών πραγματοποιήθηκε σε 5 οπτικά πεδία υπό μεγέθυνση 400x. Η ψηφιοποιημένη εικόνα του μικροσκοπίου καταλάμβανε σταθερό πλαίσιο μέτρησης στην οθόνη του υπολογιστή («ενεργό κάδρο» - active window) εκτάσεως

4 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 2ο, Τόμος 24ος, Απρίλιος - Ιούνιος μm 2. Κάθε εικονοστοιχείο (pixel) λαμβάνει μια τιμή του χρωματικού φάσματος που αποτελεί τη συνισταμένη των βασικών χρωμάτων: κόκκινο, μπλε, πράσινο (RGB triple). Σε ένα εύρος τιμών οπτικής πυκνότητας από 0 (απόλυτο μαύρο) έως 255 (απόλυτο λευκό), μειωμένες τιμές προς το 0 συσχετίζονται με αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση, ενώ αυξημένες τιμές προς το 255 συσχετίζονται με μείωση της πρωτεϊνικής έκφρασης. Σύμφωνα με την προκατασκευασμένη μακροεντολή, όλα τα ανοσοχρωσμένα μακροφάγα (σε αποχρώσεις του καφέ λόγω χρωμογόνου DAB και με διάμετρο άνω των 15μm για τον αποκλεισμό λεμφοκυττάρων και ουδετεροφίλων) μετρήθηκαν σε κάθε περίπτωση στα αντίστοιχα οπτικά πεδία και ο τελικός αριθμός καταχωρήθηκε σε κάρτες αποτελεσμάτων (excel sheets) για στατιστική ανάλυση. Περιοχές έντονης κυτταροβρίθειας, περιέχουσες απομονωμένα μακροφάγα είτε αθροίσματα μακροφάγων, επιλέχθηκαν για μετρήσεις. Ημιαυτόματη κατάτμηση πραγματοποιήθηκε με τη διάσπαση των αθροισμάτων των μακροφάγων (Εικόνες 1, 2, 3, 4). α. TNFα από υγιές άτομο α. TNFα προ θεραπείας με IFN-γ-1b β. TNFα προ θεραπείας με AZA Εικόνα 3. Υπολογιστική Ανάλυση Εικόνας για μέτρηση TNFα των ανοσοχρωσμένων μακροφάγων από άτομο της ομάδας ελέγχου (α) και από ασθενή προ θεραπείας με αζαθειοπρίνη (AZA) (β). β. TNFα μετά θεραπεία με IFN-γ-1b α. CTGF από υγιές άτομο β. CTGF προ θεραπείας Εικόνα 4. Υπολογιστική Ανάλυση Εικόνας για μέτρηση TNFα των ανοσοχρωσμένων μακροφάγων από ασθενή προ θεραπείας με IFN-γ-1b (α) και από ασθενή μετά θεραπεία με IFN-γ-1b (β). Εικόνα 1. Υπολογιστική Ανάλυση Εικόνας για μέτρηση CTGF των ανοσοχρωσμένων μακροφάγων από άτομο της ομάδας ελέγχου (α) και από ασθενή πριν την έναρξη της θεραπείας (β). α. CTGF προ θεραπείας με IFN-γ β. CTGF μετά από θεραπεία με IFN-γ Στατιστική ανάλυση Οι τιμές υπολογιστικής μορφομετρίας εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερά απόκλιση (±SD). Σύγκριση μεταξύ των ομάδων ως προς τις αρχικές τιμές (πριν την έναρξη της θεραπείας) πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία t-test είτε x 2 test. Οι μεταβολές του CTGF και TNFα, προ και μετά θεραπεία, αξιολογήθηκαν με τη δοκιμασία student s paired t-statistic. Η επίδραση της θεραπείας στις τιμές των λειτουργικών αναπνευστικών δοκιμασιών και των αερίων αίματος εξετάσθηκε με ανάλυση μεικτών μοντέλων. Ως στατιστικά σημαντικές διαφορές θεωρήθηκαν αυτές με p<0,05. Εικόνα 2. Υπολογιστική Ανάλυση Εικόνας για μέτρηση CTGF των ανοσοχρωσμένων για CTGF μακροφάγων από ασθενή πριν την έναρξη της θεραπείας (α) και από ασθενή μετά από θεραπεία με ιντερφερόνη (β). Αποτελέσματα Δεν υπήρξε διαφορά μεταξύ των 2 ομάδων ασθενών όσον αφορά το ύψος, το φύλο και το ιστορικό καπνίσματος. Επιπλέον, οι ασθενείς των 2 ομάδων είχαν παρόμοιες

5 146 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 2ο, Τόμος 24ος, Απρίλιος - Ιούνιος 2011 τιμές FEV 1, FVC, DLCO και PaCO 2, κατά την εισαγωγή τους στη μελέτη, ενώ υπήρχε στατιστική διαφορά ως προς το PaO 2 όπου η ομάδα αζαθειοπρίνης είχε χαμηλότερη μέση τιμή PaO 2 σε σχέση με την ομάδα ιντερφερόνης. Ωστόσο κανένας από τους ασθενείς δεν παρουσίαζε αναπνευστική ανεπάρκεια. Τα δημογραφικά στοιχεία των ασθενών φαίνονται στον Πίνακα 1. Τα αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικής χρώσης έδειξαν ότι η έκφραση του CTGF στα μακροφάγα του BAL των ασθενών με ΙΠΙ ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους υγιείς (Πίνακας 2). Επιπρόσθετα, δεν υπήρχε Πίνακας 1. Δημογραφικά στοιχεία, ιστορικό καπνίσματος και παράμετροι αναπνευστικής λειτουργίας των ασθενών κατά την εισαγωγή στη μελέτη Mέση ηλικία (έτη) Φύλο (άνδρες/γυκαίκες) Κάπνισμα ομάδα IFN-γ-1b 67.9 ± 5.8 Ομάδα AZA 71.6 ± 6.3 3/7 6/4 Καπνιστές 1 1 Πρώην καπνιστές 3 5 Μη καπνιστές 6 4 FVC (%pred) 74.0 ± 19.0 FEV 1 (%pred) 81.3 ± 19.9 DLCO (%pred) 47.7 ±36.8 (n=8) PaO 2 (mmhg)* 79.9 ± 8.7 PaCO 2 (mmhg)* 39.7 ± ± ± ± 17.8 (n=8) 65.7 ± ± 4.2 p-value** Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερή απόκλιση, και ηλικία ως μέσος όρος ηλικίας *Αναπνέοντας ατμοσφαιρικό αέρα (FiO 2 21%), **p<0.05: στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα διαφορά μεταξύ των 2 θεραπευτικών ομάδων πριν και μετά τη θεραπεία, ως προς την έκφραση του CTGF και του TNFα (Πίνακας 3). Τα αποτελέσματα φαίνονται επίσης στα ραβδογραφήματα (Εικόνες 5, 6), όπου οι υψηλές τιμές χρωστικής πυκνότητας σχετίζονται με μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση των CTGF και TNFα. Οι παράμετροι ελέγχου αναπνευστικής λειτουργίας παρέμειναν σταθερές πριν και μετά τη θεραπεία και στις 2 θεραπευτικές ομάδες (Πίνακας 4). Τελικά, η μελέτη έδειξε μειωμένη έκφραση του CTGF στα μακροφάγα του BAL των ασθενών με ΙΠΙ, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, χωρίς μεταβολή μετά από θεραπεία με ιντερφερόνη ή αζαθειοπρίνη. Δεν διαπιστώθηκε διαφορά στην έκφραση του TNFα μεταξύ των ασθενών και της ομάδας ελέγχου και μεταξύ των 2 ομάδων ασθενών πριν και μετά τη θεραπεία. Η στατιστική ανάλυση των τιμών FVC%, FEV 1%, DLCO%, PaO 2 και PaCO 2 έδειξε ότι οι 2 ομάδες ασθενών, κατά την εισαγωγή στη μελέτη, διέφεραν μόνο ως προς το PaO 2. Όμως κανένας από τους ασθενείς δεν παρουσίαζε αναπνευστική ανεπάρκεια. Επιπλέον, δεν παρουσιάστηκε διαφορά ως προς τις παραμέτρους ελέγχου της αναπνευστικής λειτουργίας πριν και μετά τη θεραπεία με ιντερφερόνη ή αζαθειοπρίνη. Συζήτηση Στη παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι τα μακροφάγα από το υγρό του BAL ασθενών με ΙΠΙ παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση του CTGF σε σχέση με υγιή άτομα, ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά ως προς την έκφραση του TNFα. Πίνακας 2. Έκφραση του CTGF και TNFα (μέσες τιμές υπολογιστικής ανάλυσης εικόνας) σε ασθενείς πριν από θεραπεία και σε υγιή άτομα Ομάδα ελέγχου Ομάδα IFN-γ-1b Ομάδα AZA p CTGF ± ± ± TNFα ± ± ± p<0.05: στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα Πίνακας 3. Έκφραση του CTGF και TNFα (μέσες τιμές υπολογιστικής ανάλυσης εικόνας) σε ασθενείς πριν και μετά από θεραπεία με IFN-γ-1b ή AZA. Ομάδα IFN-γ-1b Ομάδα AZA Προ θεραπείας Μετά θεραπείας p Προ θεραπείας Μετά θεραπείας p CTGF ± ± ± ± TNFα ± ± ± ± p<0.05: στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα

6 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 2ο, Τόμος 24ος, Απρίλιος - Ιούνιος Εικόνα 5. Ποσοτικοποίηση της έντασης της ανοσοϊστοχημικής χρώσης για CTGF (Μέσες τιμές. Εύρος τιμών: 0-255). α. Σημαντικά μειωμένη έκφραση του CTGF σε ασθενείς με ΙΠΙ, συγκριτικά με υγιή άτομα (p=0,001). β. Δεν διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση CTGF πριν και μετά από τη θεραπεία με IFN-γ-1b ή AZA. CTGF = αυξητικός παράγων του συνδετικού ιστού IPF = Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση AZA = αζαθειοπρίνη IFN-γ-1b = ιντερφερόνη Επίσης, η θεραπεία με ιντερφερόνη ή αζαθειοπρίνη δεν επηρέασε την έκφραση αυτών των παραγόντων. Το γεγονός ότι οι 2 ομάδες ασθενών δεν διέφεραν ως προς την έκφραση του CTGF και του TNFα προ θεραπείας υποδηλώνει ότι οι 2 ομάδες ήταν συγκρίσιμες μεταξύ τους. Εξάλλου, παρουσιάστηκαν με παρόμοιες τιμές λειτουργικών αναπνευστικών δοκιμασιών, ενώ διέφεραν ως προς το PaO 2 χωρίς όμως να υπάρχει ασθενής με αναπνευστική ανεπάρκεια. Ο CTGF θεωρείται ως ένας κρίσιμος μεσολαβητής της ίνωσης και έχει βρεθεί αυξημένος στην ΙΠΙ 6,9. Σε μια μελέτη των Pan και συν. διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση Εικόνα 6. Ποσοτικοποίηση της έντασης της ανοσοϊστοχημικής χρώσης για TNFα (Μέσες τιμές. Εύρος τιμών: 0-255). α. Δεν υπήρχε στατιστική διαφορά στην έκφραση του TNFα μεταξύ ασθενών και ομάδας control. β. Δεν υπήρχε στατιστική διαφορά στην έκφραση του TNFα πριν και μετά από θεραπεία με ΑΖΑ ή IFN-γ-1b. TNFα = παράγων νέκρωσης όγκων-άλφα IPF = Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση AZA = αζαθειοπρίνη IFN-γ-1b = ιντερφερόνη του CTGF mrna σε πνευμονικό ιστό ασθενών με ΙΠΙ και εντοπίστηκε σε πολλαπλασιαζόμενα κυψελιδικά κύτταρα τύπου ΙΙ και σε ενεργοποιημένους ινοβλάστες 8. Το εύρημά μας, σχετικά με το CTGF, δείχνει ότι τα μακροφάγα του BAL δεν είναι η κύρια κυτταρική πηγή αυτού του παράγοντα. Επιπλέον, μια πιθανή εξήγηση της μειωμένης πρωτεϊνικής έκφρασης του CTGF στα μακροφάγα ασθενών με ΙΠΙ σε σύγκριση με υγιή άτομα είναι πως ο παράγοντας αυτός είχε ήδη καταναλωθεί όταν εξελίχθηκε η ίνωση. Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας αντανακλούν μόνο τα στάδια της νόσου όπου αυτοί οι δείκτες αξιολογήθηκαν Πίνακας 4. Παράμετροι αναπνευστικής λειτουργίας πριν και μετά θεραπεία IFN-γ-1b ή AZA Ομάδα IFN-γ-1b Ομάδα AZA Προ θεραπείας Μετά θεραπείας p Προ θεραπείας Μετά θεραπείας p FVC (%pred) 74.0 ± ± ± ± FEV 1 (%pred) 81.3 ± ± ± ± DLCO (%pred) 47.7 ± ± ± ± pao 2 (mmhg) 79.9 ± ± ± ± paco 2 (mmhg) 39.7 ± ± ± ± p<0.05: στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα

7 148 ΠΝΕΥΜΩΝ Τεύχος 2ο, Τόμος 24ος, Απρίλιος - Ιούνιος 2011 και έτσι δεν μπορούν να προβλέψουν τι συμβαίνει αρχικά ή αργότερα κατά την εξέλιξη της νόσου. Έτσι τα αποτελέσματα αυτά δεν αποκλείουν την πιθανότητα η έκφραση αυτών των δεικτών να είναι διαφορετική κατά τη διάρκεια άλλων φάσεων της πορείας της νόσου. Αυτό αποτελεί περιορισμό των περισσοτέρων μελετών της παθογένειας της ΙΠΙ όπου χρησιμοποιούνται ανθρώπινα δείγματα (ιστός, ορός, BALF) αφού η έρευνα περιορίζεται σε «στιγμιότυπα» της εξέλιξης της νόσου και έτσι δεν υπάρχει ολοκληρωμένη άποψη η οποία να βασίζεται σε δεδομένα ασθενών. Οι Τζωρτζάκη και συν. διαπίστωσαν ότι η αυξημένη mrna έκφραση του CTGF που είχε παρατηρηθεί σε πνευμονικό ιστό ασθενών με ΙΠΙ, παρέμεινε σταθερή 24 μήνες μετά από θεραπεία με ιντερφερόνη-γ-1b 29. Αυτό το εύρημα είναι σύμφωνο με τα αποτελέσματά μας ως προς την επίδραση της θεραπείας με ιντερφερόνη-γ-1b στην έκφραση του CTGF. O TNFα είναι γνωστός ως Th 1 κυτταροκίνη με πλειοτροπικές επιδράσεις στη φλεγμονώδη απάντηση 6,10. Οι Martinez και συν. ανακοίνωσαν ότι τα επίπεδα του TNFα mrna στα μακροφάγα του BALF ασθενών με ΙΠΙ δεν διέφερε στατιστικά σημαντικά από τα αντίστοιχα υγιών ατόμων 30, ενώ οι Homolka και συν. παρατήρησαν αυξημένη έκκριση του TNFα από κύτταρα του BALF, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η οποία παρέμεινε αυξημένη μετά από θεραπεία με κορτικοστεροειδή 31. Οι Nash και συν. έδειξαν ότι τα επιθηλιακά κύτταρα τύπου ΙΙ από πνευμονικό ιστό ασθενών με ΙΠΙ υπερέκφρασαν TNFα ενώ τα μακροφάγα παρουσίασαν μόνο ασθενή χρώση (μειωμένη έκφραση). Σύμφωνα με το σύστημα Μ 1/Μ 2 μακροφάγων, τα εναλλακτικώς ενεργοποιημένα Μ 2 κυψελιδικά μακροφάγα δεν παράγουν μεγάλες ποσότητες TNFα, ο οποίος είναι Th 1 κυτταροκίνη, και εκκρίνουν Th 2 κυτταροκίνες όπως η IL-10 η οποία επικρατεί στην ίνωση 20,21,25,26. Τα θεραπευτικά σχήματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη δεν μετέβαλαν την πρωτεϊνική έκφραση, ούτε τις τιμές των FVC, FEV 1, DLCO, PaO 2 και PaCO 2. Τα ευρήματα αυτά συμφωνούν με τά αποτελέσματα της πρόσφατης μελέτης INSPIRE των Kings και συν., στην οποία 15% των ασθενών που έλαβαν IFN-γ-1b είχαν αποβιώσει 64 εβδομάδες μετά τη χορήγηση θεραπείας, σε σύγκριση με 13% ασθενών που απεβίωσαν από την ομάδα ασθενών που δεν είχαν λάβει αγωγή (placebo) επομένως η IFN-γ-1b αποδείχθηκε αναποτελεσματική 18,33. Εξάλλου, δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα τα οποία να δείχνουν σημαντικά θετική επίδραση της αζαθειοπρίνης στην ΙΠΙ 34 και μέχρι τώρα η μεταμόσχευση πνευμόνων είναι η μόνη θεραπεία που επιμηκύνει το προσδόκιμο επιβίωσης 18. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η περφινιδόνη μπορεί να αποτελεί κατάλληλη αγωγή για την ΙΠΙ 35,36. Όμως, όταν η παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε, η IFN-γ-1b θεωρείτο ως ένα υποσχόμενο φάρμακο 34,37, ενώ ο συνδυασμός ανοσοκατασταλτικού ή κυτταροτοξικού παράγοντα, όπως η αζαθειοπρίνη, με πρεδνιζολόνη ήταν προτεινόμενη αγωγή από την ATS/ERS. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα μακροφάγα του BALF χαρακτηρίζονται από μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση του CTGF και παρόμοια έκφραση του TNFα, σε σύγκριση με υγιή άτομα. Επιπλέον, η θεραπεία με αζαθειοπρίνη ή IFN-γ-1b δεν μετέβαλε την έκφραση αυτών των δεικτών ούτε τις παραμέτρους αναπνευστικής λειτουργίας. Περαιτέρω μελέτες χρειάζεται να πραγματοποιηθούν για τη διευκρίνιση του ρόλου των κυψελιδικών μακροφάγων στην πολύπλοκη παθογένεια αυτής της νόσου. BΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ (Βλέπε αγγλικό κείμενο)