«ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΚΥΤΟΣΙΝΗΣ ΣΤΗ ΚΩΔΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΚΑΙ ΘΕΣΕΙΣ ΜΑΤΙΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥ p53. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΟΥ ΜΑΤΙΣΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΟΦΙΑ ΚΟΥΙΔΟΥ-ΑΝΔΡΕΟΥ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ: ΑΡΙΘΜ. Δ.Δ.: 3083 «ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΗΣ ΚΥΤΟΣΙΝΗΣ ΣΤΗ ΚΩΔΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΚΑΙ ΘΕΣΕΙΣ ΜΑΤΙΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥ p53. ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΕ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΟΥ ΜΑΤΙΣΜΑΤΟΣ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ» ΦΡΑΓΚΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΑΣ-ΤΟΞΙΚΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2 2

3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΚΟΥΪΔΟΥ-ΑΝΔΡΕΟΥ ΣΟΦΙΑ Καθηγήτρια 2. ΧΑΪΤΟΓΛΟΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Αν. Καθηγητής 3. ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Αν. Καθηγητής Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΚΟΥΪΔΟΥ-ΑΝΔΡΕΟΥ ΣΟΦΙΑ Καθηγήτρια 2. ΧΑΪΤΟΓΛΟΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Αν. Καθηγητής 3. ΤΖΗΜΑΓΙΩΡΓΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ Αν. Καθηγητής 4. ΓΙΑΓΚΟΥ ΜΗΝΑΣ Καθηγητής 5. ΠΑΤΑΚΑ-ΑΡΓΥΡΟΠΟΥΛΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ Καθηγήτρια 6. ΝΤΑΟΥΝΤΑΚΗ ΜΑΡΙΑ Αν. Καθηγήτρια 7. ΚΟΒΑΤΣΗ ΛΗΔΑ-ΚΑΛΛΙΟΠΗ Επ. Καθηγήτρια Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλεί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως. (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 παρ. 2 και ν. 1268/82, άρθρο 50 παρ. 8) 3

4 4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Δ. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ 5

6 6

7 Στο σύζυγο μου Στους γονείς μου Στην αδερφή μου Στην θεία μου 7

8 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ σελ.15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΧΡΗΣΗ ΚΑΠΝΟΥ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΑΛΛΟΙ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ DNA ΕΙΔΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ DNA ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΣΕ CpG ΝΗΣΙΔΕΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ DNA ΚΑΙ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΣΤΑΘΕΙΑ ΚΑΙ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟ ΓΟΝΙΔΙΟ p Η ΙΣΤΟΡΙΑ ΑΝΑΚΑΛΥΨΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p53 42

10 5.3 ΠΡΩΤΕЇΝΗ p ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΠΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕЇΝΗΣ p ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ p53 ΜΕΣΩ ΤΗΣ Mdm ΕΜΠΛΟΚΗ ΙΙΚΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ p53 ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΤΡΟΠΟ ΕΛΕΓΧΟΥ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΑΠΟ ΑΥΤΗΝ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ TOY p53, ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ ΜΑΤΙΣΜΑ ΚΑΙ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΣΤΑΘΕΙΑ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΑΣΤΑΘΕΙΑΣ ΜΕ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΣΤΟ p ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟΥ ΜΑΤΙΣΜΑΤΟΣ ΜΕ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ TOY p53 ΚΑΙ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ ΜΑΤΙΣΜΑ 58 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) PCR ΑΝΑΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΑΣΗΣ (RT-PCR) ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΣΕ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΧΡΟΝΟ (RT-PCR) ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ DNA ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ DNA ΑΡΧΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΤΗΣ MSP (METHYLATION SPECIFIC PCR) ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ PCR ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕЇΝΩΝ Η ΜΕΘΟΔΟΣ WESTERN BLOT 71

11 8. YΛΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΛΛΟΓΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ73 ΓΟΝΙΔΙΟΥ p53 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΧΗΜΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥ DNA ΑΠΟ ΑΙΜΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ DNA C MET - U ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ DNA ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΜΕ NaHSO 3 ΕΞΟΝΙΟΥ 5 ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ MSP ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ MSP ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΜΕ NaHSO 3 ΕΞΟΝΙΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ ΜΕ NaHSO 3 ΕΞΟΝΙΟΥ 10 ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ NESTED PCR ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ NESTED PCR ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ 92 ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΒΑΣΕΩΝ DNA (DNA SEQUENCING) ΜΕΓΕΘΥΝΣΗ ΕΞΟΝΙΟΥ 10 ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ PCR ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΤΗΣ PCR ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ 94

12 8.3 ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΞΟΝΙΩΝ 4-6, 6-9, 4-9, 9-11 ΚΑΙ ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ Δ133p53, p53β και p53γ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p53 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΧΗΜΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA ΑΠΟ ΙΣΤΟΥΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ RNA ΣΥΝΘΕΣΗ cdna ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ RT-PCR ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΞΟΝΙΩΝ 4-6, 6-9, 4-9, 9-11 ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ PCR ΕΛΕΓΧΟΣ PCR ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΗΚΤΗ ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΒΑΣΕΩΝ DNA (DNA SEQUENCING) ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΠΛΗΡΟΥΣ ΜΗΚΟΥΣ p53, ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ Δ133p53, p53β και p53γ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ REAL TIME PCR ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ MDM2 ΚΑΙ p21 ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ REAL TIME PCR ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΤΗΣ REAL TIME PCR ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ p53, MDM2 ΚΑΙ p21 ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΧΗΜΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ «ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ» ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ BCA ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ SDS-PAGE (SDS-POLYACRILAMIDE GEL ELECTROPHORESIS) 114

13 8.4.7 ΧΡΩΣΗ ΠΗΚΤΗΣ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΙΟΥ ΜΕ COOMASSIE BRILLIANT BLUE (CBB) R ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ- ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΜΑ WESTERN (WESTERN BLOTTING) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p53 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΞΟΝΙΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΞΟΝΙΟΥ ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΞΟΝΙΩΝ 3-4, 4-6, 6-9, 4-9, 9-11 ΚΑΙ ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ Δ133p53, p53β και p53γ ΤΟΥ ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ p ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΞΟΝΙΩΝ 4-6, 6-9, 4-9, 9-11 TOY p ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΞΟΝΙΩΝ 4-6, 6-9 ΚΑΙ 4-9 TOY p ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΕΞΟΝΙΩΝ 4-6, 6-9 ΚΑΙ 9-11 TOY p ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΠΛΗΡΟΥΣ ΜΗΚΟΥΣ p53, ΤΩΝ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ Δ133p53, p53β και p53γ ΜΕΛΕΤΗ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ MDM2 KAI p21 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΠΛΗΡΟΥΣ ΜΗΚΟΥΣ p53 ΚΑΙ ΤΗΣ ΙΣΟΜΟΡΦΗΣ Δ133p53, ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ MDM2 KAI p21 ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΜΕ ΤΟ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΟ ΕΡΓΑΛΕΙΟ REST ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ p53, MDM2 ΚΑΙ p21 ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΛΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕЇΝΗΣ-ΜΕΘΟΔΟΣ BCA ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΗ SDS-PAGE 150

14 9.5.3 ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ- ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΜΑ WESTERN (WESTERN BLOTTING) 151 ΣΥΖΗΤΗΣΗ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 153 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 159 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 163

15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η διαδικασία της μεθυλίωσης δεν εμπλέκεται μόνο στη ρύθμιση της μεταγραφής αλλά πιθανότατα και του ματίσματος με τη παρουσία μικρών νησίδων CpG κοντά σε θέσεις εναλλακτικής συναρμολόγησης στο γονίδιο p53 όπου παρατηρείται αυξημένη μεταλλαξιγένεση ακόμη και με τη μορφή σιωπηρών μεταλλάξεων. Η σύνδεση των νησίδων CpG με την εναλλακτική συναρμολόγηση, υποδηλώνει ότι ο ρόλος της μεθυλίωσης είναι πολλαπλός, και παράλληλα συμβάλει στην κατανόηση της ρύθμισης του ματίσματος που αποτελεί έναν από τους βασικούς μηχανισμούς με τον οποίο επιτυγχάνεται η υψηλή διαφοροποίηση τους. Η μεθυλίωση του DNA αποτελεί έναν εκτεταμένο μηχανισμό επιγενετικής επίδρασης στη γονιδιακή έκφραση και η RNA πολυμεράση ΙΙ είναι ο άμεσος αποδέκτης αυτού του ελέγχου. Τα νέα δεδομένα που έχουν προκύψει από τη μελέτη βάσεων δεδομένων της μεθυλίωσης καθώς και της μεθυλίωσης ολόκληρων γενωμάτων συμφωνούν με την αρχική υπόθεση στην οποία βασίστηκε η παρούσα διατριβή, σύμφωνα με την οποία, υφίσταται στενή σχέση μεταξύ μεθυλίωσης σε θέσεις εκτός υποκινητών και του ματίσματος (και γενικότερα των περιοχών όπου μπορεί να διαφοροποιηθεί η έκφραση). Η ασυνήθιστη πυκνή επιγενετική τροποποίηση που παρατηρείται στις αρχές του εξονίου 10 του p53 με τις 5 CpG μεθυλιωμένες περιοχές μπορεί να αποτελεί ένα μηχανισμό ελέγχου της μεταγραφής των διαφόρων ισομορφών του γονιδίου. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η περαιτέρω διερεύνηση της επιγενετικής τροποποίησης του p53 στη κωδική περιοχή του και τη σχέση της μεθυλίωσης με τη διαδικασία της εναλλακτικής συναρμολόγησης. Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που συνέβαλλαν στην πραγματοποίηση της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής. Αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω αρχικά την Καθηγήτρια και Διευθύντρια του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας και επιβλέπουσα της διατριβής κ. Σοφία Κουῒδου-Ανδρέου που μου έδωσε τη δυνατότητα να ασχοληθώ με το εξαιρετικά ενδιαφέρον ερευνητικό πεδίο της επιγενετικής και να αποτελέσω μέλος του εργαστηρίου της. Η συνεχής υποστήριξη και βοήθεια που παρείχε σε όλη την πορεία εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής, οι πολύτιμες συμβουλές της τόσο σε επιστημονικό όσο και προσωπικό επίπεδο βελτίωσαν τις ερευνητικές μου 15

16 ικανότητες, διεύρυναν τον επιστημονικό τρόπο σκέψης μου και με βελτίωσαν ως ερευνήτρια και ως άνθρωπο. Της οφείλω ευγνωμοσύνη για τη πολύτιμη συνεργασία μας όλα αυτά τα χρόνια και τις πολύτιμες εμπειρίες που αποκόμισα. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα δύο μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κώστα Χαΐτογλου και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γιώργο Τζημαγιώργη, του τομέα Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής Α.Π.Θ, για την καθημερινή συνεργασία, το ενδιαφέρον και τη συμβολή τους στην πειραματική εργασία. Τον κ. Χαΐτογλου για τις πολύτιμες συμβουλές του στο ερευνητικό πεδίο των πρωτεϊνών και τον κ. Τζημαγιώργη για τις πολύτιμες γνώσεις του στη γονιδιακή έκφραση. Τους είμαι υπόχρεη για τη θερμή υποδοχή τους στο εργαστήριο και για την βοήθεια τους. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στην Αναπληρώτρια καθηγήτρια και μέλους της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής κ. Μαρία Νταουντάκη, που σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της διδακτορικής διατριβής μου παρείχε αμέριστη ηθική στήριξη, συμπαράσταση και ενθάρρυνση. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Λήδα-Καλλιόπη Κοβάτση του Εργαστηρίου Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας, Ιατρική Σχολή ΑΠΘ, επίσης μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής για τη πολύτιμη υποστήριξη της και την καθοριστική της παρουσία στο ξεκίνημα μου και τη πίστη που έδειξε στο πρόσωπο μου. Ευχαριστώ θερμά τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής τον Καθηγητή κ. Μηνά Γιάγκου και την Καθηγήτρια κ. Παρασκευή Πατάκα- Αργυροπούλου για την ενθάρρυνση και τις συμβουλές τους στα τελικά στάδια της διατριβής. Δεν θα μπορούσα να παραλείψω τη πολύ σημαντική βοήθεια των επιστημονικών συνεργατών του εργαστηρίου και ιδιαίτερα τη πολύτιμη συμβολή του συνεργάτη μου και υποψήφιου διδάκτορα κ. Χρήστο Καραγεωργόπουλο για την αντιμετώπιση από κοινού των καθημερινών απαιτήσεων του εργαστηρίου. Του οφείλω εγκάρδιες ευχαριστίες όπως και σε όλους του συνεργάτες που βρίσκονται ή πέρασαν από το εργαστήριο καθώς και όσους εργάζονται στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας. Τις ευχαριστίες μου θα ήθελα να εκφράσω στη Λέκτορα κ. Ελισάβετ Γεωργίου για την ηθική συμπαράσταση της στη διαδικασία συγγραφής της διατριβής καθώς και τη 16

17 Λέκτορα κ. Μαρία Παπαϊωάννου για την πολύτιμη συμμετοχή της στις πρωτεϊνικές πειραματικές διαδικασίες. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στον Διευθυντή της Θωρακοχειρουργικής Κλινικής του Α.Ν.Θ. Θεαγενείου κ. Νικόλαο Μπαρμπετάκη για το προσωπικό του ενδιαφέρον για τη χορήγηση του πειραματικού υλικού καθώς και στον ειδικευόμενο γιατρό της Θωρακοχειρουργικής Κλινικής του Α.Ν.Θ. Θεαγενείου κ. Αχιλλέα Λαζόπουλο που συμμετείχε ενεργά στη συλλογή του πειραματικού υλικού και διασφάλισε ασφαλείς συνθήκες συντήρησής του. Ιδιαίτερες ευχαριστίες τέλος θα ήθελα να απευθύνω προς την οικογένειά μου για την υποστήριξη που έδειξαν στις προτεραιότητες που επέβαλε αυτή η προσπάθεια όλα αυτά τα χρόνια. Η εκπόνηση της παρούσας διατριβής ολοκληρώθηκε με την απονομή υποτροφίας από το Υπουργείο Παιδείας και Θρησκευμάτων και το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο της Ευρωπαϊκής Ένωσης, στο πλαίσιο του προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) «Ηράκλειτος ΙΙ- Ενίσχυση του ανθρώπινου ερευνητικού δυναμικού μέσω της υλοποίησης διδακτορικής έρευνας», αρ. έργου

18 18

19 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Το κυριότερο χαρακτηριστικό όλων των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών είναι οι εξαιρετικά ακριβείς μηχανισμοί ρύθμισης της ανάπτυξης και διαίρεσης των κυττάρων τους. Η καθορισμένη διάρκεια ζωής τους, χαρακτηρίζει ξεχωριστά κάθε σωματικό κύτταρο, εφόσον η ανάπτυξη, η διαίρεση, καθώς και η απόπτωση (προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος) υπόκεινται σε ακριβείς ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι αρκετά πολύπλοκοι και αφορούν μία οργανωμένη σειρά γεγονότων στην οποία υπόκεινται όλα τα ενεργά διαιρούμενα ευκαρυωτικά κύτταρα και ονομάζεται «κυτταρικός κύκλος» (Εικόνα 1.1). Τα χρονικά γεγονότα ενός κυτταρικού κύκλου που απαιτούν άμεση ρύθμιση από συγκεκριμένους παράγοντες προκειμένου να εξασφαλιστεί η φυσιολογική αύξηση και λειτουργία του κάθε κυττάρου είναι δύο: 1. η είσοδος στη φάση S του κυτταρικού κύκλου όπου γίνεται η αντιγραφή του DNA. 2. η είσοδος στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου όπου ξεκινά η διαδικασία της κυτταροδιαίρεσης (μίτωση). Η πορεία του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται με ακρίβεια από τη δραστηριότητα πολλών γονιδίων που δημιουργούν ένα πολύπλοκο σύστημα ελέγχου και βιοχημικών ισορροπιών (Εικόνα 1.1). Οι πρωτεῒνες που αποκαλούνται κυκλίνες και ένζυμα γνωστά ως κυκλινοεξαρτώμενες πρωτεϊνικές κινάσες είναι οι κύριοι παράγοντες που ενέχονται στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς του κυτταρικού κύκλου. Απώλεια ρύθμισης των γεγονότων αυτών οδηγεί σε διαταραγμένη διεκπεραίωση ολόκληρου του κυτταρικού κύκλου και επομένως ανώμαλη αύξηση και λειτουργία του κυττάρου (2). Κύτταρα που έχουν υποστεί τέτοιες αλλαγές αποτελούν αξιοσημείωτη εξαίρεση στον κανόνα της ελεγχόμενης αύξησης των ευκαρυωτικών κυττάρων και χαρακτηρίζονται ως καρκινικά. Η παρουσία καρκινικών κυττάρων μέσα σε έναν οργανισμό οδηγεί στην εμφάνιση της νόσου του καρκίνου, η οποία στις περισσότερες περιπτώσεις αποτελεί αιτία θανάτου για τον οργανισμό (3). 19

20 Εικόνα 1.1: Κυτταρικός κύκλος και ορισμένα μοριακά γεγονότα που τον ελέγχουν: Mεσόφαση (G1,S,G2) μεταβολικές δραστηριότητες του κυττάρου, αντιγραφή του DNA και προετοιμασία για τη μίτωση αντίστοιχα. Μίτωση (Μ) διαίρεση του κυττάρου (1). Ο όρος «καρκίνος» χρησιμοποιείται για να περιγράψει την παθολογική κατάσταση κατά την οποία τα κύτταρα ενός οργανισμού διαιρούνται ανεξέλεγκτα λόγω απώλειας των ρυθμιστικών μηχανισμών της ανάπτυξης και της διαίρεσης, και τα οποία μπορούν, μέσω του αίματος και του λεμφικού συστήματος, να διεισδύουν σε παρακείμενους ιστούς (μετάσταση). Ο όρος δεν χαρακτηρίζει μια και μόνο ασθένεια, αλλά ένα σύνολο ασθενειών (περίπου 100 στο σύνολο), που οφείλονται στην ανάπτυξη μιας ποικιλίας κακοήθων όγκων. Η διαδικασία κατά την οποία ένα φυσιολογικό κύτταρο μετατρέπεται σε καρκινικό (κακόηθες νεοπλασματικό κύτταρο) ονομάζεται καρκινογένεση και ο όρος νεοπλασία περιγράφει το σύνολο των διαδικασιών που απαιτούνται για τη δημιουργία νεοπλασμάτων. Στη νεοπλασία, όπως και σε άλλες ασθένειες, προηγείται μια περίοδος από τη στιγμή της δράσης του καρκινογόνου παράγοντα μέχρι την ανάπτυξη ορατών νεοπλασματικών βλαβών. Κατά τη διάρκεια αυτής της σύνθετης διαδικασίας τρία διακριτικά στάδια λαμβάνουν χώρα. Πρόκειται για την έναρξη (initiation), προαγωγή 20

21 (promotion) και εξέλιξη (progression) (Εικόνα 1.2). Παρότι η παραπάνω διαδικασία της καρκινογένεσης που προσδιορίστηκε σε οργανισμούς μοντέλα ισχύει και για τον άνθρωπο, τα διαφορετικά χημικά στοιχεία στα οποία ο άνθρωπος εκτίθεται κατά τη διάρκεια της ζωής του, αλλάζουν την ταχύτητα με την οποία πραγματοποιείται η διαδικασία, τη συχνότητα μετάλλαξης, την ταχύτητα της κυτταρικής ανάπτυξης καθώς και τη φαινοτυπική έκφραση των μεταλλαγμένων γονιδίων (4). Η έναρξη, αποτελεί το πρώτο στάδιο στη φυσική ιστορία της νεοπλασματικής ανάπτυξης και αντικατοπτρίζει τη μόνιμη και αμετάκλητη αλλαγή στο κύτταρο. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα της διαδικασίας αυτής σχετίζεται με την κυτταρική αντιγραφή του DNA και τη κυτταρική διαίρεση. Επιπλέον, η σύνθεση του DNA είναι πιθανό να απαιτείται για τη μονιμοποίηση και την αντιστρεψιμότητα της αρχικής κατάστασης. Οι κύριοι παράγοντες που δρουν κατά το στάδιο αυτό είναι χημικές καρκινογόνες ουσίες, ακτινοβολίες, γενετικές αλλαγές και διάφοροι ιοί. Οι εναρκτήριοι αυτοί παράγοντες της καρκινογένεσης θεωρείται ότι προκαλούν βλάβες ή καταστροφές συγκεκριμένων γονιδίων, κυρίως στα σωματικά κύτταρα του ιστού που εμπλέκεται στη διαδικασία. Η έκθεση ωστόσο των κυττάρων στους καρκινογόνους αυτούς παράγοντες δεν είναι αρκετή ώστε να προκληθεί αυτόματη δημιουργία νεοπλάσματος (5). Στο στάδιο της έναρξης, τα κύτταρα μπορούν να παραμείνουν σε λανθάνουσα κατάσταση για βδομάδες, μήνες ή χρόνια, είτε μπορούν να αναπτυχθούν με αυτόνομο τρόπο δημιουργώντας αποικίες, γεγονός που είναι αποτέλεσμα αφενός μεν μιτωτικών διαιρέσεων αφετέρου δε παρεμπόδισης της απόπτωσης. Tέλος, το στάδιο αυτό εξαρτάται από τη δόση του καρκινογόνου. Συγκεκριμένα, όσο μεγαλύτερη είναι αυτή, τόσο αυξημένες είναι οι επιπτώσεις και η πολυπλοκότητα της προκύπτουσας νεοπλασίας, ενώ τόσο μειωμένη είναι η λανθάνουσα περίοδος εκδήλωσης των συμπτωμάτων. Η προαγωγή είναι μία αντιστρεπτή διαδικασία κατά την οποία τα έμμεσα χημικά καρκινογόνα (πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες π.χ. βεζανθρακένιο αρωματικές αμίνες και αζω-χρωστικές νιτροζαμίνες και αμίδια) προκαλούν την αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού στους παρακείμενους ιστούς, ενισχύουν μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση και προκαλούν βλάβες στους μηχανισμούς ελέγχου της κυτταρικής ανάπτυξης (6). Η πιθανότητα ανάπτυξης ανθρώπινου καρκίνου είναι ανάλογη της δράσης των καρκινογόνων παραγόντων (μέγεθος δόσης και συχνότητα έκθεσης) και σχετίζεται με τη φύση του (4). 21

22 Η εξέλιξη αποτελεί το τελευταίο στάδιο της καρκινογένεσης και χαρακτηρίζεται κατά κύριο λόγο από τη καρυοτυπική αστάθεια και εξέλιξη, καθώς και από την ανάπτυξη μόνιμων ανευπλοειδικών κακοήθων νεοπλασμάτων. Πρόκειται για μια μη αναστρέψιμη διαδικασία η οποία χαρακτηρίζεται από γενετική αστάθεια, ταχύτερη ανάπτυξη, εισβολή (invasion), μετάσταση και αλλαγές σε μεταβολικούς, βιοχημικούς και μορφολογικούς χαρακτήρες των κυττάρων (4). Εικόνα 1.2: Σχηματική παρουσίαση των τριών σταδίων καρκινογένεσης (7). Οι παράγοντες που μπορεί να οδηγήσουν στη μετατροπή ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό είναι πολλοί και ποικίλοι. Οι κύριες αλλαγές όμως που υφίσταται ένα κύτταρο κατά τη μετατροπή του σε καρκινικό είναι τρεις (5) : 1. Αθανατοποίηση (Immortalization): η ιδιότητα της ανεξέλεγκτης αύξησης και της συνεχούς διαίρεσης των κυττάρων. Το στάδιο αυτό δε συνοδεύεται απαραίτητα από άλλες αλλαγές στο φαινότυπο των κυττάρων. 2. Μετασχηματισμός (Transformation): η απώλεια των φυσιολογικών ρυθμιστικών μηχανισμών αύξησης των κυττάρων. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα αυξάνονται και λειτουργούν ανεξάρτητα από τους συνήθεις μηχανισμούς που δρουν σε φυσιολογικά κύτταρα. 3. Μετάσταση (Metastasis): η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να προσβάλλουν φυσιολογικούς ιστούς, διαφορετικούς από τους ιστούς στους οποίους πρωτοεμφανίστηκαν. Τα καρκινικά κύτταρα με ικανότητα μετάστασης μεταναστεύουν από τον ιστό όπου πρωτο-εμφανίστηκαν σε άλλους ιστούς του σώματος όπου σχηματίζουν νέες αποικίες. 1.1 ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Ο καρκίνος είναι μια γενετική ασθένεια στην οποία τα κακοήθη κύτταρα έχουν υποστεί μεταλλάξεις και επιγενετικές αλλαγές, αλλά διατηρούν το μετασχηματισμένο 22

23 φαινότυπο τους Αποτελέσματα από μελέτες σε οικογενείς μορφές καρκίνου, συνδυάστηκαν με δεδομένα πληθυσμιακών μελετών και οδήγησαν στην επιστημονική άποψη ότι ο καρκίνος διαθέτει μια γενετική βάση η οποία είναι υπεύθυνη για την κληρονομούμενη εμφάνιση της νόσου αυτής. Γονιδιακές μεταλλάξεις (σημειακές) σε σωματικά και γεννητικά κύτταρα καθώς και αλλαγές στον αριθμό ή και την οργάνωση των χρωμοσωμάτων (ελλείμματα ή μετατοπίσεις) έχουν αναφερθεί σε διάφορες μορφές καρκίνου. Οι χρωμοσωμικές μετατοπίσεις και οι σημειακές μεταλλάξεις συμβάλλουν είτε στην ενεργοποίηση των πρωτο-ογκογονιδίων, είτε στην παρεμπόδιση της δράσης των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ενώ εμφανίζονται ως ένας από τους πιο συχνούς μηχανισμούς δημιουργίας νεοπλασιών στον άνθρωπο. To 1971, ο Alfred Knudson, διατύπωσε το μοντέλο των δύο πλεγμάτων για την καρκινογένεση, σε οικογενείς μορφές καρκίνου, προσπαθώντας να ερμηνεύσει την ανάπτυξη των κληρονομικών και σποραδικών μορφών ρετινοβλαστώματος. Στο σποραδικό ρετινοβλάστωμα, ένα άτομο γεννιέται με δύο αντίγραφα του άγριου τύπου του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (γονότυπος RB/RB) (1). Για την εμφάνιση της ασθένειας είναι απαραίτητο να συμβεί μεταλλαγή και στα δύο αντίγραφα και στο ίδιο κύτταρο του οφθαλμού (γονότυπος rb/rb). Στη κληρονομική μορφή του ρετινοβλαστώματος, οι ασθενείς κληρονομούν ένα μεταλλαγμένο αντίγραφο του γονιδίου RB, μέσω της αναπαραγωγικής σειράς, δηλαδή είναι ετεροζυγώτες (RB/ rb). Έτσι απομένει να συμβεί μια μόνο επιπλέον μεταλλαγή του γονιδίου RB στο κύτταρο του οφθαλμού για να μετατραπεί σε ομόζυγο (rb/rb). Με δεδομένο τον αριθμό των κυττάρων σε ένα αναπτυσσόμενο αμφιβληστροειδή και την πιθανότητα μεταλλαγής ανά κύτταρο, η απώλεια ετεροζυγωτίας είναι πολύ πιθανό να συμβεί τουλάχιστον σε μερικά κύτταρα (1) ΟΓΚΟΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ Ο όρος «ογκογονίδιο» χρησιμοποιείται για να δηλώσει ένα γονίδιο ικανό να προκαλέσει καρκινογένεση. Ο ορισμός αυτός ωστόσο θεωρείται μάλλον απλουστευμένος καθώς είναι γνωστό ότι η διαδικασία της καρκινογένεσης είναι μία πολυσταδιακή διαδικασία στην οποία εμπλέκονται διάφοροι παράγοντες (3). Περίπου 30 διαφορετικά ογκογονίδια έχουν εντοπιστεί σε RNA ογκογόνους ιούς, ενώ πάνω από 50 διαφορετικά ογκογονίδια έχουν χαρακτηριστεί συνολικά από μελέτες σε διάφορα είδη κακοήθων νεοπλασμάτων (8). 23

24 Τα τελευταία δεκαπέντε χρόνια η μελέτη των ογκογονιδίων έχει συμβάλλει σημαντικά στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που συντελούν στη δημιουργία του καρκίνου. Αρχικά τα ογκογονίδια ανακαλύφθηκαν σε ιούς που έχουν τη δυνατότητα να προκαλέσουν καρκίνο, ενώ αργότερα διαπιστώθηκε ότι παρουσίαζαν στενή ομοιότητα ή προερχόντουσαν από γονίδια στα κύτταρα του ξενιστή, τα πρωτοογκογονίδια, που κωδικοποιούν πρωτεῒνες υπεύθυνες για τη ρύθμιση της ανάπτυξης των κυττάρων. Ποικίλες γενετικές αλλαγές μπορούν να οδηγήσουν στην ενεργοποίηση των πρωτο-ογκογονιδίων προκαλώντας είτε ποσοτικές είτε ποιοτικές αλλαγές στην έκφραση της αντίστοιχης κακοποιούμενης πρωτεΐνης. 1. Γονιδιακή ενίσχυση. Πολλές κυτταρικές σειρές διαφόρων όγκων παρουσιάζουν ορατές περιοχές γονιδιακής ενίσχυσης (9). Η ενισχυμένη περιοχή μπορεί να περιλαμβάνει ένα πρωτο-ογκογονίδιο με συνέπεια την αυξημένη έκφραση του και την επακόλουθη ποσοτική αύξηση της κωδικοποιημένης πρωτεΐνης. Παραδείγματα πρωτο-ογκογονιδίων που εμφανίζονται ενισχυμένα σε διάφορους όγκους είναι: c- myc, c-abl, c-myb, c-erbb, c-k-ras και mdm2. Η παρουσία γνωστών πρωτοογκογονιδίων σε ενισχυμένες περιοχές πολλών μεμονωμένων όγκων του ίδιου τύπου συνηγορεί στο γεγονός ότι η αυξημένη έκφραση των πρωτο-ογκογονιδίων σχετίζεται άμεσα με το σχηματισμό όγκων. Ενσωμάτωση ρετροϊών στο γονιδίωμα κυττάρου-ξενιστή. Κατά τη διάρκεια ιογενούς λοίμωξης, η αλληλουχία του DNA ενός πρωτο-ογκογονιδίου μπορεί μερικές φορές να αντιγραφεί και να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του. Σε κάποιο σημείο της ιογενούς λοίμωξης το γονίδιο μπορεί να γίνει ελαττωματικό (να ενεργοποιηθεί) λόγω αποκοπής ή μετάλλαξης. Όταν αυτό το ιικό ογκογονίδιο εκφραστεί στο κύτταρο ξενιστή κατά τη διάρκεια μιας μεταγενέστερης λοίμωξης, το ελαττωματικό πρωτεϊνικό προϊόν που θα προκύψει παρεμβαίνει στην κανονική ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στη δημιουργία όγκου (10). Το καλύτερα μελετημένο παράδειγμα αυτής της κατηγορίας πρωτο-ογκογονιδίων είναι το c-myc, του οποίου η έκφραση αυξάνει με την ενσωμάτωση ενός ρετροϊού στην περιοχή του c-myc γονιδίου (11). Σε πολλούς μεμονωμένους όγκους, ο ιός ενσωματώνεται στο κυτταρικό γονιδίωμα μέσα ή κοντά στο c-myc γονίδιο και οδηγεί σε μετασχηματισμό του κυττάρου λόγω της ικανότητας της LTR (Long Terminal Repeat) περιοχής του ιικού γονιδιώματος να προκαλεί υπερέκφραση κυτταρικών γονιδίων. 24

25 2. Χρωμοσωμική μετατόπιση. Η μετατόπιση ενός πρωτο-ογκογονιδίου σε μία νέα χρωμοσωμική θέση είναι ένας άλλος μηχανισμός ενεργοποίησης πρωτοογκογονιδίων. Συγκεκριμένες χρωμοσωμικές μετατοπίσεις του c-myc πρωτοογκογονιδίου εμπλέκονται σε όγκους που προκύπτουν από μη-διαφοροποιημένα Β και Τ λεμφοκύτταρα (12). Στον άνθρωπο, οι μετατοπίσεις σε όγκους των Β- λεμφοκυττάρων αφορούν το χρωμόσωμα 8 που φέρει το c-myc και το χρωμόσωμα 14 που φέρει την IgH περιοχή. Αντίστοιχα, οι μετατοπίσεις σε όγκους των Τ- λεμφοκυττάρων αφορούν το χρωμόσωμα 8 που φέρει το c-myc και τα χρωμοσώματα 14 και 7 που φέρουν τις περιοχές TcRα και TcRβ, αντίστοιχα. Όταν το c-myc μετατοπίζεται σε μία νέα χρωμοσωμική θέση, το επίπεδο της έκφρασής του αυξάνει είτε γιατί η νέα αυτή χρωμοσωμική θέση υπερεκφράζεται είτε γιατί η δομή του ίδιου του c-myc μεταβάλλεται. Η μετατόπιση ορισμένων χρωμοσωμικών τμημάτων σε μία νέα χρωμοσωμική θέση μπορεί να ενεργοποιεί πρωτο-ογκογονίδια. Οι νεοπλασίες οφείλονται στην ανισορροπία της έκφρασης του γενετικού υλικού που προκύπτει εξαιτίας των μετατοπίσεων. Σε κάθε τύπο καρκινικού όγκου παρατηρείται συχνότερα συγκεκριμένη μετατόπιση. Ειδικότερα, μετατοπίσεις απαντώνται στις λευχαιμίες και στα λεμφώματα (13). Σε ορισμένες περιπτώσεις η χρωμοσωμική μετατόπιση ενός πρωτο-ογκογονιδίου οδηγεί στο σχηματισμό ενός γονιδίου-υβριδίου, στο οποίο μία ενεργή μεταγραφική μονάδα έχει αποκοπεί. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα εξόνια ενός γονιδίου να συρραφτούν με εναλλακτικό μάτισμα με τα εξόνια κάποιου άλλου γονίδιου του ίδιου ή διαφορετικού χρωμοσώματος (14). Ένα από τα πιο μελετημένα παραδείγματα κατά το οποίο μία χρωμοσωμική μετατόπιση δημιουργεί ένα γονίδιο-υβρίδιο είναι αυτό του χρωμοσώματος Philadelphia (PH (2) ) που εντοπίζεται σε ασθενείς με χρόνια μυελογενή λευχαιμία. Η προκύπτουσα πρωτεΐνη του υβριδίου αυτού (Bcr-Abl πρωτεΐνη) φαίνεται να είναι ογκογόνος καθώς ενεργοποιεί το μονοπάτι μετασχηματισμού Ras. 3. Μεταλλάξεις πρωτο-ογκογονιδίων. Ο τελευταίος μηχανισμός ενεργοποίησης πρωτο-ογκογονιδίων αφορά την ποιοτική αλλαγή του ίδιου του πρωτοογκογονιδίου. Η ποιοτική αυτή αλλαγή μπορεί να προκύψει από σημειακές μεταλλάξεις του πρωτο-ογκογονιδίου, και επιφέρει σημαντικές αλλαγές στη δομή της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης. Ένα από τα πιο μελετημένα παραδείγματα μεταλλαγμένου πρωτο-ογκογονιδίου είναι αυτό του c-ras που φαίνεται να εμπλέκεται σε διάφορες μορφές όγκων. Η αντικατάσταση ενός νουκλεοτιδίου στο 25

26 κωδικόνιο 12 του c-ras προκαλεί αντικατάσταση ενός αμινοξέος στην προκύπτουσα πρωτεΐνη ras, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του γνωστού Ras μετασχηματιστικού μονοπατιού (15). Μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί περίπου 100 ογκογονίδια τα οποία διαιρούνται σε ομάδες ανάλογα με τον τύπο της δράσης τους: 1. Αυξητικοί παράγοντες: διεγείρουν κύτταρα που βρίσκονται σε ηρεμία ή στη φάση G 0 προκειμένου να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Η πρώτη άμεση σχέση μεταξύ ενός ογκογονιδίου και ενός αυξητικού παράγοντα αποκαλύφθηκε μετά από μια συγκριτική μελέτη που απέδειξε ότι η αμινοξική αλληλουχία του προϊόντος του ογκογονιδίου v- sis εμφάνιζε υψηλή συσχέτιση με την αλληλουχία της Β αλυσίδας του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων PDGF (16). 2. Υποδοχείς ορμονών και αυξητικών παραγόντων: χωρίζονται περαιτέρω σε υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης και ενδοκυτταρικούς υποδοχείς. Οι αυξητικοί παράγοντες ή ορμόνες προσδένονται στους υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης και στέλνουν ένα αυξητικό ή μιτωτικό μήνυμα στο κύτταρο. Μερικοί υποδοχείς έχουν δράση κινασών στην κυτταροπλασματική τους πλευρά και διαβιβάζουν το μήνυμα με φωσφορυλίωση καταλοίπων τυροσίνης. Τα γονίδια των υποδοχέων γίνονται ογκογονίδια όταν μεταλλαχθούν με τέτοιο τρόπο ώστε, οι υποδοχείς να παραμένουν ενεργοί ακόμα και απουσία του προσδενόμενου παράγοντα (π.χ. υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα επιδερμικής ανάπτυξης-egfr). Στους ενδοκυτταρικούς υποδοχείς το ογκογονίδιο παράγει ένα τροποποιημένο υποδοχέα που συναγωνίζεται το φυσιολογικό και προκαλεί ανάπτυξη χωρίς έλεγχο (π.χ. υποδοχέας της θυροειδούς ορμόνης-ογκογονίδιο erba). 3. Ενδοκυτταρικοί διαβιβαστές μηνυμάτων: Τα ογκογονίδια αυτής της κατηγορίας χωρίζονται σε πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης, κινάσες σερίνης/θρεονίνης, πρωτεΐνες Ras, πρωτεΐνες G (GTPάσες) και συγγενείς πρωτεΐνες της φωσφολιπάσης C. Η μεγαλύτερη τάξη ογκογονιδίων αποτελείται από γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που μεταδίδουν σήματα από ένα υποδοχέα στους κυτταρικούς στόχους συμμετέχοντας στα διαφορετικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος του κυττάρου. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν οι G πρωτεΐνες, που έχουν δράση GTPάσης και ελέγχουν τη σύνθεση του Camp. Το προϊόν του ογκογονιδίου είναι μια G πρωτεΐνη που διεγείρει συνεχώς τη σύνθεση του Camp. Μια άλλη ομάδα 26

27 ογκογονιδίων κωδικοποιεί τις πρωτεΐνες Ras, μια δεύτερη οικογένεια GTPασών. Οι Ras συμμετέχουν στο μονοπάτι RTK-Ras που οδηγεί στη μεταγραφή γονιδίων στόχων στον πυρήνα. Σημειακές μεταλλάξεις μπορεί να ενεργοποιήσουν το ογκογονίδιο Ras το οποίο έχει συσχετιστεί με την πρόκληση όγκου. 4. Πυρηνικοί μεταγραφικοί παράγοντες: τα ογκογονίδια της κατηγορίας αυτής επηρεάζουν τη μεταγραφή άλλων γονιδίων. Τα jun και fos ογκογονίδια κωδικοποιούν πρωτεΐνες οι οποίες μαζί σχηματίζουν το μεταγραφικό παράγοντα AP1. Τα πρωτοογκογονίδια αυτά επάγονται όταν τα φυσιολογικά κύτταρα διεγερθούν για κυτταρική διαίρεση και αύξηση. Η μη ρυθμιζόμενη έκφραση των ογκογονιδίων αυτής της ομάδας έχει ογκογόνο δράση ΟΓΚΟΚΑΤΑΣΤΑΛΤΙΚΑ ΓΟΝΙΔΙΑ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ Στα τέλη της δεκαετίας του 1960, ο Henry Harris παρακολούθησε τη συμπεριφορά καρκινικών κυττάρων µετά τη σύντηξή τους µε φυσιολογικά κύτταρα τρωκτικών και παρατήρησε πως ορισμένα από τα υβριδικά κύτταρα που προέκυψαν δε σχηµάτιζαν όγκους και είχαν φυσιολογικό ρυθµό πολλαπλασιασμού. Ο Harris διατύπωσε την υπόθεση ότι τα φυσιολογικά κύτταρα περιείχαν γονιδιακά προϊόντα τα οποία είχαν την ικανότητα να καταστέλλουν τον ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό που χαρακτηρίζει τα καρκινικά κύτταρα. Τα γονίδια που εμπλέκονται στη διαδικασία αυτή ονομάστηκαν ογκοκατασταλτικά γονίδια (1). Η ανακάλυψη των ογκοκατασταλτικών γονιδίων υπήρξε κατά πολύ δυσκολότερη από αυτή των ογκογονιδίων. Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τη κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασμό και άλλες λειτουργίες, όπως η κυτταρική προσκόλληση και η ρύθμιση της λειτουργίας κάποιων πρωτεασών. Η απώλεια της λειτουργίας τους μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλαγμένο φαινότυπο καθώς οι κυριότερες αιτίες που οδηγούν στην απενεργοποίηση τους είναι ελλείψεις των χρωμοσωματικών τμημάτων με τα αντίστοιχα γονίδια, σημειακές μεταλλάξεις, αδρανοποίηση μέσω ιικών πρωτεϊνών και μέσω επιγενετικών φαινομένων (10). Οι φυσιολογικές λειτουργίες των ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι η παρεμπόδιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου, η ενεργοποίηση της απόπτωσης και η διατήρηση της σταθερότητας του γονιδιώματος διεγείροντας μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Η μετάλλαξη σε ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο οδηγεί στην άρση του περιοριστικού ρόλου της παραγόμενης πρωτεΐνης και κατά συνέπεια στην απώλεια ελέγχου της κυτταρικής αύξησης. Η έλλειψη 27

28 της λειτουργικότητας (loss of function) ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου είναι ένα ογκογόνο φαινόμενο και απαιτεί συχνά την απενεργοποίηση και των δύο αλληλομόρφων του γονιδίου. Η ετερόζυγη κατάσταση συνοδεύεται από προδιάθεση για ανάπτυξη όγκου λόγω διαφόρων μηχανισμών που μπορεί να οδηγήσουν σε απώλεια της ετεροζυγωτίας (LOH: Loss Of Heterozygosity). Το φαινόμενο συντελείται με απώλεια ολόκληρου του χρωμοσώματος ως αποτέλεσμα λανθασμένης μιτωτικής αποσύνδεσης ή εναλλακτικά με ταυτόχρονη απώλεια του φυσιολογικού χρωμοσώματος και διπλασιασμό του μεταλλαγμένου χρωμοσώματος, που φέρει το δείκτη και αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό των μεταλλαγμένων ογκοκατασταλτικών γονιδίων (17). Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια ευθύνονται για τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και χωρίζονται σε κατηγορίες ανάλογα με τις διαδικασίες στις οποίες συμμετέχουν: 1. Γονίδια που ελέγχουν την κυτταρική διαίρεση και αύξηση, π.χ. το γονίδιο Rb ρυθμίζει τη μετάβαση των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S (φάση αντιγραφής του DNA). 2. Γονίδια που συμμετέχουν στις διαδικασίες επιδιόρθωσης του DNA. Έχουν αναγνωριστεί ογκοκαταστολείς οι οποίοι αποτελούν μέρος των επιδιορθωτικών συστημάτων που επισκευάζουν το νεοσυντιθέμενο DNA που προέκυψε από την αντιγραφή, πριν προχωρήσει το κύτταρο στη φάση της διαίρεσης. Άλλοι ογκοκαταστολείς παγώνουν τον κυτταρικό κύκλο μόλις ανιχνευθεί βλάβη στο DNA δίνοντας με αυτόν τον τρόπο χρόνο στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς να δράσουν και να μη προκύψουν κύτταρα από διαίρεση τα οποία περιέχουν μετάλλαξη, π.χ. η πρωτεΐνη p53 ενεργοποιεί τη μεταγραφή του p21 και έτσι καταστέλλει την είσοδο του κυττάρου στον κυτταρικό κύκλο. 3. Γονίδια που οδηγούν στον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, στην απόπτωση, π.χ. η πρωτεΐνη p53 επάγει την απόπτωση κυττάρων των οποίων το DNA έχει υποστεί βλάβες πέρα των ορίων επιδιόρθωσης. Η ανάπτυξη ενός μεγάλου αριθμού καρκίνων στον άνθρωπο συνοδεύεται από απώλεια ή μετάλλαξη ενός ή περισσοτέρων ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Τα γονίδια αυτά εμπλέκονται και σε ένα μεγάλο ποσοστό διάφορων τύπων κληρονομικού καρκίνου (π.χ. Rb-καρκίνος του ρετινοβλαστώματος, BRCA1-καρκίνος του μαστού). Μέχρι σήμερα έχουν χαρακτηριστεί περίπου 12 γονίδια ως ογκοκατασταλτικά, με σημαντικότερα το Rb και το p53. Η απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων 28

29 οφείλεται συνήθως σε ελλείψεις χρωμοσωμικών τμημάτων τα οποία περιέχουν τα εν λόγω γονίδια. Σε πολλές περιπτώσεις έχουν παρατηρηθεί σημειακές μεταλλάξεις στους ογκοκαταστολείς, αδρανοποίησή τους μέσω ιικών πρωτεϊνών μετά από μόλυνση και μέσω επιγενετικών φαινομένων (π.χ. μεθυλίωση). 2. ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ 2.1 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ Ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί την πιο συχνά εμφανιζόμενη θανατηφόρα κακοήθεια παγκοσμίως τόσο από άποψη συχνότητας όσο από άποψη θνησιμότητας. Ευθύνεται για 1,3 εκατομμύρια θανάτους το χρόνο σε διεθνές επίπεδο, καταλαμβάνει ποσοστό 18,2% θανάτων από όλα τα είδη καρκίνου και είναι η δεύτερη αιτία θανάτου μετά τις καρδιαγγειακές παθήσεις. Κάθε χρόνο διαγνώσκονται περισσότερα από 1,6 εκατομμύρια νέα κρούσματα σε όλο τον κόσμο με το 55% των περιπτώσεων να εμφανίζεται στις αναπτυσσόμενες χώρες (18). Στην Ευρώπη ο ετήσιος αριθμός νέων περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα ανέρχεται στις Σύμφωνα με πρόσφατα στοιχεία από την Ευρωπαϊκή Ένωση, η Ελλάδα εμφανίζει τη μεγαλύτερη συχνότητα καρκίνου του πνεύμονα σε ηλικίες κάτω των 45 ετών και σημειώνονται περίπου θάνατοι ετησίως από τη νόσο αυτή. Σύμφωνα με τα στοιχεία της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας προκύπτει ότι η Ανατολική Ευρώπη έχει την υψηλότερη θνησιμότητα του καρκίνου των πνευμόνων μεταξύ των ανδρών, ενώ η βόρεια Ευρώπη και οι ΗΠΑ μεταξύ των γυναικών. Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο θανατηφόρος από όλες τις κακοήθειες, εφόσον οι θάνατοι από τη νόσο αυτή ξεπερνούν το άθροισμα των θανάτων που οφείλονται στον καρκίνο του προστάτη, του μαστού και του παχέος εντέρου. Για όλους αυτούς του λόγους αναφέρεται ότι ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί παγκόσμια επιδημία. 2.2 ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ Ο καρκίνος του πνεύμονα ταξινομείται σύμφωνα με τον ιστολογικό του τύπο σε δύο κύριους τύπους, οι οποίοι καταλαμβάνουν ποσοστό μεγαλύτερο από το 90% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα. Η ιστολογική ταξινόμηση των καρκινωμάτων του πνεύμονα είναι σημαντική, γιατί αποτελεί τη βάση για επιδημιολογία, πρόγνωση 29

30 και θεραπευτική προσέγγιση. Οι τύποι του πνευμονικού καρκίνου είναι ο μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (SCLC: Small Cell Lung Cancer) και ο μημικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC: Non-Small Cell Lung Cancer). Σε περιπτώσεις όπου ο καρκίνος του πνεύμονα παρουσιάζει χαρακτηριστικά τόσο του SCLC όσο και του NSCLC, τότε ο καρκίνος αυτός ονομάζεται «Συνδυασμένος μικροκυτταρικός/μη-μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα». Ο μη-μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα εμφανίζεται συχνότερα και αποτελεί το 85% των περιπτώσεων του καρκίνου του πνεύμονα (19). Το 20-25% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι μικροκυτταρικού τύπου. Πολλαπλασιάζεται πολύ γρήγορα και χαρακτηρίζεται από ταχύτατο ρυθμό διάδοσης σε όλο το σώμα. Το κύριο σημείο εμφάνισης μικροκυτταρικού καρκίνου είναι η βρογχική βλεννώδης μεμβράνη κάτω από το επιθήλιο στο κέντρο των πνευμόνων (80%), ενώ πιο σπάνια (20%) η νόσος ξεκινά από την περιφέρεια (βρόγχοι). Στο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα τα κύτταρα περιέχουν πυκνούς νευροεκκριτικούς κόκκους που συσχετίζουν τον όγκο με ενδοκρινικό/παρανεοπλασματικό σύνδρομο. Και στη μεγάλη πλειοψηφία οι ασθενείς έχουν ιστορικό καπνίσματος. Τα καρκινικά κύτταρα του SCLC είναι μικρά σε μέγεθος ενώ το σχήμα τους μπορεί να είναι είτε πολυπλευρικό είτε ατρακτοειδές, έχουν στρογγυλό ή ωοειδή πυρήνα και διάχυτη χρωματίνη. Ο συγκεκριμένος τύπος καρκίνου συνδέεται στενά με το κάπνισμα (20). Το 75-80% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι μη-μικροκυτταρικού τύπου. Ο τύπος αυτός καρκίνου διακρίνεται σε 3 επιμέρους υπομορφές, η καθεμιά από τις οποίες παρουσιάζει μεμονωμένα διακριτά στοιχεία: 1. Ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (Squamous Cell Carcinoma): είναι από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου του πνεύμονα παγκοσμίως, καθώς ευθύνεται για το 30% περίπου όλων των περιπτώσεων. Η μορφή αυτή καρκίνου συνήθως ξεκινά από τους μεγάλους βρόγχους και μένει στην περιοχή του θώρακα χωρίς να προχωρεί σε μεταστάσεις. Μια κοιλότητα που σχετίζεται με νέκρωση βρίσκεται συνήθως στο κέντρο του όγκου. 2. Αδενοκαρκίνωμα (Adenocarcinoma): είναι η πιο διαδεδομένη μορφή καρκίνου του πνεύμονα καθώς ευθύνεται για το 40% όλων των περιπτώσεων. Τα αδενοκαρκινικά 30

31 κύτταρα έχουν σωληνοειδές σχήμα και συνήθως πρωτο-εμφανίζονται στις εξωτερικές άκρες των πνευμόνων. 3. Μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα (Large cell carcinoma): ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για όλους τους καρκίνους του πνεύμονα που δεν ανήκουν στις κατηγορίες του ακανθοκυτταρικού καρκινώματος και αδενοκαρκινώματος. Η μορφή αυτή καρκίνου του πνεύμονα ευθύνεται για το 9% περίπου όλων των περιπτώσεων και μπορεί να εμφανιστεί σε οποιαδήποτε περιοχή του πνεύμονα. Ονομάζεται έτσι επειδή τα καρκινικά κύτταρα είναι μεγάλα, με περίσσεια κυτταροπλάσματος, μεγάλους πυρήνες και εμφανείς πυρηνίσκους (21). Εκτός από τους παραπάνω κύριους και συνήθεις τύπους καρκίνου του πνεύμονα, διάφοροι άλλοι όγκοι είναι δυνατόν να εμφανιστούν στους πνεύμονες, μερικοί από τους οποίους μπορεί να είναι καλοήθεις όπως τα τυπικά καλοήθη καρκινοειδή (Typical Benign Carcinoids) και τα μη-τυπικά καρκινοειδή (Atypical Carcinoids) ακόμη και πιο σπάνιες μορφές καρκίνου του πνεύμονα όπως, για παράδειγμα, αδενοκυστικά καρκινώματα, αιματώματα, λεμφώματα και σαρκώματα (22). 2.3 ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΓΕΝΕΤΙΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ Μελέτες χρόνων έδειξαν ότι πολλά είδη γενετικών τροποποιήσεων συμβάλλουν είτε στο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) είτε στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC). Ο καρκίνος του πνεύμονα αρχίζει με ενεργοποίηση των ογκογονιδίων ή αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Αναλυτικότερα, ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και την αγγειογένεση μέσω της ενεργοποίησης του ενδοκυττάριου τμήματός του που έχει ενεργότητα κινάσης της τυροσίνης. Η υπερέκφραση του EGFR και η παρουσία μεταλλάξεων στη περιοχή κινάσης της τυροσίνης του EGFR γονιδίου οδηγούν στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα καθώς και στην εξέλιξή του. Ενεργοποιημένες μεταλλάξεις του EGFR, οι οποίες συνδέονται με αυξημένη ευαισθησία στους αναστολείς της ενεργότητας κινάσης της τυροσίνης του EGFR, κυριαρχούν σε μη-καπνιστές, γυναίκες και σε όγκους αδενοκαρκινώματος. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις περιλαμβάνουν απαλοιφές στο εξόνιο 19 και τη L858R σημειακή μετάλλαξη στο εξόνιο 21 (23). 31

32 Η πρωτεΐνη KRAS διεγείρει τη σηματοδότηση μονοπατιών που ξεκινούν από το EGFR. Οι μεταλλάξεις στο KRAS οδηγούν στη δημιουργία μιας μόνιμης ενεργοποιημένης πρωτεΐνης KRAS που διεγείρει με τη σειρά της συνέχεια τα μονοπάτια αυτά. Οι μεταλλάξεις στο KRAS παρατηρούνται συνήθως σε αδενοκαρκινώματα, σε ασθενείς οι οποίοι είναι καπνιστές και κυρίως σε καυκάσιους ασθενείς και όχι ασθενείς από την ανατολική Ασία και είναι προγνωστικός παράγοντας κακής επιβίωσης (24). Αναδιατάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) έχουν συνδεθεί με ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και εμφάνιση NSCLC (συνηθέστερα σε αδενοκαρκινώματα). Η πιο κοινή αναδιάταξη ALK στο NSCLC είναι η EML4-ALK, η οποία προκύπτει από τη σύντηξη μεταξύ του 5 άκρου του γονιδίου EML4 και του 3 άκρου του γονιδίου ALK στο χρωμόσωμα 2p23. Οι ασθενείς με ALK αναδιατάξεις είναι νεότεροι από ότι οι περισσότεροι ασθενείς με NSCLC, και όχι ή λίγο καπνιστές των οποίων οι όγκοι δεν παρουσιάζουν EGRR και KRAS μεταλλάξεις (25). Γενετικές τροποποιήσεις αναφέρονται και στην ενεργοποίηση του γονιδίου myc έπειτα από γονιδιακή ενίσχυση, μετάλλαξη στα γονίδια της οικογένειας ras και απώλεια της ετεροζυγωτίας (LOH) σε περιοχές των χρωμοσωμάτων 3p, 13q και 17p2. Στις περιοχές 13q14 και 17p13 έχουν εντοπιστεί τα ογκοκατασταλτικά γονίδια RB και p53 αντίστοιχα (26). Τα διάφορα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια που παρουσιάζουν διαταραχές έκφρασης, καθώς και οι πιθανές χρωμοσωμικές θέσεις που ενδεχόμενα εμφανίζουν απώλεια ετεροζυγωτίας σε περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα, δίνονται στον Πίνακα 2.1. Πίνακας 2.1: Συχνές γενετικές αλλαγές σε καρκίνο του πνεύμονα (27). SCLC NSCLC Συχνές απώλειες αλληλομόρφων 3p, 4p, 4q, 5q, 8p, 10q, 13q, 17q, 22q 3p, 6p, 8p, 9p, 13q Υπερέκφραση ras < 1% 15-20% Υπερέκφραση bcl % 10-35% Υπερέκφραση myc 15-30% 5-10% Απενεργοποίηση RB1 ~90% 15-30% Απενεργοποίηση p % ~50% Απενεργοποίηση p % 30-70% Απενεργοποίηση FHIT ~75% 50-75% 32

33 2.3.2 ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΣΥΝΔΕΟΝΤΑΙ ΜΕ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΧΡΗΣΗ ΚΑΠΝΟΥ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενη νόσος του βιομηχανικού κυρίως κόσμου με όλο και μεγαλύτερη συχνότητα σε άνδρες και γυναίκες που συνδέονται με την επιδημία του καπνίσματος. Έρευνες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι, ο καπνός του τσιγάρου προκαλεί κακοήθεις όγκους του αναπνευστικού συστήματος (26). Μελέτες έχουν δείξει ότι, εκτός από το ενεργητικό κάπνισμα και το παθητικό κάπνισμα αποτελεί σημαντικό παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της νόσου. Τα άτομα, που εκτίθενται σε παθητικό κάπνισμα έχουν 15% μεγαλύτερο κίνδυνο να εμφανίσουν ασθένειες, που σχετίζονται με το κάπνισμα και ο κίνδυνος να εκδηλώσουν καρκίνο των πνευμόνων αυξάνεται κατά 20-30% (28). Αξίζει να σημειωθεί ότι ο καπνός του τσιγάρου περιέχει χημικές ουσίες, 60 από τις οποίες είναι δυνητικά καρκινογόνες. Οι ουσίες αυτές ανήκουν στην κατηγορία των πολυκυκλικών αρωματικών υδρογονανθράκων, νιτροζαμινών και αρωματικών αμινών και παράγονται κατά την καύση λιθανθρακόπισσας. Πιο ειδικά, βρέθηκε ότι προϊόντα του βενζο(a)πυρενίου, ενός πολυκυκλικού αρωματικού υδρογονάνθρακα, συνδέονται κυρίως με γουανίνη, δημιουργούν μεταβάσεις τύπου GC>AT. Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η έκθεση των κυττάρων σε βενζο(a)πυρένιο οδήγησε στον σχηματισμό προϊόντων προσθήκης (adducts) στα κωδικόνια 157, 248 και 273 του γονιδίου p53 (26). Επιπρόσθετα, ο Tomoko Hirao και οι συνεργάτες του απέδειξαν τη σπουδαιότητα των καρκινογόνων ουσιών του καπνού στη γένεση του καρκίνου του πνεύμονα (29). Συγκεκριμένα, ο κοντός βραχίονας του χρωμοσώματος 3 (3p21) φαίνεται να φιλοξενεί μια διακριτή περιοχή, ευαίσθητη στην απώλεια της ετεροζυγωτίας από τη δράση των καρκινογόνων ουσιών του καπνού και είναι ειδικώς στοχευόμενη για διαγραφή στο καρκίνο του πνεύμονα ΑΛΛΟΙ ΜΕΤΑΛΛΑΞΙΟΓΟΝΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ Στη παγκόσμια βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί και άλλοι εξωγενείς παράγοντες που μπορούν σε λιγότερο ποσοστό να συμβάλλουν στη δημιουργία καρκίνου του πνεύμονα (Εικόνα 2.3). Το ραδόνιο, ένα άχρωμο, άοσμο και ραδιενεργό αέριο είναι η δεύτερη πιο 33

34 συχνή αιτία προκλήσεων καρκίνου του πνεύμονα στις ΗΠΑ μετά το κάπνισμα. Πρόκειται για ένα άχρωμο και άοσμο αέριο που παράγεται από τη διάσπαση του ραδιενεργού ραδονίου, το οποίο με τη σειρά του είναι προϊόν της διάσπασης του ουρανίου, που βρίσκεται στο φλοιό της γης. Τα επίπεδά του διαφέρουν ανάλογα με τον τόπο και τη σύνθεση του υποκείμενου εδάφους και των βράχων κυρίως αν το υπέδαφος αποτελείται από γρανίτη όπως συμβαίνει στη Κορνουάλλη του Ηνωμένου Βασιλείου και στις ΗΠΑ. Ο τρόπος δράσης του ραδόνιου στηρίζεται στη δράση των ραδιενεργών σωματιδίων που εκπέμπονται από το ραδόνιο το οποίο εισέρχεται στον οργανισμό με την εισπνοή και ιονίζουν το γενετικό υλικό προκαλώντας μεταλλάξεις (30). Ο αμίαντος αποτελεί την κοινή ονομασία για ομάδα ορυκτών που χρησιμοποιούνταν σε βιομηχανίες και σε εμπορικές κατασκευές κυρίως τις δεκαετίες Έκθεση σε αμίαντο έχει παρατηρηθεί σε ναυπηγεία, μεταλλεία αμιάντου, βιομηχανίες μονωτικών υλικών, εργασιακούς χώρους επισκευής φρένων. Άτομα που εκτίθενται σε αμίαντο (σε συγκεκριμένες καρκινογόνες μορφές του όπως ο χρυσοτίλης, κροκιδόλιθος και τρεμολίτης) και καπνό τσιγάρου έχουν σημαντικά αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα. Έχει βρεθεί ότι τα σωματίδια αμιάντου μπορούν να συμβάλλουν στη μεταφορά συγκεντρωμένων καρκινογόνων του καπνού στα κύτταρα που επενδύουν τους πνεύμονες (31). Η περιβαλλοντική ατμοσφαιρική ρύπανση έχει μικρή επίδραση στην αύξηση του κινδύνου για καρκίνο των πνευμόνων με τα μικροσωματίδια και τους ψεκασμούς του θείου, τα οποία μπορούν να εκλύονται από τα καυσαέρια των μέσων μεταφοράς (32). Ο Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC), το 2013 κατέταξε την περιβαλλοντική ρύπανση του αέρα στο σύνολο του ως καρκινογόνο. Στο παρελθόν πολλές συνιστώσες της εξωτερικής ρύπανσης του αέρα είχαν χαρακτηριστεί ως καρκινογόνες όπως τα καυσαέρια των κινητήρων ντίζελ, διαλύτες, μέταλλα και η σκόνη. Η αξιολόγηση της IARC έδειξε ότι η εξωτερική ατμοσφαιρική ρύπανση προκαλεί καρκίνο του πνεύμονα και συνδέεται με αυξημένο κίνδυνο για καρκίνο της ουροδόχου κύστης μέσω της σωματιδιακής ύλης που είναι ένας συνδυασμός από εξαιρετικά μικρά στερεά σωματίδια και σταγονίδια υγρού που βρίσκονται στον αέρα, κυρίως σε βιομηχανικές χώρες με μεγάλους πληθυσμούς (33). 34

35 ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗ Πληθυσμιακές μελέτες σε άτομα με συγκεκριμένες διατροφικές συνήθειες απέδειξαν ότι οι πιθανότητες για εμφάνιση καρκίνου του πνεύμονα αυξάνονται σε περιπτώσεις όπου, σε συνδυασμό με χρήση καπνού, τα διαιτολόγια των ατόμων είναι ελλιπή σε φρούτα και λαχανικά. Τα φρούτα και τα λαχανικά είναι πλούσια σε αντιοξειδωτικές ουσίες όπως τα φλαβονοειδή και οι βιταμίνες A, C, E όπως και τα πράσινα βότανα (34). Επίσης, η αυξημένη κατανάλωση αλκοόλ καθώς και η πλούσια διατροφή σε χοληστερόλη μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο για καρκίνο πνεύμονα. Εικόνα 2.3: Σχετική συμβολή των παραγόντων κινδύνου για την επιβάρυνση του καρκίνου του πνεύμονα (35). 3. ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΤΟΥ DNA Η μεθυλίωση του DNA αποτελεί τη δεσπόζουσα κληρονομική επιγενετική τροποποίηση, που λαμβάνει χώρα στο γονιδίωμα των θηλαστικών και συνδέεται με την αποσιώπηση της μεταγραφής, την αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος, τη γενετική αποτύπωση και τη σταθερότητα του γονιδιώματος (36). Η μεθυλίωση του DNA χαρακτηρίζεται από μια ομοιοπολική χημική τροποποίηση, η οποία περιλαμβάνει την προσθήκη μιας μεθυλο- ομάδας (CH 3 ) στη 5 θέση του δακτυλίου της κυτοσίνης, που συμβαίνει κυρίως στην 5 CG 3 αλληλουχία (ονομάζεται επίσης CpG δινουκλεοτίδιο), και η οποία καταλύεται από την οικογένεια των DNA μεθυλοτρανσφερασών (4). Η πλειοψηφία των μεθυλιωμένων CpGs βρίσκεται εντός επαναλαμβανόμενων στοιχείων όπως επαναλήψεις του κεντρομεριδίου, δορυφορικές ακολουθίες και γονιδιακές επαναλήψεις που κωδικοποιούν επαναλαμβανόμενα ριβοσωμικά RNAs ή άλλες εξονικές αλληλουχίες. 35

36 Εικόνα 3.1: Η χημική αντίδραση της μεθυλίωσης της κυτοσίνης που καταλύεται από τις μεθυλοτρανσφεράσες (DNMTs). Οι πρώτες ενδείξεις για την ύπαρξη του φαινομένου της μεθυλίωσης του DNA προήλθαν από μελέτες σε βακτήρια. Σε αυτούς τους κατώτερους οργανισμούς, η μεθυλίωση τροποποιεί τόσο τις κυτοσίνες όσο και τις αδενίνες, ενώ φαίνεται να σχετίζεται με τη διαμόρφωση και την αντιγραφή του DNA. Κατά την αντιγραφή, η θυγατρική αλυσίδα δε μεθυλιώνεται άμεσα, αλλά προηγείται έλεγχος σφαλμάτων που επιδιορθώνονται όταν η νέα αλυσίδα βρίσκεται ακόμη στη μη-μεθυλιωμένη της μορφή. 3.1 ΕΙΔΗ ΜΕΘΥΛΙΩΣΗΣ ΤΟΥ DNA Η μεθυλίωση του DNA είναι μία δυναμική και αυστηρά καθορισμένη λειτουργία των ευκαρυωτικών κυττάρων. Τα σχήματα μεθυλίωσης μεταφέρονται με πιστότητα στις επόμενες γενιές κατά τις κυτταροδιαιρέσεις. Ωστόσο, κατά την εμβρυονική ανάπτυξη (μετά τη γονιμοποίηση αλλά πριν την εμφύτευση), ακαθόριστοι ρυθμιστικοί μηχανισμοί επιτρέπουν τη γρήγορη απo-μεθυλίωση σε πολύ αρχικά στάδια, που ακολουθούνται από επανα-καθιέρωση των σχημάτων μεθυλίωσης μετά την εμφύτευση. Ο κύριος στόχος των ρυθμιστικών αυτών μηχανισμών είναι η αποφυγή των αρνητικών επιπτώσεων της υπο- ή υπερ-μεθυλίωσης του γενετικού υλικού (37). Δύο είναι τα κύρια είδη της μεθυλίωσης του DNA: i) de novo μεθυλίωση κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης ή διαφοροποίησης των κυττάρων, και ii) μεθυλίωση 36

37 διατήρησης (maintenance methylation) που συντηρεί τα σχήματα μεθυλίωσης αφού αυτά έχουν καθιερωθεί (38). Σήμερα, τρία ένζυμα προσθήκης μεθυλομάδων σε κατάλοιπα κυτοσίνης έχουν κλωνοποιηθεί από κύτταρα θηλαστικών. Τα ένζυμα αυτά ονομάζονται DNA-μεθυλοτρανσφεράσες (DNMT) και συμβολίζονται ως: DNMT1, DNMT3a και DNMT3b. Από τα ένζυμα αυτά, η DNMT1 καταλύει την προσθήκη μεθυλομάδων κατά τη μεθυλίωση διατήρησης, ενώ η DNMT3a και η DNMT3b δρουν κατά τη de novo μεθυλίωση (39). 1. De novo μεθυλίωση: το είδος αυτό μεθυλίωσης σχετίζεται με την καθιέρωση πρωταρχικών σχημάτων μεθυλίωσης που είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τα ένζυμα που εμπλέκονται στη de novo μεθυλίωση είναι η DNMT3a και η DNMT3b, τα επίπεδα έκφρασης των οποίων είναι υψηλά σε αδιαφοροποίητα εμβρυϊκά στελεχιαία κύτταρα και χαμηλά σε κύτταρα σωματικών ιστών. Η δράση των ενζύμων αυτών εντοπίζεται σε περιπτώσεις μεθυλίωσης επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών, ενώ, πρόσφατες σχετικά μελέτες σε καρκινικά κύτταρα, απέδειξαν ότι η δράση αυτή αυξάνει με ρυθμό ανάλογο προς την πρόοδο των καρκινικών όγκων. 2. Μεθυλίωση διατήρησης: ο τύπος αυτός μεθυλίωσης είναι υπεύθυνος για τη διατήρηση των σχημάτων μεθυλίωσης αφού αυτά έχουν καθιερωθεί με τη de novo μεθυλίωση. Το ένζυμο που εμπλέκεται στη μεθυλίωση διατήρησης είναι αυτό της DNMT1 που αρχικά εντοπίστηκε σε ποντίκια και στη συνέχεια στον άνθρωπο. Κατά την αντιγραφή του DNA, η DNMT1 βρίσκεται στο δίχαλο της αντιγραφής όπου αναγνωρίζει τις μεθυλιωμένες CpG θέσεις της μητρικής αλυσίδας και έτσι καταλύει την προσθήκη μεθυλομάδων στις αντίστοιχες CpG θέσεις της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας (40). 3.2 ΜΕΘΥΛΙΩΣΗ ΣΕ CpG ΝΗΣΙΔΕΣ Η μεθυλίωση CpG δινουκλεοτιδίων αποτελεί έναν από τους κυριότερους ρυθμιστικούς μηχανισμούς της μεταγραφής. Η κατανομή αυτών των θέσεων στο γονιδίωμα είναι ασύμμετρη. Στα σπονδυλωτά το δινουκλεοτίδιο CpG απαντάται με συχνότητα περίπου 20% της αναμενόμενης συχνότητας, που υπολογίζεται από την αναλογία των βάσεων C και G στο γονιδίωμα. Ωστόσο, σε ορισμένες περιοχές η συχνότητα του CpG ανέρχεται σε πολύ υψηλότερα επίπεδα, πλησιάζοντας την αναμενόμενη. Οι περιοχές ονομάζονται CpG νησίδες (CpG islands, CGIs). Οι CpG 37